Zur Zeit gibt es keinen quantitativen Gesamtüberblick und keinen bundesweiten Vergleich der Zahlen von Studienanfängern, Absolventen mit abgelegter Tierärztlichen Prüfung (TP), Tierärzten mit Approbation sowie Kammermitgliedschaften. Es wird untersucht, wie sich das Verhältnis zwischen der Anzahl der von den veterinärmedizinischen Bildungsstätten erteilten TP zur Anzahl der in Deutschland erteilten Approbationen und diese wiederum zu den bestehenden Pflichtmitgliedschaften in den Landestierärztekammern für den Untersuchungszeitraum der Abschlussjahrgänge 2000 bis 2010 darstellt. Es wurde Datenmaterial der Stiftung für Hochschulzulassung, der fünf veterinärmedizinischen Bildungsstätten, des Deutschen Tierärzteblattes, der Approbationsbehörden und der Zentralen Tierärztedatei Dresden genutzt. Anschließend wurden die Daten mittels Recherche in öffentlichen Medien ergänzt. Insgesamt wurden n = 8036 Personen zur Untersuchung herangezogen, wovon n = 6715 (84 %) auswertbar waren, dabei lag der Frauenanteil stets bei durchschnittlich 82 %. Es zeigte sich, dass die überwiegende Mehrheit (92 %) der auswertbaren Personen ihre Approbation innerhalb der ersten drei Monate nach Bestehen der TP erhielt. 84 % ließen nur maximal drei Monate zwischen Approbationserhalt und Kammerbeitritt vergehen. 75 % der Absolventen bleiben ihrem Ausbildungsland treu bzw. kehren dorthin zurück, eine veterinärmedizinische Hochschule bzw. Fakultät hat somit einen fachkräftebindenden Effekt für das jeweilige Bundesland. Im Bereich der Haupttätigkeitsfelder geht der Trend nach wie vor in Richtung „Praktiker“ (52 %). Personen ohne Berufsausübung bzw. Doktoranden nehmen den zweitgrößten Anteil (17 %) der Tätigkeitsfelder ein. Dabei steht die Einstufung der Doktoranden der Tiermedizin in tierärztlich „Tätige“ oder „nicht Tätige“ zur Diskussion, da diese in Deutschland noch in einer rechtlichen Grauzone liegt. Das Anmeldesystem ausgehend von der Approbationsbeantragung bis zur Kammermitgliedschaft bei den Tierärzten in Deutschland, mit weniger als 3 % nicht registrierter Kammermitgliedschaften sowie weniger als 1 % niemals beantragter Approbationen, funktioniert recht gut. Dies scheint in erster Linie am starken Pflichtbewusstsein der deutschen Tierärzte zu liegen. Lücken in der Zusammenarbeit zwischen Approbationsbehörden und Landestierärztekammern bzw. Fehlerquellen bei der Datenübermittlung fielen bisher nicht auf und die rechtliche Verfolgung von Versäumnissen einzelner Tierärzte spielt in der Kammerverwaltung eine untergeordnete bis gar keine Rolle, da rechtliche Vergehen tatsächlich Ausnahmen darstellen. Dennoch sollten die Datenbasis und auch der Datenfluss zwischen den beteiligten Institutionen vereinheitlicht, verifiziert und auch regelmäßig ausgewertet werden, denn ohne die Anwendung von Kontroll- und Sanktionsmaßnahmen ist die rechtsverbindliche Pflichtmitgliedschaft de facto eine reine Selbstverpflichtung. Eine einheitliche Stellungnahme zum Status der Doktoranden seitens der berufspolitischen Organe ist dringend notwendig. Doktoranden sollten zur Gruppe der tierärztlich „Tätigen“ zählen und der Nachweis der Approbation für alle mit der Promotion einhergehenden Arbeitsschritte Pflicht sein. In Anbetracht einer diesbezüglich bisher fehlenden bundeseinheitlichen Regelung, ist die Frage, ob man in Deutschland ohne Probleme mit fehlender Approbation tierärztlich tätig werden kann, eindeutig mit „ja“ zu beantworten.:Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis III 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Approbation 3 2.2 Bedeutung „tätiger“ Tierarzt 5 2.3 Aufgaben und Stellung der Tierärztekammern 6 2.4 Zentrale Tierärztedatei 7 2.4.1 Entstehungsgeschichte und Funktionsweise 7 2.4.2 Aufgaben 8 2.4.3 Die Jahresstatistik der Bundestierärztekammer 8 3 Material und Methodik 10 3.1 Stiftung für Hochschulzulassung 10 3.2 Veterinärmedizinische Bildungsstätten 10 3.3 Deutsches Tierärzteblatt 11 3.4 Approbationsbehörden 11 3.5 Jahresstatistik der Bundestierärztekammer 12 3.6 Datenbasis 12 3.7 Zentrale Tierärztedatei Dresden 12 3.8 Internetrecherche 14 3.9 Angaben zum Datenschutz 14 3.10 Methodenkritik 15 4 Ergebnisse 17 4.1 Allgemeine Datenlage der veterinärmedizinischen Bildungsstätten 17 4.2 Untersuchter Gesamtdatensatz der Approbierten und Repräsentativität der Datenbasis aus dem Deutschen Tierärzteblatt 24 4.3 Zeitspanne zwischen Ablegung der Tierärztlichen Prüfung und Erhalt der Approbation 25 4.4 Zeitspanne zwischen Approbation und Kammermitgliedschaft 26 4.5 Approbation ohne Kammermitgliedschaft 27 4.6 Ergebnisse der Internetrecherche 28 4.6.1 Korrigierte Zahlen zur Approbation ohne Kammermitgliedschaft 28 4.6.2 Weder Kammermitgliedschaft noch Approbation 30 4.7 Tätigkeitsbereiche 31 4.8 Verbleib 32 4.9 Austritt aus der Kammerzugehörigkeit 35 5 Diskussion 36 5.1 Zu den Datensätzen und deren Verarbeitung durch die einzelnen Institutionen 36 5.2 Zu den Datensätzen der Tierärztlichen Prüfungen 37 5.3 Zu den Approbationszahlen 38 5.4 Zum Zeitraum zwischen Tierärztlicher Prüfung und Approbation 39 5.5 Zum Zeitraum zwischen Approbation und Kammermitgliedschaft 40 5.6 Zu den Tätigkeitsbereichen 41 5.7 Zum Verbleib 43 5.8 Zu den „Nichtgemeldeten“ 44 5.8.1 Schwächen der Zentralen Tierärztedatei/Datenerfassung 44 5.8.2 Einflussfaktor „Ausländer“ 45 5.9 Auswirkungen und Konsequenzen bei Verstößen gegen die Approbationspflicht und Kammermitgliedschaft 46 5.10 Situation der Doktoranden – Approbation ein Muss? 49 6 Zusammenfassung 52 7 Summary 54 8 Literaturverzeichnis 56 Anhang 62 Danksagung 75

Einleitung: Bei der Dystonie handelt es sich um eine Erkrankung des zentralen Nervensystems. Sie ist charakterisiert durch ungewollte, dauerhafte oder wiederkehrende Muskelkontraktionen, die zu abnormalen Bewegungsabläufen und Haltungen führen. Sie ist die dritthäufigste Bewe-gungsstörung beim Menschen. Bisherige Befunde beim Menschen und Untersuchungen an Tier-modellen weisen u.a. auf eine besondere Bedeutung der Basalganglien-Thalamus-Schleife hin, die an der Kontrolle von willkürlichen und unwillkürlichen Bewegungen beteiligt ist. So konnten bei unterschiedlichen Tiermodellen Veränderungen im Striatum (STR), der Eingangsstruktur der Basalganglien, nachgewiesen werden. Beim dtsz Hamster, einem gut etablierten Tiermodell für die paroxysmale Dystonie, konnte neben vielen striatalen Veränderungen eine Reduktion der GABAergen Interneurone (IN), wie Parvalbumin-positive (PV+) IN, zum Zeitpunkt der maximalen Ausprägung der Dystonie gezeigt werden. Ziele der Untersuchung: Die Gründe für den Mangel an striatalen GABAergen IN bei der dtsz Hamstermutante sollten weiter untersucht werden, indem der Frage nachzugehen war, ob beim dtsz Hamster eine Migrations- oder Ausreifungsstörung der IN vorliegt. Dazu wurde das Homöodomänprotein Nkx 2.1, als Marker für aus dem medialen Ganglienhügel eingewanderte IN, im STR der dtsz Hamstermutante untersucht. Die Expression des Brain-derived neurotrophic factors (BDNF), des Kalium-Chlorid-Kotransporters 2 (KCC2) und die zytosolische Carboanhydrase vom Isotyp 7 (CAH7) wurden als Indikatoren für die Ausreifung von GABAergen IN herangezogen. Tiere, Material und Methoden: Die Untersuchungen wurden vergleichend an dtsz Hamstern und Kontrollhamstern durchgeführt. Beim dtsz Hamster zeigt die Dystonie einen altersabhängigen Verlauf (Beginn: ca. 16. Lebenstag (LT); Maximum: 30.-42. LT; Remission: 70. LT). Deshalb wurden als Untersuchungszeitpunkte der 18. LT und der 33. LT gewählt. Um die Migration der striatalen IN zu untersuchen, wurde im STR bei 33 Tage alten Hamsterns die Dichte der immun-histochemisch markierten Nkx 2.1-positiven Zellen stereologisch ermittelt. Der mRNA-Gehalt wurde relativ mittels „quantitativer Echtzeit-PCR“ (qPCR) bestimmt. Zusätzlich wurde die mRNA-Expression von Nkx 2.1 bei 18 Tage alten Tieren untersucht. Von KCC2 und CAH7 wurde die mRNA mittels qPCR bei 18 und 33 Tage alten Hamstern im STR untersucht. Die Expression von BDNF wurde mittels ELISA-System im Kortex (Cx), STR und im restlichen Gehirngewebe („R“) bei 33 und 18 Tage alten Tieren bestimmt. Der BDNF-mRNA Gehalt wurde im Cx (18. und 33. LT) und im STR (33. LT) untersucht. Des Weiteren sollte BDNF bei 33 Tage alten Hamstern mittels immunhistochemischer Markierung im Cx und STR untersucht werden. Die Untersuchung von BDNF im Cx ist deshalb wichtig, weil BDNF vom Cx in das STR trans-portiert wird. Zusätzlich wurde Parvalbumin (PV) zusammen mit Nkx 2.1 immunhistochemisch markiert und die mRNA-Expression von PV bei 18 und 33 Tage alten Tieren bestimmt. Ergebnisse: Für Nkx 2.1 konnte kein Unterschied in der Zelldichte zwischen dtsz- und Kontroll-hamstern gefunden werden. Ebenfalls gab es weder bei 18 noch bei 33 Tage alten Tieren einen Unterschied in der Nkx 2.1-mRNA-Expression. Unterschiede in der mRNA-Expression von KCC2 und CAH7 im STR (18. und 33. LT) lagen auch nicht vor. Die Expression der PV-mRNA im STR bei 33 Tage alten Tieren war jedoch erwartungsgemäß vermindert. Auf mRNA-Ebene konnte im Cx für BDNF kein Unterschied zwischen dtsz- und Kontrolltiergruppe gefunden wer-den. Bei beiden Tiergruppen wurde mittels ELISA im STR mehr BDNF nachgewiesen als im Cx und im R (18. und 33. LT) nachweisbar. Entgegen der Hypothese war nach Analyse der Daten mittels Zwei-Wege ANOVA eine geringe Erhöhung der BDNF-Expression im Cx und STR bei 33 Tage alten dtsz Hamstern nachweisbar. Dies lag daran, dass die BDNF-Expression nur bei den Kontrolltieren am 33. LT im Vergleich zum 18. LT herunterreguliert war. Die Ergebnisse der BDNF-Immunhistologie waren in Hinblick auf die Spezifität zweifelhaft. Schlussfolgerung: Die Nkx 2.1 Daten lassen auf eine ungestörte Migration striataler IN bei der dtsz Mutante schließen. Wahrscheinlich ist eine Ausreifungsstörung für den Mangel an GABAer-gen IN verantwortlich. Die Ergebnisse von KCC2 und CAH7 zeigen, dass keine generelle Ausreifungsstörung von GABAergen Neuronen vorliegt, wobei dies für kleinere Subpopulationen nicht ausgeschlossen werden kann. Entgegen der Arbeitshypothese konnte keine Verringerung sondern eine leichte Erhöhung von BDNF zum 33. LT bei der dtsz Hamstermutante festgestellt werden. Eine mögliche Erklärung könnte sein, dass BDNF auf Grund der verzögert einsetzenden Entwicklung der IN nicht herunterreguliert wird. Die Gründe für diese Erhöhung wie auch weitere Marker für die neuronale Ausreifung werden durch weiterführende Studien untersucht.

Die strahleninduzierte Mucositis enoralis ist eine der bedeutendsten und häufig dosislimitierenden frühen Nebenwirkungen der Strahlentherapie fortgeschrittener Kopf Hals Tumoren. Bis heute hat sich noch kein allgemein gültiges Konzept zur Therapie und Prophylaxe der Mundschleimhautentzündung durchsetzen können. Ein Ansatz zur selektiven, auf der Tumorbiologie beruhenden Beeinflussung der Strahlenempfindlichkeit von Tumoren ist die Blockade des epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptors (EGFR). In Kombination mit Strahlentherapie sollen so die lokale Tumorkontrolle und die Heilungschancen verbessert werden. Die Wirkung der Tyrosinkinase-Inhibitoren BIBX1382BF und Erlotinib auf histomorphologische Parameter in der Mundschleimhaut sowie auf die Expression der als Stammzellmarker diskutierten Proteine p63, Integrin β1 und CD44 wurde in der vorliegenden Arbeit im Vergleich zur alleinigen fraktionierten Bestrahlung untersucht. Für die histologischen Studien erfolgte die zweiwöchige fraktionierte Bestrahlung der Schnauzen von Mäusen des Inzuchtstammes C3H/Neu mit zehn Fraktionen zu je 3 Gy (Tag 0-4, Tag 7-11). Die Versuche gliederten sich in vier Gruppen: • I/A (54 Tiere) und II/A (40 Tiere): fraktionierte Bestrahlung, keine weitere Behandlung • I/B (51 Tiere): fraktionierte Bestrahlung, zusätzlich orale Gabe von BIBX1382BF, 50 mg/kg KG per os, von Tag 0-14 je 30 min nach der Bestrahlung • II/B (35 Tiere): fraktionierte Bestrahlung, zusätzlich orale Gabe von Erlotinib, 50 mg/kg KG per os, von Tag 0-11 je 30 min nach der Bestrahlung. Die Entnahme der Zungen erfolgte im Versuch I bei jeweils drei Tieren pro Tag von Tag 0 bis Tag 17. Im Versuch II wurden an den Tagen 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 und 14 jeweils die Zungen von fünf Tieren entnommen. Anschließend folgten die Fixierung der Zungen in Formalin, die Einbettung in Paraffin und die Anfertigung 3 µm dicker Gewebeschnitte. Die Zungenpräparate wurden für die histologischen Untersuchungen mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt. Für die immunhistochemischen Färbungen wurde die ABC-Methode eingesetzt. Das Epithel der Zungenunterseite wurde lichtmikroskopisch hinsichtlich Zellzahl, Schichtdicke und Expression der potentiellen Stammzellmarker p63, Integrin β1 und CD44 ausgewertet. Aufgrund der geringen Gruppengröße (Versuch I: drei Tiere pro Datenpunkt; Versuch II: fünf Tiere pro Datenpunkt) wurde auf eine eingehende statistische Testung verzichtet. Die vorliegende Arbeit beschränkt sich auf eine beschreibende Darstellung des Verlaufs der Einzelparameter über den Gesamtzeitraum. Die Zellzahlen verringerten sich während der ersten Bestrahlungswoche auf 60-70 % der Ausgangswerte, stagnierten in der zweiten Woche und stiegen schließlich bis zum Ende der Nachbeobachtung wieder an. Zwischen den nur bestrahlten und den zusätzlich mit BIBX1382BF behandelten Tieren war kein Unterschied feststellbar. Ein gleichsinniger Verlauf war auch in Versuch II zu beobachten, wobei die Zellzahlen der mit Erlotinib behandelten Tiere in der Funktionsschicht durchgängig höher ausfielen als in Versuchsreihe A. Die Dicke des Gesamtepithels bzw. der einzelnen Epithelschichten zeigte im Versuch I unter Bestrahlung große individuelle Schwankungen. Unter zusätzlicher BIBX1382BF-Gabe wurden oft niedrigere Werte gemessen. Im Versuch II blieb die Dicke des Gesamtepithels unter Fraktionierung konstant. Von Tag 0-12 wurden bei zusätzlicher Erlotinib-Applikation geringere Werte der Gesamtdicke gemessen als unter alleiniger Bestrahlung, ansonsten fielen die Veränderungen der Epitheldicke unabhängig von der Erlotinib-Gabe gering aus. Der kurzzeitigen, mit dem allgemeinen Zellverlust einhergehenden Verringerung der p63-Expression zu Beginn der Bestrahlung folgt bis zum Ende des Beobachtungszeitraumes die Normalisierung der p63-positiven Zellen. Mit EGFR-Blockade sind gegenüber der alleinigen Bestrahlung keine Unterschiede in der p63-Expression festzustellen. Die Integrin β1-Expression nahm im Verlauf der Bestrahlung ab. Unter EGFR-Blockade mit BIBX1382BF zeigte sich an den Tagen 2-9 und 12-16 ein schwächeres Färbesignal als im fraktioniert bestrahlten Epithel, was für eine mögliche Interaktion des EGF-Rezeptors mit Integrin β1 spricht. Im Versuch II waren unabhängig von der Erlotinib-Gabe keine Unterschiede in der Expression von Integrin β1 feststellbar. Die CD44-Expression im Epithel wurde durch Bestrahlung gefördert. Übereinstimmend konnte in der vorliegenden Arbeit in beiden Versuchen eine Steigerung der CD44-Färbeintensität über den jeweiligen Referenzbereich festgestellt werden. Eine Blockade der EGFR-Aktivität durch Erlotinib reduzierte die Expression von CD44, wie in Versuch II/B im initialen Abfall der CD44-Färbeintensität deutlich wurde. Doch schon ab Tag 4 wurden im Versuch II/A und II/B gleich starke Färbesignale für CD44 erfasst. Insgesamt ergaben sich unter EGFR-Inhibition mittels BIBX1382BF oder Erlotinib keine Hinweise auf Veränderungen der untersuchten Parameter während einer zweiwöchigen fraktionierten Bestrahlung. Ob diese Ergebnisse auch auf andere Tyrosinkinase-Inhibitoren bzw. unterschiedliche Wirkstoffklassen (z. B. Anti-EGFR-Antikörper) übertragbar sind, muss in weiteren Studien untersucht werden. / Radiation-induced oral mucositis is one of the most important and often dose limiting early side effects of radiotherapy of advanced tumours in the head-and-neck region. To this day, no general concept for therapy and prophylaxis of the oral mucositis has been established. The inhibition of the epidermal growth factor receptor (EGFR) is one approach to a selective increase of the radiosensitivity of tumours based on the tumour biology. In combination with radiotherapy, application of EGFR-inhibitors is supposed to increase the local tumour control and the chances of cure. The aim of the present study was to investigate the effect of the tyrosine kinase inhibitors BIBX1382BF and Erlotinib on the radiation response of the oral mucosa and on the expression of different proteins that are discussed to be markers of epithelial stem cells. For the histological studies, the snouts of C3H/Neu mice were irradiated with ten daily fractions of 3 Gy over two weeks (on days 0-4, 7-11). The experiments comprised four treatment groups: • I/A (54 animals) and II/A (40 animals): fractionated irradiation, no further treatment • I/B (51 animals): fractionated irradiation, administration of BIBX1382BF, 50 mg/kg per os, once daily (days 0-14) 30 min after the radiation treatment • II/B (35 animals): fractionated irradiation, administration of Erlotinib, 50 mg/kg per os, once daily (days 0-11) 30 min after the radiation treatment. Between day 0 and 17, three animals of the groups I/A and I/B were euthanised per day. In the experimental arms II/A and II/B five mice were killed on day 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 and 14, respectively. The tongues were excised, fixed in formalin, embedded in paraffin and 3 µm thick sections were prepared. Subsequently, the tongue sections were stained with haematoxylin and eosin or with an ABC kit to visualise proteins of interest. The epithelium of the lower tongue was examined by light microscopy regarding the following parameters: cell numbers, thickness of epithelial layers and expression of the potential stem cell markers p63, integrin β1 and CD44. Due to the limited number of animals per data point (experiment I: three mice per data point; experiment II: five mice per data point), a detailed statistical analysis was not performed. The present study is determined to describe the parameter variations over the observation period. Cell numbers decreased to 60-70 % of the pre-treatment control values within the first week of irradiation alone, remained constant in the second week, and then slowly increased until the end of the observation period. There was no difference between radiotherapy alone or combined treatment with BIBX1382BF. In experiment II similar observations were made with higher cell numbers in the functional layer of the epithelium of the Erlotinib treated animals than in the irradiated group. The thickness of the epithelium and its individual layers showed high inter individual differences in experiment I. In treatment group I/B, lower values of thickness were often detected in comparison to group I/A. In experiment II the thickness of the epithelium remained constant under fractionated irradiation. Between day 0 and 12 the Erlotinib treatment slightly decreased the thickness of the whole epithelium in comparison to the irradiated group. Besides, there were only minor changes in the thickness of the different layers. Associated with the general loss of cells, radiation treatment led to a transient decrease in the expression of p63. The number of p63-positive cells recovered until the end of the observation period. A similar expression pattern of p63-positivity was found independent of EGFR inhibition. The expression of integrin β1 decreased during fractionated irradiation. On days 2-9 and 12-16, the changes were more pronounced in combination with BIBX1382BF treatment which indicates a potential interaction of the EGF receptor with integrin β1. In experiment II, no differences between the exclusively irradiated group and the combined treatment with Erlotinib were found for the expression patterns of integrin β1. Irradiation alone resulted in a higher epithelial expression of CD44. Accordingly, a general increase of CD44 staining intensity was observed in both experiments exceeding control values. Due to the EGFR inhibition with Erlotinib, the expression of CD44 initially decreased. However, by day 4 no persisting differences in staining intensity could be observed independent of EGFR inhibition. In summary, EGFR inhibition via BIBX1382BF or Erlotinib did not result in alterations of the analysed parameters during two weeks of fractionated irradiation. Further studies are required to demonstrate if the present findings are transferable to other tyrosine kinase inhibitors or different substance classes (e.g. inhibiting receptor antibodies).

Einleitung: Die Übergangszyklen (ÜZ) der Stute sind hinsichtlich klinischer Parameter bereits ausführlich charakterisiert. Das Endmetrium wird bislang, trotz seines elementaren Stellenwertes in der „Reproduktionsachse“, nicht oder nur sehr vereinzelt in die Betrachtungen mit einbezogen. Ziele der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war eine umfassende morphologischfunktionelle Charakterisierung des equinen Endometriums während der ÜZ, insbesondere im Hinblick auf die endometriale Aktivität und Differenzierung. Zudem wurden die dokumentierten endometrialen Charakteristika in ein klinische Parameter beinhaltendes Gesamtkonzept eingebunden, um ein tiefergreifendes Verständnis der physiologischen Abläufe während des Frühjahrs und Herbstes zu erlangen. Auf dieser Grundlage sollte darüber hinaus der optimale Zeitraum einer diagnostischen Bioptatentnahme hinsichtlich der Funktionsmorphologie des Endometriums ermittelt werden. Tiere, Material und Methoden: Für die vorliegende Arbeit wurden insgesamt 260 Endometriumproben von Stuten verschiedener Rassen sowie mit einem variablen und individuellen Alters- und Reproduktionsstatus untersucht. Diese stammten im Wesentlichen aus den Routineeinsendungen (n = 253) des Instituts für Veterinär-Pathologie der Universität Leipzig der Jahre 1993 - 2012. Darüber hinaus wurden endometriale Gewebeproben von sieben Tieren im Rahmen von Obduktionen entnommen. Als Kontrollgruppe dienten Bioptate von sechs klinisch-gynäkologisch gesunden Stuten aus der physiologischen Zuchtsaison, welche an definierten Tagen des Zyklus entnommen wurden. Für die Auswertung des Herbst-Übergangszyklus (HÜZ) standen 76 Proben aus den Monaten September, Oktober und November zur Verfügung. Der Frühjahrs-Übergangszyklus (FÜZ) wurde durch 184 im Februar, März und April entnommene Bioptate repräsentiert. Die Gewebeproben wurden routinemäßig aufgearbeitet und mittels H.-E. gefärbt. Eine lichtmikroskopische Untersuchung erfolgte im Besonderen hinsichtlich der endometrialen Aktivität sowie der glandulären und stromalen Differenzierung. An 100 ausgewählten Endometriumproben wurde zudem eine immunhistologische Untersuchung hinsichtlich der Expression von Östrogenrezeptor α und Progesteronrezeptor sowie des Proliferationsmarkers Ki67-Antigen durchgeführt. Ergebnisse: Während des HÜZ ergibt sich das Bild einer nahezu kontinuierlichen Abnahme der endometrialen Aktivität. Demgegenüber kann im Verlauf des FÜZ eine deutliche Zunahme der Aktivität beobachtet werden. Der Prozentsatz fehldifferenzierter Endometrien nimmt im Herbst von etwa 14 % im späten September auf nahezu 44 % in der ersten Novemberhälfte zu. In jenen den Untersuchungszeitraum begrenzenden Monatshälften (früher September, 33 %; später November, < 30 %) weichen die ermittelten Fehldifferenzierungsraten von der beobachteten Zunahme ab. Während des FÜZ ist der höchste Prozentsatz fehldifferenzierter Endometrien im späten März (32 %) zu verzeichnen. Im April fällt der Anteil nachgewiesener Differenzierungsstörungen auf < 15 % ab. Mehr als 90 % der fehldifferenzierten Gewebeproben weisen eine irreguläre Funktionsmorphologie auf, während bei den übrigen Endometrien (< 10 %) eine ungleichmäßige Differenzierung beobachtet werden kann. Die ermittelte Kongruenz der endometrialen funktionellen Morphologie und des klinisch- gynäkologisch (vorberichtlich) dokumentierten Zyklusstandes aller im HÜZ und FÜZ untersuchten Proben beträgt rund 70 %. Die dominierende Funktionsmorphologie fehldifferenzierter Endometrien passt in ca. 60 % der Fälle zu dem jeweiligen klinisch dokumentierten Zyklusstand. Während der ÜZ sind sowohl in regulär als auch in fehldifferenzierten Endometrien eine überwiegend schwache Steroidhormonrezeptorexpression und eine nahezu fehlende Ki67-Antigenexpression zu beobachten. Insgesamt zeigen die irregulär differenzierten Endometrien v. a. im Bereich des tiefen Drüsenepithels eine deutlich stärkere Expressionsintensität insbesondere von Östrogenrezeptor α als entsprechende Strukturen regulär differenzierter Endometrien. Schlussfolgerungen: Die vermehrte Nachweisbarkeit endometrialer Fehldifferenzierungen sowie einer fehlenden Kongruenz histomorphologischer und klinisch-gynäkologischer Befunde während der ÜZ ist möglicherweise auf eine in diesen Zeiträumen physiologische Entkopplung insbesondere der ovariell-endometrialen Regulationsmechanismen zurückzuführen. Eine diagnostische Bioptatentnahme zur endometrialen Funktionsanalytik sollte demzufolge ab der zweiten Aprilhälfte und bis Ende August stattfinden.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Der Sexualzyklus der Stute 2 2.1.1 Allgemeine Betrachtungen 2 2.1.2 Regulation des Sexualzyklus während der physiologischen Zuchtsaison 3 2.1.3 Der Anöstrus (anovulatorische Phase) 5 2.1.3.1 Der Herbst-Übergangszyklus 6 2.1.3.2 Der tiefe Winteranöstrus (ovarielle Inaktivität) 9 2.1.3.3 Der Frühjahrs-Übergangszyklus 10 2.2 Histomorphologie des Endometriums der Stute 11 2.2.1 Morphologische Charakteristika des zyklisch aktiven Endometriums 12 2.2.2 Endometriale Differenzierungsstörungen 12 2.2.2.1 Endometriale Atrophie und Inaktivität 15 2.2.2.2 Histomorphologie des equinen Endometriums während der Übergangszyklen – Physiologische endometriale Asynchronizität 18 2.2.2.3 Endometriale Hyperplasie 18 2.2.2.4 Endometriale Hypoplasie 19 2.2.2.5 Irreguläre glanduläre Differenzierung 19 2.2.2.6 Ungleichmäßige glanduläre Differenzierung 22 2.2.2.7 Vollständig irreguläre und ungleichmäßige glanduläre Differenzierung 24 2.3 Östrogen- und Progesteronrezeptoren 25 2.3.1 Aufbau, Struktur und Wirkmechanismen der Steroidhormonrezeptoren 25 2.3.2 Hormonelle Beeinflussung der Steroidhormonrezeptorexpression 26 2.3.3 Hormonrezeptoren im Endometrium der Stute 27 2.4 Ki67-Antigen 28 2.4.1 Allgemeine Betrachtungen 28 2.4.2 Ki67-Antigen im Endometrium der Stute 29 2.5 Fazit aus der Literatur im Hinblick auf den eigenen Forschungsschwerpunkt 30 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 31 3.1 Tiergut, Material und Probenherkunft 31 3.2 Nähere Charakterisierung des Tiergutes und des Untersuchungsmaterials 31 3.2.1 Selektionskriterien für die Auswahl des Untersuchungsmaterials aus der Datenbank 31 3.2.2 Probenentnahme und Dokumentation der Ovarbefunde von Sektionstieren 32 3.2.3 Endokrinologische Analysen der Blutserumproben 33 3.2.3.1 Bestimmung von E2 im Pferdeserum (mit Extraktion) 33 3.2.3.2 Bestimmung von P4 im Pferdeserum (mit Extraktion) 34 3.2.4 Kontrollstuten 35 3.3 Probenaufarbeitung und histologische Präparation 35 3.4 Lichtmikroskopie 36 3.4.1 Auswertung der histologischen Präparate 36 3.5 Immunhistologie 39 3.5.1 Anfertigung der immunhistologischen Präparate 39 3.5.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen 40 3.5.2.1 Steroidhormonrezeptoren 41 3.5.2.2 Proliferationsmarker – Ki67-Antigen 42 4 ERGEBNISSE 43 4.1 Charakterisierung des HÜZ 43 4.1.1 Lichtmikroskopische Beurteilung der endometrialen Proben (HÜZ) 45 4.1.1.1 Endometriale Aktivität 45 4.1.1.2 Endometriale Differenzierung 47 4.1.1.3 Endometriale Alterationen 49 4.1.2 Immunhistologische Beurteilung ausgewählter endometrialer Proben (HÜZ) 51 4.1.3 Gegenüberstellung histomorphologisch-funktioneller und klinisch-gynäkologischer Befunde unter Berücksichtigung anamnestischer Daten 54 4.1.4 Zusammenfassende Darstellung des HÜZ 56 4.2 Charakterisierung des FÜZ 60 4.2.1 Lichtmikroskopische Beurteilung der endometrialen Proben (FÜZ) 62 4.2.1.1 Endometriale Aktivität 62 4.2.1.2 Endometriale Differenzierung 64 4.2.1.3 Endometriale Alterationen 65 4.2.2 Immunhistologische Beurteilung ausgewählter endometrialer Proben (FÜZ) 67 4.2.3 Gegenüberstellung histomorphologisch-funktioneller und klinisch-gynäkologischer Befunde unter Berücksichtigung anamnestischer Daten 70 4.2.4 Zusammenfassende Darstellung des FÜZ 74 4.3 Morphologisch-funktionelle Beurteilung endometrialer Bioptate im Zyklusverlauf (Kontrollstuten) 78 5 DISKUSSION 79 5.1 Ziel der Arbeit 79 5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials 79 5.3 Charakteristika der Übergangszyklen 81 5.3.1 Endometriale Aktivität und deren Vergleich mit den Befunden der klinisch-gynäkologischen Untersuchung 81 5.3.2 Endometriale Differenzierung im saisonalen Kontext 83 5.3.2.1 Potenzielle Einflussfaktoren auf die endometriale Funktionsmorphologie während der ÜZ (Alter, Parität und Güstzeit) 85 5.3.2.2 Vergleich der Ergebnisse der endometrialen Funktionsanalyse mit den Befunden der klinisch-gynäkologischen Untersuchung 87 5.3.3 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in ausgewählten endometrialen Bioptaten 88 5.3.3.1 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in Endometrien mit einer regulären Funktionsmorphologie 88 5.3.3.2 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in Endometrien mit einer irregulären Funktionsmorphologie 90 5.4 Fazit 91 5.5 Ausblick und weiterführende Untersuchungen 93 5.5.1 Homogenität des Probenmaterials 93 5.5.2 Funktionelle Charakterisierung des Endometriums während der ÜZ 93 6 ZUSAMMENFASSUNG . 95 7 SUMMARY 97 8 LITERATURVERZEICHNIS 99 9 ANHANG 116 9.1 Fragebogen zur Vervollständigung der klinisch-anamnestischen Daten 116 9.2 Charakterisierung der Kontrollstuten 117 9.3 Reagenzien für die Immunhistologie 118 9.4 Auswertungsprotokoll Lichtmikroskopie und Immunhistologie 119 10 DANKSAGUNG 122 / Introduction: With regard to clinical parameters the transitional period of the mare is already characterized thoroughly. Despite its important key-role in the reproductive axis, however, the endometrium is largely neglected in these considerations. Objective: The aim of the present study was a detailed morphofunctional characterization of the equine endometrium during the autumn (ATP) as well as the spring transitional period (STP). Special emphasis was placed regarding the endometrial activity and differentiation. Furthermore, the investigated endometrial characteristics were integrated in a superordinate concept, also considering clinical parameters, in order to gain a more comprehensive understanding of physiological processes during both ATP and STP. Based on these findings the most effective time span for diagnostic biopsy sampling, especially regarding the functional morphology of the endometrium, should be evaluated. Material and methods: For this survey altogether 260 endometrial samples of mares with a variable age and foaling status as well as of different breeds were investigated. The main part of the examined specimens (n = 253) was obtained from routine biopsy submissions sent to the Institute of Pathology at the University of Leipzig from 1993 to 2012. Moreover, endometrial tissue was retrieved from 7 mares, which were submitted for necropsy to the same department. Samples with no endometrial alterations taken from 6 gynaecologically healthy mares during the physiological breeding season on defined days of the oestrus cycle served as positive controls. To outline the ATP, 76 specimens taken in September, October and November were selected for examination. Samples taken in February, March and April were chosen to investigate the STP (184). All samples were routinely processed and stained with haemalum and eosin (H.-E.). Subsequently, the samples were evaluated microscopically especially with regard to the functional morphology of the endometrium, that means activity as well as glandular and stromal differentiation. An immunohistochemical evaluation of the expression of oestrogen receptor α and progesterone receptor as well as of Ki67-antigen was performed on selected endometrial samples (n = 100). Results: Concerning the endometrial activity a considerable decrease in activity from September to the second half of November could be detected in ATP. Compared to this course in autumn, a noticeable increase in activity could be recognized during STP. The appearance of endometrial disorders in ATP is characterized by a straight increase from about 14 % in late September to nearly 44 % in the first half of November. At the ‘margins’ of ATP (early September, 33 %; late November, < 30 %) results deviating form the mentioned increase were observed. During STP the highest percentage of endometrial differentiation disorders could be detected in late March (32 %). At the end of STP in April, the percentage of endometrial maldifferentiations declined to about 15 % or lower. Altogether, the vast majority (90 %) of specimens with differentiation disorders were classified as being differentiated ‘irregularly’. Accordingly, only about 10 % of all maldifferentiated endometria showed an ‘unequal’ functional morphology. A comparison of the clinically evaluated ovarian status and the endometrial functional morphology revealed that both parameters were in accordance in about 70 % of all mares examined during ATP and STP. Regarding only maldifferentiated endometria, a consistence of the predominant functional morphology and the ovarian status could only be detected in about 60 % of all investigated cases. During the transitional peroids, both regularly differentiated endometria and specimens showing functional disorders showed an only mild steroid hormone receptor expression and almost no expression of Ki67-antigen. However, a distinctively higher oestrogen receptor α expression could be observed in the epithelial cells of mainly mid to basal glands especially in ‘irregular’ differentiated specimens compared to according structures of regularly differentiated endometria. Conclusion: Endometrial maldifferentiations as well as a relatively low ratio of concordance of the histomorphological findings in the endometrium compared to the reported gynaecological status are frequently found in biopsies taken during the transitional periods. These two conditions might display a physiological decoupling of the regulatory processes between ovaries and endometrium. Therefore, a diagnostic sampling – with regard to a functional analysis of the endometrium – should take place during the physiological breeding season between late April and before September.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 2 2.1 Der Sexualzyklus der Stute 2 2.1.1 Allgemeine Betrachtungen 2 2.1.2 Regulation des Sexualzyklus während der physiologischen Zuchtsaison 3 2.1.3 Der Anöstrus (anovulatorische Phase) 5 2.1.3.1 Der Herbst-Übergangszyklus 6 2.1.3.2 Der tiefe Winteranöstrus (ovarielle Inaktivität) 9 2.1.3.3 Der Frühjahrs-Übergangszyklus 10 2.2 Histomorphologie des Endometriums der Stute 11 2.2.1 Morphologische Charakteristika des zyklisch aktiven Endometriums 12 2.2.2 Endometriale Differenzierungsstörungen 12 2.2.2.1 Endometriale Atrophie und Inaktivität 15 2.2.2.2 Histomorphologie des equinen Endometriums während der Übergangszyklen – Physiologische endometriale Asynchronizität 18 2.2.2.3 Endometriale Hyperplasie 18 2.2.2.4 Endometriale Hypoplasie 19 2.2.2.5 Irreguläre glanduläre Differenzierung 19 2.2.2.6 Ungleichmäßige glanduläre Differenzierung 22 2.2.2.7 Vollständig irreguläre und ungleichmäßige glanduläre Differenzierung 24 2.3 Östrogen- und Progesteronrezeptoren 25 2.3.1 Aufbau, Struktur und Wirkmechanismen der Steroidhormonrezeptoren 25 2.3.2 Hormonelle Beeinflussung der Steroidhormonrezeptorexpression 26 2.3.3 Hormonrezeptoren im Endometrium der Stute 27 2.4 Ki67-Antigen 28 2.4.1 Allgemeine Betrachtungen 28 2.4.2 Ki67-Antigen im Endometrium der Stute 29 2.5 Fazit aus der Literatur im Hinblick auf den eigenen Forschungsschwerpunkt 30 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 31 3.1 Tiergut, Material und Probenherkunft 31 3.2 Nähere Charakterisierung des Tiergutes und des Untersuchungsmaterials 31 3.2.1 Selektionskriterien für die Auswahl des Untersuchungsmaterials aus der Datenbank 31 3.2.2 Probenentnahme und Dokumentation der Ovarbefunde von Sektionstieren 32 3.2.3 Endokrinologische Analysen der Blutserumproben 33 3.2.3.1 Bestimmung von E2 im Pferdeserum (mit Extraktion) 33 3.2.3.2 Bestimmung von P4 im Pferdeserum (mit Extraktion) 34 3.2.4 Kontrollstuten 35 3.3 Probenaufarbeitung und histologische Präparation 35 3.4 Lichtmikroskopie 36 3.4.1 Auswertung der histologischen Präparate 36 3.5 Immunhistologie 39 3.5.1 Anfertigung der immunhistologischen Präparate 39 3.5.2 Auswertung der immunhistologischen Untersuchungen 40 3.5.2.1 Steroidhormonrezeptoren 41 3.5.2.2 Proliferationsmarker – Ki67-Antigen 42 4 ERGEBNISSE 43 4.1 Charakterisierung des HÜZ 43 4.1.1 Lichtmikroskopische Beurteilung der endometrialen Proben (HÜZ) 45 4.1.1.1 Endometriale Aktivität 45 4.1.1.2 Endometriale Differenzierung 47 4.1.1.3 Endometriale Alterationen 49 4.1.2 Immunhistologische Beurteilung ausgewählter endometrialer Proben (HÜZ) 51 4.1.3 Gegenüberstellung histomorphologisch-funktioneller und klinisch-gynäkologischer Befunde unter Berücksichtigung anamnestischer Daten 54 4.1.4 Zusammenfassende Darstellung des HÜZ 56 4.2 Charakterisierung des FÜZ 60 4.2.1 Lichtmikroskopische Beurteilung der endometrialen Proben (FÜZ) 62 4.2.1.1 Endometriale Aktivität 62 4.2.1.2 Endometriale Differenzierung 64 4.2.1.3 Endometriale Alterationen 65 4.2.2 Immunhistologische Beurteilung ausgewählter endometrialer Proben (FÜZ) 67 4.2.3 Gegenüberstellung histomorphologisch-funktioneller und klinisch-gynäkologischer Befunde unter Berücksichtigung anamnestischer Daten 70 4.2.4 Zusammenfassende Darstellung des FÜZ 74 4.3 Morphologisch-funktionelle Beurteilung endometrialer Bioptate im Zyklusverlauf (Kontrollstuten) 78 5 DISKUSSION 79 5.1 Ziel der Arbeit 79 5.2 Kritische Beurteilung des Untersuchungsmaterials 79 5.3 Charakteristika der Übergangszyklen 81 5.3.1 Endometriale Aktivität und deren Vergleich mit den Befunden der klinisch-gynäkologischen Untersuchung 81 5.3.2 Endometriale Differenzierung im saisonalen Kontext 83 5.3.2.1 Potenzielle Einflussfaktoren auf die endometriale Funktionsmorphologie während der ÜZ (Alter, Parität und Güstzeit) 85 5.3.2.2 Vergleich der Ergebnisse der endometrialen Funktionsanalyse mit den Befunden der klinisch-gynäkologischen Untersuchung 87 5.3.3 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in ausgewählten endometrialen Bioptaten 88 5.3.3.1 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in Endometrien mit einer regulären Funktionsmorphologie 88 5.3.3.2 Expressionsverhalten von ERα, PR und Ki67-Antigen in Endometrien mit einer irregulären Funktionsmorphologie 90 5.4 Fazit 91 5.5 Ausblick und weiterführende Untersuchungen 93 5.5.1 Homogenität des Probenmaterials 93 5.5.2 Funktionelle Charakterisierung des Endometriums während der ÜZ 93 6 ZUSAMMENFASSUNG . 95 7 SUMMARY 97 8 LITERATURVERZEICHNIS 99 9 ANHANG 116 9.1 Fragebogen zur Vervollständigung der klinisch-anamnestischen Daten 116 9.2 Charakterisierung der Kontrollstuten 117 9.3 Reagenzien für die Immunhistologie 118 9.4 Auswertungsprotokoll Lichtmikroskopie und Immunhistologie 119 10 DANKSAGUNG 122

Die Blauzungenkrankheit (Bluetongue, BT) ist eine weltweit verbreitete Infektionskrankheit der Wiederkäuer. Sie wird von einem Orbivirus, dem Bluetongue virus (BTV) ausgelöst, welches durch belebte Vektoren übertragen wird. Nach ursprünglich limitierter Verbreitung zwischen dem 35. südlichen und dem 40. nördlichen Breitengrad, hat sich das BT-Virus ausgehend vom Mittelmeerraum, auch in Teilen Südeuropas manifestiert. Im Spätsommer 2006 wurde BTV erstmals auch in Zentraleuropa nachgewiesen (Belgien, Niederlande und Deutschland) und breitete sich in den folgenden Jahren in weitere angrenzende europäische Länder aus. Der nachgewiesene Serotyp 8 (BTV-8) war bis dahin nur auf Gebiete südlich der Sahara, sowie Mittel- und Südamerika beschränkt. Die Bedeutung von Wildwiederkäuern für die Epidemiologie der Blauzungenkrankheit in Deutschland und in Mitteleuropa war bis zu diesem Zeitpunkt unbekannt. Sind die einheimischen Wildwiederkäuer (Rothirsch (Cervus elaphus), Damhirsch (Dama dama), Europäischer Mufflon (Ovis aries musimon) und Reh (Capreolus capreolus)) für das BTV empfänglich, so könnten sie eine Rolle als Erregerreservoir spielen und müssen somit auch in einer wirksamen Bekämpfungsstrategie berücksichtigt werden. Von April 2008 bis März 2011 wurde ein Monitoring zum BTV-Nachweis in Thüringen durchgeführt. Es sollte untersucht werden, ob die heimischen Wildwiederkäuerarten während des BTV-8-Seuchenzuges eine Rolle in der Epidemiologie der BT gespielt haben. Im Untersuchungszeitraum wurden 2535 Blut- und 3922 Muskelfleischproben von 4204 gehaltenen und erlegten Wildwiederkäuern (Rot-, Dam-, Muffel-, Reh- und Sikawild) auf BTV untersucht. Für Rot , Dam und Muffelwild lag der Anteil der untersuchten Proben an der Jagdstrecke im Jagdjahr 2008/09 mit 3,7 %, 4,1 % und 24,3 % jeweils am höchsten und nahm in den folgenden Jagdjahren auf 0,4 %, 0,3 % und 5,3 % ab. Beim Rehwild lag der Anteil in allen Jagdjahren zwischen 0,8 % und 1,7 %. Die Seroprävalenzen waren in den Jagdjahren 2008/09 bis 2010/11 rückläufig und lagen beim Muffelwild (n=354) zwischen 4,1 % und 1,3 %, beim Damwild (n=1721) zwischen 0,7 % und 0,0 % und beim Rotwild (n=283) zwischen 3,2 % und 0,0 %. Das bestätigt die Empfänglichkeit und Exposition dieser Spezies für BTV 8 in Thüringen. Bei dem untersuchten Rehwild wurden im gesamten Betrachtungszeitraum keine Antikörper gegen BTV im Blut (n=132) gefunden. In keiner der untersuchten 2535 Blutproben wurde BT-Virusgenom mittels RT-qPCR nachgewiesen. Die rückläufigen Seroprävalenzen bei Rot-, Dam- und Muffelwild und der fehlende Virusgenomnachweis deuten darauf hin, dass es keine Neuinfektionen und keine Persistenz des BTV-8 in der Wildwiederkäuerpopulation gab. Es ist anzunehmen, dass es im Untersuchungszeitraum in Thüringen zu keiner Zirkulation des BTV-8 in der Wildwiederkäuerpopulation, vergleichbar zu dem aus Spanien berichteten „Wildzyklus“, gekommen ist. Rehwild scheint weit weniger empfänglich für eine BTV-8 Infektion zu sein als andere Wildwiederkäuerarten, weshalb die Bedeutung bei der Verbreitung des BTV-8 vernachlässigbar ist. Zur frühestmöglichen Erkennung eines erneuten Auftretens von BTV Infektionen in Deutschland oder Mitteleuropa, zur Ausbruchsverfolgung, zur Abschätzung des Infektionsdruckes im Wildwiederkäuerbestand und zur Einschätzung, ob sich ein eigener Wildwiederkäuer Zyklus etabliert hat, ist neben dem Monitoring im Nutztierbereich auch eine Untersuchung von Wildtieren (Rot-, Dam- und Muffelwild) zu empfehlen. Hierbei sollten ganz gezielt insbesondere Tiere aus Gehegen einbezogen werden. Im Rahmen dieser Studie erwies sich EDTA Blut als geeignete Probenmatrix, welche den Antikörper- und Virusgenomnachweis von BTV in Wildwiederkäuern zulässt und leicht im Rahmen der Schlachttier- und Fleischuntersuchung gewonnen werden kann. / Bluetongue disease (Bluetongue, BT) is a globally widespread infectious disease of ruminants. The causative agent is the bluetongue virus (BTV), an Orbivirus that is transmitted by living vectors. Its distribution was originally limited to regions between the 35th southern and the 40th northern latitude, however the BT virus spread from the Mediterranean and manifested in southern parts of Europe. In late summer of 2006, BTV was detected in Central Europe (Belgium, Netherlands and Germany) for the first time and spread to other European countries in the following years. Before, the detected serotype 8 (BTV 8) was limited to areas south of the Sahara, as well as Central and South America. The importance of wild ruminants in the epidemiology of BT in Germany and Central Europe was unknown up to this point. If native wild ruminants (red deer (Cervus elaphus), fallow deer (Dama dama), mouflon (Ovis aries musimon) and roe deer (Capreolus capreolus)) are susceptible to BTV, they could play a role as a virus reservoir and must be considered in an effective control strategy. From April 2008 to March 2011, a monitoring for the detection of BTV was carried out in Thuringia. The role of indigenous wild ruminants in the epidemiology of BT during the BTV-8 epidemic was to be investigated. In the course of the study period 2535 blood and 3922 muscle samples from 4204 fenced and free ranging wild ruminants (red deer, fallow deer, mouflon, roe deer and sika) were examined for BTV. For red deer, fallow deer and mouflon, the proportion of the tested samples on the hunting bag in the season 2008/09 was 3.7 %, 4.1 % and 24.3 % and decreased in the following hunting seasons to 0.4 %, 0.3 % and 5.3 %, respectively. In the case of roe deer, the proportion was between 0.8 % and 1.7 % in all hunting seasons. From the hunting seasons 2008/09 to 2010/11, the detected seroprevalences in mouflons (n=354) decreased from 4.1 % to 1.3 %, in fallow deer (n=1721) from 0.7 % to 0.0 % and in red deer (n=283) from 3.2 % to 0.0 %. These findings show the susceptibility and the exposure of these species to BTV in Thuringia. No antibodies against BTV could be detected in blood samples of roe deer (n=132) over the entire period of observation. BT virus genome was not detected in any of the 2535 investigated blood samples by RT-qPCR. The declining seroprevalences in red deer, fallow deer and mouflon and the absence of viral genome indicate that there were no new infections and no persistence of BTV-8 in the wild ruminant population. It can be assumed that there was no circulation of BTV-8 in the wild ruminant population in Thuringia during the study period, which would have been comparable to the 'wild cycle' reported from Spain. Roe deer appears to be far less susceptible to BTV-8 infection than other wild ruminants, therefore its importance for the spread of BTV-8 is negligible. To detect the reoccurrence of BTV infections in Germany or Central Europe as soon as possible, for outbreak control, to estimate the risk of infection in the wild ruminant population and to assess if a wild ruminant cycle has been established, the investigation of wild ruminant species (red deer, fallow deer and mouflon), especially the sampling of farmed wild ruminants, is recommended in addition to monitoring programs in the livestock sector. The Data of this study shows that EDTA blood is a suitable sample matrix for both, antibody and genome detection of BTV in wild ruminants, which can be easily collected during the ante and post mortem inspection.

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Einleitung Zytokine bewirken maßgeblich die Kommunikation und Koordination der zellulären und humoralen Effektorsysteme der angeborenen und erworbenen Immunität. Die Immunzellen stellen selbst die Hauptproduzenten der Zytokine dar. Pro- und anti-inflammatorische Zytokine nehmen nicht nur innerhalb der Zellkommunikation ablaufender Immun- und Entzündungsreaktionen eine Schlüsselrolle ein, sondern sind somit ebenso am Ablauf von Pathogenesen zahlreicher Erkrankungen beim Pferd beteiligt. Trotz verschiedener Studien anhand unterschiedlicher Modelle existiert keine einheitliche Datenlage zu validierten, vergleichbaren in vivo-nahen Zellkultursystemen, die es erlauben die Kinetiken equiner Zytokine als Grundlage zur weiterführenden Erforschung von Zytokinwechselwirkungen sowie zur Testung potentieller Arzneimittel abzubilden. Aktuell werden insbesondere Glukokortikoide weiterhin aufgrund ihrer anti-inflammatorischen und immunmodulatorischen Eigenschaften häufig, aber in Bezug auf Zytokine unspezifisch zur Therapie equiner Erkrankungen eingesetzt. Ziele der Untersuchung Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, eine einfache, schnelle, günstige und reproduzierbare Methodik zur ex vivo-Messung von Zytokinen (Tumornekrosefaktor-alpha [TNF-α], Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist [IL-1Ra] und Interferon gamma [IFN-γ]) und deren zeit- und konzentrationsabhängige Freisetzung in der equinen Vollblutzellkultur zu entwickeln. Anhand dessen sollte weiterführend der Effekt der Glukokortikoide Dexamethason (DEX) und Hydrocortison (HC) auf die Produktion von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ im equinen Vollblut untersucht werden. Zurzeit sind Zytokine, ihre Freisetzung sowie das Eintreten ihrer vermittelten Effekte Gegenstand der gegenwärtigen Forschung, mit dem Ziel spezifische Wechselwirkungen aufzuzeigen und somit zielgerichtete Therapeutika etablieren zu können. Insbesondere Pferde, die eine Anfälligkeit gegenüber mit Sepsis einhergehenden Erkrankungen oder für equines Asthma aufweisen, könnten davon profitieren. Material und Methoden Hierfür wurde Pferdevollblut, in den Verdünnungen zu 10%, 20% und 50% eingesetzt und mit Lipopolysaccharid (LPS), einer Kombination aus Phytohämagglutinin, Concanavalin A, Pokeweed-Mitogen und LPS (PCPwL) oder equinem rekombinantem TNF-a (erTNF-α) zur Zytokinfreisetzung stimuliert. Zur Erstellung der Zytokinkinetiken wurden Zellkulturüberstände zu verschiedenen Zeitpunkten gesammelt und die Konzentrationen von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ mit spezifischen enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) analysiert. In weiterführenden Versuchen wurden in der etablierten equinen Vollblutzellkultur DEX und HC in Konzentrationen von 10-12 - 10-5 M eingesetzt, um die LPS- oder PCPwL- induzierte Zytokinfreisetzung zu modulieren. Statistische Analysen erfolgten über die Berechnungen der Mittelwerte mit den dazugehörigen Standardfehlern. Signifikanzen wurden über ein- und zweifaktorielle ANOVA bestimmt. Ergebnisse Die durchgeführten Untersuchungen ergaben, dass die optimale Detektion der Zytokine in equinen Vollblutzellkulturen mit einem Blutanteil von 20% durchgeführt werden kann. TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ wurden zeitabhängig freigesetzt und zeigten unterschiedliche Freisetzungskinetiken. Die PCPwL- induzierte TNF-α- und IL-1Ra-Freisetzung stiegen jeweils kontinuierlich über 24 - 48 Stunden an. In ähnlicher Weise erreichte die LPS- stimulierte TNF-α-Konzentration ein Maximum zu Zeitpunkten zwischen 8 - 12 Stunden und begann daraufhin abzufallen, wohingegen die Konzentration von IL-1Ra 24 Stunden später gipfelte und vielmehr fortgeführt über 48 Stunden hinaus akkumulierte. Equines rekombinantes TNF-α konnte ebenso die IL-1Ra-Freisetzung induzieren. Die PCPwL-induzierte IFN-γ-Freisetzung begann zeitversetzt und verlief kontinuierlich ansteigend über 48 - 72 Stunden. In weiterführenden konzentrationsabhängigen Untersuchungen konnte anhand der equinen Vollblutzellkultur eine stärkere Suppression der LPS-induzierten TNF-α- und IL-1Ra-Produktion sowie der PCPwL-induzierten IFN-γ-Produktion durch DEX als durch HC nachgewiesen werden. DEX hemmte die Zytokinfreisetzung mit einer mittleren inhibitorischen Konzentration (IC50) von 0,09 μM (TNF-α), 0,453 μM (IL-1Ra) und 0,001 μM (IFN-γ), während HC IC50 Werte von 1,45 μM (TNF-α), 2,96 μM (IL-1Ra) und 0,09 μM (IFN-γ) aufwies. Schlussfolgerungen Schlussfolgernd kann zusammengefasst werden, dass sich das Model der equinen Vollblutzellkultur hervorragend eignet, um nach erfolgreicher Mitogenstimulation den zeitabhängigen Freisetzungsverlauf von Zytokinen evaluieren zu können. Somit bietet das Model der equinen Vollblutzellkultur durch die Vorteile einer einfachen, günstigen Durchführung im in vivo-nahen, physiologischen Milieu, die Möglichkeit den Zytokinstatus gesunder sowie kranker Pferde zu beurteilen und stellt seinen Nutzen und die Verlässlichkeit unter Beweis potentielle Arzneimittel und immunologische Zusammenhänge des Pferdes untersuchen zu können.:INHALTSVERZEICHNIS I ABBILDUNGSVERZEICHNIS III TABELLENVERZEICHNIS III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 Allgemeine wissenschaftliche Hintergründe 3 2.1.1 Das Blut und das Immunsystem des Pferdes 3 2.1.1.1 Zusammensetzung des equinen Blutes 3 2.1.1.2 Allgemeiner Aufbau des Immunsystems 4 2.1.2 Zytokine und Entzündungsreaktionen - Mediation der Immunantwort durch Zytokine und Chemokine 14 2.1.2.1 Pro-inflammatorische Zytokine: Tumornekrosefaktor-α und Interferon-γ 17 2.1.2.2 Anti-inflammatorische Zytokine: Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist 19 2.2 Therapeutische Beeinflussung der Zytokin- und Mediator-Freisetzung 21 2.2.1 Inhibition der Zytokinfreisetzung durch Glukokortikoide 21 2.2.2 Inhibition der Zytokinfreisetzung durch weitere Pharmaka und Substanzen 23 2.2.2.1 NSAID 23 2.2.2.2 Small molecules und Anti-Zytokinantikörper 24 2.3 Equine Zellkulturmodelle zur Zytokindetektion 25 2.3.1 Stimulation der Zytokinfreisetzung 26 2.3.2 Vollblutzellkultursysteme und Systeme mit isolierten Zellen 27 2.4 Fragestellung der Dissertation 30 3 PUBLIKATIONEN 31 3.1 Freisetzungskinetik von TNF-α und IL-1Ra im equinen Vollblut 32 3.2 Modulation der Freisetzung von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ in der equinen Vollblutzellkultur durch Glukokortikoide 40 4 DISKUSSION 45 4.1 Zytokinfreisetzung im equinen Vollblut 46 4.2 Der Einfluss von Glukokortikoiden auf die Zytokinfreisetzung 52 4.3 Schlussfolgerungen 56 4.4 Ausblick 56 5 ZUSAMMENFASSUNG 58 6 SUMMARY 60 7 LITERATURVERZEICHNIS 62 8 ANHANG 72 8.1 Freisetzungskinetik von IFN-γ 72 8.2 Konzentration von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ in der equinen Vollblutzellkultur 72 9 DANKSAGUNG 74 / Introduction The communication and coordination between the cellular and humoral effector compartments of the innate and adaptive immunity were mainly accomplished by cytokines. Immunocompetent cells themselves represent the main source for cytokines. Pro- and anti-inflammatory cytokines not only play a pivotal role within the cell signaling of expiring immune- and inflammatory reactions but also take part in the pathogenesis of several equine diseases. Despite various studies based on different experimental setups no uniform availability of data about validated, comparable in vivo cell culture systems exists which enables the description of the kinetically time course of cytokines as foundation of further investigations of cytokine interactions as well as the testing of potential drugs. These days especially glucocorticoids are still frequently used for treatment of equine diseases because of their anti-inflammatory and immunomodulatory, but with respect to cytokines unspecific properties. Objectives of the investigations The aim of the study was to develop an easy, quick, cheap and reproducible ex vivo method for measuring cytokines (tumor necrosis factor alpha [TNF-α], interleukin-1 receptor antagonist [IL-1Ra] and interferon gamma [IFN-γ]) and their time- and concentration-dependent release in the equine whole blood cell culture. Whereby the impact of the glucocorticoids dexamethasone (DEX) and hydrocortisone (HC) on production of TNF-α, IL-1Ra and IFN-γ should be investigated subsequently. Currently, cytokines, their release and eventuation of their mediated effects are objects of actual research with the aim to reveal specific interactions and thus be able to establish purposeful therapeutic agents. This could be beneficial especially for horses which display a susceptibility to septic diseases or equine asthma. Material and Methods Therefore horse whole blood diluted to 10%, 20% and 50% was stimulated with lipopolysaccharide (LPS), a combination of phytohemagglutinin, concanavalin A, pokeweed mitogen and LPS (PCPwL) or equine recombinant TNF-α (erTNF-α). To generate cytokine kinetics TNF-α, IL-1Ra and IFN-γ were analyzed in culture supernatants, which were collected at different time points using specific enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). In further investigations within the equine whole blood cell culture DEX and HC were applied with concentrations between 10-12 and 10-5 M to modulate LPS- or PCPwL-induced cytokine release. Statistics were performed by calculation of means with associated standard errors. Statistical significances were assessed by one- and two-way analysis of variance. Results The evaluations revealed that cytokines could be detected optimal in whole blood cell cultures with 20% blood volume. TNF-α, IL-1Ra and IFN-γ were released time-dependently and differing kinetics were displayed. PCPwL-induced TNF-α and IL-1Ra release was enhanced continuously over 24 - 48 hours, respectively. Similarly, LPS-stimulated TNF-α was at maximum at time points between 8 - 12 hours and started to decrease thereafter, whereas IL-1Ra peaked 24 hours later and rather continued to accumulate beyond 48 hours. ErTNF-α could induce also the IL-1Ra release. PCPwL- induced IFN-γ release started time displaced and showed a continuously enhanced course over 48 - 72 hours. In subsequent investigations within equine whole blood cell culture, LPS-induced TNF-α and IL-1Ra as well as PCPwL-induced IFN-γ production were more potently suppressed concentration-dependently by DEX than by HC. DEX inhibited cytokine release with the inhibition concentration (IC50) 0.09 μM (TNF-α), 0.453 μM (IL-1Ra) and 0.001 μM (IFN-γ), whereas HC with IC50 values of 1.45 μM (TNF-α), 2.96 μM (IL-1Ra) and 0.09 μM (IFN-γ). Conclusion In conclusion our results could suggest the eminent suitability of equine whole blood cell culture to assess the release of a variety of cytokines following successful mitogen stimulation. Therefore the model of the equine whole blood cell culture provides, because of its advantages including simple and cheap performance in an in vivo close physiological ambient, the opportunity to evaluate the cytokine status of healthy and diseased horses. Furthermore it could give the proof of its benefit and reliability to evaluate potential equine drugs and immunological coherences of the horse.:INHALTSVERZEICHNIS I ABBILDUNGSVERZEICHNIS III TABELLENVERZEICHNIS III ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV 1 EINLEITUNG 1 2 LITERATURÜBERSICHT 3 2.1 Allgemeine wissenschaftliche Hintergründe 3 2.1.1 Das Blut und das Immunsystem des Pferdes 3 2.1.1.1 Zusammensetzung des equinen Blutes 3 2.1.1.2 Allgemeiner Aufbau des Immunsystems 4 2.1.2 Zytokine und Entzündungsreaktionen - Mediation der Immunantwort durch Zytokine und Chemokine 14 2.1.2.1 Pro-inflammatorische Zytokine: Tumornekrosefaktor-α und Interferon-γ 17 2.1.2.2 Anti-inflammatorische Zytokine: Interleukin-1 Rezeptor-Antagonist 19 2.2 Therapeutische Beeinflussung der Zytokin- und Mediator-Freisetzung 21 2.2.1 Inhibition der Zytokinfreisetzung durch Glukokortikoide 21 2.2.2 Inhibition der Zytokinfreisetzung durch weitere Pharmaka und Substanzen 23 2.2.2.1 NSAID 23 2.2.2.2 Small molecules und Anti-Zytokinantikörper 24 2.3 Equine Zellkulturmodelle zur Zytokindetektion 25 2.3.1 Stimulation der Zytokinfreisetzung 26 2.3.2 Vollblutzellkultursysteme und Systeme mit isolierten Zellen 27 2.4 Fragestellung der Dissertation 30 3 PUBLIKATIONEN 31 3.1 Freisetzungskinetik von TNF-α und IL-1Ra im equinen Vollblut 32 3.2 Modulation der Freisetzung von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ in der equinen Vollblutzellkultur durch Glukokortikoide 40 4 DISKUSSION 45 4.1 Zytokinfreisetzung im equinen Vollblut 46 4.2 Der Einfluss von Glukokortikoiden auf die Zytokinfreisetzung 52 4.3 Schlussfolgerungen 56 4.4 Ausblick 56 5 ZUSAMMENFASSUNG 58 6 SUMMARY 60 7 LITERATURVERZEICHNIS 62 8 ANHANG 72 8.1 Freisetzungskinetik von IFN-γ 72 8.2 Konzentration von TNF-α, IL-1Ra und IFN-γ in der equinen Vollblutzellkultur 72 9 DANKSAGUNG 74

Dendritische Zellen (DCs) sind befähigt, als potenteste Antigen-präsentierende Zelle anti¬genspezifische Immunantworten zu initiieren und zu regulieren. Mittels in vivo Antigen¬beladung von spezifischen DC-Subpopulationen mit rekombinanten Antigen-gekoppelten Antikörpern gegen C-Typ-Lektinrezeptoren konnte im Mausmodell erfolgreich adaptive zelluläre und humorale Immunantworten hervorgerufen werden. Im Menschen kann dieser Ansatz therapeutisch noch nicht zum Einsatz kommen, da DC-Subpopulationen im humanen Gewebe momentan nicht ausreichend charakterisiert sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden humane Gewebe auf das Vorhandensein der im peripheren Blut beschriebenen DC-Subpopulationen (mDC-1 DCs: CD11c+BDCA1+, mDC-2 DCs: CD11clowBDCA3+ und pDCs: CD11c-CD123+BDCA2+) und die Expression von C-Typ-Lektinrezeptoren (DC-SIGN, MMR, Langerin, DCIR und DEC205) mittels Immun¬fluoreszenz untersucht. Anhand der vorge¬gebenen Marker im peripheren Blut konnten alle drei DC-Subpopulationen in der Milz, Thymus und Tonsillen detektiert werden. Zusätzlich konnte hier erstmalig eine vierte CD11c-CD123-BDCA2+ pDC-2 DC-Subpopulation in der Milz beschrieben werden, deren Funktion derzeit noch näher untersucht wird. Im Thymus konnte CD26 nach FACS-Analysen von Gordon Heidkamp als spezifischer Marker für mDC-2 DCs identifiziert und dies in der vorliegenden Arbeit auch durch Immun¬fluores¬zenzaufnahmen von Gewebeschnitten verifi¬ziert werden. CD26 stellt damit erstmalig einen Marker dar, der erfolgreich als alternativer Marker für BDCA3, welcher unspezifisch an Thrombomodulin bindet, zur Identifikation von mDC-2 DCs in der Immunfluoreszenz von Thymusproben eingesetzt werden könnte. Die getesteten Anti¬körper XCR-1 (monoklonal) und Clec9a (polyklonal) hingegen erschienen in der Immun¬fluoreszenz sowie in FACS-Analysen (Gordon Heidkamp) nicht geeignet. Weiterhin wurde die Expression ausgewählter C-Typ-Lektinrezeptoren (MMR, Langerin, DCIR, DC-SIGN und DEC205) im vorhandenen Gewebe näher betrachtet. Nach Auswertung der Immun¬fluoreszenzen konnte eine weit verbreitete Expression der untersuchten C-Typ-Lektin¬rezeptoren in humaner Milz und Thymus gefunden werden. Einzig hDCIR war auf vereinzelten Zellen exprimiert, und Langerin im Thymus nicht detektierbar. Um nicht verfügbare monoklonale Antikörper gegen C-Typ-Lektinrezeptoren zu produzieren und später Antigene an diese koppeln zu können, sollten lösliche Proteine einiger C-Typ-Lektinrezeptoren (humanes und murines Clec9a, Dectin-1 und -2, Langerin) produziert werden. Dabei gelang es bereits, lösliche Proteine der C-Typ-Lektinrezeptoren von humanem und murinem Dectin-1 zu generieren und diese zur weiteren Antikör¬per¬produktion einzusetzen.

Einleitung: Ausgangspunkt für die Untersuchungen sind Projektergebnisse aus der Mastphase, nach denen Fußballen von 45 % der in Deutschland gehaltenen Mastputen in der 6. Lebenswoche Epithelnekrosen aufweisen. Die vorliegende Arbeit ist Teil eines Folgeprojekts für die Aufzuchtphase und leitet aus den gewonnenen Ergebnissen Tierschutzindikatoren für die ersten Wochen ab. Ziele der Untersuchungen: Ziel der Arbeit war die Erhebung der Prävalenz von Fußballenentzündungen in der Aufzuchtphase von in Deutschland gehaltenen Mastputen des Hybrids B.U.T. 6 und die Messung der Einstreufeuchtigkeit in diesem Zeitraum. Tiere, Material und Methoden: Am Folgeprojekt nahmen bundesweit 46 Herden von 24 Betrieben teil. Aus jeder Herde wurden jeweils 60 Einzeltiere in der 1. Woche, dem ersten Untersuchungszeitpunkt (U1), und innerhalb der 4. und 5. Woche, dem zweiten Untersuchungszeitpunkt (U2), klinisch untersucht. Insgesamt wurden 5.531 Mastputen erfasst, davon 3.131 Hähne und 2.400 Hennen. Die Fußballen wurden mit Hilfe eines 5-stufigen Bewertungssystems beurteilt. Parallel zur klinischen Untersuchung wurden Einstreuproben aus dem Tränke-, Futter- und Ruhebereich sowie Vergleichsproben vor der Einstallung gezogen, insgesamt 625 Proben, und die Feuchtigkeit mit einem thermogravimetrischen Verfahren bestimmt. Die Tierhalter/-innen wurden zu den Haltungsbedingungen, zum Stallmanagement und zur Herkunft der Herde mit Hilfe von standardisierten Bögen befragt. Die biometrische Auswertung erfolgte mit Methoden der explorativen Datenanalyse, Hypothesentests und logistischen Regressionsmodellen. Die Betriebe wurden anschließend miteinander verglichen anhand der Parameter Fußballenscore, Einstreufeuchtigkeit, Mortalität sowie Gewichtsdifferenz zwischen Ist- und Sollwert. Ergebnisse: Die Aufzuchtställe waren am häufigsten mit Holzspänen eingestreut, aber auch Stroh, Strohpellets, Lignocellulose, Dinkelspelzen und Maisspindelgranulat wurden verwendet. Die Einstreufeuchtigkeit betrug im Stall 11 % vor Einstallung, 29 % zum U1 und 40 % zum U2. Unterschiede in der Einstreufeuchtigkeit zeigten sich in Abhängigkeit von der Lokalisation (am höchsten im Tränkebereich), dem Aufzuchtsystem, der Art der Einstreu und dem Tränkesystem (am höchsten um Rundtränken). Zum U1 hatten nach dem Bewertungssystem 27,3 % der Küken Veränderungen am rechten Fußballen. Die Veränderungen bestanden vor allem aus Hyperkeratosen, lediglich 0,1 % der Tiere hatte Epithelnekrosen. An den Fußballen wurden zusätzlich Rötungen und oberflächliche Hautrisse festgestellt, die nicht Teil des Bewertungssystems waren. Mehr Tiere waren von Veränderungen betroffen, wenn, statt des rechten, der stärker geschädigte Fußballen in die Beurteilung einbezogen wurde. Die Zahl betroffener Tiere stieg unter Berücksichtigung von allen Veränderungen an beiden Fußballen auf 48,9 %. Zum U2 hatten gemäß Bewertungsschema 63,3 % der Jungputen Veränderungen am rechten Fußballen. Hyperkeratosen unterschiedlichen Schweregrads zum Teil mit nicht ohne Substanzverlust lösbaren Schmutzanhaftungen prägten das Bild hauptsächlich, aber 12,1 % der Tiere hatten Epithelnekrosen und 0,2 % der Tiere wiesen eine Ballenläsion auf. Unter Berücksichtigung aller Schäden und beider Fußballen stieg die Zahl betroffener Tiere auf 77,0 %. Die Mortalität betrug 0,5 % zum U1 und 2,1 % zum U2. Die Körpergewichte blieben 6 % zum U1 und 9 % zum U2 unterhalb der vom Zuchtunternehmen empfohlenen Werte für das jeweilige Alter. Zum U1 wurden die Küken in klassischen Kükenringen, in „Großringen“ sowie in ringfreier Aufzucht gehalten mit durchschnittlichen Besatzdichten von 27, 16 und 10 Küken/m². Nach Auflösung der Ringe lag zum U2 die Besatzdichte durchschnittlich bei 9 Jungputen/m². Die statistische Analyse ergab, dass eine feuchtere Einstreu sich negativ auf die Fußballengesundheit auswirkt. Der Zustand der Fußballen zum U2 war auf Strohpellets besser als auf Holzspänen und Stroh. Ein Anstieg des Alters der Tiere, des Körpergewichts und der Verweildauer auf der Einstreu wirkte sich ebenfalls negativ auf die Fußballengesundheit aus. Diese drei Parameter ließen sich statistisch nicht voneinander trennen. Zum U1 führte eine höhere Besatzdichte auf Holzspänen signifikant zu einer feuchteren Einstreu, für die anderen Einstreuarten war die Stichprobe zu klein. Schlussfolgerungen: „Großringe“ erwiesen sich in Kombination mit weiteren Haltungsbedingungen als vorteilhaft für die Tiergesundheit. In Bezug auf die Flächenbelegung können zu Beginn und am Ende der Aufzuchtphase Besatzdichten wie in der Endmast erreicht werden. Das in der Praxis angewendete Einstreumanagement verhindert weder das Ansteigen der Einstreufeuchtigkeit noch eine Zunahme an Fußballenentzündungen während der Aufzuchtphase. Die Betriebe unterscheiden sich in der Fußballengesundheit während der Aufzuchtphase. Eine von 46 Herden ist kurz vor Umstallung frei von Fußballenveränderungen. Aus den vorliegenden Ergebnissen lassen sich drei Tierschutzindikatoren mit Grenzwerten für ein 3-stufiges Ampelsystem ableiten. Für die Mortalität werden Grenzwerte für Stufe 1 von 1,5 und für Stufe 2 von 2,5 % empfohlen. Der Fußballenscore wird auf 0,5 und 1,0 bei maximaler Kategorie von I des Bewertungssystems begrenzt. Die Einstreuqualität ist in Stufe 1 trocken und locker oder in Stufe 2 trocken und locker mit feuchtem nicht mit Kot verklebtem Tränkebereich, wobei trocken mit einer Einstreufeuchtigkeit von unter 30 % definiert wird. Weiterer Forschungsbedarf besteht für Tierschutzindikatoren, die Wohlbefinden und Angst charakterisieren; und im Einfluss der Besatzdichte auf die Tiergesundheit und das Verhalten.:1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Aufzucht 2.2 Tränke 2.3 Einstreu 2.3.1 Einstreumaterial 2.3.2 Feuchtigkeitsursachen 2.3.3 Einstreumanagement 2.3.4 Krankheitsursache Einstreu 2.4 Fußballenentzündung 2.4.1 Klinik und Pathologie 2.4.2 Epidemiologie 2.4.3 Beurteilung der Fußballen 2.5 Tierschutzindikatoren 3. Tiere, Material und Methoden 3.1 Bestände und Untersuchungszeitraum 3.2 Datenerhebung 3.3 Besatzdichte 3.4 Untersuchung der Einstreu 3.4.1 Probennahme und -vorbereitung 3.4.2 Bestimmen der Einstreufeuchtigkeit 3.5 Beurteilung der Fußballen 3.6 Statistik 3.6.1 Fallzahlplanung 3.6.2 Deskriptive Statistik und Hypothesentests 3.6.3 Modelle 3.6.4 Vergleiche 4. Ergebnisse 4.1 Erhebung konstanter Daten 4.1.1 Betriebsdaten 4.1.2 Personal 4.1.3 Stallart und -einrichtung 4.1.4 Fütterungstechnik 4.1.5 Tränketechnik 4.2 Erhebung variabler Daten 4.2.1 Ablauf der Aufzuchtphase 4.2.2 Mortalität 4.2.3 Besatzdichte 4.2.4 Einstreubeschaffenheit 4.3 Einstreu 4.3.1 Feuchtigkeit 4.3.2 Management 4.4 Klinische Untersuchung 4.4.1 Ernährungs- und Entwicklungszustand 4.4.2 Kot 4.4.3 Fußballen 4.5 Weiterführende Statistik 4.5.1 Beginn von Fußballenveränderungen 4.5.2 Modelle 4.5.3 Betriebsvergleiche 4.5.3.1 Mortalität 4.5.3.2 Körpermassedifferenz 4.5.3.3 Einstreufeuchtigkeit 4.5.3.4 Fußballengesundheit 5. Diskussion 5.1 Methodenkritik 5.2 Einzelne Aspekte zu den Haltungsbedingungen 5.3 Mortalität 5.4 Besatzdichte 5.5 Einstreu 5.6 Einstreufeuchtigkeit 5.7 Fußballenveränderungen 5.7.1 Beurteilung der Fußballen 5.7.2 Fußballenergebnisse 5.7.3 Ursachen 5.7.3.1 Einstreufeuchtigkeit 5.7.3.2 Körpermasse 5.7.3.3 Geschlecht 5.7.3.4 Alter 5.7.3.5 Verweildauer 5.7.3.6 Art der Einstreu 5.7.3.7 Einstreumanagement 5.7.4 Grenzwert für die Einstreufeuchtigkeit 5.7.5 Vergleich von Aufzuchtphase und Beginn der Mastphase 5.8 Vergleichsparameter 5.9 Beurteilung von Betrieben 5.10 Indikatoren für die Aufzuchtphase 5.11 Schlussfolgerungen 5.12 Empfehlungen und Forschungsbedarf 6. Zusammenfassung 7. Summary 8. Literaturverzeichnis 9. Anhang 9.1 Rohdaten und ergänzende Übersichten 9.2 Fragebögen 9.3 Fotos 10. Danksagung / Introduction: The starting point for the examinations are project results from the fattening phase, according to which at the age of 6 weeks footpads with epithelial necrosis are common in 45% of fattening turkeys kept in Germany. The present study is part of a follow-up project for the rearing period and deduces animal welfare indicators for the first weeks from the results obtained. Aim of this study: The aim of this study was to survey the prevalence of footpad dermatitis in the rearing period of B.U.T. 6 fattening turkeys and the measurement of litter moisture in this period. Animals, material and methods: At total number of 46 flocks from 24 farms nationwide were part of the follow-up project. From each flock, 60 individual animals were examined clinically at examination time point 1 (U1) during the first week, and at examination time point 2 (U2) during week 4 and 5. A total of 5,531 fattening turkeys were recorded, including 3,131 gobblers and 2,400 turkey hens. The footpads were assessed with the aid of a 5-stage evaluation scheme. Parallel to the clinical examination, litter samples were taken from the drinking, feeding, and resting areas as well as comparison samples before birds entered the barn, a total of 625 litter samples. The moisture was determined by a thermogravimetric method. The livestock owners were surveyed on the husbandry conditions, the barn management, and the origin of the flock, using standardized questionnaires. The biometric evaluation was carried out using exploratory data analysis, hypothesis tests and logistic regression models. The farms were then compared with each other by means of the parameter of scoring of footpads, litter moisture, as well as mortality and weight difference between actual value and setpoint. Results: The most commonly used litter found in the rearing barns were wood shavings, but also straw, straw pellets, lignocelluloses, spelt husks, and corncob granules utilized. The litter moisture was 11% before birds entered the barn, 29% at U1, and 40% at U2. Differences in the litter moisture were found depending on the location (highest in the drinking area), the rearing system, the type of litter, as well as the watering system (highest near round drinkers). Using the evaluation scheme, at U1 27.3% of the poults had changes to the right footpad. The changes consisted mainly of hyperkeratosis, only 0.1% of the animals had epithelial necrosis. Outside of the scheme, redness and superficial skin cracks were found on the footpads. In addition, more animals were affected by changes when, instead of the right one, the more severely damaged footpad was included in the assessment. Taking into account all changes in both footpads, the number of affected animals increased to 48.9%. According to the evaluation scheme, 63.3% of the young turkeys had changes on the right footpad at U2. Hyperkeratosis of different severity degrees partially with dirt adhesions not removable without loss of substance, mainly characterized the picture, but 12.1% of the animals had epithelial necrosis and 0.2% of the animals had deep lesions. Taking into account all the damages and both footpads, the number of affected animals increased to 77.0%. The mortality was 0.5% at U1 and 2.1% at U2. The body weights remained at 6% (U1) and 9% (U2) below the recommended values for the respective age. At U1 the poults were kept in classical poult rings, “large poult rings”, and ringless rearing with average stocking densities of 27, 16 and 10 poults/m². After dismantling at U2 the stocking density averaged 9 young turkeys/m². The statistical analysis showed that a moister litter has a negative impact on the footpad health. In addition, the condition of the footpads during U2 on straw pellets was better than on wood shavings and straw. An increase in the age of the animals, the body weight and the length of stay on the litter also had a negative effect on the footpads. These three parameters cannot be separated statistically. During U1 a higher stocking density on wood shavings resulted in a moister litter significantly. For the other litter types the sample was too small to draw a comparison. Conclusions: “Large poult rings” proved to be beneficial for animal health in combination with other housing conditions. At the beginning and end of the rearing period, finishing period resembling stocking densities can be achieved in relation to the area occupation. stocking densities can be achieved in the same way as in the finishing period in relation to the area occupation. The litter management used in practice prevents neither the increase in litter moisture nor an increase in footpad dermatitis during the rearing period. Farms differ in footpad health during the rearing period. One out of 46 flocks is free of footpad changes at the end of the rearing period. From the present results three animal welfare indicators with limits for a 3-level traffic light system can be derived. For mortality, limits for stage 1 of 1.5% and stage 2 of 2.5% are recommended. The footpad score is limited respectively 0.5 and 1.0 at the maximum category of I of the evaluation scheme. The litter is dry and loose (stage 1) or dry and loose with a moist, non faeces clotted drinking area (stage 2), whereby dry is defined as a litter moisture of less than 30%. Further research is needed for animal welfare indicators that characterize well-being and fear, and in the influence of stocking density on animal health and behavior.:1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Aufzucht 2.2 Tränke 2.3 Einstreu 2.3.1 Einstreumaterial 2.3.2 Feuchtigkeitsursachen 2.3.3 Einstreumanagement 2.3.4 Krankheitsursache Einstreu 2.4 Fußballenentzündung 2.4.1 Klinik und Pathologie 2.4.2 Epidemiologie 2.4.3 Beurteilung der Fußballen 2.5 Tierschutzindikatoren 3. Tiere, Material und Methoden 3.1 Bestände und Untersuchungszeitraum 3.2 Datenerhebung 3.3 Besatzdichte 3.4 Untersuchung der Einstreu 3.4.1 Probennahme und -vorbereitung 3.4.2 Bestimmen der Einstreufeuchtigkeit 3.5 Beurteilung der Fußballen 3.6 Statistik 3.6.1 Fallzahlplanung 3.6.2 Deskriptive Statistik und Hypothesentests 3.6.3 Modelle 3.6.4 Vergleiche 4. Ergebnisse 4.1 Erhebung konstanter Daten 4.1.1 Betriebsdaten 4.1.2 Personal 4.1.3 Stallart und -einrichtung 4.1.4 Fütterungstechnik 4.1.5 Tränketechnik 4.2 Erhebung variabler Daten 4.2.1 Ablauf der Aufzuchtphase 4.2.2 Mortalität 4.2.3 Besatzdichte 4.2.4 Einstreubeschaffenheit 4.3 Einstreu 4.3.1 Feuchtigkeit 4.3.2 Management 4.4 Klinische Untersuchung 4.4.1 Ernährungs- und Entwicklungszustand 4.4.2 Kot 4.4.3 Fußballen 4.5 Weiterführende Statistik 4.5.1 Beginn von Fußballenveränderungen 4.5.2 Modelle 4.5.3 Betriebsvergleiche 4.5.3.1 Mortalität 4.5.3.2 Körpermassedifferenz 4.5.3.3 Einstreufeuchtigkeit 4.5.3.4 Fußballengesundheit 5. Diskussion 5.1 Methodenkritik 5.2 Einzelne Aspekte zu den Haltungsbedingungen 5.3 Mortalität 5.4 Besatzdichte 5.5 Einstreu 5.6 Einstreufeuchtigkeit 5.7 Fußballenveränderungen 5.7.1 Beurteilung der Fußballen 5.7.2 Fußballenergebnisse 5.7.3 Ursachen 5.7.3.1 Einstreufeuchtigkeit 5.7.3.2 Körpermasse 5.7.3.3 Geschlecht 5.7.3.4 Alter 5.7.3.5 Verweildauer 5.7.3.6 Art der Einstreu 5.7.3.7 Einstreumanagement 5.7.4 Grenzwert für die Einstreufeuchtigkeit 5.7.5 Vergleich von Aufzuchtphase und Beginn der Mastphase 5.8 Vergleichsparameter 5.9 Beurteilung von Betrieben 5.10 Indikatoren für die Aufzuchtphase 5.11 Schlussfolgerungen 5.12 Empfehlungen und Forschungsbedarf 6. Zusammenfassung 7. Summary 8. Literaturverzeichnis 9. Anhang 9.1 Rohdaten und ergänzende Übersichten 9.2 Fragebögen 9.3 Fotos 10. Danksagung

Einleitung Der intensive Einsatz von Pflanzenschutzmitteln in der konventionellen Landwirtschaft kann zum Eintrag von Rückständen in die Nahrungskette führen. Milchliefernde Rinder nehmen Pflanzenschutzmittelrückstände mit dem Futter auf, die durch aktive Sekretion in die Milch eine Gefährdung für sensible Bevölkerungsgruppen, wie Kinder, verursachen könnten. Die in nationalen Rückstandskontrollen untersuchten Milchproben unterschreiten zwar in der Regel die gesetzlich festgelegten Höchstgrenzen (Maximum Residue Level, MRL), jedoch kann eine andauernde Belastung mit Pflanzenschutzmitteln die Entstehung chronischer Erkrankungen, wie Morbus Parkinson und Kinderleukämie, fördern. Im Rindereuter stellt der ATP-binding cassette Transporter der Subfamilie G2 (ABCG2) den wichtigsten Transportweg für Fremdstoffe in die Milch dar. Mit seinem breiten Substratspektrum ist der bovine ABCG2-Transporter (bABCG2) in der Lage, unterschiedliche Substrate in die Kuhmilch zu transportieren. Jedoch ist bislang unklar, ob auch Pflanzenschutzmittel bABCG2-vermittelt in die Milch sezerniert werden können und ob die gleichzeitige Aufnahme mehrerer Rückstände die bABCG2-Effluxaktivität beeinflusst. Ziele der Untersuchungen Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von Pflanzenschutzmitteln als mögliche Substrate des bovinen Effluxtransporters. Weiterhin wurde untersucht, ob zwischen zwei Wirkstoffen synergistische oder antagonistische Effekte am bABCG2-Transporter auftreten. Material und Methoden Es wurden 14 häufig in der konventionellen Landwirtschaft eingesetzte Pflanzenschutzmittel in 0,1-, 1- und 10-facher MRL-Konzentration, in Bezug auf essbare Gewebe von Rindern, untersucht. Weiterhin wurden sechs Kombinationen aus jeweils zwei Wirkstoffen ausgewählt. Im WST-1 (Water Soluble Tetrazolium 1) Assay wurden MDCKII-bABCG2-Zellen in aufsteigender Konzentration mit den Pflanzenschutzmitteln inkubiert (72 h) und die Zellvitalität ermittelt. Nach Inkubation der MDCKII-bABCG2- und MDCKII-Mock-Zellen mit den ausgewählten Pflanzenschutzmitteln oder den Kombinationen (4 h) wurde der Hoechst 33342-Akkumulationsassay durchgeführt. Dabei führt eine Interaktion des Pflanzenschutzmittels mit dem bABCG2-Transporter zu einer intrazellulären Anreicherung des Hoechst 33342-Farbstoffes. Für die Identifikation signifikanter Unterschiede wurden jeweils mindestens zwölf Monolayer auf Normalverteilung (Shapiro-Wilk-Test) überprüft und eine Einweg-Varianzanalyse mit Holm-Šidák post hoc Test (p ≤ 0,05) durchgeführt. Ergebnisse Nachdem eine Beeinträchtigung der Zellvitalität durch die ausgewählten Pflanzenschutzmittel in 0,1- bis 10-facher MRL-Konzentration ausgeschlossen wurde, konnte im Hoechst 33342-Assay für Chlorpyrifos-methyl und Tebuconazol ab 0,1-facher MRL-Konzentration eine signifikante Zunahme der intrazellulären Hoechst 33342-Gehalte im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle nachgewiesen werden. Für Diflufenican, Glyphosat, Methiocarb, Prochloraz, Rimsulfuron sowie Thiacloprid konnte in 1- und 10-facher MRL-Konzentration und für Iprodion sowie Ioxynil in 10-facher MRL-Konzentration eine signifikant erhöhte Hoechst 33342-Anreicherung detektiert werden. Darüber hinaus führte eine gleichzeitige Applikation von Methiocarb und Chlorpyrifos-methyl in 1-facher MRL-Konzentration, sowie von Glyphosat und Rimsulfuron in 10-facher MRL-Konzentration zu einer synergistischen Steigerung der Farbstoffakkumulation. Schlussfolgerung Es konnte festgestellt werden, dass das MDCKII-Zellmodell in Kombination mit dem Hoechst 33342-Assay eine valide Methode darstellt, um Wechselwirkungen einzelner und kombinierter Pflanzenschutzmittel zu detektieren. Insgesamt konnten unterhalb gesetzlich festgelegter MRL-Werte acht Pflanzenschutzmittel als potentielle bABCG2-Substrate identifiziert, sowie additive Effekte von Wirkstoffkombinationen nachgewiesen werden. Durch die Aufnahme von Pflanzenschutzmitteln mit dem Futter könnten diese aktiv in die Milch sezerniert werden und somit eine Gefahr für den Verbraucher darstellen:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 4 2.1 Überblick über Membrantransporter 4 2.2 ABCG2-Effluxtransporter 5 2.2.1 Überblick 5 2.2.2 Struktur 6 2.2.3 ABCG2-Transportmechanismus 8 2.2.4 Spezifität der ABCG2-Substrate und Inhibitoren 9 2.2.5 Gewebeexpression 11 2.2.6 Bedeutung 12 2.2.7 Regulation der ABCG2-Transportaktivität 14 2.3 Fremdstoffsekretion der bovinen Milchdrüse 16 2.3.1 Funktionelle Anatomie 16 2.3.2 Transportmechanismen 16 2.3.3 Fremdstofftransporter 17 2.3.4 Bedeutung des ABCG2-Transporters 19 2.4 Pestizide 20 2.4.1 Überblick 20 2.4.2 Einsatz von Pflanzenschutzmitteln 21 2.4.3 Rechtliche Regelungen 21 2.4.4 MRL-Wert-Festsetzung von Pestiziden 22 2.4.5 Exposition des Verbrauchers 23 2.4.6 Gesundheitliche Risiken 24 2.4.7 Pestizide als endokrine Disruptoren 25 2.4.8 Mehrfachrückstände 26 2.4.9 Risikobewertung von Mehrfachrückständen 27 2.5 Problemstellung und Zielsetzung 29 3 Material und Methoden 30 3.1 Material 30 3.1.1 Pestizide 30 3.1.2 Chemikalien 32 3.1.3 Kit 32 3.1.4 Puffer und Lösungen 32 3.1.5 Zellkultur 33 3.1.6 Geräte 34 3.2 Methoden 35 3.2.1 Allgemeine zellbiologische Methoden 35 3.2.1.1 Kultivierung 35 3.2.1.2 Passagieren 35 3.2.1.3 Bestimmung der Zellzahl 35 3.2.1.4 Kryokonservierung 36 3.2.2 Bestimmung der Zellvitalität mittels WST-1 Zytotoxizitätstest 36 3.2.3 Quantitative Proteinbestimmung mittels BCA-Assay 38 3.2.4 Ermittlung von Interaktionen am bABCG2-Transporter 38 3.2.4.1 Aussaat und Vorbehandlung 39 3.2.4.2 Durchführung des Hoechst 33342-Assays 40 3.2.5 Detektion von Pestizidwechselwirkungen am bABCG2-Transporter 41 3.3 Statistik 42 4 Ergebnisse 43 4.1 Auswahl der Pestizide und ihrer Konzentrationen 43 4.2 Auswahl der Pestizidkombinationen 46 4.3 Einfluss der Pestizide auf die Zellvitalität 48 4.4 Interaktionen von Pestiziden am bABCG2-Transporter 53 4.5 Pestizidwechselwirkungen am bABCG2-Transporter 56 5 Diskussion 60 5.1 Zellmodell 60 5.2 Zellvitalitätsstudien in MDCKII-bABCG2-Zellen 61 5.3 Pestizide als potentielle bABCG2-Substrate 64 5.4 Wechselwirkungen von Pestiziden am bABCG2-Transporter 75 5.5 Risiken potentieller bABCG2-Substrate 79 6 Zusammenfassung 80 7 Summary 82 8 Literaturverzeichnis 84 9 Anhang 106 10 Danksagung 111