Salmonella enterica subspecies enterica serovar Infantis (S. Infantis) places the fourth position in the ranking of most reported Salmonella serovars in Europe. During the last decade, a multi-drug resistant (MDR) S. Infantis population has rapidly increased and widespread in European and non-European broiler production. The study proposed here aimed to i) implement and evaluate the performance of a bioinformatics pipeline named WGSBAC for Salmonella in silico serotyping, and ii) identify the genetic determinants for the increased emergence of broiler-derived S. Infantis observed in Germany. First, we conducted an evaluation of WGSBAC and three bioinformatic tools (SISTR, SeqSero, and SeqSero2) for the characterization and genoserotyping of 43 Salmonella strains of 26 different serovars. Second, we performed sequencing of 30 broiler-derived S. Infantis isolates collected from two distant decades (the 1990s and the 2010s). We applied the WGSBAC pipeline and external bioinformatics software to i) assess and control the quality of the sequenced reads ii) assembly and quality control of assemblies, and iii) annotation, typing by classical MLST, cgMLST, genoserotyping, SNPs-based phylogenetic reconstruction and in silico phenotype prediction including antimicrobial resistance genes (AMR), virulence genes and plasmid replicons detection. To detect possible clonal relatedness with other S. Infantis clones from Europe, we performed a further comparative genome analysis using 17 public genomes of other S. Infantis clones circulating in Europe. WGSBAC was feasible for the serovar prediction of most of the 43 Salmonella strains. The tool SISTR reported the highest correlation (79.1%) followed by SeqSero2 (72.1%) and SeqSero (60.5%). The study of the S. Infantis strains revealed that in contrast to the isolates from the 1990s, the majority of the strains from the 2010s revealed the presence of a megaplasmid that carried a multidrug-resistant genes (MDR) pattern, a virulence genes pattern, and several fitness-associated determinants. We termed the MDR gene pattern “ESIr” and it coded for at least three antimicrobial families: ant(3”)-Ia (aminoglycosides), sul1 (sulfonamides), and tet(A) (tetracyclines). Besides, we termed the virulence pattern as “ESIv” which includes genes for fimbriae cluster, yersiniabactin siderophore, mercury resistance, and antitoxin/antitoxin systems. Furthermore, the genotyping analysis revealed the presence of a novel sequence type (ST2283) among the majority of the strains from the 2010s and ST32 and ST1032 within the strains from the 1990s. This genetic traits may promote the rapid incidence and dissemination of a novel MDR S. Infantis population. Following a WGS-based approach, this study evidences that MDR S. Infantis ST2283 strains carrying a pESI-like plasmid have emerged during the last decade and are currently circulating in the German poultry production chain. This event results in an urgent public health hazard, thus, control measures and the support of epidemiological studies are needed to prevent the entrance, transmission, and further dissemination of this clonal population in the food chain. / Salmonella enterica subspecies enterica serovar Infantis (S. Infantis) nimmt die vierte Position in der Rangliste der am häufigsten gemeldeten Salmonella-Serovare in Europa ein. Während des letzten Jahrzehnts hat das Auftreten einer multiresistenten Salmonella enterica subspecies enterica serovar Infantis (S. Infantis)-Population rapide zugenommen und ist in der europäischen und außereuropäischen Broilerproduktion weit verbreitet. Die Studie zielte darauf ab, i) eine bioinformatische Pipeline für die in silico-Serotypisierung von Salmonellen zu implementieren und deren Leistungsfähigkeit zu bewerten, und ii) die genetischen Determinanten für das in der deutschen Broilerproduktion während des letzten Jahrzehnts beobachtete vermehrte Auftreten von S. Infantis zu identifizieren. Zunächst wurde eine Bioinformatik-Pipeline (WGSBAC) und drei bioinformatische Tools (SISTR, SeqSero und SeqSero2) zur Genoserotypisierung von 43 Salmonella spp.-Stämmen von 26 verschiedenen Serovaren durchgeführt. Zweitens führten wir die Genomsequenzierung von 30 S. Infantis Broiler-Isolaten durch, die in zwei unterschiedlichen Jahrzehnten (den 1990er und den 2010er Jahren) gesammelt wurden. Wir setzen die WGSBAC-Pipeline und externe Bioinformatik-Software ein, um i) die Qualität der sequenzierten Reads zu bewerten und zu kontrollieren, ii) Assemblierungen und Qualitätskontrollen von und iii) Annotation, Typisierung durch klassischen MLST, cgMLST, Genoserotypisierung, phylogenetische Rekonstruktion mittels Einzelnukleotidänderungen (SNPs) und in-silico-Phänotyp-Vorhersage, einschließlich antimikrobieller Resistenzgene (AMR), Virulenzgene und Plasmid-Replikons zu erkennen. Die Bioinformatik-Pipeline WGSBAC ist geeignet, das antigene Profil der meisten der in der Studie verwendeten Salmonella-Stämme zu bestimmen. Das Tool SISTR zeigte dabei die höchste Übereinstimmung (79,1 %), gefolgt von SeqSero2 (72,1 %) und SeqSero (60,5 %). Die Untersuchung der S. Infantis-Stämme ergab, dass im Gegensatz zu den Isolaten aus den 1990er Jahren, die Mehrheit der Stämme aus den 2010er Jahren das Vorhandensein eines Megaplasmids zeigte, das homolog zu dem pESI-Plasmid aus Israel und anderen pESIähnlichen Plasmiden aus europäischen Isolaten ist. Das deutsche pESI-ähnliche Plasmid kodierte für ein Muster von multiresistenten Genen (MDR), ein Muster von Virulenzgenen und mehrere Fitness-assoziierte Determinanten, welches wir 'ESIr' nannten. Dieses korrelierte mit mindestens drei antimikrobiellen Familien: ant(3')-Ia (Aminoglykoside), sul1 (Sulfonamide) und tet(A) (Tetracycline). Der Genotyp korreliert hier vollständig mit dem antimikrobiellen Phänotyp. Außerdem bezeichneten wir das Virulenzmuster als 'ESIv', welches Gene für Fimbrien-Cluster, Yersiniabactin-Siderophore, Quecksilberresistenz und Antitoxin/Antitoxin- Systeme mit einschließt. Die Genotypisierungsanalyse ergab das Vorhandensein eines neuen Sequenztyps (ST2283) bei der Mehrzahl der Stämme aus den 2010er Jahren und ST32 und ST1032 bei den Stämmen aus den 1990er Jahren. Anhand eines auf Gesamtgenomsequenzierung-basierten Ansatzes zeigte diese Studie, dass MDR S. Infantis ST2283 Stämme, die ein pESI-ähnliches Plasmid tragen, während des letzten Jahrzehnts entstanden sind und derzeit in der deutschen Geflügelproduktionskette zirkulieren. Der Erwerb eines Megaplasmids, das für Resistenzen, Virulenz-assoziierte Determinanten und Fitnessmechanismen kodiert, könnte dieses schnelle und besorgniserregende epidemiologische Ereignis erklären. Dieses Ereignis stellt eine Gefahr für die öffentliche Gesundheit dar. Daher sind Kontrollmaßnahmen und die Unterstützung epidemiologischer Studien erforderlich, um den Eintritt, die Übertragung und die weitere Verbreitung dieser klonalen Population in der Lebensmittelkette zu verhindern.

EINLEITUNG: In der Diagnostik mittels Positronen-Emissions-Tomographie (PET) liegt ein großes Potential hinsichtlich Diagnostik und Therapie einer Vielzahl von Erkrankungen. Gerade das radioaktive Isotop 18F eignet sich aufgrund hervorragender Zerfallseigenschaften besonders gut für die Entwicklung neuer Radiotracer für den klinischen Einsatz. Dabei haben sich Aminosäure (AS)-Tracer besonders bei der Darstellung von zerebralen Tumoren bewährt. Dies ist insbesondere auf eine erhöhte AS- Transportrate sowie eine erhöhte Proteinbiosyntheserate im Tumorgewebe zurückzuführen. ZIELE DER UNTERSUCHUNGEN: Eine große Hürde in der PET-Diagnostik besteht in der Entwicklung neuer Tracer, welche sich für den klinischen Einsatz eignen. Denn auch die Qualität von PET-Untersuchungen hängt stark von der Entwicklung selektiver PET-Tracer ab. Ziel dieser Studie war es daher, die neu entwickelten Phenylalanin (Phe)-Tracer zunächst in vitro zu evaluieren, bevor die Tracer bei erfolgsversprechenden Ergebnissen in verschiedenen subkutanen sowie orthotopen Tumormodellen in vivo eingesetzt wurden. Ein besonderes Augenmerk wurde auf die Entwicklung neuer Tracer für die Darstellung zerebraler Glioblastome gelegt, da diese nach wie vor meist zu einem späten Erkrankungszeitpunkt diagnostiziert werden und mit einer hohen Mortalität einhergehen. TIERE, MATERIAL UND METHODEN: Insgesamt 5 Tracer – 3-L-[18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe sowie α-Methyl-2-,3- und 4-[18F]FPhe – wurden hinsichtlich ihrer Bildeigenschaften im PET evaluiert. Als Referenztracer wurde jeweils der bereits etablierte Tracer [18F]Fluoroethyltyrosin ([18F]FET) eingesetzt. Zunächst wurde die prinzipielle Eignung der Tracer anhand von in vitro Zellaufnahmeversuchen an verschiedenen humanen Tumorzelllinien (MCF-7, PC-3 und U87 MG) evaluiert. Erste in vivo Versuche zur Biodistribution wurden an gesunden weiblichen und männlichen Ratten (Long Evans, je n=6) durchgeführt. Im Anschluss erfolgten Untersuchungen an einem subkutanen Tumormausmodell (männliche SCID-Mäuse, n=18) sowie einem orthotopen Gehirntumormodell an der Ratte (männliche RNU-Ratten, n=24). ERGEBNISSE: Die in vitro Traceraufnahme der evaluierten Phe-Tracer war höher oder ähnlich im Vergleich zu [18F]FET. Vor allem das AS-Transportsystem L sowie ASC waren am Transport der AS-Tracer beteiligt. Eine Proteininkorporation konnte für den Tracer 3-L-[18F]FPhe nachgewiesen werden. Insgesamt zeigten alle Tracer eine hohe metabolische Stabilität in gesunden Tieren in vivo. Die höchste Gehirnaufnahme wurde für die Tracer 3-L-[18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe beobachtet. Im subkutanen Tumormodell wiesen alle Tracer ähnliche Tumorbildgebungseigenschaften auf. Lediglich αM-2-[18F]FPhe zeigte in den MCF-7 Tumoren signifikant niedrigere Tumorwerte im Vergleich zu [18F]FET. Auch im orthotopen Modell war zu beobachten, dass sich die neuen Phe-Tracer nur geringgradig von [18F]FET unterschieden. Hier zeigten sich in den ersten Minuten post injectionem (p.i.) signifikant höhere Traceraufnahmen für 3-L-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe im orthotopen Glioblastom. Das Tumor/Gehirn-Verhältnis zeigte jedoch keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich der untersuchten Tracer. SCHLUSSFOLGERUNGEN: Insgesamt wiesen alle fünf evaluierten Tracer gute Tumorbildgebungseigenschaften auf. Die Enantiomere 3-L-[18F]FPhe und 3-D-[18F]FPhe unterschieden sich erstaunlicherweise kaum in ihrem biologischen Verhalten. Insbesondere für die Tracer 3-L-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe war eine hohe Tumortraceraufnahme zu beobachten. Alle Tracer ermöglichten eine sensitive Detektion orthotoper Glioblastome in der Ratte. Die signifikant höhere Tumoraufnahme von 3-L-[18F]FPhe sowie αM-3-[18F]FPhe in den ersten Minuten p.i. könnte die Scanzeiten von Gehirntumorpatienten verkürzen. Eine erhöhte Proteininkorporation zeigte keinen signifikanten Vorteil für 3-L-[18F]FPhe gegenüber [18F]FET. Insgesamt war kein klarer Vorteil gegenüber dem etablierten AS-Tracer [18F]FET zu sehen.:1. EINLEITUNG 2. LITERATURÜBERSICHT 2.1 Prinzip der Positronen-Emissions-Tomographie 2.2 Klinische Bedeutung von Phenylalanin. 2.3 Vor- und Nachteile Aminosäure-basierter PET-Tracer 2.4 Wichtige eingesetzte PET-Tracer in der zerebralen Tumorbildgebung 2.4.1 L-[methyl-11C]methionin ([11C]MET) 2.4.2 [11C]-α-Methyl-L-Tryptophan ([11C]AMT) 2.4.3 6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin ([18F]FDOPA) 2.4.4 [18F]Fluorethyltyrosin ([18F]FET) 2.5 Blut-Hirn-Schranke: Aufbau und tierartliche Unterschiede 2.5.1 Aufbau der Blut-Hirn-Schranke 2.5.2 Transport über die Blut-Hirn-Schranke 2.5.3 Tierartliche Unterschiede 2.5.4 Einfluss von Krankheiten auf die Blut-Hirn-Schranke 2.6 Aminosäurentransporter: Charakterisierung und Vorkommen in verschiedenen Tumorarten 2.6.1 Aminosäurentransportsystem L 2.6.1.1 LAT1/SLC7A5-Transporter 2.6.2 Aminosäurentransportsystem ASC 2.6.2.1 ASCT2/SLC1A5-Transporter 2.6.3 Aminosäurentransportsystem A 3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Haltung der Versuchstiere 3.1.1 Haltung der Versuchsratten 3.1.2 Haltung der Versuchsmäuse 3.2 Anästhesie der Versuchstiere 3.3 Verwendete Materialien und Geräte 3.4 Verwendete Agenzien 3.5 Herstellung der 18F-markierten Tracer 3.5.1 Physikalische Grundlagen 3.5.2 Herstellung des radioaktiven Isotops 18F 3.5.3 Aminosäuren-Tracer auf Phenylalanin-Basis 3.6 Verwendete Zelllinien 3.6.1 U87 MG Zelllinie (humanes Glioblastom) 3.6.2 MCF-7 Zelllinie (humanes Brustadenokarzinom) 3.6.3 PC-3 Zelllinie (humanes Prostataadenokarzinom) 3.7 Zellaufnahmeversuche in vitro 3.7.1 Zellkultivierung 3.7.2 Versuchsdurchführung der zellulären Tracer-Aufnahme 3.7.3 Versuchsdurchführung der kompetitiven Inhibitionsstudien 3.7.4 Versuchsdurchführung der Proteininkorporation 3.7.5 Messung der zellulären Tracer-Aufnahme 3.8 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 3.8.1 Versuchstiere 3.8.2 Versuchsaufbau 3.9 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 3.9.1 Versuchstiere 3.9.2 Verwendete Zelllinien 3.9.3 Versuchsaufbau 3.9.4 Diagnostische Verfahren 3.10 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 3.10.1 Versuchstiere 3.10.2 Verwendete Zelllinie 3.10.3 Versuchsaufbau 3.10.4 Diagnostische Verfahren 3.10.5 Transkardiale Perfusion und Gehirnentnahme nach Versuchsende 3.11 PET-Messungen 3.11.1 Rekonstruktion der PET-Bilder 3.11.2 Auswertung der PET-Bilder mit der Software VINCI 3.11.3 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 3.11.4 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 3.11.5 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 3.12 Statistische Auswertung 4. ERGEBNISSE 4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 4.1.1 Zelluläre Tracer-Aufnahme 4.1.2 Kompetitive Inhibitionsstudien 4.1.3 Proteininkorporation 4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 4.2.1 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.2 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.3 α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.4 α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.5 α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.6 Vergleichende Auswertung 4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 4.3.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung 4.3.2 PET-Messungen MCF-7 Zelllinie 4.3.3 PET-Messungen PC-3 Zelllinie 4.3.4 Vergleichende Auswertung 4.3.5 Histologische Verfahren 4.4.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung 4.4.2 MRT- und PET-Messungen 4.4.3 Vergleichende Auswertung 4.4.4 Immunhistochemie 5. DISKUSSION 5.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 5.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 5.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 5.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 5.5 Synopsis: Gegenüberstellung der untersuchten Tracer 5.6 Ausblick 6. ZUSAMMENFASSUNG 7. SUMMARY 8. REFERENZEN 8.1 Abbildungsverzeichnis 8.2 Tabellenverzeichnis 8.3 Formelverzeichnis 8.4 Literaturverzeichnis 9. ANHANG 9.1 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 9.1.1 PET-Bilder und TACs 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.2 PET-Bilder und TACs 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.3 PET-Bilder und TACs α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.4 PET-Bilder und TACs α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.5 PET-Bilder und TACs α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.6 PET-Bilder und TACs [18F]Fluorethyltyrosin 9.2 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 9.2.1 MRT-und PET-Bilder 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.2 MRT-und PET-Bilder 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.3 MRT-und PET-Bilder α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.4 MRT-und PET-Bilder [18F]Fluorethyltyrosin 9.3 Durchführung der histologischen Verfahren 9.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 9.3.2 Anti-LAT1(SLC7A5)-Färbung 9.3.3 Anti-ASCT2(SLC1A5)-Färbung 9.4 Statistische Auswertung 9.4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 9.4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 9.4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 9.4.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 10. DANKSAGUNG / INTRODUCTION: Positron emission tomography (PET) has gained great potential for the diagnosis and treatment of a wide range of diseases. The radioactive isotope 18F is particularly well suited for the development of new radiotracers for clinical use due to its excellent decay properties. Amino acids (AA) have proven particularly useful in the imaging of cerebral tumors due to an increased protein synthesis rate and AA transport rates in tumor tissue. AIMS OF THE STUDIES: A major difficulty in PET diagnostics is the development of new tracers which are suitable for clinical use. This is because the quality of PET imaging depends heavily on the development of selective PET tracers. The aim of the study was therefore to preclinically evaluate the newly developed phenylalanine (Phe) tracers. After principle suitability was seen in in vitro cellular experiments, further experiments were performed in subcutaneous as well as orthotopic tumor models in vivo. Particular attention has been paid to the development of new tracers imaging cerebral glioblastomas, as they are mostly still diagnosed late and are associated with high mortality. ANIMALS, MATERIAL AND METHODS: A total of 5 Phe-based tracers – 3-L-[18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe as well as α-Methyl-2-,3- and 4-[18F]FPhe – were evaluated with regard to their imaging properties in PET. The already established tracer [18F]fluoroethyltyrosine ([18F]FET) was used as reference tracer in each case. First, the principle suitability of the tracers was evaluated by in vitro cell uptake experiments on various human tumor cell lines (MCF-7, PC-3 and U87 MG). Next, in vivo biodistribution studies were carried out on healthy female and male rats (Long Evans, n=6). Subsequently, experiments with subcutaneous tumor bearing mice (male SCID mice, n=18) and an orthotopic brain tumor model in the rat (male RNU rats, n=24) were performed. RESULTS: The in vitro cellular uptake of the evaluated Phe-tracers was higher or similar compared to [18F]FET. Significant inhibition of cellular uptake was seen in blocking the AA transport systems L and ASC. Protein incorporation could be demonstrated for 3-L-[18F]FPhe. Overall, all tracers showed high in vivo metabolic stability in healthy animals. The highest brain uptake was observed for the tracers 3-L- [18F]FPhe, 3-D-[18F]FPhe and αM-3-[18F]FPhe. In the subcutaneous tumor model, all tracers showed similar tumor imaging properties. Only αM-2-[18F]FPhe showed significantly lower tumor levels in the MCF-7 tumors compared to [18F]FET. It was also observed in the orthotopic model that the new Phe- based tracers differed only slightly from [18F]FET. Significantly higher tracer uptakes for 3-L-[18F]FPhe as well as αM-3-[18F]FPhe were seen in the first minutes post injection (p.i.) in the orthotopic tumor. However, the tumor-to-brain-ratio showed no significant differences. CONCLUSION: All five tracers evaluated showed good tumor imaging properties. Surprisingly, the enantiomers 3-L- [18F]FPhe and 3-D-[18F]FPhe hardly differed in their biological behaviour. In particular, a high tumour tracer uptake was observed for the tracers 3-L-[18F]FPhe as well as αM-3-[18F]FPhe. All tracers enabled sensitive detection of orthotopic glioblastomas in the rat. The significantly higher tumor uptake of 3-L-[18F]FPhe and αM-3-[18F]FPhe in the first minutes p.i. could shorten the scan times of brain tumour patients. Increased protein incorporation showed no significant advantage for 3-L- [18F]FPhe over [18F]FET. In summary, no clear advantage was seen over the established AA tracer [18F]FET.:1. EINLEITUNG 2. LITERATURÜBERSICHT 2.1 Prinzip der Positronen-Emissions-Tomographie 2.2 Klinische Bedeutung von Phenylalanin. 2.3 Vor- und Nachteile Aminosäure-basierter PET-Tracer 2.4 Wichtige eingesetzte PET-Tracer in der zerebralen Tumorbildgebung 2.4.1 L-[methyl-11C]methionin ([11C]MET) 2.4.2 [11C]-α-Methyl-L-Tryptophan ([11C]AMT) 2.4.3 6-[18F]Fluor-L-3,4-dihydroxyphenylalanin ([18F]FDOPA) 2.4.4 [18F]Fluorethyltyrosin ([18F]FET) 2.5 Blut-Hirn-Schranke: Aufbau und tierartliche Unterschiede 2.5.1 Aufbau der Blut-Hirn-Schranke 2.5.2 Transport über die Blut-Hirn-Schranke 2.5.3 Tierartliche Unterschiede 2.5.4 Einfluss von Krankheiten auf die Blut-Hirn-Schranke 2.6 Aminosäurentransporter: Charakterisierung und Vorkommen in verschiedenen Tumorarten 2.6.1 Aminosäurentransportsystem L 2.6.1.1 LAT1/SLC7A5-Transporter 2.6.2 Aminosäurentransportsystem ASC 2.6.2.1 ASCT2/SLC1A5-Transporter 2.6.3 Aminosäurentransportsystem A 3. TIERE, MATERIAL UND METHODEN 3.1 Haltung der Versuchstiere 3.1.1 Haltung der Versuchsratten 3.1.2 Haltung der Versuchsmäuse 3.2 Anästhesie der Versuchstiere 3.3 Verwendete Materialien und Geräte 3.4 Verwendete Agenzien 3.5 Herstellung der 18F-markierten Tracer 3.5.1 Physikalische Grundlagen 3.5.2 Herstellung des radioaktiven Isotops 18F 3.5.3 Aminosäuren-Tracer auf Phenylalanin-Basis 3.6 Verwendete Zelllinien 3.6.1 U87 MG Zelllinie (humanes Glioblastom) 3.6.2 MCF-7 Zelllinie (humanes Brustadenokarzinom) 3.6.3 PC-3 Zelllinie (humanes Prostataadenokarzinom) 3.7 Zellaufnahmeversuche in vitro 3.7.1 Zellkultivierung 3.7.2 Versuchsdurchführung der zellulären Tracer-Aufnahme 3.7.3 Versuchsdurchführung der kompetitiven Inhibitionsstudien 3.7.4 Versuchsdurchführung der Proteininkorporation 3.7.5 Messung der zellulären Tracer-Aufnahme 3.8 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 3.8.1 Versuchstiere 3.8.2 Versuchsaufbau 3.9 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 3.9.1 Versuchstiere 3.9.2 Verwendete Zelllinien 3.9.3 Versuchsaufbau 3.9.4 Diagnostische Verfahren 3.10 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 3.10.1 Versuchstiere 3.10.2 Verwendete Zelllinie 3.10.3 Versuchsaufbau 3.10.4 Diagnostische Verfahren 3.10.5 Transkardiale Perfusion und Gehirnentnahme nach Versuchsende 3.11 PET-Messungen 3.11.1 Rekonstruktion der PET-Bilder 3.11.2 Auswertung der PET-Bilder mit der Software VINCI 3.11.3 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 3.11.4 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 3.11.5 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 3.12 Statistische Auswertung 4. ERGEBNISSE 4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 4.1.1 Zelluläre Tracer-Aufnahme 4.1.2 Kompetitive Inhibitionsstudien 4.1.3 Proteininkorporation 4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 4.2.1 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.2 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.3 α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.4 α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.5 α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin 4.2.6 Vergleichende Auswertung 4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 4.3.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung 4.3.2 PET-Messungen MCF-7 Zelllinie 4.3.3 PET-Messungen PC-3 Zelllinie 4.3.4 Vergleichende Auswertung 4.3.5 Histologische Verfahren 4.4.1 Versuchsablauf und Gewichtsentwicklung 4.4.2 MRT- und PET-Messungen 4.4.3 Vergleichende Auswertung 4.4.4 Immunhistochemie 5. DISKUSSION 5.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 5.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 5.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 5.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 5.5 Synopsis: Gegenüberstellung der untersuchten Tracer 5.6 Ausblick 6. ZUSAMMENFASSUNG 7. SUMMARY 8. REFERENZEN 8.1 Abbildungsverzeichnis 8.2 Tabellenverzeichnis 8.3 Formelverzeichnis 8.4 Literaturverzeichnis 9. ANHANG 9.1 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 9.1.1 PET-Bilder und TACs 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.2 PET-Bilder und TACs 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.3 PET-Bilder und TACs α-Methyl-2-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.4 PET-Bilder und TACs α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.5 PET-Bilder und TACs α-Methyl-4-[18F]Fluorphenylalanin 9.1.6 PET-Bilder und TACs [18F]Fluorethyltyrosin 9.2 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 9.2.1 MRT-und PET-Bilder 3-L-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.2 MRT-und PET-Bilder 3-D-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.3 MRT-und PET-Bilder α-Methyl-3-[18F]Fluorphenylalanin 9.2.4 MRT-und PET-Bilder [18F]Fluorethyltyrosin 9.3 Durchführung der histologischen Verfahren 9.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung 9.3.2 Anti-LAT1(SLC7A5)-Färbung 9.3.3 Anti-ASCT2(SLC1A5)-Färbung 9.4 Statistische Auswertung 9.4.1 Zellaufnahmeversuche in vitro 9.4.2 Biodistributionsstudien in der gesunden Ratte 9.4.3 Subkutanes Tumor-Xenograft-Modell der Maus 9.4.4 Orthotopes Tumor-Xenograft-Modell der Ratte 10. DANKSAGUNG

Altersassoziiert entwickeln Hunde eine Erkrankung, die in vielen Aspekten der Alzheimer-Krankheit des Menschen ähnelt. Das canine kognitive Dysfunktionssyndrom äußert sich klinisch u.a. durch Desorientierung in vertrauter Umgebung, Vergessen von Kommandos und einen gestörten Schlaf-Wach-Rhythmus. Aus der Literatur ist bekannt, dass in den Gehirnen von alten Hunden regelmäßig Aβ- und selten Tauablagerungen zu beobachten sind. Allerdings erfolgte bisher kein Nachweis des hochgradig zytotoxischen und modifizierten pE3Aβ. Auch Veränderungen der mikroglialen Morphologie wurden bisher nicht beschrieben. Insgesamt lagen in dieser Studie 24 euthanasierte Rasse- und Mischlingshunde verschiedenen Alters vor. Fünf dieser Tiere besaßen ein durchschnittliches Alter von 2,1 Jahren und dienten als Kontrollgruppe. Die anderen 19 Hunde waren 8 bis 19 Jahre alt und wurden entsprechend ihrer Größe und des Gewichts in die drei Kategorien kleine (≤ 10 kg), mittelgroße (10 – 25 kg) und große Hunde (> 25 kg) unterteilt. Die Gehirne wurden aus den Schädeln präpariert und in 4 % Paraformaldehyd fixiert. Anschließend erfolgte die Präparation des frontalen und entorhinalen Kortex sowie der Hippokampusformation, die in 30%iger Saccharoselösung vitrifiziert und mittels Methylbutan bei -80 °C eingefroren wurden. Von den Regionen wurden Kryoschnitte mit einer Dicke von 40 µm angefertigt und diese anhand immunhistologischer Färbungen auf das Vorhandensein von Ablagerungen, bestehend aus den Amyloidsubtypen Aβ8-17 und pE3Aβ, sowie aus hyperphosphorylierten Tau, untersucht. Die Morphologie und das Aktivitätsstadium der Mikroglia wurden mit Antikörpern gegen Iba1 und TAL.1B5 analysiert. Zusätzlich erfolgte eine Untersuchung anhand des Filament Tracer. Stereologische Analysemethoden wurden zur Quantifizierung der Aβ-Ablagerungen und der Mikroglia angewandt. Disseminierte Plaques fanden sich bereits ab 9 Jahren. In den untersuchten Gehirnregionen von alten Hunden zeichnete sich ein progressiver Verlauf der Ablagerungen ab. Da insbesondere kleinere Hunde ein höheres Alter erreichten als mittelgroße und große Hunde konnten in dieser Kategorie vermehrt Plaques beobachtet werden. Den alten Tieren gemein war, dass in den untersuchten Gehirnregionen pE3Aβ-Plaques häufiger vorlagen als Plaques, die aus Aβ8-17 bestanden. Kleinere parenchymale und meningeale Gefäße des frontalen Kortex schienen besonders anfällig gegenüber pE3Aβ-Ablagerungen zu sein. Im entorhinalen Kortex von kleinen Hunden war die Menge an gefäßassoziierten Aβ8-17- und pE3Aβ-Ablagerungen annähernd gleich. Bei mittelgroßen und großen Hunden dominierte im entorhinalen Kortex und ventralen Hippokampus die Anzahl an gefäßassoziierten Aβ8-17-Ablagerungen. Bei kleinen Hunden existierten im ventralen Hippokampus signifikant mehr gefäßassoziierte Aβ8-17- als pE3Aβ-Ablagerungen. Hyperphosphoryliertes Tau fand sich in der Hippokampusformation von drei Hunden im Alter von 11 bzw. 15 Jahren. Der Schweregrad war unterschiedlich ausgeprägt, sodass nur ein Hund eine hochgradige Pathologie mit NFTs und neuritischen Plaques aufwies. Einhergehend mit dem Alter und einer assoziierten Proteinpathologie fanden sich Veränderungen der mikroglialen Morphologie. Neben ramifizierten Mikroglia lagen in den untersuchten Gehirnregionen aktivierte Mikroglia vor. Einige Mikroglia wiesen Zeichen einer Seneszenz auf und waren insbesondere in den Gehirnen von Hunden mit einer hochgradigen Aβ- bzw. Tau-Pathologie vorhanden. Zusammenfassend ist festzustellen, dass mit dieser Studie eine nähere Charakterisierung des caninen kognitiven Dysfunktionssyndroms erfolgte. Die Befunde sind von hoher translationaler Bedeutung und fördern die Etablierung des Hundes als natürliches Modelltier zur Untersuchung von Alterungsprozessen des Gehirns und für die Erforschung des initialen Stadiums der Alzheimer-Krankheit.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das canine kognitive Dysfunktionssyndrom 2.2 Pathogenese der Proteinablagerungen 2.2.1 Amyloid-Pathologie 2.2.2 Tau-Pathologie 2.3 Mikroglia 2.3.1 Ursprung und Formen 2.3.2 Die Rolle der Mikroglia beim Morbus Alzheimer 2.4 Assoziation des CCDS zum Morbus Alzheimer 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Hunde 3.2 Gehirnproben 3.2.1 Gewinnung und Kryofixierung der Gehirne 3.2.2 Makroskopische Untersuchung der Gehirne 3.2.3 Untersuchte Gehirnregionen 3.2.4 Histologische Färbungen 3.3 Immunohistochemische und Immunfluoreszenzfärbungen 3.3.1 Antikörper und Seren 3.3.2 Protokoll der ABC-Methode 3.3.3 Protokoll zur Immunfluoreszenz 3.3.4 Kontrollen 3.4 Auswertung der Färbungen 3.4.1 Deskriptive Analyse der Präparate 3.4.2 Quantitative Analyse der immunhistochemischen Befunde 3.4.3 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Anamnestische Merkmale der Hunde 4.1.1 Gruppeneinteilung in Größen- und Gewichtskategorien 4.1.2 Altersverteilung 4.1.3 Symptomatik 4.2 Pathologisch-histologische Untersuchung der Gehirne 4.2.1 Altersabhängige pathologische Gehirnveränderungen 4.2.2 Anteil der grauen Substanz des frontalen Kortex 4.2.3 Pathologisch-histologische Charakterisierung ausgewählter Hirnareale 4.2.3.1 Kontrollgruppe 4.2.3.2 Gehirne der alten Hunde 4.2.3.3 Korrelation der altersassoziierten Neuropathologie mit der Größen- und Gewichtskategorie 4.2.3.4 Statistische Auswertung 4.3 Detektion, Charakterisierung und Quantifizierung des Aβ-Proteins 4.3.1 Immunhistochemische Darstellung des Aβ-Proteins 4.3.1.1 Kontrollgruppe 4.3.1.2 Altersassoziierte Verteilung der Aβ-Ablagerungen 4.3.2 Morphologie der Aβ-Ablagerungen 4.3.3 Assoziation der Aβ-Ablagerungen mit der Größen- und Gewichtskategorie 4.3.4 Histochemische Darstellung des Aβ-Proteins 4.3.5 Quantifizierung der Aβ-Ablagerungen 4.4 Immunhistologische Darstellung von Tau-Pathologien 4.4.1 Kontrollgruppe 4.4.2 Alte Hunde der Versuchsgruppen 4.5 Charakterisierung und Quantifizierung der Mikroglia 4.5.1 Darstellung der Mikroglia 4.5.1.1 Kontrollgruppe 4.5.1.2 Alte Hunde der Versuchsgruppen 4.5.2 Assoziation der mikroglialen Morphologie zu den Größen- und Gewichtskategorien der untersuchten Hunde 4.5.3 Auswertung morphologischer Parameter mit dem Filament Tracer 4.5.4 Quantifizierung der Mikroglia 4.5.4.1 Untersuchung der Anzahl der Mikroglia in Assoziation zur Neuropathologie 4.5.4.2 Untersuchung der Anzahl der Mikroglia in Assoziation zu den Größen- und Gewichtskategorien 4.5.5 Nachweis HLA DR-positiver Mikroglia 4.5.5.1 Kontrollgruppe 4.5.5.2 Alte Versuchshunde 5 Diskussion 5.1 Hundepopulation 5.2 Pathologisch-histologische Untersuchung der Gehirne 5.3 Aβ-Pathologie 5.3.1 Parenchymale Aβ-Plaques 5.3.2 Gefäßassoziiertes Aβ-Protein 5.4 Tau-Pathologie 5.4.1 Häufigkeit innerhalb der Hundepopulation und kritische Wertung der Färbemethodik 5.4.2 Zusammenhang der Tau-Pathologie mit den Aβ-Ablagerungen 5.5 Mikroglia 5.5.1 Unterschiede in der Anzahl der Mikroglia zwischen jungen und alten Hunden 5.5.2 Unterschiede der Morphologie der Mikroglia zwischen jungen und alten Hunden 5.5.3 Detektion von dystrophischen Mikroglia in den Gehirnen von alten Hunden 5.6 Schlussfolgerungen 5.7 Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Tabellarische Übersichten zu den Studientieren 9.2 Protokoll der H&E-Färbung 9.3 Übersicht einzelner Ergebnisse des humanen Gewebes 9.4 Tabellarische Übersichten der verwendeten Materialien Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis / Dogs develop an age-associated cognitive dysfunction syndrome with several aspects resembling Alzheimer\\\''s disease. Affected animals show signs of dis-orientation in their familiar surroundings, dementia, and a disturbed circadian rhythm. The underlying neurodegenerative disease is associated with patho-logic changes in the brain including regularly deposition of β-pleated amyloid and rarely hyperphosphorylated tau accumulation. However, there have been no reports of the highly cytotoxic and modified pE3Aβ in the canine brain. Equally, altered microglial morphology has not been documented so far. For this study 24 euthanized thoroughbred dogs and mongrels of different ages were available. Five of these animals had an average age of 2.1 years and served as control group. The remaining 19 dogs were 8 to 19 years old. Accor-ding to their height and weight these dogs were divided into 3 different categories including small (≤ 10 kg), medium (11 - 25 kg) and large dogs (> 25 kg). Brains were dissected from the skulls and fixed in 4 % paraformaldehyde. Afterwards the frontal and entorhinal cortex as well as the hippocampal for-mation were isolated, vitrificated in 30 % sucrose solution and frozen to -80 °C by methylbutane. These regions were sliced into 40 µm thick sections and subsequently stained by immunohistology in order to detect deposits of Aβ8-17, pE3Aβ and hyperphosphorylated tau, respectively. Antibodies against Iba1 and TAL.1B5 were used to analyze microglial morphology and activation status. Additionally further investigations were made with the Filament Tracer of Imaris software. Stereological analysis methods served for the quantification of Aβ depositions and microglia. Disseminated Aβ plaques were detected in dogs from 9 years on. Within the examined brain regions of elderly dogs a progressive course of Aβ depositions was observed. Especially small dogs had a longer lifespan than medium and large dogs with the result that more plaques were deposited in the brains of small dogs. Elderly dogs had in common that pE3Aβ-plaques where more often located in the examined brain regions than plaques containing Aβ8-17. Minor parenchymal and meningeal vessels seemed to be susceptible especially to pE3Aβ depositions. The amount of vessel-associated Aβ8-17 and pE3Aβ in the entorhinal cortex of small dogs was almost equal. Within the entorhinal cortex of medium and large dogs the amount of vessel-associated Aβ8-17 predominated. The ventral hippocampus of small dogs showed significantly more vessel-associated Aβ8-17 than pE3Aβ depositions. Hyperphosphorylated tau was present in the hippocampal formations of 3 dogs with an age of 11 and 15 years, respectively. The degree of severity varied with the result that only one dog showed a high-grade pathology with development of NFTs and neuritic plaques. Accompanied by age and associated protein pathology altered microglial morphology was detected. Alongside with ramified microglia, activated cells were identified in the examined brain regions. Several microglia showed signs of senescence and were present in the brains of dogs with severe Aβ and tau pathology. Summarizing, this study facilitated a further characterization of the canine cognitive dysfunction syndrome. The results are of highly translational importance and encourage the establishment of the dog as a natural animal model for studying age-associated processes and the initial stage of Alzheimer’s disease.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das canine kognitive Dysfunktionssyndrom 2.2 Pathogenese der Proteinablagerungen 2.2.1 Amyloid-Pathologie 2.2.2 Tau-Pathologie 2.3 Mikroglia 2.3.1 Ursprung und Formen 2.3.2 Die Rolle der Mikroglia beim Morbus Alzheimer 2.4 Assoziation des CCDS zum Morbus Alzheimer 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Hunde 3.2 Gehirnproben 3.2.1 Gewinnung und Kryofixierung der Gehirne 3.2.2 Makroskopische Untersuchung der Gehirne 3.2.3 Untersuchte Gehirnregionen 3.2.4 Histologische Färbungen 3.3 Immunohistochemische und Immunfluoreszenzfärbungen 3.3.1 Antikörper und Seren 3.3.2 Protokoll der ABC-Methode 3.3.3 Protokoll zur Immunfluoreszenz 3.3.4 Kontrollen 3.4 Auswertung der Färbungen 3.4.1 Deskriptive Analyse der Präparate 3.4.2 Quantitative Analyse der immunhistochemischen Befunde 3.4.3 Statistische Auswertung 4 Ergebnisse 4.1 Anamnestische Merkmale der Hunde 4.1.1 Gruppeneinteilung in Größen- und Gewichtskategorien 4.1.2 Altersverteilung 4.1.3 Symptomatik 4.2 Pathologisch-histologische Untersuchung der Gehirne 4.2.1 Altersabhängige pathologische Gehirnveränderungen 4.2.2 Anteil der grauen Substanz des frontalen Kortex 4.2.3 Pathologisch-histologische Charakterisierung ausgewählter Hirnareale 4.2.3.1 Kontrollgruppe 4.2.3.2 Gehirne der alten Hunde 4.2.3.3 Korrelation der altersassoziierten Neuropathologie mit der Größen- und Gewichtskategorie 4.2.3.4 Statistische Auswertung 4.3 Detektion, Charakterisierung und Quantifizierung des Aβ-Proteins 4.3.1 Immunhistochemische Darstellung des Aβ-Proteins 4.3.1.1 Kontrollgruppe 4.3.1.2 Altersassoziierte Verteilung der Aβ-Ablagerungen 4.3.2 Morphologie der Aβ-Ablagerungen 4.3.3 Assoziation der Aβ-Ablagerungen mit der Größen- und Gewichtskategorie 4.3.4 Histochemische Darstellung des Aβ-Proteins 4.3.5 Quantifizierung der Aβ-Ablagerungen 4.4 Immunhistologische Darstellung von Tau-Pathologien 4.4.1 Kontrollgruppe 4.4.2 Alte Hunde der Versuchsgruppen 4.5 Charakterisierung und Quantifizierung der Mikroglia 4.5.1 Darstellung der Mikroglia 4.5.1.1 Kontrollgruppe 4.5.1.2 Alte Hunde der Versuchsgruppen 4.5.2 Assoziation der mikroglialen Morphologie zu den Größen- und Gewichtskategorien der untersuchten Hunde 4.5.3 Auswertung morphologischer Parameter mit dem Filament Tracer 4.5.4 Quantifizierung der Mikroglia 4.5.4.1 Untersuchung der Anzahl der Mikroglia in Assoziation zur Neuropathologie 4.5.4.2 Untersuchung der Anzahl der Mikroglia in Assoziation zu den Größen- und Gewichtskategorien 4.5.5 Nachweis HLA DR-positiver Mikroglia 4.5.5.1 Kontrollgruppe 4.5.5.2 Alte Versuchshunde 5 Diskussion 5.1 Hundepopulation 5.2 Pathologisch-histologische Untersuchung der Gehirne 5.3 Aβ-Pathologie 5.3.1 Parenchymale Aβ-Plaques 5.3.2 Gefäßassoziiertes Aβ-Protein 5.4 Tau-Pathologie 5.4.1 Häufigkeit innerhalb der Hundepopulation und kritische Wertung der Färbemethodik 5.4.2 Zusammenhang der Tau-Pathologie mit den Aβ-Ablagerungen 5.5 Mikroglia 5.5.1 Unterschiede in der Anzahl der Mikroglia zwischen jungen und alten Hunden 5.5.2 Unterschiede der Morphologie der Mikroglia zwischen jungen und alten Hunden 5.5.3 Detektion von dystrophischen Mikroglia in den Gehirnen von alten Hunden 5.6 Schlussfolgerungen 5.7 Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Tabellarische Übersichten zu den Studientieren 9.2 Protokoll der H&E-Färbung 9.3 Übersicht einzelner Ergebnisse des humanen Gewebes 9.4 Tabellarische Übersichten der verwendeten Materialien Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis

Einleitung Huferkrankungen nehmen einen hohen Patientenanteil in der orthopädischen Pferdepraxis ein. Sie sind häufig begleitet von geringem Hornwachstum und/oder ständigen Tragrandausbrüchen. Hierbei stellt sich die Frage, in wie weit dieses Geschehen durch die jeweilige Pferdehaltung begünstigt wird und wie stark der genetische Einfluss hierauf ist. Vom einzigen rezenten Wildpferd, dem Przewalskipferd, sind Daten zum Hornwachstum und -abrieb mit ausgeprägter Saisonalität bekannt, außerdem existiert bei Haltung im Semireservat ein spezieller Mechanismus des Tragrandausbruches. Diese Faktoren führen zu einer selbstständigen Huflängenregulation ohne Einflussnahme des Menschen. Ziele der Untersuchungen Die Untersuchungen dienen dem Ziel, für das Hauspferd Daten über saisonale Hornproduktion und Hornabnutzung zu erheben und Aussagen über einen eventuell vorhandenen physiologischen Huflängenregulationsmechanismus (wie er auch bei den Przewalskipferden vorkommt) zu machen. Eine suffiziente Ausprägung eines solchen Mechanismus ist für die tierschutzgerechte Durchführung einer Haltungsform, bei der die Pferde weitgehend sich selbst überlassen sind, essentiell. Durch den Vergleich mit dem Przewalskipferd sollen außerdem genetische und umweltbedingte Einflüsse auf die Huflängenregulation geklärt werden, um die Kenntnisse der für eine extensive Pferdehaltung nötigen Umweltfaktoren zu verbessern und zu erweitern. Materialien und Methoden Für die Untersuchungen standen insgesamt 26 Liebenthaler Pferde (Hauspferde) unterschiedlichen Alters (12 Pferde vor 1999 geboren, 14 Pferde ab 1999 geboren) und Geschlechtes (11 Hengste, 15 Stuten) zur Verfügung, die in Semireservat-ähnlicher Haltung leben. Bei diesen Tieren wurden über einen Zeitraum von einem Jahr an jedem Huf in monatlichem Abstand die Länge des Rückenteils der Hufplatte, die Hornbildung, der Hornverlust sowie das Auftreten von Hornspalten und Hornchips erfasst. Die Messungen der Dorsallänge sowie der monatlichen Hornbildung und des monatlichen Hornverlustes wurden direkt an den Hufen der untersuchten Pferde durchgeführt, wobei zur Erfassung von Hornbildung und Hornverlust der Distalschub einer artifiziell angebrachten Markierung an der dorsalen Hufwand erfasst wurde. Die auftretenden Hornspalten und Hornchips wurden monatlich fotografisch dokumentiert und im Anschluss nach ihrer Ausdehnung und Lokalisation ausgewertet. Für die Aussagen im Ergebnisteil wurden Methoden der deskriptiven und explorativen Statistik angewendet (Berechnung von Mittelwerten, Streuungsmaßen, Korrelationen, Darstellung linearer zusammenhänge mittels Regressionsgeraden, Varianzanalysen, Scheffé-Test). Ergebnisse Die dorsale Huflänge unterliegt bei den Liebenthaler Pferden einer Regulation, die es ermöglicht, sie nach Ausbildung ihrer individuellen Größe innerhalb einer gewissen Spannweite auch über Jahre hinweg konstant zu halten. Die Dynamik im Jahreszyklus äußert sich mit Höchstwerten im Mai und Minimalwerten im August. Dieses ist bedingt durch die im Verlauf der Jahreszeiten unterschiedlichen Werte bei Hufhornbildung und -verlust. Im Sommer sind sowohl die Hornproduktion als auch der Hornverlust signifikant höher als in den kälteren Monaten. Obwohl Hornbildungsrate und Hornverlust eine positive Korrelation zueinander aufweisen (r = 0,47), lassen sich auch Unterschiede erkennen: im Frühling und Sommer überwiegt der Hornverlust, während sich im Herbst und Winter eine höhere Hornbildung nachweisen lässt. Für die Abnutzung des Hufhorns gibt es zwei sich ergänzende und saisonal unterschiedlich stark wirkende Mechanismen: den Hufhornabrieb und die Tragrandausbrüche als Endergebnis des Chippings. Der Hornabrieb wird vor allem durch die Untergrundhärte gefördert und tritt zu allen Jahreszeiten mit Höchstwerten im Sommer und Minimalwerten im Winter auf. Das Auftreten von Tragrandausbrüchen und den sie bedingenden Hornchips ist vor allem auf die Sommermonate konzentriert, während in den kälteren Jahreszeiten nur wenige und kleinere Ausbrüche stattfinden. Der Prozess des Chippings wird eingeleitet durch die Bildung von Hornspalten im Tragrandbereich zwischen denen es dann durch Spreiz- und Hebelwirkung beim Auffußen zur Bildung eines Querrisses mit anschließender vollständiger Separierung eines Hornchips kommt. Der Tragrand wurde im Ergebnis dieses Ausbruchs auf das Niveau der Hufsohle eingekürzt. Die meisten Hornchips treten in Übereinstimmung mit der Ausbildung von Hornspalten an der lateralen Hufseite auf, außerdem werden die Vorderhufe deutlich öfter durch Tragrandausbrüche verkürzt als die Hinterhufe. Die Bildung von Hornspalten ist in der untersuchten Population deutlich höher, als es für einen regelrechten Chipping-Vorgang nötig wäre. Schlussfolgerungen Für die Liebenthaler Pferde wird die Schaffung von Bereichen mit abrasiven Untergründen auf dem ansonsten mit weichem Boden bedeckten Weidegelände empfohlen, um das häufige Auftreten von durchgehenden Hornspalten (mit der damit verbundenen Gefahr von Schmerz und Lahmheiten) zu minimieren. Bei einem Vergleich mit unter ähnlichen Bedingungen gehaltenen Przewalskipferden lässt die Höhe von Hornbildungsrate und Hornverlust einen genetischen Einfluss auf diese Parameter vermuten. Die Ausprägung der saisonalen Unterschiede ist jedoch bei beiden Rassen gleich, so dass für diese am ehesten die Habitatbedingungen als auslösende Faktoren in Betracht kommen. Beim Liebenthaler Pferd stellt sich eine dem Przewalskipferd ähnliche Längenregulation am Huf ein, wobei einzelne hierfür notwendige Mechanismen auch Unterschiede aufweisen. Somit wird deutlich, dass die Grundlage für eine physiologische Selbsterhaltung der Huflänge die den Pferden angebotenen Haltungsbedingungen sind, während die Genetik und die Domestikation geringere Effekte auf die Längenregulation haben. Auftretende pathologische Erscheinungen (nicht nur am Huf) müssen jedoch auch bei Extensivhaltung der Pferde zur Landschaftspflege erkannt und behandelt werden.

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Erst kürzlich wurde der Lipolyse-stimulierte Lipoproteinrezeptor (LSR, engl. lipolysis-stimulated lipoprotein receptor) als der zelluläre Oberflächenrezeptor von CDT und Iota-Toxin, zweier Vertreter der Iota-Toxin-Familie der clostridialen Aktin-ADP-ribosylierenden Toxine, identifiziert. In dieser Arbeit sollte geprüft werden, ob CST, ein weiterer Vertreter der Iota-Toxin-Familie, ebenfalls LSR für den Zelleintritt nutzt. Zunächst wurden die Toxinkomponenten CSTa und CSTb erstmals rekombinant hergestellt. Dazu wurden die für CSTa und CSTb codierenden Genabschnitte mittels PCR amplifiziert und anschließend in einen Expressionsvektor kloniert. Als Expressionsvektor wurde in dieser Arbeit der pHis1522-Vektor verwendet. Zur Amplifizierung wurden die Plasmide in E. coli transformiert und anschließend aufgereinigt. Die Proteinexpression erfolgte in B. megaterium, weil dieses Bakterium sich bereits zur Expression anderer clostridialer Toxine bewährt hatte. Zur Aufreinigung der 6xHis-getaggten Proteine wurde die Nickel-Affinitätschromatographie eingesetzt. Als nächstes wurde gezeigt, dass die rekombinant hergestellten Toxinkomponenten CSTa und CSTb biologisch aktiv waren. Dazu wurden CaCo2-Zellen mit CST behandelt und anschließend die Morphologie der Zellen untersucht. CaCo2-Zellen, die mit CSTa und CSTb behandelt wurden, wiesen Vergiftungserscheinungen wie eine typische Zellabrundung auf. Mit dem „Aktin-Nach-ADP-Ribosylierungs-Assay“ und der fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung von TRITC-Phalloidin-gefärbtem Aktin wurde gezeigt, dass das rekombinant hergestellte CST Aktin-ADP-ribosylierende Eigenschaften besaß. Nachdem gezeigt war, dass rekombinant hergestelltes CST sich wie ein biologisch aktives, binäres Aktin-ADP-ribosylierendes Toxin verhält, konnte mithilfe der Vergiftung von H1-HeLa(+LSR)-Zellen und nativen H1-HeLa-Zellen, die kein LSR exprimierten, nachgewiesen werden, dass die Wirkung des Toxins LSR-abhängig ist. FACS-Analysen und Kolokalisationsstudien mit Alexa488-gefärbtem CSTb und Antikörper-gefärbtem LSR erbrachten zusätzlich den Beweis, dass CSTb auf der Zelloberfläche an LSR bindet und bei der Aufnahme in die Zellen mit LSR in endozytischen Vesikeln kolokalisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass das C. spiroforme Toxin (CST) ebenfalls LSR als Rezeptor für den Zelleintritt verwendet.

Einleitung: Vitamin B12 hat wichtige Funktionen im Energiestoffwechsel sowie bei der Erythropoese. Beide Funktionskreise werden bei Hochleistungskühen besonders beansprucht und können bei Belastungen und ungenügender Vitamin-B12-Versorgung Ausgangspunkt für klinische Störungen werden. Ziele der Untersuchungen: In den vorliegenden Studien wurde der Fragestellung nachgegangen, wie sich die Vitamin-B12-Konzentration im Blutserum von Milchkühen in der Frühlaktation verhält und welche Zusammenhänge zu Stoffwechselparametern, dem Erythrogramm sowie dem Gesundheitsstatus der Kühe bestehen. Des Weiteren wurde geprüft, inwieweit der postpartale Stoffwechsel und der Gesundheitsstatus durch orale Vitamin-B12-Substitutionen stabilisiert werden können. Material und Methoden: Die Untersuchungen zur Vitamin-B12-Statuserhebung erfolgten an 157 Kühen der Rasse Holstein Friesian. Blutproben zur Stoffwechselanalytik wurden 2-6 Tage p.p. sowie 4-5 Wochen p.p. entnommen. Parallel dazu wurden klinische Daten zu Leistung und Gesundheitsstatus bis 3 Monate p.p. erhoben. In einem zweiten Versuch wurden die Kühe in 2 Gruppen eingeteilt, wobei die Versuchsgruppe (65 Kühe) eine orale Vitamin-B12-Substitution in Höhe von 0,5 g Cyanocobalamin/Kuh/Tag 4-6 Wochen a.p. beginnend bis zur Kalbung erhielt. 71 Kühe, die das stallübliche Mineralfutter erhielten, dienten als Kontrollgruppe. Auch hier erfolgten die Blutkontrollen 2-6 Tage p.p. sowie 4-5 Wochen p.p. Es wurden die Milchleistung sowie auftretende Erkrankungen dokumentiert. Die Blutentnahme erfolgte aus der Vena caudalis mediana. Neben den hämatologischen Untersuchungen wurden folgende Parameter aus dem Serum bestimmt: Freie Fettsäuren (FFS), Betahydroxybutyrat (BHB), Glukose, Bilirubin, Cholesterol, Gamma-Glutamyltransferase (GGT), Creatinkinase (CK), Harnstoff, Calcium, Eisen, anorganisches Phosphat (Pi), Cyanocobalamin und Cobalt. Ergebnisse: Die Vitamin-B12-Konzentration zeigt eine signifikante Laktationsdynamik. Alle untersuchten Kühe hatten 4 Wochen p. p. gegenüber 2–6 Tage p. p. erniedrigte Vitamin-B12-Konzentrationen (p ≤ 0,05). Bei den p.p. kranken Kühen sank gegenüber den gesunden Kühen die Vitamin-B12-Konzentration weniger stark ab (p ≤ 0,05), d.h., höhere Vitamin-B12-Konzentrationen können auf klinische Probleme hinweisen. Gesunde sowie auch p.p. kranke Kühe wiesen 2–6 Tage p. p. höhere Werte für die Parameter Erythrozytenzahl, Hämatokrit und Hämoglobinkonzentration auf als 4 Wochen p. p. Die BHB-, FFS- und Bilirubin-Konzentrationen waren bei allen Kühen 2–6 Tage p. p. infolge der partusbedingten Lipolysesteigerung erhöht (p ≤ 0,05). Bei allen Kühen korrelierte die Aktivität der cholestaseanzeigenden GGT eng mit der Vitamin-B12-Konzentration (p ≤ 0,01). Aufgrund dieser engen Korrelation mit der GGT-Aktivität sowie der Bilirubinkonzentration kann Vitamin B12 bei einer Serumkonzentration ≥ 227 ng/l bei Kühen cholestatische Stoffwechselbelastungen anzeigen. Nach Vitamin-B12-Substitution blieben in der Versuchsgruppe 60 % und in der Kontrollgruppe 47,9 % der Kühe in der Frühlaktation gesund. In der Kontrollgruppe hatten 12,7 % eine Nachgeburtsverhaltung und 40,8 % eine Mastitis, in der Versuchsgruppe betrugen die Anteile 21,5 % sowie 26,2 %. Mit x̃ = 320 pg/ml war die Vitamin-B12-Konzentration 2-6 Tage p.p. in der Vitamin-B12-substituierten Gruppe gegenüber x̃ = 224 pg/ml in der Kontrollgruppe gesichert höher. Auch vier Wochen p.p. war die Differenz noch signifikant. Cobalt, die Parameter des Leber- und Energiestoffwechsels sowie Harnstoff und CK unterschieden sich zwischen der Vitamin-B12-substituierten Gruppe und der Kontrollgruppe nicht gesichert. Die Erythrozytenzahlen sowie die Hämoglobin-Konzentrationen waren in der Vitamin-B12-substituierten Gruppe gesichert höher. Der Milchfettgehalt (%) war bei den Vitamin-B12-substituierten Kühen gegenüber den Kontrollkühen signifikant erhöht (p = 0,022), die Milchleistung unterschied sich unwesentlich. Schlussfolgerungen: Signifikant höhere Vitamin-B12- und Hämoglobin-Konzentrationen, höhere Erythrozytenzahlen sowie geringere Morbidität sprechen für positive Effekte der Vitamin-B12-Substitution. Anhand der Parameter des Leber-Energiestoffwechsels sowie der Milchleistung ließ sich dies nicht bestätigen. Cholestase stört die Vitamin-B12-Bewertung im Blut bzw. ist bei der Interpretation zu beachten. / Introduction: Vitamin B12 has important functions in energy metabolism and erythropoiesis. Both functional groups are particularly stressed in high-yielding dairy cows and can be a starting point for clinical disorders under stress and insufficient vitamin B12 supply. Objective: The studies presented were designed to ascertain the characteristics of the serum vitamin B12 concentration of dairy cows in early lactation and to check the relations with metabolic parameters, the erythrogram as well as the health status of the cows. Furthermore, it was examined to what extent the postpartum metabolism can be stabilized by oral vitamin B12 substitutions. Material and methods: The investigations on vitamin B12 status survey were carried out on 157 cows of the Holstein Friesian breed. Blood samples were taken for metabolic analysis at 2-6 days p.p. and at 4-5 weeks p.p. In parallel, clinical findings on the milk yield and the health status were compiled up to 3 months p.p. In a second trial the cows were divided into 2 groups in which the experimental group (65 cows) received an oral vitamin B12 substitution in the amount of 0.5 g cyanocobalamin/cow/day starting 4-6 weeks a.p. up to calving. 71 cows, which recieved the common mineral feed, served as control group. Again the blood tests were performed at 2-6 days p.p. and at 4-5 weeks p.p. The milk yield and emerging diseases were documented. The blood samples werde taken from the Vena caudalis mediana. In addition to haematological investigations the following parameteres were measured: Non-esterified fatty acids (NEFA), beta-hydroxybutyrate (BHB), glucose, bilirubin, cholesterol, gamma-glutamyl transferase (GGT), creatinkinase (CK), urea, calcium, ferric, anorganic phosphor, cyanocobalamin and cobalt. Results: The vitamin B12 concentration shows a significant dynamic in lactation. All examined cows had decreased vitamin B12 concentrations at 4 weeks p. p. compared to 2-6 days p. p. (p ≤ 0.05). In the p.p. morbid cows the vitamin B12 concentration fell less than in the healthy cows (p ≤ 0.05), which means higher vitamin B12 concentrations may indicate clinical problems. Healthy as well as p.p. morbid cows showed higher values for the parameters erythrocyte count, hematocrit and hemoglobin concentration at 2-6 days p.p. than 4 weeks p.p. BHB, FFS, and bilirubin levels were increased in all cows at 2-6 days p.p. as a result of partus related rise in lipolysis (p ≤ 0.05). In all cows, the activity of the GGT, which indicates cholestasis, was closely correlated with the vitamin B12 concentration p ≤ 0.01). Because of this close correlation with GGT activity and bilirubin concentration, vitamin B12 may show cholestatic metabolic stress in cows at a serum concentration ≥ 227 ng/l. After vitamin B12 substitution 60 % of the cows in the experimental group and 47.9 % of the cows in the control group remained healthy during early lactation. In the control group 12.7 % had a Retentio secundinarum and 40.8 % had a mastitis, in the experimental group the proportions were 21.5 % and 26.2 %. At two to six days p.p. the vitamin B12 concentration in the vitamin B12 substituted group was significant higher (x̃ = 320 pg/ml) than in the control group (x̃ = 224 pg/ml). This difference was still significant at four weeks p.p. Cobalt, parameters of liver and energy metabolism as well as urea and CK did not differ significantly between the vitamin B12 substituted group and the control group. Erythrocyte counts and hemoglobin concentrations were significant higher in the vitamin B12 substituted group. Milk fat content (%) was significant higher in the vitamin B12 substituted group compared to the control group (p = 0.022), the milk yield did not differ significantly. Conclusions: Significant higher vitamin B12 and hemoglobin concentrations, higher erythrocyte counts as well as lower morbidity speak for positive effects of vitamin B12 substitution. Based on the parameters of hepatic and energy metabolism as well as milk yield this could not be confirmed. Cholestasis interferes with the evaluation of vitamin B12 in the blood respectively should be considered in the interpretation.

Die subklinische Klauenrehe oder claw horn disruption (CHD) ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung für die Rinderhaltung, da sie zu Lahmheiten, Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens sowie einer eingeschränkten Leistungsfähigkeit der Tiere führt. Trotz zahlreicher Untersuchungen sind die pathophysiologischen Grundlagen der CHD noch immer nicht vollständig geklärt. Die derzeitigen Hypothesen weisen auf eine Ischämie in den noch lebensfähigen Epidermisschichten infolge einer veränderten dermalen Mikrozirkulation. Diese hat pathophysiologische Veränderungen zur Folge, die eine Störung der epidermalen Zellproliferation, eine Schädigung der dermo-epidermalen Verbindung sowie eine veränderte Keratinisierung und Hornproduktion umfassen. Von Bedeutung sind daher In-vitro-Ischämiemodelle, um die epidermale Reaktionsmechanismen auf die pathologischen Veränderungen der Dermis zu untersuchen. Ziel in der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines In-vitro-Ischämiemodells auf der Grundlage boviner Keratinozyten aus der Klauenepidermis. Mithilfe dieses Modells sollten die zellulären Pathomechanismen infolge einer Ischämie, einer Hypoxie sowie eines Glukoseentzugs untersucht werden. Des Weiteren stand die Analyse des Differenzierungsverhaltens der Keratinozyten infolge ischämischer, hypoxischer und hypoglykämischer Konditionen im Mittelpunkt. Für die Etablierung des In-vitro-Ischämiemodells diente als Grundlage das oxygen glucose deprivation (OGD)-Modell, das die Untersuchung eines gleichzeitigen Sauerstoff- und Glukosemangels sowie lediglich einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs bei bovinen Keratinozyten ermöglichte. Die Versuche wurden in eine Kurzzeitanalyse über 96 Stunden sowie eine Langzeitanalyse über drei Wochen geteilt. Nach erfolgter Exposition wurde die Zellviabilität mittels LDH(Lactatdehydrogenase)- und MTT(3-(4,5-Dimethylhiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay untersucht. Des Weiteren wurde das veränderte Differenzierungsverhalten der Keratinozyten infolge der veränderten Kultivierungsbedingungen mittels Western Blot-Analyse anhand der Involukrin- und Lorikrin-Expression untersucht. Die Keratinozyten zeigten infolge einer OGD nach kurzer Expositionsdauer die höchsten zytotoxischen Effekte, die von einer zeitabhängigen Abnahme der Zellviabilität sowie massiven morphologischen Veränderungen gefolgt wurde. Hypoxische Bedingungen bewirkten eine zeitabhängige Abnahme der Zellviabilität, die erst nach zweiwöchiger Inkubation die größte Zytotoxizität aufwies, sowie eine geringgradig veränderte Zellmorphologie bei Erhaltung des Zellverbands. Der Glukoseentzug bewirkte eine stark verminderte Zellviabilität sowie starke morphologische Zellveränderungen. In der Western Blot-Analyse konnte eine gesteigerte Involukrin- und Lorikrin-Expression infolge einer OGD, einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig ein auf bovinen Keratinozyten basierendes In-vitro-Ischämiemodell etabliert werden, das die Untersuchung zellulärer Mechanismen der Epidermis ermöglichte. Die OGD zeigte den stärksten Einfluss auf die Zellviabilität sowie eine veränderte Zelldifferenzierung der Keratinozyten, was die pathophysiologischen Veränderungen im Rahmen der CHD reflektiert. Die ebenfalls starken Zellveränderungen infolge eines Glukoseentzugs verdeutlichen die Rolle der Glukose im Zellmetabolismus der Keratinozyten. Solch ein epidermaler Glukosemangel ist in Verbindung mit der negativen Energiebilanz der Rinder im peripartalen Zeitraum denkbar. Die Ergebnisse infolge einer Hypoxie verweisen auf vielfältige Adaptationsmechanismen der Keratinozyten an hypoxische Bedingungen, denen sie in der Epidermis in vivo während der Zelldifferenzierung ausgesetzt werden. Damit besitzt das In-vitro-Ischämiemodell ein großes Potenzial für den Einsatz in der Klauenreheforschung, um einerseits die mit einer Ischämie einhergehenden pathologischen Veränderungen der CHD untersuchen zu können. Andererseits liefert das Modell wertvolle Informationen zu den physiologischen Grundlagenmechanismen der Epidermis, die mit der Zelldifferenzierung einhergehen. / The subclinical laminitis or claw horn disruption (CHD) is of great economic importance in the dairy industry as it causes lameness, poor general condition and reduced performance. Despite extensive research efforts, the pathomechanism of CHD remains widely unclear. The current hypotheses on CHD pathogenesis include ischemic alterations of the epidermal keratinocytes resulting from an impaired blood supply. This causes an alteration of cell proliferation, a dermo-epidermal separation and an impaired keratinization and horn production. Therefore, in vitro ischemia models are of critical importance in clarification of the epidermal responses to an altered microcirculation. The aim of this study was the establishment of an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes. This in vitro model should enable the investigation of cellular pathomechanisms following exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation. An additional aim was the analysis of the differentiation pattern of keratinocytes under ischemic, hypoxic and hypoglycaemic conditions. To establish the in vitro ischemia model, the keratinocytes were exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD). In addition, this model allowed the parallel examination of hypoxic and hypoglycaemic conditions on bovine claw keratinocytes. The experiments were divided into a short-term analysis over 96h and a long-term analysis over three weeks. Measurement of cell viability was performed by LDH(lactatedehydrogenase) and MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- zolium bromide) assays. Furthermore, the differentiation pattern of the keratinocytes after exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation was detected by western blot analysis of the focus on expression of involucrin and loricrin. The highest cytotoxic effect was measured after short exposure to OGD followed by a time-dependent decrease of cell viability and extensive morphological changes of the keratinocytes. Hypoxic conditions lead to a time-dependent decrease of cell viability with the highest cytotoxicity after two weeks. The keratinocytes showed slight changes in cell morphology while maintaining a confluent cell layer. Exposure of keratinocytes to glucose deprivation showed a high decrease of cell viability and strong morphological changes. Furthermore, western blot analysis showed an altered expression pattern with increased involucrin and loricrin levels after exposure to OGD, hypoxia and glucose deprivation. The present study established for the first time an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes to study the cellular mechanisms of the epidermis. After exposure to OGD, keratinocytes showed the highest loss in cell viability and an altered cell differentiation. This reflects the pathophysiological changes following epidermal ischemia occurring during the pathogenesis of CHD. The massive cellular alterations after glucose deprivation provide good evidence for the importance of glucose in the cellular metabolism of keratinocytes. An epidermal glucose deficiency may occur in combination with a negative energy balance during peripartal period in cattle. The results of hypoxia show the different adaptive mechanisms of keratinocytes to hypoxic conditions which are present in the epidermis during cell differentiation. Thus, the in vitro ischemia model has a great potential for use in research into CHD pathogenesis and pathomechanisms associated with ischemia. On one side, it is possible to investigate the pathological changes following ischemia during CHD. On the other side, the model offers useful information on physiological response mechanisms of the epidermis that correlate with cell differentiation.

Durch die höhere Verfügbarkeit von Schnittbildverfahren in der Kleintiermedizin treten Flüssigkeitsansammlungen in der Bulla tympanica immer häufiger als Zufallsbefund bei Hunden, insbesondere bei brachyzephalen Rassen, auf. Aufgrund der fehlenden klinischen Symptome der Patienten ist eine akute Entzündung unwahrscheinlich. Daher bezeichnen neuere Studien diese Flüssigkeitsansammlung als primär sekretorische Otitis media (PSOM). In der vorliegenden Studie wurde untersucht, ob Hunde der Rassen Mops und Französische Bulldogge mit einer primär sekretorischen Otitis media einen konduktiven Hörverlust für das betroffene Ohr im Vergleich zu „Ohr gesunden“ Hunden ihrer Rasse zeigen. Des Weiteren wurde untersucht, ob Französische Bulldoggen signifikant häufiger eine primär sekretorische Otitis media als Hunde der Rasse Mops zeigen. Es wurden bei jeweils 41 Hunde der Rasse Mops und Französische Bulldogge, die zur chirurgischen Versorgung des Brachyzephalen Syndroms vorgestellt wurden, die frühen akustisch evozierten Potentiale (FAEP) abgeleitet. Des Weiteren erfolgte bei allen Patienten eine Computertomographie des Kopfes, eine Otoskopie und ggf. eine Punktion der Bulla tympanica inklusive einer Zytologie und bakteriologischen Untersuchung des Sekrets. In der vorliegenden Studie konnte kein konduktiver Hörverlust für die Hunde mit einer PSOM nachgewiesen werden. Es zeigte sich nur eine Verlängerung der Latenz der Welle I bei Vorliegen einer PSOM, jedoch ohne dass eine signifikant erhöhte Hörschwelle für diese Patienten festgestellt werden konnte. Als Ursache für die Verlängerung der Latenz der Welle I kommt sowohl die beschriebene Füllung der Bulla als auch ein stenotischer Gehörgang in Frage. Die Hörschwelle ist zwar bei den Hunden mit einer PSOM tendenziell höher als bei den Patienten ohne Füllung der Bullae, allerdings konnte hierfür kein signifikanter Unterschied nachgewiesen werden. Bei 40 % der untersuchten Patienten mit einseitiger PSOM konnte für beide Ohren dieselbe Hörschwelle bestimmt werden, so dass eine Füllung der Bulla tympanica nicht immer zu einer vorhersagbaren Veränderung der Hörschwelle führen muss. Eine mögliche Erklärung für diesen Umstand ist ein sensorineuraler Hörverlust, der durch eine chronische Entzündung des Mittelohres zustande kommt. Dies ist bisher nur in der Humanmedizin beschrieben und die Pathogenese ist noch unklar. Die Ergebnisse zeigen zusätzlich, dass Französische Bulldoggen signifikant häufiger von einer PSOM betroffen sind. Die Ursache für diese Häufung könnte ein dickerer weicher Gaumen der Französischen Bulldoggen im Vergleich zu Hunden der Rasse Mops sein, durch den es zu einer Funktionsstörung der Tuba auditiva kommen könnte. Beim Vergleich der Hunde ohne Vorliegen einer Füllung konnte festgestellt werden, dass Französische Bulldoggen eine höhere Hörschwelle und eine längere Latenz der Welle I als Hunde der Rasse Mops aufweisen. Bei beiden Rassen ist zusätzlich auffällig, dass die Hörschwelle um 30 dB höher liegt als bei Hunden anderer Rassen (SHIU et al. 1997). Alle brachyzephalen Hunde dieser Studie zeigen somit ein im Vergleich zu anderen Rassen vermindertes Hörvermögen, das aber durch eine PSOM nicht weiter verschlechtert wird. Der Symptomenkomplex Brachyzephalen Syndrom muss nach der vorliegenden Studie durch die Symptome vermindertes Hörvermögen und das Vorliegen einer PSOM ergänzt werden. Die klinischen Auswirkungen des Hörverlusts, wie etwa eine starke Anhänglichkeit, könnten bei Hunden dieser Rassen übersehen werden, da dies als gewünschter Charakterzug der Rassen interpretiert wird und nicht als mögliches Symptom einer Erkrankung wahrgenommen wird. / Because of the increased availability of cross-sectional imaging modalities in small animal medicine the incidental finding of material in the middle ear is more common, especially in brachycephalic dogs. Because the animals show no clinical signs, an acute inflammation is unlikely. Therefore recent studies term it as primary secretory otitis media (PSOM). The aim of the current study was to determine whether brachycephalic dogs with PSOM show a conductive hearing loss compared to brachycephalic dogs without changes in the middle ear. Additionally it was evaluated whether French bulldogs suffer from PSOM more frequent than pugs. BAER was recorded in 41 pugs and 41 French bulldogs, which were under general anesthesia because of the surgical correction of the brachycephalic syndrome. In all patients a computed tomography of the head, an otoscopy and if possible a myringotomy with aspiration of the fluid in the middle ear was performed. If fluid was available a cytological examination and a bacterial culture of the fluid was initiated. In the current study no conductive hearing loss was detected in brachycephalic dogs with PSOM. The latencies of wave I were increased in patients with PSOM, although the thresholds of hearing were not increased. The increased latencies of wave I can be explained by the fluid in the middle ear as well as the stenotic external ear canal. The thresholds of hearing in dogs with PSOM were tendentially higher than in dogs without fluid in the middle ear, but the correlation was not significant. In 40 % of the patients with PSOM in one ear the threshold of hearing in both ears is at the same level. Therefore there is no strict correlation between fluid in the middle ear and an increased threshold of hearing on the affected side. This could be explained by a sensorineural hearing loss caused by chronic inflammation of the middle ear. Until now a chronic inflammation as a cause of sensorineural hearing loss has only been described in human medicine, not in veterinary medicine. The pathogenesis is still unknown. The results show that French bulldogs suffer more frequently from the PSOM than pugs. French bulldogs usually show a bigger soft palate than pugs which could result in a dysfunction of the tuba auditiva. Hence the bigger soft palate could be causing the increased prevalence of PSOM in French bulldogs. Compared to pugs without PSOM, French bulldogs without PSOM show an increased latency of wave I as well as an increased threshold of hearing. Additionally for both breeds an increase in the threshold of hearing by 30 dB compared to normocephalic breeds could be detected (SHIU et al. 1997). It is remarkable that French bulldogs as well as pugs show a hearing loss without correlation to the PSOM. In conclusion hearing loss has to be added to the characteristic triad of symptoms of the brachycephalic syndrome. Clinical signs of hearing loss like loyalty to the owner could be misinterpreted especially in these breeds, since this is a favored behavior of these dogs.

Die Kryptosporidiose stellt aufgrund ihres zoonotischen Charakters und der Entwicklung chronischer Durchfälle bei Immunsupprimierten ein hohes Gesundheitsrisiko für den Menschen, aber ebenso für Tiere dar. Derzeit verfügbare Therapeutika ermöglichen keine zuverlässige Bekämpfung klinischer Symptome oder eine Erregerelimination, daher ist die Erforschung neuer Therapieansätze dringend notwendig. CDPK stellen in diesem Zusammenhang interessante Zielmoleküle dar, da sie zwar in Pflanzen und Protisten einschließlich Apikomplexa, jedoch nicht in Pilzen und Säugetieren vorkommen. Trotz der Entdeckung vielversprechender neuer Wirkstoffe gegen CpCDPK1 in den letzten Jahren ist zur Lokalisation und Funktion von CDPK in C. parvum wenig bekannt.Diese Arbeit belegt die Transkription von sechs CpCDPK in vitro und beschreibt erstmals die Länge der 3’UTR von CpCDPK. Die Translation wurde durch den Nachweis spezifischen Proteins in Sporozoiten im Immunoblot sowie die Lokalisation von CpCDPK1 mit Hilfe der Immunfluoreszenz belegt. Möglicherweise wird die CpCDPK1 durch N-Myristoylierung an Membranen gebunden, an die Oberfläche von Zoiten gebracht und sezerniert. Eine Rolle des Enzyms im Invasions- und Egressmechanismus des Parasiten wird diskutiert.