Einleitung: Der diätetische Einsatz von ω-3 Fettsäuren wird für viele Erkrankungen sowohl des Menschen als auch der Tiere mit positiven Effekten verbunden. Auch für Tumorerkrankungen wird, insbesondere bei einem niedrigen Gehalt an Vitamin E, eine positive Wirkung von ω-3 Fettsäuren postuliert. Die Aufnahme der ω-3 Fettsäuren beim Hund aus dem Futter sowie die Inkorporation in das Gewebe wird durch viele verschiedene Faktoren beeinflusst. Um den potenziellen therapeutischen Nutzen einer Supplementierung des Futters mit ω-3 Fettsäuren abschätzen zu können, ist es unerlässlich zu wissen, in welchem Ausmaß und in welcher Geschwindigkeit die Inkorporation der ω-3 Fettsäuren aus dem Futter beim Hund erfolgt. Gleichzeitig stellt sich die Frage nach einem geeigneten Indikator, um den Erfolg einer Supplementierung mit ω-3 Fettsäuren zu überprüfen. Zielstellung: In der vorliegenden Dissertation sollten deshalb die folgenden Fragestellungen untersucht werden: a) Kann ein ω-3 Fettsäuresupplement die Fettsäurezusammensetzung im Gewebe genauso effektiv verändern wie ein kommerzielles, ω-3 Fettsäure-reiches Futter? b) Wie gestaltet sich der zeitliche Verlauf der Inkorporation von diätetisch verabreichten ω-3 Fettsäuren in der Erythrozytenmembran (EM) und im Plasma? c) Können die im Plasma zu beobachtenden Veränderungen als Indikator für die Veränderungen in der EM dienen? Material & Methoden: 30 Beagle wurden in 3 Gruppen à 10 Tiere eingeteilt und für 12 Wochen unterschiedlich gefüttert. Die Kontrollgruppe (CONT) erhielt ein kommerzielles Futter, das wenig ω-3 Fettsäuren enthält, eine Versuchsgruppe bekam zusätzlich ein ω-3 Fettsäuren-Konzentrat (ADD) und die zweite Versuchsgruppe erhielt ein kommerzielles Futter mit einem hohen Anteil an ω-3 Fettsäuren (FO). Anschließend wurde ADD für weitere 4 Wochen wie CONT gefüttert. Die Fettsäurezusammensetzung der EM und des Plasmas wurde nach 0, 1, 2, 4, 8 und 12 Wochen und bei ADD zusätzlich auch nach 14 und 16 Wochen per Gaschromatografie analysiert. Der Vitamin E-Gehalt des Plasmas in ADD und CONT wurde per Hochleistungsflüssigkeitsdruckchromatografie bestimmt. Ergebnisse: In unserer Studie erwies sich der Zusatz eines ω-3 Fettsäure-Supplementes zu einem Grundfutter ohne EPA und DHA genau so effektiv wie eine komplette Futterumstellung auf ein kommerzielles ω-3 fettsäurereiches Futter. Dies ist insbesondere für die Therapie von Hunden, die ein Spezialfutter erhalten ein wichtiger Vorteil. Auch können Supplemente einfacher an den jeweiligen individuellen Bedarf angepasst und dosiert werden. Bereits nach einer Woche konnte bei ADD und FO ein signifikanter Anstieg der Gesamt ω-3 Fettsäuren, EPA, und DHA in der EM und im Plasma beobachtet werden. Innerhalb von zwei (ADD) bzw. vier (FO) Wochen war das Plateau des Anstieges der ω-3 Fettsäuren im Plasma erreicht, nach acht Wochen auch in der EM. Das Plateau für DHA wurde im Plasma nach zwei (FO) bzw. vier (ADD) Wochen erreicht, in der EM nach acht Wochen. Das Plateau für EPA wurde im Plasma nach zwei Wochen erreicht, in der EM nach zwei (ADD), bzw. vier (FO) Wochen. Nach der Umstellung von ADD auf CONT-Fütterung ging der Gehalt an EPA im Plasma innerhalb von zwei Wochen auf den Ausgangswert zurück. Der Gehalt an EPA in der EM und der Gehalt an DHA im Plasma und in der EM erreichte das Ausgangsniveau innerhalb der vier Wochen der Washoutperiode nicht wieder. Der Gehalt an Arachidonsäure (AA) und der gesamt ω-6 Fettsäuren in den EM und im Plasma in ADD und FO sank innerhalb des Versuchszeitraumes signifikant, jedoch war die Reduktion nach 12 Wochen noch nicht abgeschlossen. Die Vitamin E Konzentration in ADD und CONT im Plasma zeigte keine signifikanten Änderungen. Schlussfolgerungen: Auf Grund von möglichen individuellen Unterschieden im Fettsäuremuster sollte der Erfolg einer Supplementierung mit ω-3 Fettsäuren immer in Relation zum individuellen Ausgangswert bewertet werden. Unabhängig von der Art der Supplementierung ist ein signifikanter Anstieg von EPA, DHA und der gesamt ω-3 Fettsäuren innerhalb von einer Woche zu erwarten. Hierbei korreliert die Entwicklung im Plasma sehr gut mit der der EM. Die Reduktion von AA und der gesamt ω-6 Fettsäuren erfolgt dagegen über einen wesentlich längeren Zeitraum. Um diese beobachten zu können, ist die Analyse der EM zu bevorzugen.:Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... III 1. Einleitung ....................................................................................................... 1 2. Literatur .......................................................................................................... 3 2.1. Fettsäuren ................................................................................................... 3 2.1.1. Aufbau und Eigenschaften ....................................................................... 3 2.1.2. Vorkommen und Synthese ....................................................................... 4 2.1.3. Funktion der Fettsäuren im Körper .......................................................... 5 2.1.4. Rolle der ω-3 Fettsäuren bei entzündlichen Prozessen .......................... 6 2.2. Tumorerkrankungen .................................................................................... 7 2.2.1 Rolle der ω-3 Fettsäuren bei Tumorerkrankungen .................................... 8 2.3 Rolle der ω-3 Fettsäuren bei anderen Erkrankungen ................................. 12 2.4. Diätetische Versorgung mit ω-3 Fettsäuren ............................................... 12 2.4.1. Inkorporation der ω-3 Fettsäuren in das Gewebe ................................... 13 2.4.2. Indikatoren für den Fettsäurestatus des Organismus .............................. 15 2.5. Vitamin E ..................................................................................................... 16 2.5.1. Aufnahme in den Körper ........................................................................... 16 2.5.2. Funktion von Vitamin E ............................................................................. 17 2.5.3. Hypovitaminose E ..................................................................................... 18 2.5.4. Hypervitaminose E .................................................................................... 18 2.5.5. Supplementierung mit Vitamin E bei Erkrankungen .................................. 18 3. Fragestellungen ............................................................................................... 19 4. Publikationen .................................................................................................... 20 4.1. Publikation 1 .................................................................................................. 20 Stellungnahme zum Eigenanteil der Arbeit an der Publikation 1 .......................... 20 4.2. Publikation 2 .................................................................................................. 32 Stellungnahme zum Eigenanteil der Arbeit an der Publikation 2 .......................... 32 5. Diskussion ......................................................................................................... 43 5.1. Würdigung der Versuchsanstellung ................................................................ 43 5.2. Ausgangssituation ........................................................................................... 45 5.3. Inkorporation der ω-3 Fettsäuren .................................................................... 47 5.4. Auswirkungen auf ω-6 Fettsäuren ................................................................... 49 5.5. Nachteile einer Supplementierung mit ω-3 Fettsäuren ................................... 50 5.6. Effektivität des ω-3 Fettsäure-Additivs ............................................................ 51 5.7. Einsatz von ω-3 Fettsäuren bei Tumorpatienten ............................................. 54 5.8. Einfluss von Vitamin E ..................................................................................... 56 5.9. Indikatoren für den Erfolg einer Supplementierung mit ω-3 Fettsäuren .......... 58 5.10. Ausblick ......................................................................................................... 59 6. Schlussfolgerungen ............................................................................................ 60 7. Zusammenfassung ............................................................................................. 61 8. Summary ............................................................................................................ 63 9. Literaturverzeichnis ............................................................................................ 65 Danksagung ........................................................................................................... 83 / Introduction: Dietary supplementation with n-3 fatty acids is associated with positive effects on many diseases in humans and animals. A positive effect of n-3 fatty acids on cancer is discussed especially in combination with a low Vitamin E content. Bioavailability from food and incorporation of n-3 fatty acids into tissues is influenced by many different factors. In order to estimate the potential therapeutical use of n-3 fatty acid supplementation in dogs it is nessecary to know the extend and speed of the incorporation of dietary n-3 fatty acids into tissues. There is also need for a reliable indicator to monitor the success of n-3 fatty acid supplementation. Objective: We therefore sought to answer the following questions: a) Is a n-3 fatty acid additive as effective in changing tissue fatty acid profiles as a commercial n-3 fatty acid diet? b) How are n-3 fatty acids incorporated into erythrocyte membranes (EM) and plasma over time? c) Are plasma fatty acid profiles a suitable indicator for EM fatty acid profiles? Material & Methods: 30 Beagle dogs were divided into 3 groups with 10 dogs per group and fed different diets for 12 weeks. One group got a commercial diet with a low n-3 fatty acid content (CONT). One group got the CONT diet with an added n-3 fatty acid concentrate (ADD) and one group got a commercial diet rich in n-3 fatty acids. After the 12 week period ADD was fed an additional four weeks as CONT to observe washout effects. Fatty acid profiles of plasma and EM were analysed at week 0, 1, 2, 4, 8 and 12 and for ADD also at week 14 and 16 per gas chromatography. Vitamin E content was analysed in Plasma of ADD and CONT via high pressure liquid chromatography. Results: In our study the use of a n-3 fatty acid additive was as effective in changing tissue fatty acid profiles as a commercial diet rich in n-3 fatty acids. Especially for dogs already recieving specialized diets, this is an important advantage. Additives are also much easier to customise and dose according to individual needs. A significant increase of total n-3 fatty acids, EPA and DHA was seen in EM and in plasma after one week both in ADD and FO. For total n-3 fatty acids the plateau was reached in plasma after two (ADD) and four (FO) weeks and after eight weeks in EM. DHA reached its plateau in plasma after two (FO) and four (ADD) weeks and after eight weeks in EM. For EPA the plateau was reached after two weeks in plasma and in EM after two (ADD) and four (FO) weeks. During the washout period in ADD EPA reached its baseline levels after two weeks in plasma but not within four weeks in EM. Total n-3 fatty acids and DHA in both plasma and EM also did not return to baseline levels within the four weeks of the washout period. Arachidonic acid (AA) and total n-6 fatty acids were significantly reduced in both ADD and FO during the trial, but their decline was not completed within the 12 weeks of the trial period. Vitamin E content in ADD and CONT showed no significant changes. Conclusion: Due to possible individual differences in fatty acid profiles success of dietary n-3 fatty acid supplementation should always be measured in relation to individual fatty acid profiles before the start of dietary supplementation. Both the additive and the commercial n-3 fatty acid diet led to an increase in EPA, DHA and total n-3 fatty acids within one week. This could be seen clearly in both plasma and EM. Changes in EM also correlated well with changes in plasma. For AA and total n-6 Fatty acids it took much longer to decline. In order to monitor this decline analysis of EM should be preferred.:Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................... III 1. Einleitung ....................................................................................................... 1 2. Literatur .......................................................................................................... 3 2.1. Fettsäuren ................................................................................................... 3 2.1.1. Aufbau und Eigenschaften ....................................................................... 3 2.1.2. Vorkommen und Synthese ....................................................................... 4 2.1.3. Funktion der Fettsäuren im Körper .......................................................... 5 2.1.4. Rolle der ω-3 Fettsäuren bei entzündlichen Prozessen .......................... 6 2.2. Tumorerkrankungen .................................................................................... 7 2.2.1 Rolle der ω-3 Fettsäuren bei Tumorerkrankungen .................................... 8 2.3 Rolle der ω-3 Fettsäuren bei anderen Erkrankungen ................................. 12 2.4. Diätetische Versorgung mit ω-3 Fettsäuren ............................................... 12 2.4.1. Inkorporation der ω-3 Fettsäuren in das Gewebe ................................... 13 2.4.2. Indikatoren für den Fettsäurestatus des Organismus .............................. 15 2.5. Vitamin E ..................................................................................................... 16 2.5.1. Aufnahme in den Körper ........................................................................... 16 2.5.2. Funktion von Vitamin E ............................................................................. 17 2.5.3. Hypovitaminose E ..................................................................................... 18 2.5.4. Hypervitaminose E .................................................................................... 18 2.5.5. Supplementierung mit Vitamin E bei Erkrankungen .................................. 18 3. Fragestellungen ............................................................................................... 19 4. Publikationen .................................................................................................... 20 4.1. Publikation 1 .................................................................................................. 20 Stellungnahme zum Eigenanteil der Arbeit an der Publikation 1 .......................... 20 4.2. Publikation 2 .................................................................................................. 32 Stellungnahme zum Eigenanteil der Arbeit an der Publikation 2 .......................... 32 5. Diskussion ......................................................................................................... 43 5.1. Würdigung der Versuchsanstellung ................................................................ 43 5.2. Ausgangssituation ........................................................................................... 45 5.3. Inkorporation der ω-3 Fettsäuren .................................................................... 47 5.4. Auswirkungen auf ω-6 Fettsäuren ................................................................... 49 5.5. Nachteile einer Supplementierung mit ω-3 Fettsäuren ................................... 50 5.6. Effektivität des ω-3 Fettsäure-Additivs ............................................................ 51 5.7. Einsatz von ω-3 Fettsäuren bei Tumorpatienten ............................................. 54 5.8. Einfluss von Vitamin E ..................................................................................... 56 5.9. Indikatoren für den Erfolg einer Supplementierung mit ω-3 Fettsäuren .......... 58 5.10. Ausblick ......................................................................................................... 59 6. Schlussfolgerungen ............................................................................................ 60 7. Zusammenfassung ............................................................................................. 61 8. Summary ............................................................................................................ 63 9. Literaturverzeichnis ............................................................................................ 65 Danksagung ........................................................................................................... 83

Einleitung: Nasenhöhlentumoren stellen mit bis zu 47 % die Hauptursache für Nasenausfluss beim Hund dar. Sie sind überwiegend maligne, zu 60 % Karzinome und zu 34 % Sarkome. Die mediane Überlebenszeit (MÜZ) liegt ohne Therapie bei etwa drei Monaten. Nach einer Bestrahlungstherapie beträgt sie etwa 8-20 Monate. Eine Therapie mit klassischen Chemotherapeutika oder eine Tumorablation über eine offen-chirurgische Rhinotomie führen nicht zu einer Verlängerung der Überlebenszeit. Durch ein neues Therapieverfahren, die endoskopisch interventionelle Zytoreduktion (EIZ), werden bei deutlich weniger Nebenwirkungen und Sitzungen in Allgemeinanästhesie ähnliche Überlebenszeiten erreicht wie durch eine Radiotherapie. Da es sich bei der EIZ um eine Zytoreduktion handelt, bei der die Nasenhöhlentumoren nicht mit Sicherheitsabstand im gesunden Gewebe entfernt werden können, stellt sich die Frage, ob die Überlebenszeit zusätzlich durch adjuvante Therapeutika verlängert werden kann. Als solche kommen beispielsweise Tyrosinkinase-Inhibitoren (TKI) und Cyclooxygenase-2 (COX-2)-Inhibitoren infrage, deren Zielstruktur-Expression besonders in kaninen nasalen Sarkomen noch unbekannt ist. Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit ist, anhand von Bioptaten von kaninen nasalen Karzinomen und Sarkomen eine immunhistochemische Charakterisierung durchzuführen. Hierzu wurden 10 Marker ausgewählt. Besonders im Fokus standen die Wachstumsfaktorrezeptoren vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) und epidermal growth factor receptor (EGFR) sowie COX-2, die ersten beiden als Zielstrukturen von TKI und der letztere als Zielstruktur von COX-2-Inhibitoren. So soll eine Wirksamkeit dieser Medikamente bei kaninen nasalen Karzinomen und Sarkomen evaluiert werden. Weiterhin soll eine Korrelation zwischen der Expression von bestimmten Markern (p53, Ki-67, aktivierte Caspase-3, Survivin, E-Cadherin) mit den klinischen Daten zur Tumorkategorie und Überlebenszeit der Patienten untersucht werden. Außerdem soll als Grundlage für den Einsatz neuartiger Medikamente analysiert werden, ob EGFR, VEGFR-2 oder COX-2 in Karzinomen und Sarkomen unterschiedlich stark exprimiert werden. Tiere, Material und Methoden: Es wurden 19 Karzinome, sieben Sarkome und drei andere Tumorarten (ein malignes Melanom, zwei undifferenzierte maligne Tumoren unklarer Histogenese) retrospektiv immunhistochemisch auf die Expression von EGFR, VEGFR-2, COX-2, p53, Ki-67, aktivierter Caspase-3, Survivin, E-Cadherin, Zytokeratinen und Vimentin untersucht. Von drei Patienten wurden insgesamt vier Rezidivbioptate entnommen und ebenfalls immunhistochemisch untersucht. Beidseitige Nasenschleim-hautbioptate von neun gesunden Beagles dienten als Kontrollgruppe (genehmigungspflichtiger Tierversuch: TVV 02/18, Landesdirektion Sachsen). Alle Bioptate wurden während einer standardisierten Diagnostik mit computer-/ magnetresonanztomographischer Untersuchung - bei der auch ein Staging in vier Tumor-Kategorien (T1-T4) durchgeführt wurde - und Rhinoskopie zwischen Jan. 2015 und Dez. 2018 entnommen. Die immunhistochemische Untersuchung der in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeschnitte wurde mit der Avidin-Biotin-Komplex-Methode durchgeführt, nachdem die histopathologischen Diagnosen an Hämatoxylin-Eosin-gefärbten Schnitten gestellt wurden. Die immun-histochemischen Färbungen wurden entweder quantitativ oder semiquantitativ ausgewertet. Die Ergebnisse wurden auf Normalverteilung getestet und u.a. mit One-way Anova oder Kruskal-Wallis Test analysiert. Die MÜZ wurde mit der Kaplan Meier Methode berechnet und mit Log-Rank Test und Gehan-Breslow-Wilcoxon Test verglichen (Signifikanzniveau alpha = 5 %). Ergebnisse: 29 Hunde haben die Einschlusskriterien erfüllt. 14 Hunde wurden unmittelbar nach der Diagnostik euthanasiert; 15 Hunde wurden mit einer EIZ behandelt. Die MÜZ der Patienten in T1 (n = 3) nach EIZ betrug 1362 Tage und war signifikant länger als die MÜZ der Patienten in T2 (n = 1) mit 379 Tagen, in T3 (n = 8) mit 250 Tagen und in T4 (n = 1) mit 75 Tagen (p = 0,0062). Von den nasalen Karzinomen zeigten 68 % für EGFR, 100 % für VEGFR-2, 63 % für COX-2, 100 % für Survivin und 100 % für E-Cadherin eine immunhistochemisch positive Reaktion. Von den nasalen Sarkomen reagierten 100 % für VEGFR-2, 57 % für COX-2 und 86 % für Survivin positiv. Die Proteine EGFR und E-Cadherin werden ausschließlich von epithelialen Zellen exprimiert. Die Expression lag somit bei den vorliegenden Sarkomen bei 0 %. Unter den anderen Tumoren waren 33 % für EGFR, 100 % für VEGFR-2, 67 % für COX-2, 67 % für Survivin und 67 % für E-Cadherin positiv. Die mediane Expression von p53 lag bei 0,9 %, von Ki-67 bei 25 % und von aktivierter Caspase-3 bei 0,7 %. Die Unterschiede in der Expression von EGFR, VEGFR-2, COX-2, p53, Ki-67, aktivierter Caspase-3, Survivin und E-Cadherin zwischen den einzelnen histogenetischen Gruppen sowie zwischen den vier Tumor-Kategorien und in der MÜZ waren nicht signifikant. Eine Korrelation der VEGFR-2-Expression mit der MÜZ oder den T-Kategorien konnte nicht untersucht werden, da alle Tumoren der drei histogenetischen Gruppen VEGFR-2-positiv waren. 100 % der Karzinome zeigten eine Zytokeratin-Expression, 0 % eine Vimentin-Expression. Sarkome verhielten sich dazu konträr. In den anderen Tumoren konnten weder Zytokeratine noch Vimentin immunhistochemisch nachgewiesen werden. In den Rezidivbioptaten war ein Anstieg der COX-2 und aktivierte-Caspase-3-Expression zu beobachten, der aufgrund der geringen Fallzahl nicht statistisch untersucht werden konnte. Schlussfolgerungen: In der vorliegenden Studie wurden erstmalig kanine nasale Karzinome und Sarkome vergleichend immunhistochemisch untersucht. Weiterhin konnte erstmalig gezeigt werden, dass auch mesenchymale und andere Tumoren in vergleichbarer Häufigkeit wie Karzinome der Nase COX-2 exprimieren, wodurch ein Einsatz von COX-2-Inhibitoren nach einer Zytoreduktion bei Nasenhöhlentumoren allgemein von Nutzen sein könnte. Da alle Tumoren VEGFR-2 und die Mehrzahl der Karzinome (68 %) EGFR exprimierten, könnte eine adjuvante Therapie nach EIZ durch einen TKI mit VEGFR-2 oder EGFR als Zielstruktur einen positiven Einfluss auf die Überlebenszeit der erkrankten Hunde haben. Durch die Expression von E-Cadherin und Zytokeratinen in 100 % der Karzinome und 0 % der Sarkome sowie der Expression von Vimentin in 0 % der Karzinome und 100 % der Sarkome konnte die histopathologische Diagnose im Hinblick auf die Histogenese der Tumoren bestätigt werden. Auf der Grundlage der Ergebnisse der vorliegenden Studie sollte eine klinische Studie zur Anwendung von TKI und COX-2-Inhibitoren zur Untersuchung der klinischen Wirksamkeit und Sicherheit bei nasalen Tumoren von Hunden durchgeführt werden.:1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Physiologie der Nasenhöhle 2 2.1.1 Anatomischer und histologischer Aufbau 2 2.1.2 Funktionen der Nasenhöhle und Nasenschleimhaut 3 2.2 Tumoren der Nase und der Nasennebenhöhlen 3 2.2.1 Prävalenz und Signalement von Hunden mit Nasentumoren 3 2.2.2 Biologisches Verhalten der Tumoren 3 2.3 Klinische Symptome 4 2.4 Diagnostik 5 2.4.1 Laboruntersuchungen 5 2.4.2 Bildgebende Verfahren 6 2.4.3 Rhinoskopie 9 2.4.4 Histopathologische Untersuchung 10 2.5 Therapieoptionen 10 2.5.1 Radiotherapie 10 2.5.2 Rhinotomie 11 2.5.3 Chemotherapie 11 2.5.4 Endoskopisch interventionelle Zytoreduktion (EIZ) 12 2.5.5 Tyrosinkinase-Inhibitoren 13 2.5.6 Antikörper gegen Rezeptortyrosinkinasen 15 2.5.7 Cyclooxigenase-Inhibitoren 16 2.6 Prognose 16 2.7 Zielantigene für die Immunhistochemie 17 2.7.1 Epidermal growth factor receptor (EGFR) 17 2.7.2 Vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) 18 2.7.3 Cyclooxygenase-2 (COX-2) 18 2.7.4 p53 19 2.7.5 Ki-67 19 2.7.6 Aktivierte Caspase-3 20 2.7.7 Survivin 20 2.7.8 E-Cadherin 21 2.7.9 Zytokeratine 21 2.7.10 Vimentin 21 3 HUNDE, MATERIAL UND METHODEN 22 3.1 Patienten 22 3.2 Bioptate und Einschlusskriterien 23 3.3 Kontrolltiere 24 3.4 Immunhistochemische Untersuchungen 25 3.5 Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen 28 3.6 Statistische Auswertung 29 4 ERGEBNISSE 31 4.1 Patienten 31 4.1.1 Signalement und Anamnese 31 4.1.2 Einteilung der Patienten in T-Kategorien 33 4.1.3 Histopathologische Befunde 34 4.1.4 Mediane Überlebenszeit nach endoskopisch interventioneller Zytoreduktion 34 4.1.5 Gesunde Kontrollgruppe 35 4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen 37 4.2.1 Kontrollen und Absorptionsreaktionen 37 4.2.2 Epidermal growth factor receptor (EGFR) 37 4.2.3 Vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) 40 4.2.4 Cyclooxygenase-2 (COX-2) 42 4.2.5 p53 46 4.2.6 Ki-67 48 4.2.7 Aktivierte Caspase-3 50 4.2.8 Survivin 52 4.2.9 E-Cadherin 55 4.2.10 Zytokeratine 58 4.2.11 Vimentin 58 4.2.12 Bioptate von Tumorrezidiven 60 5 DISKUSSION 62 6 ZUSAMMENFASSUNG 84 7 SUMMARY 86 8 LITERATURVERZEICHNIS 88 9 ANHANG 105 9.1 Übersicht über die Hunde und Bioptate 105 9.2 Ergebnistabellen 107 9.3 Immunhistochemisches Reaktionsprotokoll 120 9.4 Ansatz der Lösungen und Puffer für die Immunhistochemie 122 9.5 Bezugsquellen für Geräte, Einmalartikel, Reagenzien und Chemikalien 123 9.6 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 125 / Introduction: Tumours of the nasal cavity are the main cause of nasal discharge in dogs (up to 47 %). They are almost always malignant, 60 % are carcinomas and 34 % are sarcomas. Without performing any treatment, the median survival time (MST) is about three months. After radiation therapy, the MST is about 8-20 months. A therapy with conventional chemotherapeutics or tumour ablation via open surgical rhinotomy does not prolong the survival time. A new treatment method, the endoscopic interventional cytoreduction (EIC), achieves survival times similar to radiotherapy with considerably fewer sessions under general anaesthesia and fewer potential adverse events. As EIC is a cytoreduction procedure in which the intranasal tumours cannot be removed with safety margins in surrounding healthy tissue, the question arises whether survival could be prolonged by an additional application of adjuvant therapeutics. As such, for example, tyrosine kinase inhibitors (TKIs) and cyclooxygenase-2 (COX-2) inhibitors may be considered, whose target expression is still unknown, especially in canine nasal sarcomas. Aims of the study: One aim of this study is to perform an immunohistochemical characterisation on the basis of biopsy specimens from canine nasal carcinomas and sarcomas. For this purpose, 10 markers were selected. We particularly focused on the growth factor receptors vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) and epidermal growth factor receptor (EGFR) as well as COX-2, the first two being targets of TKIs and the latter one being the target of COX-2-inhibitors. Thus, a possible efficacy of these drugs in canine nasal carcinomas and sarcomas should be evaluated. Furthermore, a correlation between the expression of specific markers (p53, Ki-67, cleaved caspase-3, survivin, E-cadherin) with clinical data of the tumour stage and patient survival time should be investigated. Moreover, it will be analysed as a basis for the use of novel drugs whether EGFR, VEGFR-2 or COX-2 are differentially expressed in carcinomas and sarcomas. Animals, Material and Methods: A total of 19 carcinomas, seven sarcomas and three other tumour types (one malignant melanoma, two undifferentiated malignant tumorus of unclear histogenesis) were retrospectively examined by immunohistochemistry for the expression of EGFR, VEGFR-2, COX-2, p53, Ki-67, cleaved caspase-3, survivin, E-cadherin, cytokeratins and vimentin. A total of four biopsies from recurrent tumours were obtained from three patients and also examined by immunohistochemistry. Bilateral nasal mucosal samples from nine healthy beagles served as a control group (animal experiment requiring approval: TVV 02/18, Directorate of the Federal State of Saxony, Germany). All biopsy specimens were collected during a standardised diagnostic procedure with computer /magnetic resonance tomography, which also included a staging into four tumour stages (T1-T4) and rhinoscopy between Jan 2015 and Dec 2018. The immunohistochemical examination of tissue sections fixed in formalin and embedded in paraffin was performed using the avidin-biotin complex method after histopathological diagnoses had been made on haematoxylin-eosin stained sections. The immunohistochemically stained sections were evaluated either quantitatively or semiquantitatively. Results were tested for normal distribution and analysed by the one-way anova or Kruskal-Wallis test, among others. MST was calculated using the Kaplan Meier method and compared with the log-rank test and Gehan-Breslow-Wilcoxon test (significance level alpha = 5 %). Results: A total of 29 dogs met the inclusion criteria. A total of 14 dogs were euthanised immediately after diagnosis; 15 dogs were treated with an EIC. The MST of patients in T1 (n = 3) after EIC was 1362 days and was significantly longer than the MST of those patients in T2 (n = 1) at 379 days, T3 (n = 8) at 250 days and T4 (n = 1) at 75 days (p = 0.0062). Of the nasal carcinomas, 68 % were immunohistochemically positive for EGFR, 100 % for VEGFR-2, 63 % for COX-2, 100 % for survivin and 100 % for E-cadherin. Of the nasal sarcomas, 100 % reacted positively for VEGFR-2, 57 % for COX-2 and 86 % for survivin. The proteins EGFR and E-cadherin were expressed exclusively by epithelial cells and, therefore, the expression was 0 % in the present sarcomas. Amongst the other tumours, 33 % were positive for EGFR, 100 % for VEGFR-2, 67 % for COX-2, 67 % for survivin and 67 % for E-cadherin. The median expression of p53 was 0.9 %, that of Ki-67 25 % and that of cleaved caspase-3 0.7 %. Differences in expression of EGFR, VEGFR-2, COX-2, p53, Ki-67, cleaved caspase-3, survivin and E-cadherin among the histogenetic groups, the four tumour stages and in MST were not significant. However, a correlation of VEGFR-2 expression with MST or the tumour stages could not be investigated because all tumours in the three histogenetic groups were VEGFR-2 positive. A total of 100 % of carcinomas showed cytokeratin expression, and 0 % showed vimentin expression. Sarcomas behaved in a contrary manner. In the other tumours, neither cytokeratins nor vimentin could be detected by immunohistochemistry. An increase in COX-2 and cleaved caspase-3 expression was observed in the recurrent tumour biopsies, which could not be statistically investigated due to the small number of cases. Conclusions: In the present study, canine nasal carcinomas and sarcomas were investigated comparatively by immunohistochemistry for the first time. Again, it was shown for the first time that mesenchymal and other tumours also express COX-2 at comparable frequencies to carcinomas of the nose, suggesting that the use of COX-2 inhibitors after cytoreduction may be of general benefit in nasal cavity tumours. As all tumours expressed VEGFR-2 and the majority of carcinomas (68 %) expressed EGFR, the adjuvant therapy after EIC by a TKI targeting VEGFR-2 or EGFR could have a beneficial effect on the survival of diseased dogs. The expression of E-cadherin and cytokeratins in 100 % of the carcinomas and 0 % of the sarcomas as well as the expression of vimentin in 0 % of the carcinomas and 100 % of the sarcomas confirmed the histopathological diagnosis with regard to the histogenesis of the tumours. Based on these results of the present study, a clinical trial should be performed on the use of TKIs and COX-2 inhibitors to investigate the clinical efficacy and safety of canine nasal tumours.:1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Physiologie der Nasenhöhle 2 2.1.1 Anatomischer und histologischer Aufbau 2 2.1.2 Funktionen der Nasenhöhle und Nasenschleimhaut 3 2.2 Tumoren der Nase und der Nasennebenhöhlen 3 2.2.1 Prävalenz und Signalement von Hunden mit Nasentumoren 3 2.2.2 Biologisches Verhalten der Tumoren 3 2.3 Klinische Symptome 4 2.4 Diagnostik 5 2.4.1 Laboruntersuchungen 5 2.4.2 Bildgebende Verfahren 6 2.4.3 Rhinoskopie 9 2.4.4 Histopathologische Untersuchung 10 2.5 Therapieoptionen 10 2.5.1 Radiotherapie 10 2.5.2 Rhinotomie 11 2.5.3 Chemotherapie 11 2.5.4 Endoskopisch interventionelle Zytoreduktion (EIZ) 12 2.5.5 Tyrosinkinase-Inhibitoren 13 2.5.6 Antikörper gegen Rezeptortyrosinkinasen 15 2.5.7 Cyclooxigenase-Inhibitoren 16 2.6 Prognose 16 2.7 Zielantigene für die Immunhistochemie 17 2.7.1 Epidermal growth factor receptor (EGFR) 17 2.7.2 Vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) 18 2.7.3 Cyclooxygenase-2 (COX-2) 18 2.7.4 p53 19 2.7.5 Ki-67 19 2.7.6 Aktivierte Caspase-3 20 2.7.7 Survivin 20 2.7.8 E-Cadherin 21 2.7.9 Zytokeratine 21 2.7.10 Vimentin 21 3 HUNDE, MATERIAL UND METHODEN 22 3.1 Patienten 22 3.2 Bioptate und Einschlusskriterien 23 3.3 Kontrolltiere 24 3.4 Immunhistochemische Untersuchungen 25 3.5 Auswertung der immunhistochemischen Reaktionen 28 3.6 Statistische Auswertung 29 4 ERGEBNISSE 31 4.1 Patienten 31 4.1.1 Signalement und Anamnese 31 4.1.2 Einteilung der Patienten in T-Kategorien 33 4.1.3 Histopathologische Befunde 34 4.1.4 Mediane Überlebenszeit nach endoskopisch interventioneller Zytoreduktion 34 4.1.5 Gesunde Kontrollgruppe 35 4.2 Ergebnisse der immunhistochemischen Untersuchungen 37 4.2.1 Kontrollen und Absorptionsreaktionen 37 4.2.2 Epidermal growth factor receptor (EGFR) 37 4.2.3 Vascular endothelial growth factor receptor-2 (VEGFR-2) 40 4.2.4 Cyclooxygenase-2 (COX-2) 42 4.2.5 p53 46 4.2.6 Ki-67 48 4.2.7 Aktivierte Caspase-3 50 4.2.8 Survivin 52 4.2.9 E-Cadherin 55 4.2.10 Zytokeratine 58 4.2.11 Vimentin 58 4.2.12 Bioptate von Tumorrezidiven 60 5 DISKUSSION 62 6 ZUSAMMENFASSUNG 84 7 SUMMARY 86 8 LITERATURVERZEICHNIS 88 9 ANHANG 105 9.1 Übersicht über die Hunde und Bioptate 105 9.2 Ergebnistabellen 107 9.3 Immunhistochemisches Reaktionsprotokoll 120 9.4 Ansatz der Lösungen und Puffer für die Immunhistochemie 122 9.5 Bezugsquellen für Geräte, Einmalartikel, Reagenzien und Chemikalien 123 9.6 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 125

Untersuchung der postprandialen Reaktion gesunder Hunde auf Aloe vera (L.) Burm f. Gel und Coriandrum sativum L. Samen, als mögliche Futterzusatzstoffe im Hinblick auf eine zukünftige Wirksamkeitsprüfung der benannten Stoffe bei diabetischen Tieren.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Arzneipflanzenextrakte als orale Antidiabetika in der Therapie des Diabetes Mellitus 2 2.2 Evaluierte antidiabetogen wirkende Pflanzen bzw. pflanzliche Substanzen 3 2.3 Gattung Aloe L. 5 2.3.1 Allgemeines 5 2.3.2 Aloe vera (L.) Burm. f. 6 2.3.2.1 Aloe vera (L.) Burm. f. Gel 10 2.3.2.2 In klinischen Studien geprüfte antidiabetogene Eigenschaften von A. vera 11 2.3.2.3 Antidiabetogene Eigenschaft von A. vera bei labortierexperimentellen Studien 14 2.3.2.4 Dokumentierte Nebenwirkungen durch A. vera Gel 20 2.4 Gattung Coriandrum L. 21 2.4.1 Allgemeines 21 2.4.2 Coriandrum sativum L. 21 2.4.2.1 Coriandrum sativum L. Samen 23 2.4.2.2 In einer klinischen Studie geprüfte antidiabetogene Eigenschaft von C. sativum 26 2.4.2.3 Antidiabetogene Eigenschaft von C. sativum bei labortierexperimentellen Studien 27 2.4.2.4 Dokumentierte Nebenwirkungen durch C. sativum Samen 31 2.5 Diabetes Mellitus 32 2.5.1 Epidemiologie des Diabetes Mellitus 33 2.5.2 Typ I Diabetes Mellitus 34 2.5.3 Typ II Diabetes Mellitus 35 2.5.4 Andere Diabetes Mellitus Typen 36 2.5.5 Risikofaktor Adipositas 37 2.5.5.1 Adipositas bei Hund und Katze 38 2.5.5.1.1 Epidemiologie von Übergewicht und Fettleibigkeit 38 2.5.5.1.2 Fehlfütterung als Ätiologie der Adipositas 38 2.5.5.1.3 Folgen einer alimentären Adipositas 38 2.5.6 Maßnahmen zur Behandlung und Prävention von Diabetes Mellitus 40 2.5.6.1 Insulin-Therapie 41 2.5.6.2 Diätetik 41 2.5.6.2.1 Einfluss von Fasern 42 2.5.6.2.2 Einfluss von Stärke 42 2.5.6.2.3 Supplementierung von Chrom 43 2.5.6.3 Gewichtsreduzierung 43 2.6 Fragestellung der Arbeit 44 3 Tiere, Material und Methode 45 3.1 Experimentelle Strategie 45 3.2 Tiere des Vorversuchs 45 3.3 Tiere des Hauptversuchs 46 3.4 Haltung 47 3.5 Vorversuch 47 3.6 Hauptversuch 47 3.6.1 Kontrollperiode 48 3.6.2 Behandlungsperiode 48 3.6.3 Washout-Periode 50 3.6.4 Fütterung 50 3.6.5 Extrakte der Arzneipflanzen 52 3.6.5.1 Coriandrum sativum L. Samen 52 3.6.5.2 Aloe vera (L.) Burm. f. Gel 52 3.6.6 Allgemeine klinische Untersuchungen und Gewichtsermittlung 52 3.6.6.1 Allgemeine klinische Untersuchungen 52 3.6.6.2 Gewichtsermittlung 52 3.6.7 Gewinnung und Lagerung der Blutproben 53 3.6.8 Blutuntersuchungen 53 3.6.8.1 Blutchemische Parameter 54 3.7 Chemische Analysen des Futtermittels und Berechnung des Energiegehaltes 55 3.7.1 Futtermittelanalyse nach Weender 55 3.7.2 Bestimmung von Kohlenhydraten 57 3.7.3 Berechnung des Energiegehalts 57 3.7.4 Futterzusammensetzung, Energiebewertung, Trockensubstanz-, Nährstoff- und Energieaufnahme 57 3.8 Statistische Auswertung 57 4 Ergebnisse 59 4.1 Vorverusch 59 4.1.1 Allgemeine klinische Untersuchung 59 4.1.2 Plasmaglukosekonzentrationen im postprandialen Verlauf 59 4.2 Hauptversuch 60 4.2.1 Allgemeine klinische Untersuchung 60 4.2.2 Veränderungen der Nährstoff- und Energieversorgung während der Behandlungsphasen 60 4.2.3 Gewichtsentwicklung während der Versuchsphasen 61 4.2.4 Biochemische Untersuchungen 64 4.2.4.1 Gesamteiweiß, Albumin, Harnstoff und Kreatinin im Blutplasma 64 4.2.4.2 Cholesterin, Triglyceride und Bilirubin im Blutplasma 67 4.2.4.3 Kalium, Natrium und Phosphor im Blutplasma 70 4.2.4.4 Plasmaglukose- und Insulinkonzentrationen 71 4.2.4.5 Enzymaktivitäten 78 5 Diskussion 80 5.1 Versuchsdurchführung 80 5.2 Nährstoff- und Energieversorgung 83 5.3 Einfluss von Coriandrum sativum L. Samen und Aloe vera (L.) Burm f. Gel auf die Gewichtsentwicklung der Hunde 83 5.4 Einfluss von Coriandrum sativum L. Samen und Aloe vera (L.) Burm f. Gel auf die Plasmaglukose- und Insulinkonzentration 84 5.5 Einfluss von Coriandrum sativum L. Samen und Aloe vera (L.) Burm f. Gel auf blutchemische Parameter 88 5.6 Schlussfolgerung 92 6 Zusammenfassung 93 7 Summary 95 8 Literaturverzeichnis 97 / Einleitung: Fettleibigkeit und erhöhte Blutzuckerspiegel sind zwei der relevantesten Prädispositionsfaktoren eines Diabetes Mellitus in der Veterinärmedizin. Aufgrund der Interaktion von Diabetes und Fettleibigkeit umfassen basistherapeutische Maßnahmen unter anderem eine Ernährungsumstellung, Gewichtsreduktion und den Einsatz von oralen, antidiabetogen wirkenden Substanzen. Orale antidiabetogen wirkende Produkte synthethischer Herkunft sind mit mehreren Nebenwirkungen verbunden, weshalb ein primäres Interesse an oralen, antidiabetogen wirkenden Substanzen pflanzlichen Ursprungs existiert. Ziel der Studie: Die vorliegende Arbeit wurde durchgeführt, um die postprandiale Reaktion gesunder Hunde auf Aloe vera (L.) Burm f. Gel und Coriandrum sativum L. Samen als mögliche Futterzusätze zu prüfen. Zukünftig könnte aufgrund dieser Studie die Wirksamkeit der benannten Stoffe an diabetischen Tieren untersucht werden. Material und Methoden: Vier weibliche und fünf männliche gesunde Hunde der Rasse Beagle wurden in zwei unabhängigen Phasen, mit jeweils fünf Wochen (eine Woche Kontrollperiode [Basis-Ration], zwei Wochen Testphase [Basis-Ration + Arzneipflanzenextrakt], zwei Wochen Washout [Basis-Ration]) untersucht. Die pflanzlichen Substanzen wurden in der Testphase 1x täglich, in einer Dosierung von rund 1,8 g/kg KG in die Basis-Ration eingemischt und verabreicht. Die Körpergewichte wurden einmal pro Woche ermittelt; eine allgemeine klinische Untersuchung erfolgte zweimal pro Woche. Glukose- und Insulinkonzentrationen sowie weitere blutchemische Parameter wurden nach der Kontrollperiode und nach der ersten und zweiten Woche der Testperiode bestimmt. Die Körpergewichte der Hunde wurden durch den gepaarten t-test, die blutchemischen Parameter mittels Two-way-ANOVA mit Messwertwiederholungen, die Integrale der Kurven (AUC), die Maximalwerte sowie die Zeit bis zum Maximum mittels One-way-ANOVA mit Messwertwiederholungen analysiert. Die angegeben Werte geben Mittelwerte ± Standardabweichungen wieder. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Ergebnisse: Der Zusatz der pflanzlichen Substanzen zu der Kontrolldiät veränderte weder die Akzeptanz noch die Futteraufnahme der Hunde. Sowohl Aloe vera (L.) Burm. f. Gel als auch Coriandrum sativum L. Samen zeigten innerhalb einer 14-tägigen oralen Verabreichung an die Versuchshunde, mit einer Menge von rund 1,8 g/kg KG keine negativen Auswirkungen auf das klinische Allgemeinbefinden und auf die untersuchten blutchemischen Parameter. Nach der zweiwöchigen Verabreichung von A. vera Gel, stellte sich eine statistisch signifikante (p = 0,003) Körpergewichtsreduktion um 1,4 % im Vergleich zum Ausgangsgewicht ein. Nach der 14-tägigen C. sativum Zufütterung, reduzierte sich das Körpergewicht der Hunde um 0,8 % ohne statistische Signifikanz zu erreichen. Die Fläche unter der Kurve (AUC) der Blutzucker- sowie Insulinkonzentrationen zeigten, nach der 14-tägigen Fütterung von C. sativum Samen, keinen signifikanten Unterschied zur Kontrollperiode. Die Maximalwerte der genannten Parameter erwiesen, nach zwei Wochen C. sativum Samen Verabreichung, keinen eindeutigen Unterschied zu den Maximalwerten der Kontrollkonzentrationen. Die Ergebnisse der Fläche unter der Kurve (AUC) nach der 7-tägigen A. vera Gel Behandlung (Glu: 1813 ± 147 mmol x min/l, Ins: 10434 ± 5393 µU x min/l) wiesen erhöhte Konzentrationen im Vergleich zur Kontrollwoche (Glu: 1709 ± 152 mmol x min/l; Ins: 8264 ± 3358 µU x min/l) auf; für Glukose konnte Signifikanz (p = 0,018) nachgewiesen werden. Nach 14-tägiger A. vera Gabe wurde -ohne das Signifikanzniveau zu erreichen- für die Glukosekonzentration eine Reduzierung und für die Insulinkonzentration eine Erhöhung im Vergleich zu den Werten aus der Kontrollwoche dokumentiert. Die Maximalwerte der beiden Parameter waren nach einwöchiger A. vera Zugabe gegenüber der Kontrolle erhöht. Für Glukose konnte eine Signifikanz (p = 0,045) nachgewiesen werden (Glu: 5,84 ± 0,45 mmol/l vs 5,43 ± 0,39; Ins: 51,6 ± 25,6 µU/ml vs 36,8 ± 10,6 µU/ml). Nach 14-tägiger Zufuhr von A. vera Gel lag die Maximalkonzentration von Glukose mit 5,31 ± 0,38 mmol/l und das Maximum der Insulinwerte mit 39,0 ± 24,0 µU/ml signifikant (p < 0,05) geringer als die Maxima nach der ersten Woche A. vera Zulage, jedoch zeigte sich keine Signifikanz zur Kontrolle. Die weiteren blutchemischen Parameter lagen jederzeit in dem für sie vorgegebenen Referenzbereich; vereinzelt ließen sich signifikante Veränderungen innerhalb dieses Bereiches feststellen. Schlussfolgerung: Grundsätzlich sind, durch die in der vorliegenden Studie am gesunden Hund überprüften Arzneipflanzenextrakte: Aloe vera (L.) Burm. f. Gel und Coriandrum sativum L. Samen, Wirksamkeitsprüfungen der pflanzlichen Zubereitungen bei gesunden als auch diabetischen Hunden vorbereitet. Sowohl das A. vera Gel als auch die C. sativum Samen erwiesen sich beim gesunden Hund als potentielle, die metabolische Situation verbessernde Futterzusätze. Eine mögliche Modifizierung der postprandialen Glukose- und Insulinantwort, scheint vor allem durch den Einsatz von A. vera Gel möglich zu sein. :Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Arzneipflanzenextrakte als orale Antidiabetika in der Therapie des Diabetes Mellitus 2 2.2 Evaluierte antidiabetogen wirkende Pflanzen bzw. pflanzliche Substanzen 3 2.3 Gattung Aloe L. 5 2.3.1 Allgemeines 5 2.3.2 Aloe vera (L.) Burm. f. 6 2.3.2.1 Aloe vera (L.) Burm. f. Gel 10 2.3.2.2 In klinischen Studien geprüfte antidiabetogene Eigenschaften von A. vera 11 2.3.2.3 Antidiabetogene Eigenschaft von A. vera bei labortierexperimentellen Studien 14 2.3.2.4 Dokumentierte Nebenwirkungen durch A. vera Gel 20 2.4 Gattung Coriandrum L. 21 2.4.1 Allgemeines 21 2.4.2 Coriandrum sativum L. 21 2.4.2.1 Coriandrum sativum L. Samen 23 2.4.2.2 In einer klinischen Studie geprüfte antidiabetogene Eigenschaft von C. sativum 26 2.4.2.3 Antidiabetogene Eigenschaft von C. sativum bei labortierexperimentellen Studien 27 2.4.2.4 Dokumentierte Nebenwirkungen durch C. sativum Samen 31 2.5 Diabetes Mellitus 32 2.5.1 Epidemiologie des Diabetes Mellitus 33 2.5.2 Typ I Diabetes Mellitus 34 2.5.3 Typ II Diabetes Mellitus 35 2.5.4 Andere Diabetes Mellitus Typen 36 2.5.5 Risikofaktor Adipositas 37 2.5.5.1 Adipositas bei Hund und Katze 38 2.5.5.1.1 Epidemiologie von Übergewicht und Fettleibigkeit 38 2.5.5.1.2 Fehlfütterung als Ätiologie der Adipositas 38 2.5.5.1.3 Folgen einer alimentären Adipositas 38 2.5.6 Maßnahmen zur Behandlung und Prävention von Diabetes Mellitus 40 2.5.6.1 Insulin-Therapie 41 2.5.6.2 Diätetik 41 2.5.6.2.1 Einfluss von Fasern 42 2.5.6.2.2 Einfluss von Stärke 42 2.5.6.2.3 Supplementierung von Chrom 43 2.5.6.3 Gewichtsreduzierung 43 2.6 Fragestellung der Arbeit 44 3 Tiere, Material und Methode 45 3.1 Experimentelle Strategie 45 3.2 Tiere des Vorversuchs 45 3.3 Tiere des Hauptversuchs 46 3.4 Haltung 47 3.5 Vorversuch 47 3.6 Hauptversuch 47 3.6.1 Kontrollperiode 48 3.6.2 Behandlungsperiode 48 3.6.3 Washout-Periode 50 3.6.4 Fütterung 50 3.6.5 Extrakte der Arzneipflanzen 52 3.6.5.1 Coriandrum sativum L. Samen 52 3.6.5.2 Aloe vera (L.) Burm. f. Gel 52 3.6.6 Allgemeine klinische Untersuchungen und Gewichtsermittlung 52 3.6.6.1 Allgemeine klinische Untersuchungen 52 3.6.6.2 Gewichtsermittlung 52 3.6.7 Gewinnung und Lagerung der Blutproben 53 3.6.8 Blutuntersuchungen 53 3.6.8.1 Blutchemische Parameter 54 3.7 Chemische Analysen des Futtermittels und Berechnung des Energiegehaltes 55 3.7.1 Futtermittelanalyse nach Weender 55 3.7.2 Bestimmung von Kohlenhydraten 57 3.7.3 Berechnung des Energiegehalts 57 3.7.4 Futterzusammensetzung, Energiebewertung, Trockensubstanz-, Nährstoff- und Energieaufnahme 57 3.8 Statistische Auswertung 57 4 Ergebnisse 59 4.1 Vorverusch 59 4.1.1 Allgemeine klinische Untersuchung 59 4.1.2 Plasmaglukosekonzentrationen im postprandialen Verlauf 59 4.2 Hauptversuch 60 4.2.1 Allgemeine klinische Untersuchung 60 4.2.2 Veränderungen der Nährstoff- und Energieversorgung während der Behandlungsphasen 60 4.2.3 Gewichtsentwicklung während der Versuchsphasen 61 4.2.4 Biochemische Untersuchungen 64 4.2.4.1 Gesamteiweiß, Albumin, Harnstoff und Kreatinin im Blutplasma 64 4.2.4.2 Cholesterin, Triglyceride und Bilirubin im Blutplasma 67 4.2.4.3 Kalium, Natrium und Phosphor im Blutplasma 70 4.2.4.4 Plasmaglukose- und Insulinkonzentrationen 71 4.2.4.5 Enzymaktivitäten 78 5 Diskussion 80 5.1 Versuchsdurchführung 80 5.2 Nährstoff- und Energieversorgung 83 5.3 Einfluss von Coriandrum sativum L. Samen und Aloe vera (L.) Burm f. Gel auf die Gewichtsentwicklung der Hunde 83 5.4 Einfluss von Coriandrum sativum L. Samen und Aloe vera (L.) Burm f. Gel auf die Plasmaglukose- und Insulinkonzentration 84 5.5 Einfluss von Coriandrum sativum L. Samen und Aloe vera (L.) Burm f. Gel auf blutchemische Parameter 88 5.6 Schlussfolgerung 92 6 Zusammenfassung 93 7 Summary 95 8 Literaturverzeichnis 97 / Introduction: Adiposity and elevated blood glucose levels are the most significant predisposing factors in veterinary-medicine of developing diabetes mellitus. Due to the relationship between diabetes mellitus and obesity, common preventative and therapeutic methods include dietary change, weight loss, and the use of oral antidiabetic drugs. Oral synthetic antibiabetic agents have well known side effects, thus there is an outstanding importance to find effective antibiabetogenic substances of herbal origin. Aim of the study: The present study was carried out to evaluate the postprandial reaction in healthy dogs after Aloe vera (L.) Burm. f. gel and Coriandrum sativum L. seeds were added to their food, in order to provide insight for potential future research on mentioned plants on diabetic dogs. Materials and methods: Four female and five male healthy beagle dogs were examined in two experimental phases of five weeks (one week of control period [control diet], two weeks of test-period [control diet + herbal preparation], two weeks of washout period [control diet]). The herbal preparations were mixed in with one daily meal during the test-period and administered to the dogs with an average dose of 1.8 g/kg body weight. Glucose (glu), Insulin concentrations (ins) and other blood parameters were assessed after control period, first- and second week of test-period. A general examination was carried out two times per week while bodyweight was measured weekly. Statistical analysis of the bodyweight was carried out with the paired t-test. The blood chemical parameters were analysed by use of two-way ANOVA with repeated measurements. The Area under the curve (AUC), the maximum values and the time to reach maximum value were testet by use of one-way ANOVA with repeated mesaurements. Data were presented as means ± standard deviation. Statistical significance was accepted at p < 0,05.   Results: The addition of herbal preparations to the control diet neither changed palatability nor feed intake. Aloe vera (L.) Burm. f. gel and Coriandrum sativum L. seeds administered in a two-week oral treatment period with an average dosage of 1.8 g/kg body weight had no significant side effects on general conditions and on blood chemical parameters of the experimental dogs. In the case of A. vera Gel, after two weeks a statistically significant (p = 0.003) reduction in body weight of 1.4 % as compared to the initial control weight was observed. In the C. sativum group the body weight decreased by 0.8 % after two weeks of treatment but did not reach the level of statistical significance. The area under the curve (AUC) of blood glucose concentration, as well as insulin concentration, after 14 days of C. sativum seed test period showed no significance compared to the control period. Furthermore, the maximum values of both aforementioned parameters revealed no obvious differences in comparison to the values of control period after the second week of C. sativum feeding. The results of the AUC after 7 days A. vera treatment (glu: 1813 ± 147 mmol x min/l, ins: 10434 ± 5393 µU x min/l) presented higher concentrations compared to the control values (glu: 1709 ± 152 mmol x min/l; ins: 8264 ± 3358µU x min/l), whereas glucose concentration reached statistical significance (p = 0.018). After two weeks of A. vera gel treatment there was a reduction of glucose and a rise of insulin compared to control conditions, however no significance was achieved. The maximum values of both parameters reached higher concentrations after one week of A. vera gel treatment compared to control conditions, with the maximum value of glucose reaching statistical significance (p = 0.045; glu: 5.84 ± 0.45 mmol/l vs 5.43 ± 0.39; ins: 51.6 ± 25.6 µU/ml vs 36.8 ± 10.6 µU/ml). After 14 days of plant intake, the maximum values of glucose and insulin revealed a statistically significant decrease (p < 0.05; glu: 5.31 ± 0.38 mmol/l l, ins: 39.0 ± 24.0 µU/ml) compared to the first week of A. vera feeding, however, no statistically significances results were detected in comparison with the control week. Further parameters of blood chemistry revealed no deviations from the diagnostic reference levels. Sporadic significances within these references occurred. Conclusion: Based on the present investigation of Aloe vera (L.) Burm. f. gel and Coriandrum sativum L. seeds on healthy dogs, efficacy examinations of the herbal preparations on both healthy and diabetic dogs are recommended. Both the A. vera Gel and the C. sativum seeds were proven as potential food additives with positives effects on the metabolic status of an organism. Furthermore, a modifying effect to the postprandial glucose- and insulin-response appears to be possible by feeding A. vera gel.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Arzneipflanzenextrakte als orale Antidiabetika in der Therapie des Diabetes Mellitus 2 2.2 Evaluierte antidiabetogen wirkende Pflanzen bzw. pflanzliche Substanzen 3 2.3 Gattung Aloe L. 5 2.3.1 Allgemeines 5 2.3.2 Aloe vera (L.) Burm. f. 6 2.3.2.1 Aloe vera (L.) Burm. f. Gel 10 2.3.2.2 In klinischen Studien geprüfte antidiabetogene Eigenschaften von A. vera 11 2.3.2.3 Antidiabetogene Eigenschaft von A. vera bei labortierexperimentellen Studien 14 2.3.2.4 Dokumentierte Nebenwirkungen durch A. vera Gel 20 2.4 Gattung Coriandrum L. 21 2.4.1 Allgemeines 21 2.4.2 Coriandrum sativum L. 21 2.4.2.1 Coriandrum sativum L. Samen 23 2.4.2.2 In einer klinischen Studie geprüfte antidiabetogene Eigenschaft von C. sativum 26 2.4.2.3 Antidiabetogene Eigenschaft von C. sativum bei labortierexperimentellen Studien 27 2.4.2.4 Dokumentierte Nebenwirkungen durch C. sativum Samen 31 2.5 Diabetes Mellitus 32 2.5.1 Epidemiologie des Diabetes Mellitus 33 2.5.2 Typ I Diabetes Mellitus 34 2.5.3 Typ II Diabetes Mellitus 35 2.5.4 Andere Diabetes Mellitus Typen 36 2.5.5 Risikofaktor Adipositas 37 2.5.5.1 Adipositas bei Hund und Katze 38 2.5.5.1.1 Epidemiologie von Übergewicht und Fettleibigkeit 38 2.5.5.1.2 Fehlfütterung als Ätiologie der Adipositas 38 2.5.5.1.3 Folgen einer alimentären Adipositas 38 2.5.6 Maßnahmen zur Behandlung und Prävention von Diabetes Mellitus 40 2.5.6.1 Insulin-Therapie 41 2.5.6.2 Diätetik 41 2.5.6.2.1 Einfluss von Fasern 42 2.5.6.2.2 Einfluss von Stärke 42 2.5.6.2.3 Supplementierung von Chrom 43 2.5.6.3 Gewichtsreduzierung 43 2.6 Fragestellung der Arbeit 44 3 Tiere, Material und Methode 45 3.1 Experimentelle Strategie 45 3.2 Tiere des Vorversuchs 45 3.3 Tiere des Hauptversuchs 46 3.4 Haltung 47 3.5 Vorversuch 47 3.6 Hauptversuch 47 3.6.1 Kontrollperiode 48 3.6.2 Behandlungsperiode 48 3.6.3 Washout-Periode 50 3.6.4 Fütterung 50 3.6.5 Extrakte der Arzneipflanzen 52 3.6.5.1 Coriandrum sativum L. Samen 52 3.6.5.2 Aloe vera (L.) Burm. f. Gel 52 3.6.6 Allgemeine klinische Untersuchungen und Gewichtsermittlung 52 3.6.6.1 Allgemeine klinische Untersuchungen 52 3.6.6.2 Gewichtsermittlung 52 3.6.7 Gewinnung und Lagerung der Blutproben 53 3.6.8 Blutuntersuchungen 53 3.6.8.1 Blutchemische Parameter 54 3.7 Chemische Analysen des Futtermittels und Berechnung des Energiegehaltes 55 3.7.1 Futtermittelanalyse nach Weender 55 3.7.2 Bestimmung von Kohlenhydraten 57 3.7.3 Berechnung des Energiegehalts 57 3.7.4 Futterzusammensetzung, Energiebewertung, Trockensubstanz-, Nährstoff- und Energieaufnahme 57 3.8 Statistische Auswertung 57 4 Ergebnisse 59 4.1 Vorverusch 59 4.1.1 Allgemeine klinische Untersuchung 59 4.1.2 Plasmaglukosekonzentrationen im postprandialen Verlauf 59 4.2 Hauptversuch 60 4.2.1 Allgemeine klinische Untersuchung 60 4.2.2 Veränderungen der Nährstoff- und Energieversorgung während der Behandlungsphasen 60 4.2.3 Gewichtsentwicklung während der Versuchsphasen 61 4.2.4 Biochemische Untersuchungen 64 4.2.4.1 Gesamteiweiß, Albumin, Harnstoff und Kreatinin im Blutplasma 64 4.2.4.2 Cholesterin, Triglyceride und Bilirubin im Blutplasma 67 4.2.4.3 Kalium, Natrium und Phosphor im Blutplasma 70 4.2.4.4 Plasmaglukose- und Insulinkonzentrationen 71 4.2.4.5 Enzymaktivitäten 78 5 Diskussion 80 5.1 Versuchsdurchführung 80 5.2 Nährstoff- und Energieversorgung 83 5.3 Einfluss von Coriandrum sativum L. Samen und Aloe vera (L.) Burm f. Gel auf die Gewichtsentwicklung der Hunde 83 5.4 Einfluss von Coriandrum sativum L. Samen und Aloe vera (L.) Burm f. Gel auf die Plasmaglukose- und Insulinkonzentration 84 5.5 Einfluss von Coriandrum sativum L. Samen und Aloe vera (L.) Burm f. Gel auf blutchemische Parameter 88 5.6 Schlussfolgerung 92 6 Zusammenfassung 93 7 Summary 95 8 Literaturverzeichnis 97

Einleitung: Osteoarthrose (OA) ist eine der häufigsten muskuloskelettalen Erkrankungen beim Hund und wird definiert durch einen fortschreitenden Verlust der Knorpelschicht auf den Gelenksflächen. Therapeutika erster Wahl, wie nichtsteroidale Antiphlogistika, wirken rein palliativ und haben insbesondere bei der Langzeitgabe schädliche Nebenwirkungen. Bei der Suche nach Alternativen rückten Ergänzungsfuttermittel in den Focus der Forschung. Dabei zeigten mehreren Studien, dass eine Fütterung von Fischöl die klinischen Symptome von OA bei Hunden verbessert. Der dahinterliegende Wirkmechanismus ist jedoch beim Hund nicht erforscht. Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Studie war demnach, den genauen Wirkmechanismus von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFA) auf ausgewählte Schlüsselfaktoren der Knorpeldegeneration in einem Modellsystem der caninen OA zu untersuchen. Material und Methoden: Wir etablierten ein Protokoll zur Isolierung von caninen Chondrozyten, kultivierten die Zellen erfolgreich bis zur Konfluenz und kryokonservierten sie für die weiteren Versuche. Um die Ansprechbarkeit der Zellen auf verschiedene Zytokine zu untersuchen, wurden die Zellen über 24 h mit 10 ng/ml Interleukin‑1β (IL‑1β) und mit 1 bis 10 ng/ml Transforming Growth Faktor‑β (TGF‑β) stimuliert und die Genexpression von Matrixproteinasen, induzierbarer Stickstoffmonoxid Synthase (iNOS) und Cyclooxygenase‑2 (COX‑2) sowie die Produktion von Stickstoffmonoxid (NO) und Prostaglandin E (PGE) gemessen (4 Spender, N=3). Auf Basis des etablierten Models wurden in einer zweiten Versuchsreihe die Zellen über 6 Tage mit n-3 Eicosapentaensäure (EPA), n-3 Docosahexaensäure (DHA) oder n-6 Arachidonsäure (AA) kultiviert und anschließend über 48 h mit IL‑1β stimuliert. Die Veränderung der IL‑induzierte Genexpression von Matrixproteinasen, iNOS und COX‑2 sowie die Produktion von PGE und NO unter Einfluss der Fettsäuren wurde analysiert (6 Spender, N=4). Darüber hinaus wurde die Fettsäureaufnahme und der Fettsäuremetabolismus via Gaschromatographie überprüft. Um die Wirkungen der Fettsäuren und Stimulantien zu verifizieren, wurden die Daten einer zweifachen Varianzanalyse (AV) unterzogen. Bei signifikanten Einflüssen der Faktoren folgte ein Post-hoc-Test (Dunnett’s Test für die PUFA bzw. ein Bonferroni Test für die Stimulanzien). Die Signifikanzniveaus für AV- und die Post-hoc Tests wurden auf α = 0,01 eingestellt. Ergebnisse: Unter der Stimulation mit IL‑1β kam es zu einem signifikanten Anstieg von degenerativen und entzündlichen Markern. Das Muster der Marker entsprach dabei dem Muster, welches unter natürlichen Bedingungen in erkrankten Gelenken vorzufinden ist. Somit haben wir ein simples und dennoch repräsentatives Modell für die canine OA etabliert. Im Gegensatz zu IL‑1β reduzierte TGF‑β konzentrationsabhängig signifikant den von IL‑1β induzierten Anstieg der inflammatorischen Marker und stellt sich somit als Gegenspieler zu diesem proinflammatorischen Zytokin dar. Die gegensätzliche Antwort der Zellen auf beide Zytokine bewies, dass die Chondrozyten in unserem Modell Charakteristika von differenzierten Zellen aufweisen. Alle Fettsäuren wurden konzentrationsabhängig in die Zellen aufgenommen und metabolisiert. EPA reduzierte die IL‑induzierte Expression von iNOS und die damit im Zusammenhang stehende Produktion von NO signifikant. AA reduzierte ebenfalls iNOS und NO und außerdem die Expression von Matrixmetalloproteinase‑3 signifikant. Auf der anderen Seite steigerte AA signifikant die Produktion von PGE und die Expression von Aggrecanase ADAMTS‑5. DHA hatte auf keinen der untersuchten Marker einen Effekt. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend bestätigen die Ergebnisse dieser Studie die in Fütterungsversuchen dokumentierte positive Wirkung von n-3 PUFAs bei der caninen OA und bieten zudem eine Erklärung für die dahinterliegenden Mechanismen. Hervorzuheben ist, dass in dieser Studie nicht nur EPA, sondern auch AA eine positive Wirkung auf einzelne Marker erzielen. EPA scheint von allen untersuchten Fettsäuren die höchste Effektivität zu haben. Eine geringe Dosis an Fettsäuren über einen längeren Zeitraum führte nicht zu einer Akkumulation der Fettsäuren und hatte daher auf einige untersuchte Marker nur eine geringe Wirkung. Insgesamt lässt sich schlussfolgern, dass eine ausreichende Menge und ausgewogenes Verhältnis von n‑3 und n‑6 PUFA als unterstützende Therapie bei chronischen Gelenkserkrankungen beim Hund von großer Wichtigkeit ist. Besonders ein hoher Gehalt an EPA scheint dabei eine hohe Bedeutung für die Effektivität zu haben.:INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Physiologie und Anatomie des hyalinen Knorpels 3 2.1.1 Feinstruktur des Gewebes 3 2.1.2 Bedeutung der Chondrozyten 4 2.1.3 Aufbau der Extrazellulären Matrix (ECM) 5 2.2 Osteoarthrose (OA) 6 2.2.1 Pathogenese 6 2.2.1.1 Kausale Pathogenese 6 2.2.1.2 Formale Pathogenese 7 2.2.2 Die Rolle der Zytokine 9 2.2.2.1 Interleukin-1β (IL-1β) 9 2.2.2.2 Transforming Growth Factor-β (TGF-β) 10 2.2.3 Rolle der Matrixproteinasen MMP und ADAMTS 12 2.2.4 Rolle der Entzündungsmediatoren 14 2.2.4.1 Stickstoffmonoxid (NO) 14 2.2.4.2 Prostaglandin E2 (PGE2) 15 2.3 Zellkulturmodelle für OA 16 2.4 Die canine OA 17 2.4.1 Ätiologie und Diagnose 17 2.4.2 Therapieansätze in der caninen OA 18 2.5 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) als Ergänzungsfuttermittel 20 2.5.1 Grundlagen des Fettsäurestoffwechsels 20 2.5.2 Fettsäurestoffwechsel im Knorpelgewebe 21 2.5.3 n-3 PUFAs als Therapieoption bei caniner OA 22 3 Ziel der Arbeit 25 4 Ergebnisse 26 4.1 Publikation 1 26 4.2 Publikation 2 36 5 Diskussion 47 5.1 Isolation und Anzucht von caninen Chondrozyten 47 5.2 IL-stimulierte canine Chondrozyten als Osteoarthrosemodell 51 5.3 TGF‑β als Gegenspieler von IL-1β 52 5.4 Fettsäuremetabolismus der Chondrozyten 54 5.5 Fettsäuren als Therapieoption bei der caninen OA 59 6 Schlussfolgerung 65 7 Zusammenfassung 66 8 Summary 68 9 Literaturverzeichnis 70 10 Danksagung 90 / Introduction: Osteoarthrosis (OA) is one of the most common musculoskeletal diseases in dogs and is defined by the progressive loss of the protective joint cartilage layer. First-choice treatments, like nonsteroidal anti-inflammatory drugs, act palliative only and are known to have harmful side effects especially in long-term usage. The urge to find alternative treatments moved nutraceuticals into the focus of research. In multiple trials, feeding fish oil improved the clinical symptoms of osteoarthritis in dogs. However, the underlying molecular mechanisms have not been investigated in dogs. Aim of the Study: The aim of this study was therefore to further clarify how polyunsaturated fatty acids affect key factors of cartilage degeneration in a cell culture model for canine OA. Materials and methods: We established a protocol for the isolation of canine chondrocytes, cultivated them successfully until confluency and cryoconservated them for further experiments. To examine the response of the cells to different cytokines, cells were stimulated for 24 h with 10 ng/ml Interleukin‑1β (IL‑1β) or 1 to 10 ng/ml Transforming Growth Factor‑β (TGF‑β). The gene expression of matrix proteinases, inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxygenase‑2 (COX‑2), the production of nitric oxide (NO) and prostaglandin E (PGE) were measured (4 donors, N=3). Using the established model, cells in the second trial were incubated with eicosapentaenoic acid (EPA), docosahexaenoic acid (DHA) and arachidonic acid (AA) for 6 days and subsequently stimulated with IL‑1β for another 48 h. The change in IL‑induced gene expression of matrix proteinases, iNOS and COX‑2 as well as the production of NO and PGE under the influence of n‑3 EPA, n‑3 DHA and n‑6 AA was analysed (6 donors, N=4). To verify the effects of the fatty acids and the stimulants, data were analysed with a two‑factorial analysis of variance (ANOVA). When there was a significant effect of the factors, a post-hoc test was performed (Dunnett’s test for PUFA, Bonferroni test for stimulants). Significance level for ANOVA- and the post hoc test was set at α = 0.01. Results: Stimulation with IL-1β led to a significant increase of degenerative and inflammatory markers. This pattern of responsiveness was comparable to the events in naturally occurring OA. We therefore have established a simple yet representative model for canine OA. In contrast to IL‑1β, TGF‑β significantly decreased the IL‑induced inflammatory markers in a dose-dependent manner and therefore could counteract IL‑1β. The response of the cells to the cytokines indicates, that in our model, the chondrocytes have characteristics of differentiated cells. All fatty acids were incorporated in a dose-dependent manner and metabolized. EPA decreased the IL-induced gene expression of iNOS and reduced the concomitant production of NO significantly. AA also decreased iNOS and NO significantly and downregulated the gene expression of matrix metalloproteinase‑3 significantly. On the other hand, AA significantly increased the production of PGE and the gene expression of the aggrecanase ADAMTS‑5. DHA had no effect on any of the markers. Conclusions: Taking together, the results of this study add further weight to the beneficial effect of n‑3 PUFAs in canine OA and furthermore provide an explanation for the underlying mechanism. It is of importance, that not only the n‑3 fatty acid EPA but also the n‑6 fatty acid AA could provide beneficial effects on several markers. EPA seems to be the most effective of all fatty acids included in this study. A low concentration of fatty acids over a long period of time did not lead to an accumulation of fatty acids and therefore had a rather small impact on some of the investigated markers. Therefore, an optimal ratio between n‑3 and n‑6 and the adequate amount of fatty acids seems to be of high importance when treating chronic degenerative joint disease in dogs. However, a high content of EPA seems to be particularly effective.:INHALTSVERZEICHNIS 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Physiologie und Anatomie des hyalinen Knorpels 3 2.1.1 Feinstruktur des Gewebes 3 2.1.2 Bedeutung der Chondrozyten 4 2.1.3 Aufbau der Extrazellulären Matrix (ECM) 5 2.2 Osteoarthrose (OA) 6 2.2.1 Pathogenese 6 2.2.1.1 Kausale Pathogenese 6 2.2.1.2 Formale Pathogenese 7 2.2.2 Die Rolle der Zytokine 9 2.2.2.1 Interleukin-1β (IL-1β) 9 2.2.2.2 Transforming Growth Factor-β (TGF-β) 10 2.2.3 Rolle der Matrixproteinasen MMP und ADAMTS 12 2.2.4 Rolle der Entzündungsmediatoren 14 2.2.4.1 Stickstoffmonoxid (NO) 14 2.2.4.2 Prostaglandin E2 (PGE2) 15 2.3 Zellkulturmodelle für OA 16 2.4 Die canine OA 17 2.4.1 Ätiologie und Diagnose 17 2.4.2 Therapieansätze in der caninen OA 18 2.5 Mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFAs) als Ergänzungsfuttermittel 20 2.5.1 Grundlagen des Fettsäurestoffwechsels 20 2.5.2 Fettsäurestoffwechsel im Knorpelgewebe 21 2.5.3 n-3 PUFAs als Therapieoption bei caniner OA 22 3 Ziel der Arbeit 25 4 Ergebnisse 26 4.1 Publikation 1 26 4.2 Publikation 2 36 5 Diskussion 47 5.1 Isolation und Anzucht von caninen Chondrozyten 47 5.2 IL-stimulierte canine Chondrozyten als Osteoarthrosemodell 51 5.3 TGF‑β als Gegenspieler von IL-1β 52 5.4 Fettsäuremetabolismus der Chondrozyten 54 5.5 Fettsäuren als Therapieoption bei der caninen OA 59 6 Schlussfolgerung 65 7 Zusammenfassung 66 8 Summary 68 9 Literaturverzeichnis 70 10 Danksagung 90

Einleitung: Die oberflächliche Beugesehne (OBS) ist die am häufigsten verletzte Struktur des Bewegungsapparates von Pferden. Verletzungen der OBS verursachen ökonomische Einbußen im Pferdesport, sind unter Tierschutzaspekten hochrelevant und sind gekennzeichnet von langen Rekonvaleszenzzeiten von 9--18 Monaten und einer Wiederverletzungsrate von bis zu 80 %. Um Sehnenverletzungen, deren Heilung und den Therapieerfolg zu detektieren, bedarf es grundlegender Kenntnisse der Sehnenbiomechanik. Zur Anwendung kommende Messmethoden sollten idealerweise hochpräzise, minimalinvasiv und über einen längeren Zeitraum einsetzbar sein. Bislang etablierte Methoden genügen diesen Ansprüchen nur teilweise. Daher soll biplanare Hochfrequenz-Fluoreszenz-Kinematografie (FluoKin) als aktueller Goldstandard für Bewegungsstudien auf ihren Einsatz an equinen Sehnengewebe geprüft werden. Ziele der Untersuchungen waren es daher, 1) die Messgenauigkeit von FluoKin zu bestimmen und hinsichtlich Dehnbarkeitsmessungen equiner OBS zu evaluieren, 2) eine Technik zur Nutzung von FluoKin (3D-Röntgenmethode) zu finden, um die Bewegung eines Weichteilgewebes im Röntgenvideo zu visualisieren, 3) diese Methodik in zyklischen Zugprüfversuchen mit gesunden und Kollagenase-geschädigten OBS ex vivo zu prüfen und dafür eine geeignete Haltevorrichtung für die Sehnen zu entwickeln, 4) in einem Pilotversuch die Technik in vivo zu übertragen und in wiederkehrenden Messserien die Dehnung von gesundem, verletztem und heilendem Sehnengewebe zu messen. Tiere, Material und Methoden: Die Präzisionsmessungen wurden mit einem maßgefertigten Testplättchen und einer gefrorenen distalen Vordergliedmaße (VGlm) jeweils statisch (1976 und 5473 Bilder) und in Bewegung (2816 und 5021 Bilder) durchgeführt. Die Sehnenhaltevorrichtung inkl. Kryo-Klemme wurde neben dem Einsatz in der Ex-vivo-Studie zusätzlich Langzeittests (bis 50 min) und Rupturversuchen bis 10 kN (Maschinenlimit) unterzogen. Im Rahmen der Ex-vivo-Zugprüfversuche wurden 13 OBS von VGlm in Schritt (2 %)- und Trab (4 %)-simulierender Dehnung zyklisch getestet. Vier weitere Proben wurden mit Kollagenase inkubiert und inkl. einer Kontrollgruppe (n=4) bei 6 % getestet. Die biomechanischen Kenngrößen wurden von der Zugprüfmaschine erfasst und anhand der Bewegung von implantierten, röntgendichten Markern in zeitgleich aufgenommenen FluoKin-Videos errechnet. In der In-vivo-Langzeitstudie (37 Wochen) wurde in vier FluoKin-Messungen das Dehnverhalten der OBS beider VGlm eines Shetland Ponys in Schritt und Trab ermittelt. Vor der zweiten FluoKin-Messung wurde im mittleren metakarpalen Segment einer OBS eine Sehnenläsion mit Kollagenase induziert, deren Heilungsverlauf verfolgt wurde. Die Ergebnisbeschreibung erfolgte sowohl deskriptiv als auch bei entsprechender Stichprobengröße mit t-Tests (p<0,05). Ergebnisse: In Präzisionsmessungen wurden sowohl die Messgenauigkeit der FluoKin-Anlage (max. Exaktheit von 0,0287 mm ± 0,0377 mm), als auch die zu erwartende Standardabweichung in der studienrelevanten Region (Os metacarpale III, OBS) ermittelt. Im Rahmen der Ex-vivo-Zugprüfversuche wurde eine Haltevorrichtung inkl. Kryo-Klemme für equine OBS entwickelt, welche Probleme herkömmlicher Einspanntechniken zuverlässig löst. Erstmals konnten biomechanische Kenngrößen für die OBS von Shetland Ponys ermittelt werden. Im Mittel konnten abhängig von der Dehnungsrate (simulierter Schritt und Trab) eine Maximalkraft von 325 bzw. 953 N, eine Zugfestigkeit von 1649 bzw. 4820 N/cm² und ein Elastizitätsmodul von 828 bzw. 1212 MPa verzeichnet werden. Nach Inkubation mit Kollagenase stieg die Längenänderung im Mittel um 4,87 %. In vivo konnte die Dehnungszunahme der geschädigten OBS im Schritt bestätigt werden (2,86 % auf 3,38 %); im Trab zeigte sich hingegen ein Abfall (6,78 % auf 5,96 %). Schlussfolgerungen: FluoKin wurde als hochpräzise und minimalinvasive Messtechnik zur Ermittlung der Sehnendehnung equiner OBS ex vivo und erstmals in vivo erfolgreich eingesetzt. Dank der neu entwickelten Haltevorrichtung inkl. Kryo-Klemme konnten langandauernde Ex-vivo-Zugprüfversuche durchgeführt werden. Hierbei zeigten sich Änderungen des Dehnverhaltens der OBS (Konditionierung, Hysterese, Kriechphänomen), was die Notwendigkeit solcher Versuche für die Beschreibung des biomechanischen Verhaltens von Sehnen verdeutlicht. Der In-vivo-Pilotversuch unterstreicht die Bedeutung von FluoKin für innovatives und hochpräzises Monitoring von Sehnenläsionen in Langzeitstudien.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Sehnengewebe 2.1.1 Histologischer und molekularer Aufbau 2.1.2 Biomechanik 2.1.3 Einflüsse auf die Sehnenstruktur und -zusammensetzung 2.2 Tendinopathien der oberflächlichen Beugesehne 2.2.1 Ätiologie 2.2.2 Heilung 2.3 Möglichkeiten zur Bestimmung der Sehnendehnbarkeit 2.3.1 Ex-vivo-Zugprüfversuche mit Sehnen 2.3.2 In-vivo-Ermittlung der Sehnendehnbarkeit 2.4 Zentrale Fragestellungen 3 Publikation 1 Zyklische Zugprüfversuche mit einer neuartigen Kryo-Klemme an oberflächlichen Beugesehnen von Shetland Ponys kombiniert mit biplanarer Hochfrequenz-Fluoreszenz-Kinematografie 4 Publikation 2 Biplanare Hochfrequenz-Fluoreszenz-Kinematografie an der oberflächlichen Beugesehne eines Shetland Ponys – eine In-vivo-Pilotstudie 5 Diskussion 5.1 Diskussion von Material und Methoden 5.1.1 Ermittlung der Messgenauigkeit von FluoKin 5.1.2 Verwendetes Tiermaterial 5.1.3 Implantationstechnik für Sehnenmarker 5.1.4 Aufbau der Ex-vivo-Zugprüfversuche 5.2 Bestimmung der Sehnendehnbarkeit mit FluoKin 5.2.1 Sehnendehnung ex vivo und in vivo in nativem Sehnengewebe 5.2.2 Sehnendehnung ex vivo und in vivo in Kollagenase-geschädigtem Sehnengewebe 5.3 Schlussfolgerungen und Ausblick 5.3.1 Praktische und klinische Relevanz 5.3.2 Fazit und Perspektiven 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Bauplan des Messplättchens zur Genauigkeitsbestimmung von FluoKin 9.2 Baupläne der Einspanntechnik für Zugprüfversuche mit equinen OBS 9.2.1 Kronbeinhalterung 9.2.2 Kryo-Klemmen 9.3 Genauigkeit von biplanaren Fluoroskopie-Systemen in Abhängigkeit des Versuchsaufbaus 9.4 Lagerungseinflüsse auf biomechanische Eigenschaften von Sehnengewebe 9.5 Vorträge und Präsentationen während der Doktorarbeitszeit / Introduction: The superficial digital flexor tendon (SDFT) is the most frequently injured structure of the musculoskeletal system of horses. Injuries of the SDFT are relevant under animal welfare aspects, cause substantial economic losses in equestrian sport and are associated by long convalescence times of 9 to 18 months and a re-injury rate of up to 80 %. In order to detect tendon injuries, improve their healing and the success of therapy, fundamental knowledge of tendon biomechanics is required. The measurement methods to be used should ideally be highly precise, minimally invasive and applicable over a long period of time. So far, established methods only partially meet these requirements. Therefore, biplanar high-speed fluoroscopic kinematography (FluoKin) as the current gold standard for movement studies will be tested for its use on equine tendon tissue Aims of the study were therefore 1) to determine the measurement accuracy and precision of FluoKin and to evaluate it with regard to measurements on the equine SDFT, 2) to find a technique for using FluoKin (a 3D X-ray method) for visualizing the movement of a soft tissue in X-ray video, 3) to test this methodology in cyclic tensile tests with healthy and collagenase-incubated SDFT ex vivo and to develop a suitable holding device for the tendons in the testing machine, 4) to transfer the technique in an in vivo pilot study on a pony and to measure the elongation of healthy, injured and healing tendon tissue in measurement series. Materials and Methods: Precision measurements were performed with a custom-made test sheet and a frozen distal forelimb static (1976 and 5473 frames) and in motion (2816 and 5021 frames) resp. The tendon holding device with a cryo-clamp was subjected to long-term cyclic tests (up to 50 min) and rupture tests up to 10 kN (machine limit) in addition to its use in the ex vivo study. As part of the ex vivo tensile testing, 13 SDFT of forelimbs were cyclically tested in walk (2 % strain) and trot (4 % strain) simulated elongation. Four additional specimens were incubated with collagenase and tested including a control group (n=4) at 6 % strain. Biomechanical parameters were recorded by the testing machine and calculated from the movement of implanted radiopaque markers in simultaneously recorded FluoKin videos. In the in vivo long-term study (37 weeks) the strain behaviour of the SDFT of both forelimbs of a Shetland pony at walk and trot were determined in four FluoKin measurements. Before the second FluoKin measurement, a tendon lesion was induced with collagenase in the mid-metacarpal segment of one SDFT, and its healing process was monitored. The description of the results was done both descriptively and, with an appropriate sample size, with t-tests (p<0.05). Results: Measurements to assess the precision of both the FluoKin system (max. accuracy of 0.0287 mm ± 0.0377 mm) and the standard deviation to be expected in the region relevant to the study (Os metacarpale III, SDFT). For the ex vivo tensile tests, a holding device with a cryo-clamp for equine SDFT was developed that reliably solved problems of conventional clamping techniques. For the first time, biomechanical parameters for the SDFT of Shetland ponies could be determined. On average, depending on the strain rate (simulated walk and trot), a maximum force of 325 N and 953 N resp., a tensile strength of 1649 N/cm² and 4820 N/cm² resp. and a modulus of elasticity of 828 MPa and 1212 MPa resp. was recorded. After incubation with collagenase, the change in length increased by an average of 4.87 %. In vivo, this increased elongation of the collagenase-injured SDFT could be confirmed at walk (2.86 % to 3.38 %); in contrast, a decrease in strain was observed at trot (6.78 % to 5.96 %). Conclusions: FluoKin was successfully used as a highly precise and minimally invasive measurement technique to determine the tendon strain of equine SDFT ex vivo and for the first time also in vivo. Thanks to the newly developed holding device with a cryo-clamp, long-term ex vivo tensile tests could be carried out and changes in the strain behaviour of the SDFT became apparent (conditioning, hysteresis, creep). This shows the necessity of such tests for the description of the biomechanical behaviour of tendons. The in vivo pilot study underlines the importance of FluoKin for innovative and highly accurate monitoring of tendon lesions in long-term studies.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Sehnengewebe 2.1.1 Histologischer und molekularer Aufbau 2.1.2 Biomechanik 2.1.3 Einflüsse auf die Sehnenstruktur und -zusammensetzung 2.2 Tendinopathien der oberflächlichen Beugesehne 2.2.1 Ätiologie 2.2.2 Heilung 2.3 Möglichkeiten zur Bestimmung der Sehnendehnbarkeit 2.3.1 Ex-vivo-Zugprüfversuche mit Sehnen 2.3.2 In-vivo-Ermittlung der Sehnendehnbarkeit 2.4 Zentrale Fragestellungen 3 Publikation 1 Zyklische Zugprüfversuche mit einer neuartigen Kryo-Klemme an oberflächlichen Beugesehnen von Shetland Ponys kombiniert mit biplanarer Hochfrequenz-Fluoreszenz-Kinematografie 4 Publikation 2 Biplanare Hochfrequenz-Fluoreszenz-Kinematografie an der oberflächlichen Beugesehne eines Shetland Ponys – eine In-vivo-Pilotstudie 5 Diskussion 5.1 Diskussion von Material und Methoden 5.1.1 Ermittlung der Messgenauigkeit von FluoKin 5.1.2 Verwendetes Tiermaterial 5.1.3 Implantationstechnik für Sehnenmarker 5.1.4 Aufbau der Ex-vivo-Zugprüfversuche 5.2 Bestimmung der Sehnendehnbarkeit mit FluoKin 5.2.1 Sehnendehnung ex vivo und in vivo in nativem Sehnengewebe 5.2.2 Sehnendehnung ex vivo und in vivo in Kollagenase-geschädigtem Sehnengewebe 5.3 Schlussfolgerungen und Ausblick 5.3.1 Praktische und klinische Relevanz 5.3.2 Fazit und Perspektiven 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Bauplan des Messplättchens zur Genauigkeitsbestimmung von FluoKin 9.2 Baupläne der Einspanntechnik für Zugprüfversuche mit equinen OBS 9.2.1 Kronbeinhalterung 9.2.2 Kryo-Klemmen 9.3 Genauigkeit von biplanaren Fluoroskopie-Systemen in Abhängigkeit des Versuchsaufbaus 9.4 Lagerungseinflüsse auf biomechanische Eigenschaften von Sehnengewebe 9.5 Vorträge und Präsentationen während der Doktorarbeitszeit

Im Rahmen dieser Dissertation wurden anhand eines Ferkelmodells (8-15kg Schweine, 5 Gruppen: „nicht pulsatile HLM“: n=9, „Minozyklin+HLM“: n= 6, „pulsatile HLM“: n=7, „Minozyklin-Kontrolle: n=6, „Kontrolle“: n=8) während einer 120-minütigen extrakorporaler Zirkulation (EKZ) und einer darauffolgenden 90-minütigen Rekonvaleszenzzeit der physikalische Einflussfaktor des pulsatilen Flusses sowie der pharmakologische Effekt von Minozyklin auf die Niere jeweils unabhängig voneinander untersucht. In allen Gruppen wurden HE-Färbungen sowie immunhistochemische Färbungen (HIF-1-α, 3-Nitrotyrosin, PAR, AIF) durchgeführt um pathologische Veränderungen auf zellulärer Ebene zu detektieren. Zusätzlich wurden energiereiche Phosphate und ihre Abbauprodukte mittels High Pressure/Performance Liquid Chromatography (HPLC) bestimmt. Zur Beurteilung der klinischen Funktion der Niere wurden nierenspezifische Blutwerte (Serumkreatinin, Serumharnstoff) und Laktat im arteriellen Blut bestimmt. Mit der pulsatilen Perfusion konnte ein Abfall des O2-Partialdruckes nicht verhindert werden (HIF-1-α), allerdings konnte die ATP-Konzentration aufrecht erhalten werden. Dies spricht dafür, dass die pulsatile Perfusion im Gegensatz zu der nicht pulsatilen Perfusion keinen relevanten O2-Mangel verursachte. Auch die Ergebnisse der Nitrotyrosin-3-Auswertung zeigen, dass die Bildung von Peroxynitrit reduziert und somit der nitrosative Stress auf die Zellen begrenzt wurde. Die DNA wurde jedoch unabhängig vom gewählten Blutflussprofil geschädigt (PAR). Auch anhand der nierenspezifischen Blutparameter (Serumkreatinin, Serumharnstoff) ließ sich eine postoperative Beeinträchtigung der Nierenfunktion feststellen. Im Vergleich zu der nicht pulsatilen EKZ war hier jedoch eine geringfügige Verbesserung zu erkennen (Serumkreatinin). Zusammenfassend kann gesagt werden, dass durch die pulsatile EKZ der Grad der Ischämie beeinflusst werden konnte, allerdings waren insgesamt keine wesentlich positiven Auswirkungen auf zellulärer Ebene und auf die postoperative Nierenfunktion festzustellen. Der Einsatz des technisch anspruchsvollen pulsatilen Perfusionssystems scheint daher in Bezug auf die Niere in der routinemäßigen Herzchirurgie nicht unbedingt erforderlich zu sein. Durch die Gabe von Minozyklin wurde zwar der Grad der Ischämie (HIF-1-α, ATP) nicht beeinflusst, allerdings konnte Minozyklin durch seine antioxidativen bzw. antinitrosativen (3-Nitrotyrosin), PARP-1-hemmenden (PAR) sowie antiapoptotischen (AIF) Wirkmechanismen die Niere offenbar vor den Folgen einer Ischämie schützen. Anhand der nierenspezifischen Blutwerte (Serumkreatinin, Serumharnstoff) wurde erkenntlich, dass Minozyklin die Nierenfunktion positiv beeinflusst, was wiederum die histologischen Befunde bestätigt. Für die Humanmedizin ist somit der Einsatz von Minozyklin während der EKZ eine Möglichkeit die Auswirkungen des Ischämie/Reperfusionsschadens und deren klinische Folgen hinsichtlich der Niere zu begrenzen. Allerdings muss berücksichtigt werden, dass der einmalige Einsatz eines Antibiotikums auch negativen Einfluss auf den Körper ausübt (Resistenzentwicklung, Nebenwirkungen), sodass Minozyklin aufgrund der in dieser Versuchsreihe gezeigten positiven Eigenschaften, insbesondere die PARP-1-Inhibition, lediglich als Modellsubstanz für Weiterentwicklungen genutzt werden kann.

Bösartiges Katarrhalfieber ist eine unheilbare Virusinfektion bei Paarhufern, die wiederholt in zoologischen Gärten auftrat, ohne dass die erkrankten Fehlwirte Kontakt zu Reservoirwirten hatten. Die BKF-auslösenden Gammaherpesviren sind eng miteinander verwandt und werden von verschiedenen klinisch gesunden Reservoirwirten latent beherbergt und ausgeschieden. Einige dieser Reservoirwirte sind seit längerem bekannt, andere wurden erst kürzlich identifiziert und es wird vermutet, dass es noch weitere unerkannte Reservoirwirte für BKF-Viren gibt. Hervorzuheben ist, dass die Viren normalerweise eng an ihre Reservoirwirte gebunden sind. Es traten in letzter Zeit jedoch immer wieder Fälle auf, in denen auch Fehlwirte zwar infiziert waren, aber nicht erkrankten oder das Virus sogar ausschieden. Der Zusammenhang zwischen dem Verhalten der BKF-Viren bei Fehl- und Reservoirwirten und den ungeklärten BKF-Fällen in zoologischen Gärten wurde in der hier vorliegenden Studie näher untersucht. Es sollte herausgefunden werden, ob Wildwiederkäuer, die bisher nicht als Reservoirwirte für BKF-Viren galten, diese Viren ausscheiden und so möglicherweise für die oben erwähnten BKF-Fälle verantwortlich waren. / Malignant catarrhal fever (MCF) is an incurable infectious disease in even-toed ungulates, which occurred repeatedly in zoological gardens in Europe without any contact between known hosts and animals with clinical MCF. The causative agents are closely related viruses of the family gamma-herpesviridae, which are latently carried and shed by different clinically healthy ruminant species. Some of the hosts for MCF viruses have been known for many years, while others have been identified only recently. Yet, there are probably still more host species to be discovered. It has to be pointed out that generally MCF viruses are strictly associated with their hosts. However, it has been reported that known susceptible species were infected with MCF viruses without showing any signs of MCF, some of which even excreted the virus. This present study investigates the relationship between the behaviour of MCF viruses in hosts and susceptible species and the nebulous cases of MCF in zoological gardens. The goal was to determine whether wild ruminants, which are normally not known as hosts for MCF, shed these viruses and are possibly responsible for MCF cases mentioned above.

Einleitung: Futterrationen für Hochleistungsmilchkühe basieren häufig auf Maissilage und liefern somit nur wenig frisches Gras, was eine niedrige Zufuhr an n-3-Fettsäuren, v.a. an α-Linolensäure (ALA), bewirkt. Dies führt einerseits zu einem reduzierten Status an ALA und konjugierter Linolsäure (CLA) und andererseits zu einem hohen n-6/n-3-Verhältnis bei laktierenden Kühen. Ziel der Untersuchungen: Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Einflüsse einer Supplementierung von essentiellen Fettsäuren (EFA, v.a. ALA) zusammen mit CLA auf den Fett- säurestatus, die Leistung, auf das antioxidative und inflammatorische System bei Milchkühen, die mit einer Mais-basierten Ration gefüttert wurden, in etablierter Laktation zu untersuchen und ver- schiede Stoffwechselwege, einschließlich der somatotropen Achse, näher zu beleuchten. Tiere, Material und Methoden: Es wurden 4 Kühe (3. Laktation, 126 ± 4 Tage in Milch) in einem 4 × 4 Latin Square untersucht. Die Kühe erhielten täglich abomasale Infusionen an Kokosöl (CTRL, 38,3 g/d; v.a. gesättigte Fettsäuren), Lein- und Distelöl (EFA, 39,1 und 1,6 g/d), Lutalin® (cis-9,trans-11 und trans-10,cis-12 CLA, jeweils 4,6 g/d) oder EFA+CLA für jeweils 6 Wochen. Die initiale Dosis wurde jeweils nach 2 Wochen verdoppelt, was in 3 Dosierungen resultierte (Dosis 1, 2 und 3). Es schloss sich eine 3-wöchige Washout-Periode an. Den Kühen wurde eine Mais-basierte Ration mit einem hohen n-6/n-3-V erhältnis (11,3:1) gefüttert. Die Trockensubstanzaufnahme und die Milchleistung wurden täglich und die Milchzusammensetzung wöchentlich gemessen. Die Fettsäuremuster im Milchfett und im Blutplasma, Plasmakonzentra- tionen von Metaboliten und Hormonen sowie von Parametern des antioxidativen Systems und der Immunantwort (nur in Woche 0 und 6) wurden jeweils in Behandlungswoche 0, 2, 4 und 6 analysiert. Lebergewebe wurde zu Beginn der Studie und jeweils nach 6 Wochen Behandlung entnommen und der Energiestoffwechsel sowie Parameter des antioxidativen Systems und der Immunantwort wurden auf Ebene der Transkription untersucht. Die statistische Auswertung wurde mittels ANOVA und der MIXED Prozedur (repeated measurements) in SAS durchgeführt, wobei Behandlung, Dosis und deren Interaktion als fixe Effekte und die Laktationswoche als Kovariable dienten. Ergebnisse: Die jeweils infundierten Fettsäuren stiegen sowohl im Plasma als auch in der Milch dosisabhängig an. Das n-6/n-3-Verhältnis des Milchfetts lag in der CTRL- und in der CLA- Gruppe höher als in den beiden EFA-Gruppen. Die Energie-korrigierte Milch und das Milchfett nahmen dosisabhängig in den beiden CLA-Gruppen ab. Es gab einen Trend für eine höhere Energiebilanz in der CLA-Gruppe. Der Milchproteingehalt war in den beiden CLA-Gruppen niedriger als in der CTRL-Gruppe und die Milchharnstoffkonzentration sank in beiden CLA- Gruppen dosisabhängig ab. Die Citratkonzentration in der Milch stieg dosisabhängig in der CLA- Gruppe an. Die Aktivität der Glutathionperoxidase im Blutplasma war in der CTRL-Gruppe ge- ringer als in der EFA-Gruppe und die Plasmakonzentration von β-Carotin stieg in beiden EFA- Gruppen mit der Dosis an. Die Plasmakonzentration des Gesamtcholesterols stieg dosisabhängig in allen Gruppen, außer der CLA-Gruppe, an. Die Plasmakonzentration des High-density- lipoprotein-Cholesterols stieg in der CTRL-Gruppe an und lag höher als in der EFA- und der CLA-Gruppe, während die Konzentrationen des Low-density-lipoprotein-Cholesterols dosisab- hängig in der EFA- und der EFA+CLA-Gruppe anstiegen und höher als in der CLA-Gruppe waren. Die hepatische Genexpression der 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-CoA Synthase 1 wurde in allen Gruppen hochreguliert und lag in der EFA+CLA-Gruppe am höchsten. Die Genexpression des sterol regulatory element-binding factor 1 zeigte einen Trend für die niedrigsten Werte in den beiden EFA-Gruppen. Die Expression des leberspezifischen growth hormone receptor 1A (GHR1A) tendierte zu einer Erhöhung in der EFA+CLA-Gruppe im Vergleich zur CTRL-Gruppe. Die insulin-like growth factor I (IGF-I)-Plasmakonzentration stieg in der CLA-Gruppe an und der Plasmaspiegel des insulin-like growth factor binding protein 2 (IGFBP-2) lag in der EFA+CLA- Gruppe niedriger als in der CTRL-Gruppe. Die Albumin- und Harnstoffkonzentrationen im Plasma waren in der CLA-Gruppe niedriger als in der CTRL-Gruppe. Schlussfolgerungen: Die Milchfettdepression und das erhöhte Milch-Citrat weisen auf eine redu- zierte de-novo-Fettsäuresynthese und einen verbesserten oxidativen Status in der Milch durch CLA-Supplementierung hin. Weder CLA- noch EFA-Gaben zeigten eindeutige Wirkungen auf den Entzündungsstatus bei den Milchkühen. Die Supplementierung von EFA und CLA hatte Ein- fluss auf den Cholesterol- und den Fettstoffwechsel sowie deren Regulierung. Der erhöhte IGF- I-Plasma-Spiegel in der CLA-Gruppe sowie die niedrigere IGFBP-2-Plasmakonzentration und die erhöhte Genexpression des GHR1A in der Leber der EFA+CLA-Gruppe deuten auf stimulierende Effekte auf die somatotrope Achse hin. Weiterhin scheinen CLA-Gaben auch den Proteinstoffwechsel von Milchkühen zu beeinflussen.

Die aufgrund der Herzratenvariabilität berechnete Parasympathetic Tone Activity (PTA) ist ein neuer Index zur intraoperativen Überwachung der Analgesie und schafft eine objektive Basis für die Optimierung der analgetischen Komponente einer Allgemeinanästhesie. Die PTA wurde in der vorliegenden Studie mit den herkömmlich genutzten Parametern (Herzfrequenz und mittlerer arterieller Blutdruck) während einer Multi-Level-Chirurgie an brachyzephalen Hunden verglichen. Es sollten das Auftreten von Schmerzereignissen und die unterschiedlichen Schmerzintensitäten während des Eingriffs erfasst sowie die Praktikabilität des PTA-Monitors im klinischen Alltag geprüft werden.:1 EINLEITUNG 1 2 ALLGEMEINE GRUNDLAGEN 3 2.1 Schmerzen und das autonome Nervensystem 3 2.2 Monitoring von Analgesie 4 2.2.1 Klinische Parameter 4 2.2.2 Monitore zur Überwachung der Analgesie 6 2.2.2.1 Auf Basis der Elektromyographie 6 2.2.2.2 Auf Basis der Baroreflexe 7 2.2.2.3 Auf Basis des Sympathikotonus 7 2.2.2.4 Auf Basis des Parasympathikotonus 9 2.3 Einfluss von Anästhetika auf das autonome Nervensystem 14 2.3.1 Analgetika 14 2.3.2 Sedativa und Hypnotika 15 2.4 Das Brachyzephale Syndrom 17 2.4.1 Pathophysiologie des Brachyzephalen Syndroms 17 2.4.2 Anästhesiologisches Management des brachyzephalen Patienten 18 2.4.3 Multi-Level-Chirurgie 21 2.5 Leitungsanästhesie des N. maxillaris 21 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 25 3.1 Patienten 25 3.2 Untersuchte Gruppen 25 3.3 Anästhesieprotokoll 26 3.4 Lokalanästhesie des N. maxillaris 30 3.5 Endoskopie und Multi-Level-Chirurgie 31 3.6 Messzeitpunkte 32 3.7 Definition von Schmerzereignissen 33 3.8 Statistische Auswertung 33 4 ERGEBNISSE 35 4.1 Patienten 35 4.2 Auftreten von Schmerzereignissen 37 4.2.1 Standardgruppe 37 4.2.2 Blockgruppe und Gruppenvergleich 37 4.3 PTA während Schmerzereignissen 40 4.3.1 Standardgruppe 40 4.3.2 Blockgruppe 43 4.4 Schmerzintensitäten während der oralen und nasalen Chirurgie 44 4.4.1 Standardgruppe 44 4.4.2 Blockgruppe und Gruppenvergleich 45 4.5 PTA während der Stimulation 47 4.6 Praktikabilität des Monitors 50 5 DISKUSSION 51 5.1 Diskussion der Methodik 51 5.1.1 Patientenauswahl 52 5.1.2 Anästhesieprotokoll 53 5.1.2.1 Prämedikation und Analgesie 54 5.1.2.2 Nicht-invasive Blutdruckmessung 57 5.1.2.3 Leitungsanästhesie des N. maxillaris 58 5.2 Diskussion der Ergebnisse 60 5.2.1 Auftreten von Schmerzereignissen 60 5.2.2 PTA während Schmerzereignissen 61 5.2.2.1 Standardgruppe 61 5.2.2.2 Blockgruppe 67 5.2.3 Schmerzintensitäten während der oralen und nasalen Chirurgie 68 5.2.3.1 Standardgruppe 68 5.2.3.2 Blockgruppe und Gruppenvergleich 70 5.2.4 PTA während der Stimulation 72 5.2.5 Praktikabilität des PTA-Monitors 73 5.3 Klinische Schlussfolgerung und Ausblick 75 6 ZUSAMMENFASSUNG 77 7 SUMMARY 79 8 LITERATURVERZEICHNIS 81 9 ANHANG 102 9.1 Abbildungen 102 9.2 Tabellen 104 10 DANKSAGUNG 107

Einleitung: Die konventionelle Milchviehhaltung muss bei steigender Leistung einer artgerechten Tierhaltung und dem Tierwohl gerecht werden. Gleichzeitig ist eine Zunahme von Schwer- und Totgeburten bei hochleistenden Milchrindern zu verzeichnen. Insbesondere Primipara weisen eine deutlich höhere Inzidenz für Dystokien und peripartale Kälberverluste auf als Multipara. Daher steht die endokrine Situation der erstkalbenden Milchrinder und ihrer Kälber im Fokus dieser Studie. Ziel der Untersuchung: Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss und Zusammenhang ausgewählter endokriner Parameter mit dem Kalbeverlauf und dem postnatalen Zustand des Kalbes darzustellen. Dafür wurden die Parameter Progesteron (P4), Östradiol-17β (E2), Cortisol, Insulin, Insulin-like growth factor 1 (IGF-1), Leptin und freie Fettsäuren (NEFA) im peripartalen Zeitraum (14 Tage (d) antepartal (a.p.) bis 3 d postpartal (p.p.) bei den Studientieren aus 4 konventionellen Milchviehbetrieben ausgewertet. Weiterhin wurde der hormonelle Status der geborenen Kälber anhand der Parameter Cortisol, Insulin und IGF-1 untersucht. Zusätzlich erfolgte ein Vergleich zwischen den 4 Milchviehbetrieben mit unterschiedlichen Dystokie- und Verlustraten. Tiere, Material und Methoden: Diese Studie wurde von März 2019 bis Mai 2020 in 4 sächsischen konventionellen Milchviehbetrieben (Betrieb (B) 1 - 4) durchgeführt. Anhand der Kälberverlustraten von 2016 bis 2019 erfolgte bereits eine Kategorisierung in problematische B (B1 und 2) und unproblematische B (B3 und 4). Insgesamt wurden 162 Färsenkalbungen in die Studie eingeschlossen. Zur Erstuntersuchung ca. 14 d a.p. wurden Körpergewicht, Rückenfettdicke (RFD) und Body Condition Score (BCS) erfasst. Die Blutprobenentnahme bei den Färsen erfolgte im Abstand von 2 - 3 d bis zur Kalbung, beim Kalb direkt p.p. sowie 2 - 3 d p.p. bei Färse und Kalb. Das Kälbergeburtsgewicht wurde erfasst und die Kalbungen nach Schwer- und Normalgeburt (SG und NG) sowie Tot- und Lebendgeburt (TG und LG) anhand der endokrinen Parameter ausgewertet. Ergebnisse: Die 162 begleiteten Kalbungen ergaben einen Anteil von 37,1 % SG (B1: 33,3 %, B2: 64,3 %, B3: 23,9 %, B4: 25,0 %; NG: 62,9 %). Die Kategorisierung konnte bestätigt werden, wobei B1 und B2 als problematisch sowie B3 und B4 als unproblematisch eingeordnet wurden. Die TG- Rate lag bei 9,3 % (B1 und B2: je 11,9 %, B3: 4,4 %, B4: 9,3 %; LG: 90,7 %). Es resultierten mehr LG aus NG (94,1 % NG vs. 85,0 % SG) und mehr TG aus SG (15,0 % SG vs. 5,9 % NG). Das Geburtsgewicht hatte keinen Einfluss auf den Kalbeverlauf (p > 0,05). Die problematischen B1 und 2 zeigten ein jüngeres Erstkalbealter mit geringerer Körpermasse und höherer Körperkondition (RFD, BCS) im Vergleich zu den unproblematischen B3 und 4 (p > 0,05). Kontrovers dazu sank mit steigender RFD die Wahrscheinlichkeit für eine SG. Die Hormone P4 und E2 zeigten einen physiologischen Verlauf im peripartalen Zeitraum für alle Studientiere ohne konkreten Zusammenhang mit Kalbeverlauf und Kälbervitalität. Cortisol war bei den Färsen der problematischen B tendenziell zu allen Zeitpunkten höher. Die höchsten Cortisolwerte wurden zur Kalbung, jedoch ohne signifikanten Zusammenhang mit dem Verlauf und Ausgang der Geburt, gemessen. Kälber aus SG hatten direkt p.p. höhere Cortisolwerte als aus NG (p < 0,05). Die stoffwechselassoziierten Parameter (Insulin, IGF-1, Leptin, NEFA) zeigten für alle Studientiere das Vorliegen einer peripartalen negativen Energiebilanz an. Kurz vor der Geburt gingen höhere IGF-1-Werte mit einer sinkenden und höhere NEFA-Werte mit einer steigenden Wahrscheinlichkeit für eine SG einher. Präpartal korrelierten Insulin, IGF-1 und Leptin positiv miteinander (p < 0,05) und negativ mit NEFA (p < 0,05) sowie die Körperkondition positiv mit Insulin (p < 0,001) und Leptin (p < 0,05). Das Insulin der Kälber stieg bis zum 2. - 3. Lebenstag an. Das Kälbergeburtsgewicht korrelierte positiv mit den IGF- 1-Werten der Kälber und den Leptin-Werten der Färsen. Schlussfolgerung: Färsen der problematischen B1 und 2 zeigten zur ersten Kalbung tendenziell eine mangelnde körperliche Entwicklung mit Überkonditionierung. Zusätzlich konnte für diese Tiere eine größere metabolische Belastung mit stärkeren Stressoren festgestellt werden. Diese Faktoren hatten in unserer Studie einen negativen Einfluss auf den Kalbeverlauf und folglich auf die Totgeburtenrate. Eine gute körperliche Entwicklung mit entsprechender Kondition, ein stabiler Stoffwechsel durch adäquate Versorgung, eine stressarme Umgebung und eine optimale prä-, intra- und postpartale Betreuung von Färse und Kalb haben einen positiven Einfluss auf den endokrinen Status der Tiere und letztlich auf die Inzidenz von Schwer- und Totgeburten.