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Das Afrikanische Schweinepest-Virus (ASPV) verursacht eine tödliche Viruserkrankung bei Schweinen. Dieses hat sich weltweit fortlaufend verbreitet und wurde im September 2020 erstmalig in Deutschland nachgewiesen. Der Ausbruch der Seuche kann schwere wirtschaftliche Verluste nach sich ziehen. Bis heute ist kein Impfstoff zugelassen, daher sind Überwachung der epidemiologischen Situation und der frühzeitige Erregernachweis unerlässlich für die Bekämpfung der Afrikanischen Schweinepest als Tierseuche. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gilt als Goldstandard für den Nachweis von ASPV und zeichnet sich durch eine hohe Sensitivität und Spezifität aus. Allerdings erfordert die PCR gut ausgestattete Testlabore und ist zeitintensiv. Point-of-Need-Tests können schnelle und zuverlässige direkt vor Ort liefern und stellen somit eine Alternative zum Goldstandard PCR dar. Ziel dieser Studie war es, einen Point-of-Need-Test zum Nachweis von ASPV zu entwickeln. Dieser beruht auf der Grundlage der Rekombinase-Polymerase-Amplifikation (RPA) und sollte vor Ort einsatzfähig sein. Es wurden drei Primersätze und eine Sonde auf der Grundlage des B646L-Gens, welches für das virale Kapsidprotein p72 vom ASP-Virus kodiert, entwickelt. Alle möglichen Kombinationen wurden getestet. Die analytische Sensitivität wurde mit acht Wiederholungen von Verdünnungsreihen des molekularen Standards (102-100 DNA-Kopien pro µl) ermittelt. Die Nachweisgrenze wurde anhand einer Probit-Analyse dieser Durchläufe berechnet. Die Spezifität wurde mit verschiedenen viralen Nukleinsäuren von anderen das Schwein infizierenden Erregern überprüft. Um den Test im Feld einsatzfähig zu gestalten, wurden mittels ASPV-RPA zwei verschiedene Extraktionsansätze mit allen 73 verfügbaren Schweineblutproben getestet: eine schnelle Hitze/Lysepuffer-Extraktionsmethode und ein standardisiertes Extraktionsverfahren auf Spin-Säule-Basis. Die diagnostische Sensitivität und Spezifität wurde für beide Testverfahren berechnet. Alle Ergebnisse wurden mit einer etablierten real-time PCR für ASPV verglichen. Eine kleine Pilotstudie zum Feldeinsatz des ASPV-RPA-Tests wurde in Uganda mit 20 Blutproben unter Verwendung des Kofferlabors durchgeführt. Die berechnete Nachweisgrenze von ASPV-RPA lag bei 3,5 DNA-Kopien pro µl. Alle untersuchten ASPV-Genotypen wurden detektiert, aber keine anderen viralen Nukleinsäuren. Bei Verwendung der standardisierten DNA-Extraktionsmethode mit anschließender Durchführung der ASPV-RPA lag die diagnostische Sensitivität und Spezifität bei 100%, wie auch mittels der real-time PCR. Auch das schnelle Hitze-/Lysepuffer Protokoll zeigte vielversprechende Ergebnisse und erreichte eine Positivrate von 97% mittels ASPV-RPA im Vergleich zu 38% bei der PCR. In Uganda wurden elf ASPV-RPA-Proben als positiv erkannt, darunter zwei fieberfreie asymptomatische Tiere. Der schnelle Erregernachweis stellt einen essenziellen Aspekt der ASP Seuchenbekämpfung dar. Die ASPV-RPA erwies sich als genauso empfindlich und spezifisch wie die Goldstandard-PCR zur Erregeridentifizierung. In Kombination mit dem Schritt der DNA-Extraktion durch Hitze/Lysepuffer benötigt der entwickelte Test etwa 25 Minuten von der Probenentnahme bis zum Ergebnis. Die Positivrate ist mit 97% vielversprechend, wobei die ASPV-RPA im Vergleich zur PCR eine höhere Toleranz gegenüber Inhibitoren aufwies. Wie die Pilot-Feldstudie in Uganda mit dem Kofferlabor zeigt, ist ASPV-RPA eine im Feld einsatzfähige Nachweismethode. Das Kofferlabor bedarf lediglich einer Grundausstattung und einer Solarbatterie. Somit stellt das Kofferlabor eine vielversprechende Diagnostikmethode dar, welche vor Ort in ressourcenarmen Umgebungen zum Nachweis des ASPV eingesetzt werden kann.:1. Introduction 2. Literature overview 2.1 African swine fever 2.1.1 Aetiology 2.1.1.1 Classification and taxonomy 2.1.1.2 Viral structure and genome 2.1.1.3 Genetic typing and antigenic variability 2.1.2 Epidemiology 2.1.2.1 Disease distribution 2.1.2.2 Host range and epidemiological cycles 2.1.2.2.1 Warthog-tick cycle 2.1.2.2.2 Domestic pig-tick cycle 2.1.2.2.3 Domestic pig cycle 2.1.2.2.4 Wild boar-environment cycle 2.1.2.3 Tenacity, transmission, and infectivity 2.1.3 Pathophysiology 2.1.3.1 Pathogenesis 2.1.3.2 Clinical signs and pathological findings 2.1.3.3 Differential diagnosis 2.2 Available diagnostic tools for ASFV 2.1.4 Diagnosis based on immune response 2.1.5 Diagnosis based on agent identification 2.3 Gaps in African swine fever diagnostics 3. Publication 3.1 Statement of contribution 3.1.1 Publication 4. Discussion 5. Summary 6. Zusammenfassung 7. References 8. Appendix 9. Acknowledgements / African swine fever virus (ASFV) causes a deadly viral disease in pigs. The virus has gradually spread throughout the world and was reported in Germany in September 2020. ASF outbreak can lead to huge economical loss. No vaccine is commercially available and thus, surveillance and early detection play a pivotal role to control an ASF outbreak. Polymerase Chain Reaction (PCR) is considered the gold standard for ASFV detection due to its superior sensitivity and specificity. However, it is time-consuming and requires well-equipped laboratories. Point-of-need tests can offer an alternative, delivering fast and reliable results directly in the field. The aim of this study was to establish a field-deployable point-of-need test based on Recombinase Polymerase Amplification (RPA) to detect ASFV. Material and Methods: Three sets of primers and one probe based on the B646L gene which encodes for the viral capsid protein p72 were designed. All possible combinations were screened. Analytical sensitivity was tested with eight replicates of serial dilutions of the molecular standard (102-10° DNA copies per µl). The limit of detection was calculated using probit analysis. ASFV-RPA’s specificity was tested using various viral nucleic acids of pathogens infecting pigs. To allow the deployment at point of need, two different extraction approaches were tested in ASFV-RPA with all 73 pig blood samples included in this study: a rapid heat/lysis buffer extraction method and a standardized spin-column based extraction kit. Diagnostic sensitivity and specificity were calculated for both test approaches. All results were compared to an established real-time PCR for ASFV. A small pilot study for ASFV-RPA assay deployment was done in Uganda with 20 blood samples of a suspected outbreak using the field-deployable suitcaselab. The calculated limit of detection of ASFV-RPA was 3.5 DNA copies per µl. All screened ASFV genotypes were detected while no other viral nucleic acids were identified. Using the standardized DNA extraction method in ASFV-RPA, and compared to real-time PCR, diagnostic sensitivity and specificity were 100%. The rapid heat/lysis buffer protocol showed very promising results, achieving 97% of positivity rate compared to a 38% of the real-time PCR. In Uganda, ASFV-RPA detected 11 samples as positive, including two known afebrile animals. Immediate agent detection is a key aspect of ASF outbreak control. ASFV-RPA is as sensitive and specific as a gold standard PCR for ASFV identification. Combined with the heat/lysis buffer DNA isolation step, the duration of the assay is around 25 minutes from sample collection to result readout, with a promising positivity rate of 97% which indicates tolerance against inhibitors. ASFV-RPA is a portable detection method, as revealed during the pilot field study in Uganda. Only requiring basic equipment and solar batteries, the suitcase lab is a promising tool for on-site diagnostics in resource limited settings to detect ASFV.:1. Introduction 2. Literature overview 2.1 African swine fever 2.1.1 Aetiology 2.1.1.1 Classification and taxonomy 2.1.1.2 Viral structure and genome 2.1.1.3 Genetic typing and antigenic variability 2.1.2 Epidemiology 2.1.2.1 Disease distribution 2.1.2.2 Host range and epidemiological cycles 2.1.2.2.1 Warthog-tick cycle 2.1.2.2.2 Domestic pig-tick cycle 2.1.2.2.3 Domestic pig cycle 2.1.2.2.4 Wild boar-environment cycle 2.1.2.3 Tenacity, transmission, and infectivity 2.1.3 Pathophysiology 2.1.3.1 Pathogenesis 2.1.3.2 Clinical signs and pathological findings 2.1.3.3 Differential diagnosis 2.2 Available diagnostic tools for ASFV 2.1.4 Diagnosis based on immune response 2.1.5 Diagnosis based on agent identification 2.3 Gaps in African swine fever diagnostics 3. Publication 3.1 Statement of contribution 3.1.1 Publication 4. Discussion 5. Summary 6. Zusammenfassung 7. References 8. Appendix 9. Acknowledgements

Die Bedeutung geeigneter in vitro Modelle gewinnt im Hinblick auf die Reduktion von Tierversuchen getreu des 3R-Prinzips immer mehr an Bedeutung. Für viele Fragestellungen in Bezug auf den Lebermetabolismus bei Nutztieren bieten primäre bovine und porcine Hepatozyten ein vielversprechendes in vitro Modell. Die Verfügbarkeit von primären Hepatozyten ist aber, aufgrund ihrer besonderen Sensibilität, äußerst begrenzt. Die Kryokonservierung von primären Hepatozyten stellt eine Strategie dar die Verfügbarkeit dieser Zellen maßgeblich zu verbessern. Eine weitere Möglichkeit Hepatozyten haltbar zu machen, ist die Proliferationsinduktion und somit die Immortalisierung der Leberzellen. Ziel dieser Arbeit war es, erstmals ein Kryokonservierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten zu etablieren. Darüber hinaus sollte überprüft werden ob die Proliferationsaktivität von primären bovinen und porcinen Hepatozyten durch eine Behandlung mit Wachstumsfaktoren oder die Integration von humaner Telomerase reverse Transkriptase (hTERT) mittels Lipofectamine®-Transfektion induziert werden kann. Primäre Hepatozyten vom Rind und vom Schwein wurden von lebergesunden Spendertieren vergleichend mit einer zweischrittigen Kollagenaseperfusion gewonnen. Für die Etablierung des Kryokonservierungsprotokolls wurde zunächst die geeignete DMSO-Endkonzentration von 10 % ermittelt (n=3). Anschließend erfolgte die Kryokonservierung der Hepatozyten mit einer DMSO-Endkonzentration von 10 % und einer Konzentration von 20 % Fetalem Bovinem Serum vergleichend in William’s E Medium (WE) bzw. University of Wisconsin Medium (UW) mit und ohne Zusatz von 0,2 M Trehalose (T). Gleichzeitig wurde der Effekt einer computergesteuerten Einfriertechnik in einem Controlled-Rate-Freezer gegenüber einer manuellen Einfriertechnik mit Hilfe eines Gefrierbehälters evaluiert (n=6). Nach dem Auftauen wurde die Recovery (R, Zellzahl lebend aufgetauter Zellen im Vergleich zur Zahl der lebend eingefrorenen Zellen) und die Viabilität (V) der Hepatozyten mittels Trypanblaufärbung bestimmt, sowie die Kultivierbarkeit der Hepatozyten nach der Kryokonservierung untersucht. Für die Studien zur Proliferationsinduktion primärer boviner und porciner Hepatozyten, wurde im ersten Schritt ein geeignetes Transfektionsreagenz ermittelt, welches keine oder nur geringe zytotoxische Auswirkungen auf die Hepatozyten hat. Hierfür wurden die Hepatozyten in einer Monolayerkultur kultiviert und vergleichend mit Lipofectamine® 3000 und Lipofectamine® 2000 Reagenz behandelt (n=3). Anschließend erfolgte, mit Hilfe des Lipofectamine® 2000 Reagenz, eine Ko-Transfektion des eukaryotischen Plasmidvektors pCL-neo-hEST2 (hERT) sowie des fluoreszierenden eukaryotischen Plasmidvektors pmaxGFP™ in primäre bovine und porcine Hepatozyten. Die Überprüfung von Transfektionserfolg und -effizienz erfolgte mittels Fluoreszenzmikroskopie an Tag 2 nach Ko-Transfektion (n=6). Darüber hinaus wurde überprüft, ob eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren „bovine hepatocyte growth factor“ (bHGF) und „bovine epithelial growth factor“ (bEGF) bei kultivierten primären bovinen Hepatozyten zu einer effektiven Stimulation ihrer Proliferationsaktivität führt. Die Bestimmung der Signifikanzniveaus (P-Wert) erfolgte mittels One-way ANOVA Analyse mit Turkey-Test als Post-Hoc-Test, sowie der Two-Way ANOVA Analyse mit Šidák-Test als Post-Hoc-Test für Mehrfachvergleiche. Als statistisch signifikant wurde ein Signifikanzniveau von P ≤ 0,05 gewertet. Es konnte gezeigt werden, dass die computergesteuerte Einfriertechnik für die Kryokonservierung von primären bovinen und porcinen Hepatozyten einer manuellen Einfriertechnik deutlich überlegen ist (P < 0.0001). Im Hinblick auf die Wahl des Einfriermediums konnten für bovine Hepatozyten mit WE + T (V: 65,1 ± 8,3 %; R: 36,5 ± 6,0 %) und UW (V: 66,0 ± 11,2 %; R: 34,0 ± 8,9 %) und für porcine Hepatozyten mit UW (V: 76,8 ± 2,7 %; R: 69,7 ± 26,2 %) und UW + T (V: 64,4 ± 7,3 %; R: 67,6 ± 26,1 %) die besten Ergebnisse erzielt werden. Im Gegensatz zu kryokonservierten porcinen Hepatozyten, konnten bovine Hepatozyten ihre Kultivierbarkeit nach der Kryokonservierung nicht beibehalten. Für die Studien zur Proliferationsinduktion primärer boviner und porciner Hepatozyten, konnte gezeigt werden, dass das Transfektionsreagenz Lipofectamine® 3000 für die Transfektion primärer boviner und porciner Hepatozyten aufgrund zytotoxischer Eigenschaften nicht geeignet ist. Im Gegensatz dazu konnte mit Hilfe des Lipofectamine® 2000 Reagenz ein erfolgreiches Transfektionsprotokoll für primäre bovine und porcine Hepatozyten etabliert werden. Eine Induktion der Proliferationsaktivität durch die Integration von hTERT konnte allerdings nicht beobachtet werden. Ebenso konnte gezeigt werden, dass eine Behandlung mit den Wachstumsfaktoren bHGF und bEGF allenfalls zu einer geringgradigen Steigerung der Proliferationsaktivität primärer boviner Hepatozyten in einer Kollagen-Monolayer-Kultur führt. Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass das Kryokonservierungsprotokoll für primäre bovine Hepatozyten weiter angepasst werden muss, um diese nach dem Tiefgefrieren brauchbar zu machen. Darüber hinaus sollte im Prozess der Etablierung einer Hepatozyten-Zelllinie aus primären bovinen bzw. porcinen Hepatozyten die Transfektion viraler Onkogene durchgeführt werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Anwendungsgebiete primärer Hepatozyten 3 2.2 Kryokonservierung 4 2.2.1 Geschichte 4 2.2.2 Grundlagen des Tiefgefrierens 5 2.2.3 Kryoprotektiva 8 2.2.3.1 Penetrierende Kryoprotektiva 8 2.2.3.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva 11 2.2.4 Einfriermedium 13 2.2.5 Kühlungsrate 14 2.2.6 Lagerung kryokonservierter Zellen 15 2.2.7 Auftauen 15 2.2.8 Kryokonservierung primärer Hepatozyten 17 2.3 Immortalisierung primärer Hepatozyten 19 2.3.1 Grundlagen der Immortalisierung 19 2.3.1.1 Zellzyklus Regulation 20 2.3.1.2 Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen im Zellzyklus 23 2.3.2 Immortalisierungs-Strategien für primäre Hepatozyten 24 2.3.3 Gentransfer 26 3 Tiere, Material und Methoden 28 3.1 Material 28 3.2 Spendertiere 28 3.3 Methoden 30 3.3.1 Leberentnahme Rind 30 3.3.2 Leberentnahme Schwein 30 3.3.3 Leberzellisolation 31 3.3.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer Hepatozyten 35 3.3.5 Vorbereitung der Zellkulturplatten 36 3.3.6 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 37 3.3.7 Kryokonservierung 38 3.3.7.1 Vorversuch 38 3.3.7.2 Hauptversuch 40 3.3.8 Transfektion 44 3.3.8.1 Vorversuch 44 3.3.8.2 Hauptversuch 47 3.3.9 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 50 3.4 Auswertung 51 3.4.1 Beurteilung der Qualität der aufgetauten Hepatozyten 51 3.4.2 Statistik 52 4 Ergebnisse 53 4.1 Beurteilung der Viabilität und Qualität der isolierten primären Hepatozyten 53 4.2 Kryokonservierung 55 4.2.1 Vorversuch 55 4.2.2 Hauptversuch 57 4.3 Transfektion 63 4.3.1 Vorversuch 63 4.3.2 Hauptversuch 67 4.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 73 5 Diskussion 77 5.1 Ausgangsmaterial 77 5.2 Kryokonservierung 79 5.2.1 DMSO-Konzentration 79 5.2.2 Einfluss des Einfriermediums und des Zusatzes von Trehalose auf die Viabilität und Recovery kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 81 5.2.3 Einfluss der Einfriertechnik auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 82 5.2.4 Einfluss der Langzeitlagerung bei -80 °C bzw. -150 °C auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 83 5.2.5 Kultivierung kryokonservierter Hepatozyten 84 5.2.6 Vergleich primärer boviner und porziner Hepatozyten 88 5.3 Transfektion 90 5.3.1 Wahl des geeigneten Lipofectamine®-Reagenz und der geeigneten Einwirkdauer 90 5.3.2 Auswirkungen der Integration von hTERT in primäre bovine und porzine Hepatozyten 91 5.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 93 6 Ausblick 94 7 Zusammenfassung 96 8 Summary 98 9 Literaturverzeichnis 100 10 Anhang 119 10.1 Geräte 119 10.2 Chemikalien 120 10.3 Plasmide 123 10.4 Gas 123 10.5 Verbrauchsmaterialien 123 10.6 Original Temperatur-Kurven 126 11 Danksagung 129 / The importance of suitable in vitro models is gaining more and more importance with regard to the reduction of animal experiments true to the 3Rs principle. Primary bovine and porcine hepatocytes offer a promising in vitro model to study liver metabolism in farm animals. However, the availability of primary hepatocytes is extremely limited due to their particular sensitivity. Cryopreservation of primary hepatocytes illustrates one strategy to increase their availability. Another approach to preserve hepatocytes in vitro is to induce cell-proliferation resulting in an immortalized hepatocyte cell line. This study aimed to establish for the first time a cryopreservation protocol for primary bovine hepatocytes. Furthermore, it should be verified whether proliferation activity can be induced by treatment with growth factors or integration of human telomerase reverse transcriptase (hTERT) via Lipofectamine® transfection. Primary bovine and porcine hepatocytes of liver healthy animals were obtained comparatively using a two-step collagenase-perfusion technique. For the establishment of the cryopreservation protocol, the appropriate final DMSO concentration of 10 % was first determined (n=3). Subsequently, cryopreservation of hepatocytes was performed comparatively in William's E medium (WE) and University of Wisconsin medium (UW) respectively, with and without the addition of 0.2 M trehalose (T) with a final DMSO concentration of 10% and a concentration of 20% fetal bovine serum. At the same time, the effect of a computer-controlled freezing technique in a controlled-rate freezer versus a manual freezing technique using a freezing container was evaluated (n=6). Cell-recovery (R, cell number of live thawed cells compared to the number of live frozen cells), as well as cell-viability (V) of cryopreserved hepatocytes was determined by trypan blue staining, after thawing. In addition, it was examined if cryopreserved hepatocytes maintain plateable after thawing. For the studies on proliferation induction of primary bovine and porcine hepatocytes, the first step was to determine a suitable transfection reagent that has no or only minor cytotoxic effects on the hepatocytes. For this purpose, hepatocytes were cultured in a monolayer culture and comparatively treated with Lipofectamine® 3000 and Lipofectamine® 2000 reagent (n=3). Subsequently, the eukaryotic plasmid vector pCL-neo-hEST2 (hTERT) plus fluorescent eukaryotic plasmid vector pmaxGFP™ were transfected into primary bovine and porcine hepatocytes using Lipofectamine® 2000 reagent. Transfection success and efficiency was verified by fluorescence microscopy 2 days after co-transfection (n=6). Futhermore, it was examined whether treatment with bovine hepatocyte growth factor' (bHGF) and bovine epithelial growth factor (bEGF) leads to an effective stimulation of proliferation activity in cultured primary bovine hepatocytes Significance levels (P value) were determined by one-way ANOVA analysis with Turkey test as post hoc test, and two-way ANOVA analysis with Šidák-test as post hoc test for multiple comparisons. A significance level of P ≤ 0.05 was considered statistically significant. It was shown that a computer-controlled freezing technique is clearly superior to a manual freezing technique for the cryopreservation of primary bovine and porcine hepatocytes (P < 0.0001). With regard to the choice of the freezing medium, the best results were obtained for bovine hepatocytes with WE + T (V: 65.1 ± 8.3 %; R: 36.5 ± 6.0 %) and UW (V: 66.0 ± 11.2 %; R: 34.0 ± 8.9%) and for porcine hepatocytes with UW (V: 76.8 ± 2.7%; R: 69.7 ± 26.2%) and UW + T (V: 64.4 ± 7.3%; R: 67.6 ± 26.1%). In contrast to cryopreserved porcine hepatocytes, bovine hepatocytes could not maintain their cultivability after cryopreservation. For the studies on proliferation induction of primary bovine and porcine hepatocytes, it was shown that the transfection reagent Lipofectamine® 3000 is not suitable for transfection of primary bovine and porcine hepatocytes due to cytotoxic properties. In contrast, a successful transfection protocol for primary bovine and porcine hepatocytes could be established using Lipofectamine® 2000 reagent. However, induction of proliferation activity by integration of hTERT could not be observed. Similarly, treatment with the growth factors bHGF and bEGF was shown to result in at most a modest increase in the proliferation activity of primary bovine hepatocytes in a collagen monolayer culture. In conclusion, the cryopreservation protocol for primary bovine hepatocytes needs to be further adapted to make hepatocytes useful after deep freezing. Furthermore, transfection of viral oncogenes should be considered in the further process of establishing a hepatocyte cell line of primary bovine or porcine hepatocytes.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Anwendungsgebiete primärer Hepatozyten 3 2.2 Kryokonservierung 4 2.2.1 Geschichte 4 2.2.2 Grundlagen des Tiefgefrierens 5 2.2.3 Kryoprotektiva 8 2.2.3.1 Penetrierende Kryoprotektiva 8 2.2.3.2 Nicht penetrierende Kryoprotektiva 11 2.2.4 Einfriermedium 13 2.2.5 Kühlungsrate 14 2.2.6 Lagerung kryokonservierter Zellen 15 2.2.7 Auftauen 15 2.2.8 Kryokonservierung primärer Hepatozyten 17 2.3 Immortalisierung primärer Hepatozyten 19 2.3.1 Grundlagen der Immortalisierung 19 2.3.1.1 Zellzyklus Regulation 20 2.3.1.2 Kontrollpunkte und Kontrollmechanismen im Zellzyklus 23 2.3.2 Immortalisierungs-Strategien für primäre Hepatozyten 24 2.3.3 Gentransfer 26 3 Tiere, Material und Methoden 28 3.1 Material 28 3.2 Spendertiere 28 3.3 Methoden 30 3.3.1 Leberentnahme Rind 30 3.3.2 Leberentnahme Schwein 30 3.3.3 Leberzellisolation 31 3.3.4 Bestimmung von Zellzahl, Viabilität und Morphologie primärer Hepatozyten 35 3.3.5 Vorbereitung der Zellkulturplatten 36 3.3.6 Kultivierung primärer boviner und porziner Hepatozyten 37 3.3.7 Kryokonservierung 38 3.3.7.1 Vorversuch 38 3.3.7.2 Hauptversuch 40 3.3.8 Transfektion 44 3.3.8.1 Vorversuch 44 3.3.8.2 Hauptversuch 47 3.3.9 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 50 3.4 Auswertung 51 3.4.1 Beurteilung der Qualität der aufgetauten Hepatozyten 51 3.4.2 Statistik 52 4 Ergebnisse 53 4.1 Beurteilung der Viabilität und Qualität der isolierten primären Hepatozyten 53 4.2 Kryokonservierung 55 4.2.1 Vorversuch 55 4.2.2 Hauptversuch 57 4.3 Transfektion 63 4.3.1 Vorversuch 63 4.3.2 Hauptversuch 67 4.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 73 5 Diskussion 77 5.1 Ausgangsmaterial 77 5.2 Kryokonservierung 79 5.2.1 DMSO-Konzentration 79 5.2.2 Einfluss des Einfriermediums und des Zusatzes von Trehalose auf die Viabilität und Recovery kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 81 5.2.3 Einfluss der Einfriertechnik auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 82 5.2.4 Einfluss der Langzeitlagerung bei -80 °C bzw. -150 °C auf die Qualität kryokonservierter primärer boviner und porziner Hepatozyten 83 5.2.5 Kultivierung kryokonservierter Hepatozyten 84 5.2.6 Vergleich primärer boviner und porziner Hepatozyten 88 5.3 Transfektion 90 5.3.1 Wahl des geeigneten Lipofectamine®-Reagenz und der geeigneten Einwirkdauer 90 5.3.2 Auswirkungen der Integration von hTERT in primäre bovine und porzine Hepatozyten 91 5.4 Proliferationsinduktion primärer boviner Hepatozyten mit Wachstumsfaktoren 93 6 Ausblick 94 7 Zusammenfassung 96 8 Summary 98 9 Literaturverzeichnis 100 10 Anhang 119 10.1 Geräte 119 10.2 Chemikalien 120 10.3 Plasmide 123 10.4 Gas 123 10.5 Verbrauchsmaterialien 123 10.6 Original Temperatur-Kurven 126 11 Danksagung 129

Die equine Endometrose ist eine irreversible periglanduläre und/oder stromale Fibrose, betroffene Uterindrüsen zeigen meist glanduläre Alterationen und häufig eine zyklusasynchrone Differenzierung. Sie ist eine der wichtigsten Ursachen für Fruchtbarkeitsstörungen von Stuten und reduziert - abhängig von ihrer qualitativen und graduellen Ausprägung - die zu erwartende Abfohlrate. Fehldifferenzierte Endometrien treten nach neueren Erkenntnissen häufiger (16 % während der Decksaison) auf als bisher angenommen. Sie sind durch Abweichungen des endometrialen Funktions- und oder Aktivitätszustandes gekennzeichnet, wobei die irreguläre glanduläre Differenzierung (IGD) eine vollständige Pleomorphie ihrer Drüsenanschnitte zeigt. Die ungleichmäßige glanduläre Differenzierung (UGD) ähnelt mit ihren vom Grundzustand des Endometriums abweichend differenzierten Drüsennestern, die bisher als nicht-fibrotisch angesehen wurden, der equinen Endometrose. Bislang finden Fehldifferenzierungen (Ausnahme: die Atrophie in der Decksaison) keine Erwähnung im Kategorisierungsschema der Endometriumbioptate. Tatsächlich sind sie jedoch auch als fertilitätsmindernd anzusehen. Daher war das Ziel der vorliegenden Studie, mittels vergleichender lichtmikroskopischer und immunhistologischer Untersuchung der UGD und der Endometrose in Serienschnitten (n = 837) von Endometriumbioptaten (n = 33), neue Erkenntnisse darüber zu gewinnen, ob die UGD eine Frühform der Endometrose darstellt. Die Bioptate wurden 31 Stuten während der Decksaison (April bis September) der Jahre 1998 - 2012 entnommen und anhand ihrer Befunde in Gruppen eingeteilt: Stuten in Gr. 1 (n = 10) weisen eine UGD auf, Gr. 1a (n = 3) ist durch eine UGD und eine IGD, Gr. 2 (n = 10) durch eine UGD und eine Endometrose gekennzeichnet, während Gr. 2a (n = 10) eine UGD, eine Endometrose und eine IGD zeigt. Als Kontrollen dienten jeweils 5 Biopsien mit unveränderten Endometrien bzw. einer ggr. Endometrose. Die Serienschnitte wurden routinemäßig aufgearbeitet und mittels H.-E. gefärbt oder immunhistologischen Behandlungen zum Nachweis von α-Aktin, Desmin, Vimentin, Laminin, Östrogen- und Progesteronrezeptoren unterzogen. Die Ergebnisauswertung erfolgte semi-quantitativ und ohne die Erstellung einer Statistik. Alle ausgewählten UGD-Nester wurden in 3 Schnittebenen des Gewebes lichtmikroskopisch auf das Vorhandensein und die Ausprägung periglandulär angelagerter Stromazellen (PSC) überprüft. Dabei wiesen in Schnittebene 1 die Mehrzahl (78,15 %) der Drüsen innerhalb der UGD-Nester PSC auf, die häufig einschichtig (67,56 %), seltener (30,38 %) zwei- bis dreischichtig auftraten und die Drüsen meist (73,42 %) maximal zur Hälfte und selten (7,07 %) vollständig umschlossen. In tieferen Schnittebenen konnte eine dezente Zunahme der zwei- bis dreischichtigen PSC (35,85 % bzw. 34,67 %) festgestellt werden, welche die betroffenen Drüsen etwas häufiger vollständig umfassten (10,53 % bzw. 10,03 %). Immunhistologisch nimmt die α-Aktin-Expression innerhalb der UGD und (stärker ausgeprägt) in der Endometrose gegenüber unveränderten Stromazellen zu. Desmin wird im Vergleich mit unveränderten Arealen in der UGD und in der Endometrose von einem höheren Prozentsatz positiver Stromazellen exprimiert, jedoch – wie in der Literatur bereits für die UGD, nicht aber für die Endometrose, berichtet - mit verminderter Intensität. Die stromale Vimentin-Expression ist in UGD und Endometrose gegenüber den unveränderten Arealen insgesamt erhöht, wobei der Prozentsatz Vimentin exprimierender Stromazellen in der UGD etwas höher ausfällt als in der Endometrose. Auch die Drüsenepithelien zeigen in beiden Alterationen einen leicht erhöhten Prozentsatz und v.a. erhöhte Intensität von Vimentin. Für die Basallamina-Komponente Laminin kann v.a. ein verbreitertes/aufgefasertes, diskontinuierliches oder fehlendes, teilweise auch dünneres Erscheinungsbild um Drüsen in der UGD und in der Endometrose festgestellt werden. Die ER und PR werden von den Stromazellen in UGD und Endometrose insgesamt reduziert exprimiert, die Epithelzellen zeigen insbesondere für die ER eine leicht erhöhte Expression gegenüber unveränderten Drüsen. Zusammenfassend weist ein Großteil der UGD-Drüsen PSC auf. Dies lässt, in Verbindung mit dem vom unveränderten Endometrium abweichenden immunhistologischen Expressionsmuster der UGD sowie (meist stärker ausgeprägt) der Endometrose, den Schluss zu, dass die UGD eine Frühform der Endometrose darstellt. Daraus folgt die Notwendigkeit einer Überarbeitung und Ergänzung des histomorphologischen Kategorisierungsschemas für Endometriumbioptate, wobei für die UGD dieselbe (gradabhängige) prognostische Bewertung wie für die Endometrose angenommen werden muss. Künftige Studien können anhand von Verlaufsuntersuchungen überprüfen, ob UGD-Stuten in einem definierten Zeitraum eine den Kriterien des Kategorisierungsschemas entsprechende Endometrose entwickeln. / Equine endometrosis is known as periglandular and/or stromal fibrosis in combination with glandular alterations. In view of their function and/or activity, the affected glands often are deviating from the physiological stage of the cycle. It is one of the most important reasons for reduced fertility in mares and - in dependence on quality and degree - partly leads to a distinct reduction of the expected foaling rate. According to recent findings, endometrial maldifferentiations occur more often (16% during the breeding season) than expected. Affected endometria are characterised by glands deviating from the physiological stage of the cycle regarding their function and/or activity. The irregular glandular differentiation (IGD) shows a polymorphy of epithelial cells within one gland cross-section, while the unequal glandular differentiation (UGD) reminds on endometrosis because of the glandular nests, up to now seen as non-fibrotic, deviating from the stage of the cycle. Until now, endometrial maldifferentiations, excluding atrophia during the breeding season, are not mentioned in the catgorisation system for endometrial tissue examination. But in fact, they also are reducing the fertility. So the aim of this study was to get new insights if UGD is an early form of endometrosis by comparative histomorphological and immunohistochemical examinations on serial slides (n = 837) of 33 endometrial tissue specimens with UGD and endometrosis. The biopsies were taken of 31 mares during physiological breeding season (April to September) between 1998 and 2012 and grouped according to their diagnostic findings: The mares in group 1 (n = 10) show UGD, group 1a (n = 3) shows UGD and IGD while Group 2 (n = 10) is characterised by the presence of UGD and endometrosis and group 2a (n = 10) by UGD, endometrosis and IGD. Each 5 tissue samples without alterations, respectively a mild endometrosis served as controls. All serial slides (n = 837) were routinely processed and stained by hematoxylin and eosin or underwent an immunohistochemical treatment to detect α-actin, desmin, vimentin, laminin, estrogen- und progesteronreceptors. The evaluation of the results was carried out semi-quantitatively and without statistical analysis. Each three slide levels of the tissue samples were examined by light microscopy, if and of which gradual occurrence periglandular arranged stromal cells (PSC) were noticeable in deeper areas of the selected UGD-nests. In slide level 1 most of the glands (78.15%) within UGD show PSC, which mostly (73.42%) surrounds maximally half of the affected gland and rarely (7.07%) the whole gland, often (67.56%) consists of one layer and less frequently (30.38%) of two or three layers. A slight increase of PSC with two or three layers (35.85% respectively 34.67%) is detectable in deeper slide levels, also more often a complete surrounding of the glands (10.53% respectively 10.03%) by the PSC is seen. The immunohistochemical investigations reveal, compared to unchanged stromal cells, an increase of the stromal α-actin-expression in UGD and (stronger) in endometrosis. Desmin is expressed by a higher percentage of stromal cells in UGD as well as in endometrosis, but with reduced intensity. This is already described in literature for UGD but not for endometrosis. The stromal vimentin-expression is increased towards the unchanged areas in UGD and endometrosis, but the percentage of vimentin-positive stromal cells is slightly higher within UGD than within endometrosis. Vimentin also is detectable with slightly hightened percentage and first of all stronger intensity in epithelial cells of both alterations. Laminin, which is a part of the basal lamina, can be found around glands and around UGD- and fibrotic glands primarily is characterised by a widened/filamentous, discontinuous or missing, sometimes also slighter morphology. Compared to the unchanged areas, the stromal cells in UGD and endometrosis express the ER and PR in a reduced way, while epithelial cells show a slightly increased expression, especially for the ER. To sum up, a big part of the glands within UGD is characterised by PSC. In association with the immunohistochemical expression pattern of UGD and endometrosis differing (mostly stronger in endometrosis) from those of the unchanged endometrium, this is regarded as an aproach of UGD towards endometrosis, which suggests UGD being an early form of endometrosis. Because of that, a revision and completion of the histomorphological categorisation system for endometrial tissue samples is necessary, assuming the same prognostical evaluation für UGD as for endometrosis, that depends on the degree of the alterations. Future studies could verify, if mares suffering from UGD are developing an endometrosis according to the diagnostical criteria of the categorization system by a defined period of time.

Einleitung: Die Leptospirose ist eine der weltweit bedeutendsten Zoonosen. Durch den häufig asymptomatischen oder unspezifischen Krankheitsverlauf, wird von einer hohen Dunkelziffer ausgegangen. Menschen können sich über direkten Tierkontakt oder indirekten Kontakt mit dem Urin infizierter Tiere, zum Beispiel über kontaminierte Gewässer oder Erde, anstecken. Die Infektion erfolgt dabei über den Eintritt des Erregers in Schleimhäute oder Hautwunden. Ziel der Untersuchungen: Obwohl die Überlebenszeit von Leptospiren in der Umwelt einen entscheidenden Einfluss auf das Infektionsrisiko des Menschen hat, wurden bisher nur sehr wenige Untersuchungen dazu durchgeführt. Diese konzentrierten sich dabei vor allem auf das Überleben der Erreger in Erde oder Wasser. Daher war es Ziel dieser Arbeit die Umweltstabilität eines häufig in Deutschland gefundenen Leptospirenserovars unter verschiedenen Umweltbedingungen zu untersuchen. Zusätzlich zu diesen Untersuchungen war es Ziel dieser Arbeit, durch die Veröffentlichung eines Übersichtsartikels über die Leptospirose Ärzte in Deutschland für diese häufig unerkannt bleibende Erkrankung zu sensibilisieren. Material und Methoden: Ein jahrelang an Kulturmedium adaptierter Labor- und ein erst vor 3 Jahren isolierter Feldstamm von Leptospira kirschneri Serovar Grippotyphosa wurden auf ihr Überleben in der Umwelt untersucht. Es wurde ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber verschiedenen Umwelteinflüssen, wie z.B. Tierurin als umgebendes Medium bei verschiedenen Temperaturen oder auch der Einfluss einer Trocknung, untersucht. Nachdem die Leptospiren den Umwelteinflüssen für unterschiedliche Zeitspannen ausgesetzt waren, wurde versucht sie in EMJH-Medium wieder zu kultivieren. Während einer Inkubationszeit von mindestens 28 Tagen bei 29 °C wurden diese Kulturen wöchentlich unter dem Dunkelfeldmikroskop auf das Vorhandensein motiler Leptospiren untersucht. Zusätzlich wurde durch Kultivierungsversuche in EMJH-Medium das Überleben der Leptospiren in einem Wasserstrom mit einer definierten Fließgeschwindigkeit und ihre Verbreitung in diesem Strom mittels real-time PCR untersucht. Alle Versuche wurden im Dreifachansatz durchgeführt. Statistische Untersuchungen wurden mittels eines zweiseitigen Mann-Whitney-U Tests (Fehler 1. Art α = 0,05) durchgeführt. Ergebnisse: Die beiden untersuchten Stämme von L. grippotyphosa überlebten nicht in unverdünntem Tierurin. In verdünntem Tierurin überlebten die Stämme, je nach Temperatur und Verdünnungsmedium, zwischen 1 - 72 Stunden (Laborstamm) und 4 - 24 Stunden (Feldstamm). Beide Stämme überlebten signifikant länger bei 15 °C als bei 37 °C (p < 0,001, bzw. p = 0,041). Der Laborstamm überlebte signifikant länger in verdünntem Rindereurin (max. 72 h bei 15 °C) als in verdünntem Hundeurin (max. 4 h; p = 0,027). Im Gegensatz dazu, überlebte der Feldstamm signifikant länger in Hundeurin (max. 24 h bei 15 °C) als in Rinderurin (max. 4 h; p = 0,028). Das vollständige Trocknen auf einer festen Oberfläche war bei Temperaturen zwischen 15 °C und 37 °C für beide Stämme letal. Jedoch war, unabhängig von der untersuchten Temperatur, eine halbe Stunde vor der vollständigen Trocknung eine Kultivierung der Leptospira spp. noch möglich. In einem Wasserstrom konnten sich die Leptospiren aufgrund ihrer Eigenbewegung schneller und langsamer als die Durchschnittsgeschwindigkeit (0,01 m / s) des Wassers bewegen, überlebten jedoch die mechanischen Schäden während des Schlauchdurchflusses nicht. Schlussfolgerungen: Das Überleben von Leptospira spp. ist offensichtlich von vielen Faktoren abhängig. Eine schnelle Verdünnung nach der Ausscheidung mit dem Urin scheint dabei essentiell zu sein. Niedrigere Temperaturen sowie eine feuchte Umgebung verbessern ihre Widerstandsfähigkeit gegen schädliche Einflüsse, während Trockenheit oder mechanische Schädigung ihr Überleben nicht ermöglichen. Wegen der großen Bedeutung der leptospiralen Überlebenszeit in der Umwelt für das Infektionsrisiko von Mensch und Tier sind weitere Untersuchungen auf diesem Forschungsgebiet in der Zukunft nötig.:1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Die Geschichte der Leptospirose 2.2 Morphologie und Übertragungswege der Erreger 2.3 Taxonomie 2.4 Haupt- und Nebenwirte 2.5 Die Erkrankung beim Menschen 2.5.1 Vorkommen 2.5.2 Klinik und Therapie 2.6 Die Erkrankung beim Tier 2.6.1 Bei Nutztieren 2.6.2 Bei Haustieren 2.6.3 Bei Wildtieren 2.7 Diagnostik 2.8 Die Umweltstabilität der Erreger 2.8.1 In Erde 2.8.2 In Wasser 2.8.3 In Urin 3. Publikationen 3.1 Publikation Nr. 1 3.2 Publikation Nr. 2 4. Diskussion und Schlussfolgerung 5. Zusammenfassung 6. Summary 7. Literaturverzeichnis 8. Danksagung / Introduction: Leptospirosis is one of the most important zoonosis worldwide. Due to the often asymptomatic or non-specific course of the disease, a high number of unreported cases is assumed. Humans can get infected through direct contact with animals or indirect contact with the urine of infected animals, for example through contaminated water or soil. The infection occurs via entry of the pathogen through mucous membranes or skin wounds. Aims of the study: Although the survival time of Leptospira spp. in the environment has a crucial influence on the human infection risk, very few studies have been carried out so far. These studies focused primarily on the survival of the pathogens in soil or water. It was therefore the aim of this study to investigate the environmental stability of a leptospiral serovar that is frequently found in Germany under different environmental conditions. In addition to these investigations, the aim of this work was to raise the awareness of physicians in Germany for this often undetected and neglected disease by publishing a review article on leptospirosis. Material and Methods: The survival in the environment of both a laboratory strain, which has been adapted to culture medium for years and a field strain, which was isolated only 3 years ago, of Leptospira kirschneri Serovar Grippotyphosa was studied. Their resistance to various environmental influences, such as animal urine as surrounding medium at different temperatures or the influence of drying, were examined. After the leptospires were exposed to these influences for various time periods, an attempt was made to cultivate them in EMJH medium. During an incubation period of at least 28 days at 29 °C, the cultures were examined weekly for the presence of motile leptospires under the darkfield microscope. In addition, the survival of the leptospires in a water stream with a defined velocity and their distribution in this stream were examined by real-time PCR and cultivation experiments in EMJH medium. All experiments were carried out in triplicate. The statistical analysis was done using a two-tailed Mann-Whitney U test (type-1-error α = 0.05). Results: Both examined strains of L. grippotyphosa did not survive in undiluted animal urine. In diluted animal urine, the strains survived between 1-72 hours (laboratory strain) and 4-24 hours (field strain), depending on the temperature and dilution medium. Both strains survived significantly longer at 15 °C than at 37 °C (p < 0.001 or p = 0.041). The laboratory strain survived significantly longer in diluted cattle urine (max. 72 h at 15 °C) than in diluted dog urine (max. 4 h) (p = 0.027) while the field strain survived significantly longer in dog urine (max. 24 h at 15 °C) than in cattle urine (max. 4 h) (p = 0.028). Complete drying on a solid surface at temperatures between 15 °C and 37 °C was lethal for both strains. However, regardless of the temperature examined, Leptospira spp. were still cultivatable half an hour before the time point of complete drying. In a water stream, leptospires were able to move faster or slower than the average velocity of the water (0.01 m / s) due to their intrinsic mobility but were not able to survive the mechanical damage caused by running water in the hose system. Conclusions: Overall, it can be concluded that the survival of Leptospira spp. depends on many factors. Rapid dilution after urine excretion appears to be essential. Lower temperatures and a humid environment improve their survival time, while drought or mechanical damage is lethal to them. Because of the great importance of leptospiral survival in the environment for the infection risk of humans and animals, further studies in this research area will be necessary in the future.:1. Einleitung 2. Literaturübersicht 2.1 Die Geschichte der Leptospirose 2.2 Morphologie und Übertragungswege der Erreger 2.3 Taxonomie 2.4 Haupt- und Nebenwirte 2.5 Die Erkrankung beim Menschen 2.5.1 Vorkommen 2.5.2 Klinik und Therapie 2.6 Die Erkrankung beim Tier 2.6.1 Bei Nutztieren 2.6.2 Bei Haustieren 2.6.3 Bei Wildtieren 2.7 Diagnostik 2.8 Die Umweltstabilität der Erreger 2.8.1 In Erde 2.8.2 In Wasser 2.8.3 In Urin 3. Publikationen 3.1 Publikation Nr. 1 3.2 Publikation Nr. 2 4. Diskussion und Schlussfolgerung 5. Zusammenfassung 6. Summary 7. Literaturverzeichnis 8. Danksagung

Einleitung: Der Einfluss von Stress während der Schwangerschaft auf den Fetus lässt sich auch postnatal bis in das Erwachsenenalter und teilweise sogar bis in nachfolgende Generationen nachweisen. Eine Vielzahl an Störgrößen erschwert es enorm, beim Menschen konkrete Kausalitäten auszuarbeiten. Mit dem Weißbüschelaffen steht ein humanrelevanter Modellorganismus zur Verfügung, der eine dem Menschen sehr ähnliche Situation in Bezug auf die Physiologie der Trächtigkeit sowie der männlichen Reproduktion bietet, gleichzeitig jedoch einen hohen Grad der Standardisierung ermöglicht. Ziele der Untersuchungen: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten ausgewählte Faktoren des Reproduktionssystems in den Hoden adulter Weißbüschelaffen mittels qPCR und Immunhistochemie nachgewiesen und auf Zellebene lokalisiert werden. Weiterhin sollte ermittelt werden, ob die nachgewiesenen Proteine durch pränatalen Stress beeinflusst werden. Ziel des zweiten Teils der vorliegenden Arbeit war es herauszufinden, ob und in welcher Form sich ein standardisierter pränataler Stressreiz postnatal auf ausgewählte Parameter der männlichen Reproduktion des Weißbüschelaffen bis hin zur F3-Generation auswirken kann. Tiere, Material und Methoden: Trächtige Weißbüschelaffen wurden von Trächtigkeitstag 42 bis 48 (EDEX) bzw. Trächtigkeitstag 90 bis 96 (LDEX) täglich mit 5 mg Dexamethason (DEX) pro kg Körpergewicht per os behandelt. Eine Kontrollgruppe (C) erhielt während der gesamten Trächtigkeit keine Glucocorticoide. Von den adulten männlichen Nachkommen der F1-Generation wurden 9 (C), 8 (EDEX) und 9 (LDEX) jeweils tiefgefrorene Hoden auf 12 Transkripte aus den Gruppen der Enzyme der Steroidbiosynthese, der Steroidrezeptoren, des Relaxinsystems und der Proliferationsmarker mittels qPCR quantitativ untersucht. Die jeweils kontralateralen Hoden waren in Paraformaldehyd fixiert worden und wurden parallel auf Proteinebene mittels Immunhistochemie (IHC) untersucht. Für den zweiten Teil der vorliegenden Arbeit wurden die jeweils in maternaler Linie weitergezüchteten Männchen der DEX F2 (n = 2) und DEX F3 (n = 3) auf relevante Parameter der Reproduktionsfähigkeit hin untersucht: Die Größe der Hoden wurde im Frühling, im Sommer und im Winter gemessen, Blutplasma¬proben an einem Tag im Sommer um 8 Uhr, 12 Uhr und 16 Uhr sowie an einem Tag im Winter um 8 Uhr entnommen und daraus mittels ELISA die Konzentration von Testosteron sowie teilweise von 17β Östradiol ermittelt; Ejakulate wurden durch penile Vibrostimulation (PVS) gewonnen und computergestützt untersucht. Alle Ergebnisse wurden jeweils mit mindestens elf unbehandelten männlichen Tieren derselben Kolonie verglichen. Ergebnisse: Alle untersuchten für die männliche Reproduktion relevanten Proteine konnten in den Hoden der F1 nachgewiesen werden. In den Hoden der EDEX F1 und der LDEX F1 war auf Proteinebene jeweils einzig die Steroid-5α-Reduktase 1 (SRD5A1) gegenüber C erhöht. Auf Genebene waren von den untersuchten Transkripten nur in den Hoden der EDEX F1 die SRD5A1, SRD5A2 und Ki 67 jeweils signifikant gegenüber C aufreguliert. Die Hodengröße änderte sich nicht signifikant im Jahresverlauf. Im Tagesverlauf konnte ein signifikanter Anstieg der Testosteronkonzentration im Blutplasma zwischen 8 Uhr und 12 Uhr ermittelt werden. Jedoch konnte kein signifikanter Unterschied zwischen Testosteronkonzentration im weiteren Tageszeitenvergleich, im Sommer und Winter und in Relation zum Alter festgestellt werden. Darüber hinaus bestand keine Korrelation zwischen Testosteron- und 17β Östradiol¬konzentration aus denselben Blutproben. Der Vergleich aller im Zusammenhang mit der PVS erhobenen Parameter zwischen DEX F2/F3 und C ergab, dass einzig die Erfolgsrate der PVS in DEX F2/F3 niedriger lag als in C. Der versuchsgruppen-übergreifende Vergleich aller Ejakulate zwischen den Altersgruppen ergab bei jung adulten Tieren einen signifikant höheren Anteil an motilen Spermien sowie eine signifikant schlechtere Erfolgsrate der PVS gegenüber adulten Tieren. Schlussfolgerungen: Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit geben Hinweise darauf, wie sich Stress während der Trächtigkeit beim Weißbüschelaffen auf die Nachkommen auswirken könnte: In DEX F1 sind wichtige Voraussetzungen für eine funktionierende Testosteron-Biosynthese sowie die Vermittlung von Testosteron- und Östrogen-mediierten Signalen im Hoden gegeben, möglicherweise sogar in verstärkter Weise. Darüber hinaus bestätigen diese Ergebnisse die Humanrelevanz des Weißbüschelaffen als Modell¬organismus zum männlichen Reproduktionssystem. In DEX F2/F3 könnte die niedrige Erfolgsrate der PVS ein Hinweis auf verminderte Konzentrationsfähigkeit in den auf intra¬uterinen Stress folgenden Generationen sein. Jedoch unterscheiden sich die meisten erhobenen reproduktions-physiologisch bedeutsamen Parameter nicht zwischen DEX F2/F3 und C.:1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Glucocorticoide und Stress während der Trächtigkeit 2.2 Relevante Hormone der Reproduktion und ihre Biosynthese 2.2.1 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 2 2.2.2 Testosteron und Androgenrezeptor 2.2.3 Steroid-5α-Reduktasen 2.2.4 Aromatase 2.2.5 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 7 2.2.6 Östradiol und Östrogenrezeptoren 2.2.7 Relaxinsystem 2.2.8 Proliferationsfaktoren 2.3 Weißbüschelaffen 2.3.1 Allgemeines zu Weißbüschelaffen 2.3.2 Reproduktionsbiologie der männlichen Weißbüschelaffen 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 3.1.1 Versuchsaufbau (DEX) im DPZ 3.1.2 qPCR an DEX F1 Hoden 3.1.3 Immunhistochemie an Hoden der DEX F1 3.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/DEX F3 3.2.1 Herkunft der Weißbüschelaffen 3.2.2 Haltung der Weißbüschelaffen 3.2.3 Bestimmung der Hodengrößen und des Körpergewichtes 3.2.4 Blutentnahmen und Hormonbestimmungen mittels ELISA 3.2.5 Penile Vibrostimulation 3.3 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 4.1.1 qPCR der Hoden der F1 4.1.2 Immunhistochemie der Hoden der DEX F1 4.1.2.1 Enzyme der Steroidbiosynthese 4.1.2.2 Steroidrezeptoren 4.1.2.3 Relaxinsystem 4.1.2.4 Proliferationsmarker 4.1.3 Zusammenfassung der Ergebnisse des Versuchsteils I – ex vivo DEX F1 4.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/F3 4.2.1 Hodengrößen 4.2.2 Testosteron 4.2.3 Ejakulatanalyse 4.2.4 Zusammenfassung der Ergebnisse des Versuchsteils II – in vivo DEX F2/F3 5 DISKUSSION 5.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 5.1.1 Vergleichende Diskussion der Ergebnisse auf Gen- und Proteinebene in den Hoden der F1 5.1.1.1 Relevante Enzyme der Testosteronbiosynthese 5.1.1.2 Steroidrezeptoren 5.1.1.3 Das Relaxinsystem 5.1.1.4 Proliferationsfaktoren 5.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/F3 5.2.1 Hodengrößen 5.2.2 Testosteron 5.2.3 Ejakulatanalyse 5.3 Schlussbetrachtung 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 SUMMARY 8 Literaturverzeichnis 9 ANHANG 10 DANKSAGUNG / Introduction: The impact of prenatal stress can also be detected in the grown-up offspring and partly even in following generations. There are many interfering variables that make it nearly impossible to establish precise correlations in humans. However, the common marmoset is a model organism very similar to humans with respect to the physiology of pregnancy as well as to male reproduction. In addition to that, the possibility of a high-grade standardisation is extremely advantageous. Objective: The first part of this work aimed at detecting selected factors of the reproductive system in testes of adult common marmosets by qPCR and immunohistochemistry, and localising them at the cellular level; both were directed at clarifying whether or not the target proteins respond to prenatal stress. The second part aimed at determining in which form and to what extent standardised prenatal stress affects selected parameters of male reproduction up to the F3-generation in the common marmoset. Animals, materials and methods: Pregnant common marmosets were treated daily with a dose of 5 mg dexamethasone (DEX) per kg body weight per os on gestational days 42 to 48 (EDEX) and gestational days 90 to 96 (LDEX). A control group (C) received no glucocorticoid treatment during pregnancy at all. By qPCR, 12 transcripts from the groups of steroidogenic enzymes, steroid receptors, the relaxin system and the proliferation markers were quantitatively analysed in 9 (C), 8 (EDEX) und 9 (LDEX) frozen testes of F1 generation adult male offspring. Respective contralateral testes had been fixed in paraformaldehyde and were analysed on protein level by immunohistochemistry (IHC). In the second part of this work, males of DEX F2 (n = 2) and DEX F3 (n = 3), each bred in the maternal line, were analysed for relevant parameters of reproduction ability: testes were measured in spring, summer, and winter; blood plasma samples were taken on one day in summer at 8 a.m., 12 noon and 4 p.m. as well as on a day in winter at 8 a.m. and subsequently analysed by ELISA for testosterone and partly 17β oestradiol; ejaculates have been gathered by penile vibrostimulation (PVS) and were tested by computer-assisted sperm analysis. All results were compared with those on at least 11 untreated male common marmosets of the same colony. Results: Each of the targeted proteins relevant for male reproduction was detected in testes of F1. At the protein level only steroid 5α-reductase 1 (SRD5A1) was enhanced expressed in testes of EDEX F1, and LDEX F1 compared to C. At the gene level, SRD5A1, SRD5A2 and Ki 67 were each enhanced expressed compared to C, but in testes of EDEX F1 only. Testis size did not vary significantly during the course of the year. During the course of the day there was a significant rise of the testosterone concentration in blood plasma between 8 a.m. and 12 noon. However, there was no significant difference in the testosterone concentration during other times of the day, nor between summer and winter or in relation to the age of the monkeys. Furthermore there was no correlation between the testosterone and the 17β oestradiol concentrations in the same blood samples. Comparisons of all measured PVS parameters between DEX F2/F3 and C gave a lower success rate of PVS in DEX F2/F3 as the only difference. Comparisons of the ejaculates between age groups irrespective of the DEX classification revealed that young adult common marmosets possess a significantly higher percentage of motile sperms as well as a significantly lower success rate of PVS compared to adult monkeys. Conclusions: The results of this study suggest how stress during pregnancy could influence subsequent generations in the common marmoset: in DEX F1, important requirements of active testosterone biosynthesis as well as of mediation of testosterone and oestrogen signals in testis are met, possibly even enhanced. In addition, these results confirm the relevance of the common marmoset as a model organism for human male reproduction. In DEX F2/F3, the low success rate of PVS might indicate a reduced capability to concentrate in generations following intrauterine stress on F1. Yet, most of the tested parameters pertinent to reproduction physiology do not differ between DEX F2/F3 and C.:1 EINLEITUNG 2 LITERATURÜBERSICHT 2.1 Glucocorticoide und Stress während der Trächtigkeit 2.2 Relevante Hormone der Reproduktion und ihre Biosynthese 2.2.1 3β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 2 2.2.2 Testosteron und Androgenrezeptor 2.2.3 Steroid-5α-Reduktasen 2.2.4 Aromatase 2.2.5 17β-Hydroxysteroid-Dehydrogenase 7 2.2.6 Östradiol und Östrogenrezeptoren 2.2.7 Relaxinsystem 2.2.8 Proliferationsfaktoren 2.3 Weißbüschelaffen 2.3.1 Allgemeines zu Weißbüschelaffen 2.3.2 Reproduktionsbiologie der männlichen Weißbüschelaffen 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 3.1.1 Versuchsaufbau (DEX) im DPZ 3.1.2 qPCR an DEX F1 Hoden 3.1.3 Immunhistochemie an Hoden der DEX F1 3.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/DEX F3 3.2.1 Herkunft der Weißbüschelaffen 3.2.2 Haltung der Weißbüschelaffen 3.2.3 Bestimmung der Hodengrößen und des Körpergewichtes 3.2.4 Blutentnahmen und Hormonbestimmungen mittels ELISA 3.2.5 Penile Vibrostimulation 3.3 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 4.1.1 qPCR der Hoden der F1 4.1.2 Immunhistochemie der Hoden der DEX F1 4.1.2.1 Enzyme der Steroidbiosynthese 4.1.2.2 Steroidrezeptoren 4.1.2.3 Relaxinsystem 4.1.2.4 Proliferationsmarker 4.1.3 Zusammenfassung der Ergebnisse des Versuchsteils I – ex vivo DEX F1 4.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/F3 4.2.1 Hodengrößen 4.2.2 Testosteron 4.2.3 Ejakulatanalyse 4.2.4 Zusammenfassung der Ergebnisse des Versuchsteils II – in vivo DEX F2/F3 5 DISKUSSION 5.1 Versuchsteil I – ex vivo Hoden DEX F1 5.1.1 Vergleichende Diskussion der Ergebnisse auf Gen- und Proteinebene in den Hoden der F1 5.1.1.1 Relevante Enzyme der Testosteronbiosynthese 5.1.1.2 Steroidrezeptoren 5.1.1.3 Das Relaxinsystem 5.1.1.4 Proliferationsfaktoren 5.2 Versuchsteil II – in vivo DEX F2/F3 5.2.1 Hodengrößen 5.2.2 Testosteron 5.2.3 Ejakulatanalyse 5.3 Schlussbetrachtung 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 SUMMARY 8 Literaturverzeichnis 9 ANHANG 10 DANKSAGUNG

In dieser Arbeit werden die Zeitpunkte der Kontrastmittelphasen der Leber bei Hunden verschiedener Größe und Rasse untersucht. Diese werden mit klinischen Parametern wie der Körpermasse, dem Alter und der Herzfrequenz zum Zeitpunkt der Untersuchung korreliert. In der vorliegenden Arbeit wird diskutiert, ob anhand dieser einfach erfassbarer Patientenparametern eine zielführende Planung einer Multiphasen-CT möglich ist. Es werden folgenden Zielstellungen bearbeitet: 1. Wann ist der Beginn der früharteriellen, arteriellen und der portalvenösen Phase erreicht? 2. Wann ist der Zeitpunkt des Kontrastmittelpeaks in der Aorta abdominalis und der V. portae erreicht? 3. Erstellen von Korrelationen dieser Zeitpunkte mit dem Alter, dem Gewicht und der Herzfrequenz der Tiere. 4. Erstellen von klinisch anwendbaren Regressionsgleichungen. An insgesamt 145 Tieren wurde das Anflutungsverhalten des jodhaltigen Kontrastmittels Imeron® 300 Bracco in der Leber und den zuführenden Gefäßen (Aorta abdominalis und V. portae) untersucht. Dabei wurden die Programme Bolus Tracking (BT) und das Perfusion Protokoll (dynamisches CT/ DU) mit dem CT Philips Brilliance CT 6 MX 8000 IDT genutzt. Die hierfür verwandten Hunde stammten aus dem Patientengut der Klinik für Kleintiere der Universität Leipzig. Alle Tiere erhielten 2 ml/kg Imeron® 300 Bracco mit 3 ml/s in die rechte oder linke V. cephalica antebrachii mit einem automatischen Injektor durch eine 20 Gauge Flexüle appliziert. Dies entspricht einer Jodmenge von 600 mg/kg. Aufgrund der Einteilung der Tiere in ASA-Gruppen und der weiteren Diagnostik und Therapie wurden vier verschiedene Narkoseprotokolle angewandt. Alle Tiere wurden intubiert und die Narkose mit Isofluran aufrechterhalten. Das Narkoseregime führte bei keinem der untersuchten Parameter zu einem signifikanten Unterschied. Der Beginn der früharteriellen und der portalvenösen Phase wurde mit Bolus Tracking bei 106 Hunden untersucht. Als Beginn wurde ein absoluter Schwellenwert von 100 HE im Aortenlumen auf Höhe des kranialen Leberpols bzw. im Lumen der Vena portae definiert. Mit dieser Methode wurde eine Überschreitung des Schwellenwertes im Aortenlumen im Mittelwert nach 13,12 ± 3,6 Sekunden (64 Tiere) und im Lumen der V. portae nach 31,60 ± 8,6 Sekunden (42 Tiere) gemessen. Eine signifikante Korrelation mit dem Gewicht auf einem zweiseitigen Signifikanzniveau von 0,01 konnte festgestellt werden. Mit der dynamischen CT (DU) wurden 39 Tiere untersucht. Der Beginn der früharteriellen Phase (Schwellenwert von 100 HE im Lumen der Aorta abdominalis) wurde nach 9,77 ± 4,3 Sekunden und der portalvenösen Phase (Schwellenwert von 100 HE im Lumen der Vena portae) nach 27,6 ± 8,7 Sekunden erreicht. Die Korrelationskoeffizienten der mit der DU gemessenen Parameter und der Patientenparametern sind höher als die mit dem BT erstellten und werden deshalb hier aufgeführt. Mit der vorwärtsgerichteten Regression konnten die folgenden Modelle erstellt werden. Früharterielle Phase (s) 0,35 + 0,21 x Körpermasse R = 0,61 Portalvenöse Phase (s) 13,9 + 0,7 x Körpermasse R = 0,67 An denselben Tieren wurde auch der Zeitpunkt des arteriellen und portalvenösen Peaks im Gefäßlumen der Aorta abdominalis und der Vena portae gemessen. Dieser wurde im Mittelwert nach 24,5 ± 8,6 Sekunden und nach 43,6 ± 13,4 Sekunden erreicht. Der Zeitpunkt des arteriellen Peaks weist den höchsten Korrelationskoeffizienten mit dem Gewicht in der vorliegenden Arbeit auf. Anhand einer vorwärtsgerichteten Regression konnten die folgenden Modelle erstellt werden. Arterieller Peak1 (s) 6,13 + 0,63 x Körpermasse R = 0,9 Arterieller Peak2 (s) 12,23 + 0,61 x Körpermasse – 0,07 Herzfrq. R = 0,92 Portalvenöser Peak1 (s) 24,5 + 0,65 x Körpermasse R = 0,6 Portalvenöser Peak2 (s) 17,5 + 0,71 x Körpermasse – 0,07 Alter R = 0,66 Die Ergebnisse zeigen, dass anhand einfach erfassbarer Patientenparametern bedingt eine zielführende Planung einer Multiphasen-CT möglich ist. Aufgrund der sehr hohen Korrelationskoeffizienten zwischen dem arteriellen Peak und den klinischen Parametern ist die Anwendung dieser Gleichungen zum Errechnen des arteriellen Peaks sehr sinnvoll klinisch anzuwenden. Da diese Arbeit den Nachweis erbracht hat, dass zum Zeitpunkt des arteriellen Peaks noch eine auswertbare arterielle Phase im Leberparenchym besteht, kann diese Gleichung sowohl bei der Detektion von Leberherden als auch bei Gefäßanomalien genutzt werden.

Ziel dieser Arbeit war die Betrachtung der Leitbahnen der Akupunktur unter wissenschaftlichen Gesichtspunkten. Bereits während der Recherchen wurde deutlich, dass dieses Thema auf mehreren Ebenen zu bearbeiten ist. Zunächst wurde daher der zeitliche Rahmen der Entstehung der Akupunktur im Allgemeinen und der Veterinärakupunktur im Besonderen eingegrenzt, die Bedeutung der Veterinärakupunktur im Alten China untersucht und die Beschreibung und Darstellung der Leitbahnen und Punkte beim Tier thematisiert (Kap. 3). Anschließend wurde eine Einführung in die theoretischen Grundlagen gegeben, ihre Entstehung und Entwicklung vor allem unter historischen und soziokulturellen Gesichtspunkten und zuletzt im medizinischen Kontext beschrieben (Kap. 4). Im Folgenden wurde der Versuch des Nachweises der Leitbahnen in naturwissenschaftlichem Kontext anhand verschiedener methodischer Beispiele untersucht (Kap. 5). Schließlich wurden die Ergebnisse zusammengefasst, untereinander sowie mit Aspekten der Forschung zur Punktspezifität in einen Kontext gestellt und abschließend eine Einschätzung des Stellenwertes der Leitbahnen in der (tier)medizinischen Praxis gegeben (Kap. 6). Anhand der Quellenlage kann die Entwicklung der Akupunktur ab etwa 200 v. Chr. nachvollzogen werden, wobei Nachweise für die Tierakupunktur erst in der Sui-Zeit (581 – 618 n. Chr.) vorliegen. Aus dem Alten China sind keine Darstellungen der Leitbahnen bekannt, eine Einteilung erfolgt eher nach den Körperregionen. Erst im Europa der 1950er Jahre werden Leitbahnkarten für Tiere durch Transposition entwickelt. Die Akupunktur ist eine Teildisziplin der sogenannten Entsprechungsmedizin. Als solche sind die ihr zugrundeliegenden Theorien ein Ergebnis der politischen und sozialen Veränderungen zwischen der Zeit der streitenden Reiche (481 – 221 v. Chr.) und der Han-Zeit (202 v. Chr. – 220 n. Chr.), die danach über etwa 1700 Jahre nie grundlegend in Frage gestellt wurden. Dieser theoretische Rahmen hat in China selbst nur geringe praktische Relevanz, während ihm im Westen als Abgrenzung gegenüber der konventionellen Medizin und um den Wunschvorstellungen einer idealen alternativen Therapiemethode zu entsprechen eine deutlich größere Rolle zukommt. Ein Nachweis der Existenz der Leitbahnen wurde vielfach versucht, konnte jedoch nicht erbracht werden. Einige Ergebnisse dieser Arbeiten und auch vieler Wirksamkeitsstudien zeigen, dass es sich bei der Akupunktur um ein multifaktorielles Therapiekonzept handelt. Besonders hervorzuheben ist die rezeptive und transmissive Rolle des Nervensystems auf unterschiedlichen Funktions- und Integrationsebenen. Die Leitbahnen als Linien auf der Körperoberfläche haben rein deskriptiven Charakter, um eine Anzahl von Punkten zu verbinden. Allerdings deutet einiges darauf hin, dass eher von sensiblen und effektiven Zonen gesprochen werden müsste. In diesem Rahmen ist es nicht sinnvoll, an einer Kartographie von Punkt und Linie festzuhalten. Zu eng sind hier die Beziehungen zur sozio-historisch bedingten Theorie, die die physiologisch-anatomischen Gegebenheiten nicht adäquat wiedergibt. Die weitere Forschung auf dem Gebiet der Akupunktur muss weiterhin um Aufklärung der Wirkmechanismen bemüht sein. Gleichzeitig muss eine objektive Quantifizierung der Akupunkturwirkungen erfolgen, um sinnvolle Einsatzbereiche zu definieren.

Autoantikörper gegen Proteinase 3 (cANCA) stellen einen hochsensitiven und spezifischen Seromarker für das Krankheitsbild der Wegenersche Granulomatose dar. Während die Ätiologie dieser systemischen Vaskulitis unbekannt ist, weisen zahlreiche klinische und experimentelle Daten darauf hin, daß cANCA an der Entstehung und Chronifizierung dieser Erkrankung beteiligt sind. Insbesondere die Konsequenzen einer cANCA-Ligation an Proteinase 3 (PR3)-exprimierende Neutrophile wurden intensiv untersucht und man geht davon aus, daß Anti-PR3-Antikörper über die Aktivierung inflammatorischer, neutrophiler Zellfunktionen die Vaskulitis fördern. Über die Auswirkungen von cANCA auf Monozyten, die eine wichtige Rolle in der Regulation der Immunantwort spielen und weitere Zielzellen dieser Antikörper darstellen, ist hingegen bisher wenig bekannt. Aktivierte Monozyten sind nicht nur ein wesentlicher Bestandteil der Granulome, sondern sind auch entscheidend an den vaskulären Entzündungsinfiltraten beteiligt. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, die Effekte von cANCA auf inflammatorische Zellfunktionen PR3-exprimierender Monozyten zu charakterisieren. Dabei war insbesondere ihr Einfluß auf die transendotheliale Migration und die Sekretion proinflammatorischer Mediatoren von Interesse. Die Isolation humaner Monozyten erfolgte mittels Gegenstromzentrifugation. Die monozytäre Transmigration wurde in mit humanen Endothelzellen bewachsenen Filtereinsätzen untersucht und mittels eines chemotaktischen Gradienten und/oder TNF-Stimulation der Endothelzellen gefördert. Die transendotheliale Migration von mit murinen, monoklonalen Anti-PR3-Antikörpern vorinkubierten Monozyten war, unabhängig vom Aktivierungszustand der Endothelzellen, deutlich vermindert. Dieser Effekt konnte sowohl durch vier von fünf cANCA-IgG-Fraktionen von Patienten mit aktiver WG als auch durch F(ab´)2-Fragmente der Autoantikörper reproduziert werden. Da bekannt ist, daß cANCA die proteolytische Aktivität von PR3 inhibieren und membrangebundenen Formen der leukozytären Serinproteasen PR3, humaner leukozytärer Elastase (HLE) und Cathepsin G (CathG) eine Rolle bei der Extravasion von Leukozyten zugesprochen wird, wurde daraufhin überprüft, ob PR3 für die monozytäre Transmigration von Bedeutung ist. Der physiologische Inhibitor dieser Serinproteasen, 1-Antitrypsin, und ein synthetischer Inhibitor von PR3 und HLE, CE-2072, verminderten die Anzahl migrierender Monozyten in gleichem Maße wie der vollständige Anti-PR3-Antikörper bzw. dessen F(ab´)2-Fragmente. Dahingegen hatte SLPI, ein Serpin, das lediglich CathG und HLE inhibiert, keinen Effekt auf die Anzahl migrierender Zellen. Dabei waren die Effekte von Anti-PR3-Antikörpern und 1-Antitrypsin nicht additiv, wodurch die Annahme, daß die Anti-PR3-mediierte Reduktion der monozytären Transmigration auf einer funktionellen Inhibition von PR3 beruht, untermauert wird. Die Reduktion der monozytären Transmigration ging nicht mit einer modifizierten endothelialen Adhäsion der Monozyten einher, wie unter dynamischen und statischen Bedingungen gezeigt werden konnte. Weder die rollende noch die feste Adhäsion der Monozyten wurde durch Anti-PR3-Antikörper oder Serinproteaseinhibitoren beeinträchtigt. Auch die durchflußzytometrisch quantifizierte Expression monozytärer ß1- und ß2-Integrine wurde durch die Autoantikörper nicht beeinflußt. Diese Ergebnisse zeigen erstmals, daß PR3 an der transendothelialen Migration, nicht aber der Adhäsion von Monozyten teilhat. Ein weiteres, wesentliches Ergebnis der vorliegenden Studie ist die, im Vergleich zu entsprechenden IgG-Kontrollen, massive Freisetzung proinflammatorischer Mediatoren aus Monozyten in Gegenwart muriner Anti-PR3-Antikörper bzw. humaner cANCA, die mittels ELISA ermittelt wurde. Die Sekretion war zeitabhängig, wobei die Sekretion von TNF- und IL-1ß der von Thromboxan A2, IL-6 und IL-8 vorausging. Im Gegensatz zu den Auswirkungen von cANCA auf die monozytäre Transmigration, konnten diese Effekte nicht durch die alleinige Ligation des Antikörpers an das Antigen PR3 reproduziert werden, sondern waren von einer simultanen Ligation der Autoantikörper an PR3 und FcR auf der monozytären Oberfläche abhängig. Eine cANCA-mediierte Retention adhärenter Monozyten im Gefäßbett bei gleichzeitiger Aktivierung der monozytären Freisetzung inflammatorischer Zytokine und Prostanoide durch cANCA, könnte nicht nur die Entstehung der extra- und perivaskulären, granulomatösen Entzündung, sondern auch die Aufrechterhaltung der nekrotisierenden Vaskulitis fördern. Insgesamt weisen die Ergebnisse dieser Studie erstmals auf eine funktionelle Rolle von PR3 bei der transendothelialen Migration von Monozyten hin. Außerdem liefern sie weitere wesentliche Hinweise darauf, wie die Interaktion von cANCA mit Monozyten an der Pathogenese der Wegenerschen Granulomatose beteiligt sein könnten.

Betriebe in Mittelgebirgslagen mit einem hohen Anteil Grassilagefütterung, der damit verbundenen größeren K-Aufnahme sowie höheren DCAD (Dietary-Cation-Anion-Difference) sollten für Gebärparese stärker prädisponiert sein. Ziel dieser Arbeit war es deshalb, Ursachen des Festliegens im Erzgebirge unter Berücksichtigung der DCAD zu ermitteln. Dazu wurden sowohl Fütterungsparameter und die Körperkondition analysiert, als auch Blut- und Harnuntersuchungen ante (a.p.) und post partum (p.p.) durchgeführt. In 21 Betrieben wurden insgesamt 249 Kühe im Zeitraum von 2 Wochen ante partum (a.p.) bis eine Woche p.p. untersucht. Bei 206 gesunden Kühen erfolgte 2 Wochen a.p. eine jeweils einmalige Harn- und Blutentnahmen. Ferner wurden bei 43 peripartal festliegenden Kühen nur Blut- und Harnproben direkt vor der Behandlung analysiert. Die sonographische Ermittlung der Rückenfettdicke (RFD) erfolgte bei je zehn klinisch gesunden Kühen pro Betrieb je 2 Wochen a.p. Die Silageproben (Grundfutteranalyse) wurden hinsichtlich ihrer Inhaltsstoffe untersucht und die DCAD berechnet. Laktationsnummern, Milchleistungen und Krankheitsinzidenzen der Kühe wurden ermittelt. Im Blutserum wurden ß-Hydroxy-Butyrat (BHB), Cholesterol, Bilirubin, Aspartat-Aminotransferase (ASATS), Creatinkinase (CK), Alkalische Phosphatase (AP), Protein (TP), Albumin, Harnstoff, Creatinin, Calcium (Ca), anorganisches Phosphat (Pi), Magnesium (Mg), Natrium (Na), Kalium (K) und im Vollblut die Leukozytenanzahl bestimmt. Im Harn erfolgte die Analyse derselben Mineralstoffe wie im Serum sowie weiterhin des pH-Wertes, der NSBA (Netto-Säure-Basen-Ausscheidung) und des Creatinins. Errechnet wurden die fraktionierten Eliminationen der einzelnen Mineralstoffe, der BSQ (Basen-Säure-QuotienTS) aus den Mengen der Basen, Säuren und Ammoniumionen im Harn sowie der Creatininquotient aus Harn- und Serumcreatinin. Befunde der Klinisch gesunden Kühe zwei Wochen a.p.: Die durchschnittliche RFD der Kühe lag in den Betrieben im Mittel zwischen 19 bis 26 mm. Muskel- und Knochenstoffwechsel charakterisierende Parameter waren physiologisch. Die Mediane der AP-Aktivität im Serum lagen in 15 der 21 Betriebe unter 100 U/l. Energie- und Eiweißstoffwechsel, Leukozytenanzahlen sowie Mineralstoffe in Serum und Harn ergaben keine Hinweise für präpartale Stoffwechselstörungen. Die Mediane von pH-Wert, NSBA sowie K- und Creatininkonzentrationen im Harn überschritten in mindestens fünf Betrieben die Grenzwerte, da die K-Konzentrationen in den Silagen bis fünffach über dem empfohlenen Bereich lagen. Die DCAD lag im Mittel aller Betriebe mit 458 meq/kg T weit über –100 bis +150 meq/kg T. Eine gesicherte Korrelation zur Anzahl der Festlieger bestand nicht. Befunde der Festlieger p.p.: Die Festlieger hatten zu je 60% reduzierte Ca- sowie Pi- und zu 16% verminderte Mg-Konzentrationen. Die Verteilung auf die Gebärparesetypen war wie folgt: Typ I = 42% Typ II= 19%, Typ III = 5%, Typ IV = 12% und Typ V = 21%. Dies entspricht mehrheitlich den Literaturangaben. Die Ca-, Pi- und Mg-Konzentrationen im Harn lagen bei den Festliegern in den physiologischen Bereichen. Die Mehrzahl der Festlieger hatte gleichzeitig erhöhte CK- (74%) und AST-Aktivitäten (53%). In 38% der Fälle war die AP-Aktivität vermindert. Die K- und NSBA-Konzentrationen im Harn der Festlieger zeigten als Folge der reduzierten Futteraufnahme gegenüber den Befunden a.p. eine Abnahme bis in den unteren physiologischen Bereich und z.T. darunter. Störungen des Energiestoffwechsels in Form erhöhter Ketonkörper- (58%) und Bilirubin- (40%) sowie reduzierter Cholesterol- (58%) Konzentrationen hatte die Mehrheit der festliegenden Kühe. Dabei war die kombinierte Ca-Pi-BHB-Stoffwechselstörung die Regel, traf aber nicht in jedem Fall zu. Die moderat veränderten Parameter des Energiestoffwechsels sind offensichtlich Folge der reduzierten Futteraufnahme. Eine Steigerung der Leukozytenzahl als Hinweis auf eine akut-entzündliche Reaktion bestand bei 44% der Festlieger, - die Leukopenie war die Ausnahme. Mit der Leukozytose waren in 36,8% respektive 42,1% der Fälle eine Hypokalz- resp. Hypophosphatämie gekoppelt. Bei dem größeren Teil (47,4%) der Leukozytosen waren die Ca- und Pi-Konzentrationen jedoch physiologisch. Das zeigt in Übereinstimmung mit den klinischen Befunden, dass entzündliche Prozesse und Verletzungen als weitere Ursache des Festliegens angesehen werden mussten. Fazit: Die erhöhte DCAD war in den untersuchten Mittelgebirgsbetrieben kein prädisponierender Faktor für die Gebärparese. Neben den bekannten Ca-Pi-Störungen spielten entzündliche Prozesse dafür eine wichtige Rolle.