Einleitung: Das Darmmikrobiom, ein hochkomplexes Ökosystem an Mikroorganismen, geht eine lebenslange wechselseitige Beziehung mit seinem Wirt ein und beeinflusst wesentlich dessen Darmreifung post partum. Dazu interagieren Darmbakterien direkt und indirekt mit den intestinalen Stammzellen in den Krypten und regulieren Zellteilung und -differenzierung, wobei die Mechanismen nicht abschließend geklärt sind. Das Darmmikrobiom stellt eine wichtige Quelle für Mikroben-assoziierte molekulare Muster (MAMPs) dar, die von Mustererkennungsrezeptoren wie den Toll-like-Rezeptoren (TLR) auf den intestinalen Epithelzellen erkannt werden können. Somit können TLR auf den intestinalen Epithelzellen eine mögliche Verbindung zwischen Darmmikrobiom und Anpassungsreaktionen der Dünndarmmorphologie darstellen. Ziele der Untersuchung: Folgende Hypothesen sollten untersucht werden: 1. Die Anwesenheit von Darmbakterien beeinflusst die Morphologie der Dünndarmschleimhaut. 2. Diese Wirkung wird über Toll-like-Rezeptoren und den Hedgehog-Signalweg in Epithelzellen vermittelt. 3. Über diese Signalwege werden auch funktionelle Eigenschaften wie die Durchlässigkeit der Darmbarriere verändert. Tiere, Material und Methoden: Zur Untersuchung des Einflusses des Mikrobioms wurden in einem gnotobiotischen Mausmodell keimfreie Tiere mit dem minimalen mikrobiellen Konsortium Altered Schaedler Flora (ASF) besiedelt. Die ASF, welche sich aus acht definierten Bakterienarten zusammensetzt, wurde aus dem Caecum ASF-besiedelter C3H/HeNTac-Mäuse entnommen und männlichen und weiblichen keimfreien C57BL/6J-Mäusen appliziert. Der Nachweis der Bakterienspezies erfolgte aus bakterieller DNA, die aus frischen Kotpellets isoliert wurde. Der Vergleich wurde zwischen Dünndärmen ASF-kolonisierter Mäuse (n = 13), keimfreien Tieren (n = 8), konventionell gehaltenen (n = 7) und einer Gruppe Antibiotika-behandelter Mäuse (n = 8) durchgeführt. Zur Untersuchung des Einflusses der Toll-like-Rezeptoren TLR2 und TLR4 wurden epithelspezifische TLR2-defiziente (TLR2ΔIEC) bzw. TLR4-defiziente Mäuse (TLR4ΔIEC) verwendet und mit ihren jeweiligen Wildtyp-Geschwistertieren (WT) verglichen. Die morphometrische Eigenschaften des Dünndarms wurden anhand von histologischen Schnitten untersucht, die mit Hämatoxylin-Eosin oder Periodic-Acid-Schiff gefärbt waren. Hierbei wurden u.a. Mukosahöhe und Villuslänge gemessen sowie die Anzahl der Epithelzellen und Anzahl der Becherzellen pro Villus gezählt. Weiterhin wurden sowohl in Dünndarmgewebe als auch in isolierten intestinalen Epithelzellen mittels qPCR die mRNAExpression der Liganden des Hedgehog (Hh)-Signalwegs Sonic Hedgehog (Shh) und Indian Hedgehog (Ihh) sowie Hedgehog-Zielgene wie Glioma-associated oncogene transcription factor 1 (Gli-1), Patched-1 (Ptch-1) und Hedgehog Interacting Protein (Hhip) untersucht. In einem Teil der Tiere wurde der Hedgehog-Signalweg durch Applikation des Inhibitors Vismodegib gehemmt. Ein möglicher Einfluss auf die Permeabilität des Dünndarms wurde über die mRNA-Expression diverser Tight Junction-Proteine wie Occludin oder Claudin-4 sowie durch einen Permeabilitätsassay mit FITC-Dextran untersucht. Gruppenvergleiche wurden mit einer einfaktoriellen Varianzanalyse (ANOVA) und Holm-Šídák post-hoc Test bzw. zwischen den TLR2ΔIEC oder TLR4ΔIEC und WT-Mäusen mittels zweiseitigem ungepaarten t-Test durchgeführt. Unterschiede wurden bei P < 0,05 als statistisch signifikant betrachtet. Ergebnisse: Durch den Nachweis aller acht Bakterienarten in den Kotproben der behandelten Mäuse konnte die erfolgreiche Übertragung der ASF auf die Empfängertiere nachgewiesen werden. Hinsichtlich Mukosahöhe, Villuslänge, Anzahl der Epithelzellen und der Becherzellen wiesen keimfreie gegenüber konventionell gehaltenen Mäusen signifikant höhere Werte auf. Die Kolonisierung mit ASF führte zu einer signifikanten Verringerung dieser Merkmale, so dass sie sich denen der konventionell gehaltenen Tiere annäherten. Die mRNA-Expression der Hh-Liganden Shh und Ihh war sowohl im Dünndarm als auch in isolierten intestinalen Epithelzellen ASF-besiedelter Mäuse signifikant erhöht. Die Hh-Zielgene Gli-1, Ptch-1 und Hhip waren auf mRNA-Ebene im Dünndarm ASF-besiedelter Mäuse ebenfalls signifikant höher exprimiert. Mukosahöhe, Epithelzellzahl und Villuslänge waren im Jejunum von TLR2ΔIEC- und TLR4ΔIEC-Mäusen gegenüber ihren WT-Geschwistern signifikant höher. Während bei TLR2ΔIEC-Mäusen außer Shh alle untersuchten Hh-Zielgene vermehrt exprimiert waren, waren bei TLR4ΔIEC-Mäusen die gleichen Gene signifikant weniger exprimiert. Wurde hingegen der Hh-Signalweg in konventionell gehaltenen C57BL/6-Mäusen mit Vismodegib inhibiert, waren der Expression der Hh-Zielgene, des TLR2 und des TLR4 signifikant vermindert. Sowohl die Hemmung des Hh-Signalwegs mit Vismodegib als auch das Fehlen der epithelialen TLR2 oder TLR4 bedingte eine verminderte Expression von Tight Junction-Proteinen, die mit einer erhöhten Darmpermeabilität einherging. Konventionell gehaltene Mäuse hatten sowohl gegenüber keimfreien als auch gegenüber mit ASF besiedelten Tieren eine signifikant niedrigere Expression von Tight Junction-Proteinen, was mit einer signifikant höheren Darmpermeabilität verbunden war. Schlussfolgerungen: Zusammenfassend lassen die Ergebnisse dieser Studie darauf schließen, dass Darmbakterien über intestinale TLR2 und TLR4 den Hh-Signalweg regulieren und darüber die Morphologie der Dünndarmmukosa als auch deren funktionelle Eigenschaften wie die Durchlässigkeit der Darmbarriere beeinflussen. / Introduction: The intestinal microbiome, a highly complex ecosystem of microorganisms, enters into a lifelong reciprocal relationship with its host and significantly influences its intestinal maturation postpartum. To this end, intestinal bacteria interact directly and indirectly with intestinal stem cells in the crypts and regulate cell division and differentiation, although the mechanisms are not conclusively understood. The intestinal microbiome represents an important source of microbeassociated molecular patterns (MAMPs) that can be recognized by pattern recognition receptors such as Toll-like-Receptors (TLRs) on intestinal epithelial cells. Thus, TLRs on intestinal epithelial cells may represent a potential link between gut microbiome and adaptation responses of small intestinal morphology. Aims: The following hypotheses should be investigated: 1. The presence of intestinal bacteria affects the morphology of the small intestinal mucosa. 2. This effect is mediated via Toll-like-Receptors and the Hedgehog signaling pathway in epithelial cells. 3. Functional properties such as the permeability of the intestinal barrier are also altered via these signaling pathways. Animals, materials and methods: To investigate the influence of the microbiome, germ-free animals were colonized with the minimal microbial consortium Altered Schaedler Flora (ASF) in a gnotobiotic mouse model. The ASF, which is composed of eight defined bacterial species, was harvested from the caecum of ASF-colonized C3H/HeNTac mice and applied to male and female germ-free C57BL/6J mice. Bacterial species were detected from bacterial DNA isolated from fresh fecal pellets. Comparison was made between small intestines of ASF-colonized mice (n = 13), germ-free animals (n = 8), conventionally housed (n = 7), and a group of antibiotic-treated mice (n = 8). To investigate the influence of Toll-like-Receptors TLR2 and TLR4, epithelial-specific TLR2-deficient (TLR2ΔIEC) or TLR4-deficient mice (TLR4ΔIEC) were used and compared with their respective wild-type (WT) littermates. Morphometric characteristics of the small intestine were examined using histological sections stained with hematoxylin-eosin or periodic-acid-Schiff. Here, mucosa height and villus length were measured, and the number of epithelial cells and number of goblet cells per villus were counted, among other measurements. Furthermore, mRNA expression of the ligands of the Hedgehog (Hh) signaling pathway Sonic Hedgehog (Shh) and Indian Hedgehog (Ihh) as well as Hedgehog target genes such as Gliomaassociated oncogene transcription factor 1 (Gli-1), Patched-1 (Ptch-1) and Hedgehog Interacting Protein (Hhip) were examined in small intestinal tissue as well as in isolated intestinal epithelial cells by qPCR. In a subset of animals, Hedgehog signaling was inhibited by application of the inhibitor Vismodegib. A possible influence on small intestinal permeability was investigated by mRNA expression of various tight junction proteins such as Occludin or Claudin-4 and by permeability assay with FITC-dextran. Group comparisons were performed with a one-way analysis of variance (ANOVA) and Holm-Šídák post-hoc test or between the TLR2ΔIEC or TLR4ΔIEC and WT mice by two-tailed unpaired t test. Differences were considered statistically significant at P < 0.05. Results: Detection of all eight bacterial species in the fecal samples of treated mice demonstrated successful transfer of ASF to recipient animals. In terms of mucosa height, villus length, number of epithelial cells and goblet cells, germ-free mice had significantly higher values compared to conventionally housed mice. Colonization with ASF significantly decreased these characteristics to approach those of conventionally housed animals. The mRNA expression of the Hh ligands Shh and Ihh was significantly increased in the small intestine as well as in isolated intestinal epithelial cells of ASF colonized mice. The Hh target genes Gli-1, Ptch-1, and Hhip were also significantly higher expressed at the mRNA level in the small intestine of ASF-colonized mice. Mucosa height, epithelial cell number, and villus length were significantly higher in the jejunum of TLR2ΔIEC and TLR4ΔIEC mice compared with their WT littermates. Whereas in TLR2ΔIEC mice, except for Shh, all Hh target genes examined were increased in expression, the same genes were significantly less expressed in TLR4ΔIEC mice. In contrast, when the Hh pathway was inhibited with Vismodegib in conventionally maintained C57BL/6J mice, the expression of Hh target genes, TLR2, and TLR4 were significantly decreased. Both inhibition of the Hh pathway with Vismodegib and absence of epithelial TLR2 or TLR4 caused decreased expression of tight junction proteins, which was associated with increased intestinal permeability. Conventionally housed mice had significantly lower expression of tight junction proteins compared with both germ-free and ASF-populated animals, which was associated with significantly higher intestinal permeability. Conclusions: In summary, the results of this study suggest that intestinal bacteria regulate the Hh signaling pathway via intestinal TLR2 and TLR4 and thereby influence the morphology of the small intestinal mucosa as well as its functional properties such as intestinal barrier permeability.

Einleitung: Bei generalisierten Dystonieformen, gekennzeichnet durch abnorme Haltungen und Verdrehungen infolge unwillkürlicher Muskelkontraktionen, kommt häufig die Tiefe Hirnstimulation (THS) im Globus pallidus internus (Nucleus entopeduncularis, EPN, in Nagern) zum Einsatz. Die Entwicklung rationaler Therapieansätze bzw. die Optimierung der THS ist durch mangelnde Kenntnisse zur Pathophysiologie sowie zum Wirkmechanismus der THS bei Dystonien erschwert. Veränderungen der neuronalen Plastizität innerhalb der Basalganglienschleife scheinen hierbei allerdings eine entscheidende Rolle zu spielen. Einen wichtigen Modulator der neuronalen Plastizität stellen die perineuronalen Netze (PNs) dar, welche sich um die Zellsomata und proximalen Dendriten von Neuronen, insbesondere Parvalbumin-reaktiven (PV+) Interneuronen, befinden. Ein wichtiger Bestandteil dieses kondensierten Subtyps der extrazellulären Matrix (EZM) sind die Chondroitinsulfat-Proteoglykane, wie Aggrecan und Brevican. Während die Rolle einer abnormen PN-Expression in der Pathophysiologie der Dystonien weitgehend unbekannt ist, konnte bei einer Form der paroxysmalen Dyskinesie des Hundes mit dystonen Symptomen ein Defekt im Brevican-Gen gefunden werden. Somit könnten die PNs auch an der Pathophysiologie der Dystonien beteiligt sein. Ziele der Untersuchungen: Daher wurde im ersten Teil dieser Arbeit der Hypothese nachgegangen, dass die basale Expression von Brevican in Dystoniemodellen verändert ist und PN pathophysiologische Bedeutung bei Dystonien haben. Da Veränderungen der PN durch elektrische Impulse ein wichtiger Mechanismus der THS darstellen könnte, wurde im zweiten Teil untersucht, ob eine antidyston wirksame THS mit Veränderungen in der neuronalen Aktivität (c-Fos) und Brevican-Expression einhergeht. Tiere, Material und Methoden: Als phänotypisches Modell der paroxysmalen Dystonie wurde der dtsz Hamster genutzt, bei dem wahrscheinlich die Reifung von PV+ Interneuronen verzögert ist. Die DYT1 Knock-in Maus, die keine dystonen Symptome zeigt, ist ein ätiologisches Modell für eine permanente generalisierte Dystonieform. In beiden Tiermodellen wurde die Brevican-Expression immunhistochemisch mittels Intensitätsmessungen und Zellzählung von Brevican-exprimierenden PV+ Neuronen untersucht: dtsz Hamster (n = 8; Kontrolltiere n = 5) bzw. DYT1 KI-Maus (n = 9, Kontrolltiere n = 8). Zudem erfolgten im Mausmodell (je n = 6) Untersuchungen der Proteine mittels Western Blot und der mRNA-Expression (qPCR). Weiterhin wurde nach EPN-THS mit 130 Hz (antidyston wirksam) bzw. 40 Hz (Tendenz zu antidystonen Effekten) sowohl Brevican als auch c-Fos in dtsz und Kontrollhamstern vs. sham-Stimulationen (je n = 8 dtsz, n = 5 Kontrolltiere) untersucht. Die graphische Darstellung und statistische Auswertung mittels t-Test bzw. ANOVA erfolgte mit SigmaPlot (Signifikanzniveau von 5 % (p ≤ 0,05)). Ergebnisse: Der Vergleich von dtsz vs. Kontrollhamster ergab interessante (basale) Unterschiede innerhalb des Basalganglien-Netzwerks. So zeigte sich eine geringere Anzahl Brevican-positiver Zellen an der Gesamtzahl PV+ Zellen (Brev+/PV+) im motorischen Cortex und an striatalen schwach PV+ Interneuronen, während die Brevican-Intensitäten im Striatum und dem ventromedialen Thalamus erhöht waren. Die Untersuchungen in der DYT1 KI-Maus ergaben hingegen nur eine subtile Erhöhung von Brevican im motorischen Cortex. Eine dreistündige THS im dtsz Hamster (vs. sham) führte nicht zu Veränderungen von Brevican, die basalen Genotyp-Veränderungen bestätigten sich jedoch. Erhöhungen in der neuronalen Aktivität (c-Fos) nach EPN-THS zeigten sich nahe der Elektrodenspitze und eine Verringerung in den tiefen Cerebellarkernen nach 130 Hz EPN THS. Schlussfolgerungen: Im dtsz Hamstermodell könnte eine Entwicklungsstörung der PN an der verzögerten Ausreifung der PV+ Interneurone beteiligt sein. Die weiteren Veränderungen stimmen mit bekannten regionalen Störungen im Basalgangliennetz überein. Allerdings bleibt unklar, ob sie Ursache der Dystonie oder Folge anderer Veränderungen darstellen. Die nur kurze, dreistündige THS hatte keine weitreichenden Effekte auf die neuronale Aktivität und Brevican. Stärkere Effekte sind auch eher bei den noch laufenden Langzeit-THS Versuchen über 10 Tage bei dtsz Hamstern zu erwarten. Die basalen Brevican-Veränderungen bei der dtsz Mutante zeigten sich nicht im asymptomatischen DYT1 KI-Mausmodell, bei dem die corticale Erhöhung der Anzahl Brev+/PV+ jedoch ein Grund für sensomotorische Störungen sein könnte. Brevican ist somit zwar nicht generell vermindert, jedoch in beiden Dystoniemodellen verändert, so dass weiterführende Untersuchungen zur pathophysiologischen Bedeutung von Brevican sowie anderen PN Komponenten, wie HAPLN4 und Aggrecan, sinnvoll erscheinen.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Dystonien 2.1.1 Definition und Einteilung 2.1.2 Pathophysiologie primärer Dystonien 2.1.2.1 Neuronale Plastizität 2.1.2.2 Neuronale Aktivität 2.1.3 Therapieoptionen für Dystonien 2.1.3.1 Tiefe Hirnstimulation (THS) 2.1.4 Tiermodelle für die primäre Dystonie 2.1.4.1 dtsz Hamstermutante 2.1.4.2 DYT1 KI-Mausmodell 2.2 Extrazelluläre Matrix und perineuronale Netze 2.2.1 Aufbau und Funktion 2.2.2 Manipulationen der Expression von PN-Komponenten 2.2.3 Pathophysiologische Bedeutung von perineuronalen Netzen in Bewegungsstörungen 2.3 Hypothesen der vorliegenden Arbeit 3 Tiere, Material, Methoden 3.1 Tiere 3.1.1 Haltung und Fütterung von Hamstern 3.1.2 Haltung und Fütterung von Mäusen 3.2 Material 3.3 Methoden 3.3.1 Dystonie-Induktion und Beurteilung der Schweregrade beim dtsz Hamster 3.3.2 Tiefe Hirnstimulation dtsz Hamster und Kontrolltiere 3.3.3 Genotypisierung der DYT1 KI-Mäuse 3.3.4 Euthanasie und Probenentnahme 3.3.5 Immunhistochemie (IHC) 3.3.5.1 Brevican und Parvalbumin 3.3.5.2 c-Fos 3.3.5.3 Aggrecan 3.3.6 Western Blot (WB) 3.3.6.1 Probenvorbereitung und Proteinextraktion 3.3.6.2 Durchführung Western Blot 3.3.7 Quantitative Real-Time PCR (qPCR) 3.3.7.1 Probenvorbereitung und mRNA-Isolation 3.3.7.2 cDNA-Synthese und Durchführung qPCR 3.3.8 Statistische Auswertung 3.3.8.1 Statistische Auswertung der IHC 3.3.8.2 Statistische Auswertung des WB 3.3.8.3 Statistische Auswertung der qPCR 4 Ergebnisse 4.1 Basale Veränderungen von Brevican beim dtsz Hamster 4.1.1 Intensität von Brevican 4.1.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.1.3 Einzelzellintensität von Brevican an striatalen Parvalbumin-positiven (PV+) Zellen 4.2 Veränderungen von Brevican im DYT1 KI-Mausmodell 4.2.1 Intensität von Brevican bei DYT1 KI-Mäusen 4.2.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.2.3 Western Blot 4.2.4 qPCR 4.3 Brevican und Parvalbumin im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS) 4.3.1 Intensität von Brevican bei sham-stimulierten und stimulierten dtsz und Kontrollhamstern 4.3.2 Effekte von 130 Hz THS auf den Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.3.3 THS-Effekte auf die Anzahl von PV+ Zellen 4.3.4 Einzelzellintensitäten von Brevican um striatale PV+ Zellen 4.4 Neuronale Aktivität im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS) 4.4.1 c-Fos Intensität in der Umgebung der Elektroden 4.4.2 Anzahl c-Fos-reaktiver Zellen 4.5 Vorversuche zu weiteren Komponenten perineuronaler Netze 4.6 Zusammenfassung der Ergebnisse 5 Diskussion 5.1 Ausgewählte Aspekte zur Methodik 5.1.1 Methodische Aspekte zur Immunhistochemie 5.1.2 Methodische Aspekte zum Western Blot 5.1.3 Methodische Aspekte zur qPCR 5.2 Diskussion der Ergebnisse 5.2.1 Brevican im dtsz Hamster 5.2.2 Brevican in der DYT1 KI-Maus 5.2.3 Brevican und Parvalbumin nach THS im dtsz Hamster 5.2.4 Neuronale Aktivität nach THS im dtsz Hamster 5.3 Bedeutung und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang / Introduction: Deep brain stimulation (DBS) in the globus pallidus internus (nucleus entopeduncularis, EPN, in rodents) is frequently used in generalized forms of dystonia, characterized by abnormal postures and contortions due to involuntary muscle contractions. The development of rational therapeutic approaches or optimization of DBS is hampered by a lack of knowledge about the pathophysiology as well as the mechanism of action of DBS in dystonia. However, changes in neuronal plasticity within the basal ganglia loop seem to play a crucial role in this regard. An important modulator of neuronal plasticity is represented by the perineuronal nets (PNs) located around the cell somata and proximal dendrites of neurons, particularly parvalbumin-reactive (PV+) interneurons. An important component of this condensed extracellular matrix (ECM) subtype are chondroitin sulfate proteoglycans, such as aggrecan and brevican. While the role of abnormal PN expression in the pathophysiology of dystonia is largely unknown, a defect in the brevican gene was found in a form of canine paroxysmal dyskinesia with dystonic symptoms. Thus, PNs may also be involved in the pathophysiology of dystonia. Aims of the studies: Therefore, the first part of this work addressed the hypothesis that basal expression of brevican is altered in dystonia models and PNs have pathophysiological significance in dystonia. Because changes in PN by electrical stimuli may represent an important mechanism of DBS, the second part examined whether antidystonic DBS is associated with changes in neuronal activity (c-Fos) and brevican expression. Animals, Materials, and Methods: The dtsz hamster, in which maturation of PV+ interneurons is probably delayed, was used as a phenotypic model of paroxysmal dystonia. The DYT1 knock-in mouse, which does not show dystonic symptoms, is an etiologic model for a permanent generalized form of dystonia. In both animal models, brevican expression was examined immunohistochemically using intensity measurements and cell counting of brevican-expressing PV+ neurons: dtsz hamster (n = 8; control animals n = 5) and DYT1 KI mouse (n = 9, control animals n = 8), respectively. In addition, examination of protein (western blot) and mRNA expression (qPCR) were performed in the mouse model (n = 6 each). Furthermore, after EPN-DBS at 130 Hz (antidystonic effects) or 40 Hz (tendency to antidystonic effects), both brevican and c-Fos were examined in dtsz and control hamsters vs. sham stimulation (n = 8 dtsz each, n = 5 control animals). Graphical representation and statistical analysis using t-test and ANOVA, respectively, were performed using SigmaPlot (significance level of 5% (p ≤ 0.05)). Results: Comparison of dtsz vs. control hamsters revealed interesting (basal) differences within the basal ganglia network. For example, there was a lower number of brevican-positive cells to total PV+ cells (Brev+/PV+) in motor cortex and striatal weakly PV+ interneurons, while brevican intensities were increased in striatum and ventromedial thalamus. In contrast, the studies in the DYT1 KI mouse revealed only a subtle increase in brevican in the motor cortex. Three-hour DBS in the dtsz hamster (vs. sham) did not result in changes of brevican, but the basal genotype changes were confirmed. Increases in neuronal activity (c-Fos) after EPN-DBS were seen near the electrode tip and a decrease in deep cerebellar nuclei after 130 Hz EPN-DBS. Conclusions: In the dtsz hamster model, developmental disruption of the PN may be involved in the delayed maturation of PV+ interneurons. The other changes are consistent with known regional disturbances in the basal ganglia network. However, it remains unclear whether they represent a cause of the dystonia or a consequence of other changes. DBS, which was only brief and lasted three hours, had no widespread effects on neuronal activity and brevican. Stronger effects are also more likely after the long-term DBS which is still ongoing for 10 days in dtsz hamsters. The basal brevican changes in the dtsz mutant were not evident in the asymptomatic DYT1 KI mouse model, in which the cortical increase in Brev+/PV+ number could, however, be a cause of sensorimotor dysfunction. Thus, although brevican is not generally decreased, it is altered in both dystonia models, so further studies on the pathophysiological significance of brevican as well as other PN components, such as HAPLN4 and aggrecan, seem reasonable.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Dystonien 2.1.1 Definition und Einteilung 2.1.2 Pathophysiologie primärer Dystonien 2.1.2.1 Neuronale Plastizität 2.1.2.2 Neuronale Aktivität 2.1.3 Therapieoptionen für Dystonien 2.1.3.1 Tiefe Hirnstimulation (THS) 2.1.4 Tiermodelle für die primäre Dystonie 2.1.4.1 dtsz Hamstermutante 2.1.4.2 DYT1 KI-Mausmodell 2.2 Extrazelluläre Matrix und perineuronale Netze 2.2.1 Aufbau und Funktion 2.2.2 Manipulationen der Expression von PN-Komponenten 2.2.3 Pathophysiologische Bedeutung von perineuronalen Netzen in Bewegungsstörungen 2.3 Hypothesen der vorliegenden Arbeit 3 Tiere, Material, Methoden 3.1 Tiere 3.1.1 Haltung und Fütterung von Hamstern 3.1.2 Haltung und Fütterung von Mäusen 3.2 Material 3.3 Methoden 3.3.1 Dystonie-Induktion und Beurteilung der Schweregrade beim dtsz Hamster 3.3.2 Tiefe Hirnstimulation dtsz Hamster und Kontrolltiere 3.3.3 Genotypisierung der DYT1 KI-Mäuse 3.3.4 Euthanasie und Probenentnahme 3.3.5 Immunhistochemie (IHC) 3.3.5.1 Brevican und Parvalbumin 3.3.5.2 c-Fos 3.3.5.3 Aggrecan 3.3.6 Western Blot (WB) 3.3.6.1 Probenvorbereitung und Proteinextraktion 3.3.6.2 Durchführung Western Blot 3.3.7 Quantitative Real-Time PCR (qPCR) 3.3.7.1 Probenvorbereitung und mRNA-Isolation 3.3.7.2 cDNA-Synthese und Durchführung qPCR 3.3.8 Statistische Auswertung 3.3.8.1 Statistische Auswertung der IHC 3.3.8.2 Statistische Auswertung des WB 3.3.8.3 Statistische Auswertung der qPCR 4 Ergebnisse 4.1 Basale Veränderungen von Brevican beim dtsz Hamster 4.1.1 Intensität von Brevican 4.1.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.1.3 Einzelzellintensität von Brevican an striatalen Parvalbumin-positiven (PV+) Zellen 4.2 Veränderungen von Brevican im DYT1 KI-Mausmodell 4.2.1 Intensität von Brevican bei DYT1 KI-Mäusen 4.2.2 Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.2.3 Western Blot 4.2.4 qPCR 4.3 Brevican und Parvalbumin im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS) 4.3.1 Intensität von Brevican bei sham-stimulierten und stimulierten dtsz und Kontrollhamstern 4.3.2 Effekte von 130 Hz THS auf den Anteil von Brevican-exprimierenden Parvalbumin-reaktiven (PV+) Zellen 4.3.3 THS-Effekte auf die Anzahl von PV+ Zellen 4.3.4 Einzelzellintensitäten von Brevican um striatale PV+ Zellen 4.4 Neuronale Aktivität im dtsz Hamstermodell nach Tiefer Hirnstimulation (THS) 4.4.1 c-Fos Intensität in der Umgebung der Elektroden 4.4.2 Anzahl c-Fos-reaktiver Zellen 4.5 Vorversuche zu weiteren Komponenten perineuronaler Netze 4.6 Zusammenfassung der Ergebnisse 5 Diskussion 5.1 Ausgewählte Aspekte zur Methodik 5.1.1 Methodische Aspekte zur Immunhistochemie 5.1.2 Methodische Aspekte zum Western Blot 5.1.3 Methodische Aspekte zur qPCR 5.2 Diskussion der Ergebnisse 5.2.1 Brevican im dtsz Hamster 5.2.2 Brevican in der DYT1 KI-Maus 5.2.3 Brevican und Parvalbumin nach THS im dtsz Hamster 5.2.4 Neuronale Aktivität nach THS im dtsz Hamster 5.3 Bedeutung und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang

Insekten besitzen das Potenzial, als alternative Nahrungsquelle einen Beitrag zur Sicherstellung der Ernährung der wachsenden Weltbevölkerung zu leisten. Rechtlich gelten sie gemäß Vorgaben der Verordnung (EU) 2015/2283 als neuartige Lebensmittel und dürfen im Rahmen der Übergangsvorschriften dieser Verordnung unter bestimmten Voraussetzungen bereits in der Europäischen Union vermarktet werden. Da sie als wirbellose Tiere bisher aus dem Anwendungsbereich vieler Vorgaben herausfallen, stellen die rechtliche Beurteilung und vergleichbare Ergebnisgenerierung im Rahmen der amtlichen Lebensmittelüberwachung besondere Herausforderungen dar. Ziel der vorliegenden Dissertation ist es, die Nutzung, das Inverkehrbringen und die Planung von Untersuchungsschwerpunkten durch die amtlichen Lebensmittelüberwachungs- sowie Untersuchungsbehörden, Produzenten und Lebensmittelunternehmer zu erleichtern, indem die aktuelle Rechtslage zum Thema Speiseinsekten zusammengefasst und die Anwendbarkeit von Methoden der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren geprüft wird. Außerdem werden die Besonderheiten der Spezies Honigbienen-Drohnenbrut herausgestellt. Zur Beurteilung der aktuellen Rechtslage erfolgte neben der Einbeziehung der EU-Gesetzgebung eine Abfrage von 28 EU-Mitgliedsstaaten sowie der zuständigen Behörden für die Lebensmittelüberwachung der 16 Bundesländer in Deutschland bezüglich des aktuellen Umgangs mit Speiseinsekten und zu Änderungen, die im Zusammenhang mit den Übergangsregelungen der Verordnung (EU) 2015/2283 stehen. Zur Prüfung der Anwendbarkeit der Methoden der Amtlichen Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 64 Lebens- und Futtermittelgesetzbuch für die Parameter Wasser, Asche, Rohprotein, Fett und Natrium als standardisierte Methoden zur Bestimmung der Nährwerte, wurden vier Insektenspezies ausgewählt. Für diese lag bereits ein Antrag als neuartige Lebensmittel vor und sie repräsentierten die Variabilität dieser Lebensmittelmatrix. Nach Probenvorbereitung und Homogenitätstest erfolgte ein Werteabgleich mit vier Laboren. Um die Ergebnisse mit den entsprechenden Vorgaben zu vergleichen, wurden mit der Hilfe von unabhängigen Zielstandardabweichungen z-Scores berechnet und zur Leistungsbewertung herangezogen. In einem Übersichtsartikel wurden zudem Informationen zu der Nährstoffzusammensetzung, Sensorik, bisherigen Verwendungsmöglichkeiten, zum rechtlichen Rahmen und zu Risiken von Drohnenbrut als Lebensmittel zusammengefasst. Außerdem erfolgten mittels Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung Untersuchungen zum Nachweis von Pestizidrückständen in 37 Drohnenbrutproben. Die Darstellung der geltenden rechtlichen Aspekte sowie deren Umsetzung in den EU-Mitgliedsstaaten sowie in den Bundesländern in Deutschland zeigen, dass der gesetzliche Rahmen des Inverkehrbringens von Speiseinsekten bisher nicht mit dem von Lebensmitteln anderer Kategorien vergleichbar ist. Die Notwendigkeit der Anpassungen der gültigen Vorgaben vor allem in den Bereichen Kennzeichnung, allgemeinen Hygienevorschriften, tierseuchen-, tierschutz- sowie umweltrechtlichen Aspekten wurde herausgestellt. Es konnte außerdem nachgewiesen werden, dass die überprüften Methoden zur Bestimmung der Parameter Wasser, Asche, Rohprotein, Gesamtfett und Natrium die spezifischen Anforderungen für gefrorene Speiseinsekten erfüllen. Damit können sie nach einer Verifizierung als standardisierte Methoden von Laboren eingesetzt werden. Im Rahmen der eigenen Untersuchungen konnten keine Pestizidrückstände in Drohnenbrut detektiert werden. Auch die Zusammenfassung der bisherigen Studien ergaben keine Gefahren für die Verbraucher. Aufgrund der geringen Datenmengen sollten jedoch weitere Studien und regelmäßige Kontrollen durchgeführt werden. Die vorliegende Dissertation liefert für Produzenten, Unternehmer, gesetzgebende Institutionen und überwachende Behörden einen Überblick darüber, welche Vorgaben aktuell gelten und welche rechtlichen Überarbeitungen zukünftig notwendig sind. Außerdem wurde mit Hilfe der neuen Erkenntnisse die Beurteilung von Insektenproben nicht nur vereinfacht, sondern auch vereinheitlicht und damit vergleichbar gemacht. Da bisher keine Gefahren ausgehend von Drohnenbrut als Lebensmittel festgestellt werden konnten, ist deren Nutzung nicht nur ökologisch und ernährungsphysiologisch sinnvoll, sondern kann daneben einen Baustein zur Sicherstellung der Versorgung der anwachsenden Menschheit liefern. Von besonderer Bedeutung für die Etablierung von Speiseinsekten auf dem deutschen Markt sind die zeitnahe Publikation einer nationalen Leitlinie sowie Aufklärungsarbeit bezüglich Insekten als Lebensmittel zu leisten.

In der vorliegenden Studie wurde mit Hilfe von am Huf fixierten IMU-Sensoren der Einfluss verschiedener Manipulationen am Huf sowie der Einfluss unterschiedlicher Beschlagsmodifikationen auf die Dauer der einzelnen Schrittphasen des Pferdes untersucht. Zu den untersuchten Modifikationen gehörten Gewichtsmodifikationen, Modifikationen der dorsopalmaren und mediolateralen Ebene sowie von Hufeisen mit unterschiedlichen Abrollpunkten. Gegenstand der Studie waren zehn klinisch gesunde, lahmfreie Pferde. Gemessen wurde im Schritt und im Trab auf hartem, ebenem Boden. Die erhobenen Parameter waren die Schrittdauer, die Dauer der Hangbeinphase und die Dauer der Stützbeinphase inklusive der Auffußdauer, der Dauer der Hauptstützphase und der Abrolldauer sowie die Geschwindigkeit. Zusätzlich wurde der Einfluss morphometrischer Faktoren auf die Dauer der einzelnen Schrittphasen ermittelt. In Bezug auf die Ergebnisse, konnte in der vorliegenden Studie vor allem ein Einfluss der Beschlagsmodifikationen auf die Dauer der einzelnen Schrittphasen nachgewiesen werden. Zu den Kernergebnissen der Studie gehören eine signifikante Abnahme der Abrolldauer im Schritt durch Anschleifen einer Zehenrichtung bzw. Zurücksetzen des Hufeisens. Das Anbringen von Trachtenkeilen ging in beiden Gangarten mit einer signifikanten Abnahme der Abrolldauer sowie einer signifikanten Zunahme der Dauer der Hauptstützphase einher. Durch das Anbringen eines Eisenbeschlages kam es unabhängig von der Position des Abrollpunktes zu einer signifikanten Zunahme der Auffußdauer im Trab im Vergleich zu den Werten Barhuf. Besonderheit der vorliegenden Studie war die genaue Differenzierung der einzelnen Schrittphasen anhand der präzisen Datenerhebung durch die hohe Messfrequenz sowie die direkte Platzierung der Sensoren am Huf.:Inhaltsverzeichnis: Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literatur 2.1 Funktionelle Anatomie der distalen Gliedmaße 2.1.1 Knochen und Gelenke 2.1.2 Muskeln, Sehnen, Bänder 2.1.3 Der Huf 2.1.3.1 Definition und Aufbau 2.1.3.2 Hufschichten und Hufsegmente 2.1.3.3 Hufbeinträger 2.1.3.4 Hufmechanismus 2.1.3.5 Blutgefäße und Innervation 2.2 Biomechanische Grundlagen 2.2.1 Allgemeine Grundlagen der Biomechanik 2.2.1.1 Dynamik: Statik und Kinetik 2.2.1.2 Kinematik 2.2.2 Spezielle Biomechanik der distalen Gliedmaße des Pferdes 2.3 Hufzubereitung und Hufbeschlag 2.3.1 Überblick Hufzubereitung 2.3.2 Allgemeine Beschlagslehre 2.4 Beschlagsmodifikationen und ihre Anwendung bei Erkrankungen der distalen Gliedmaße sowie Fehlstellungen und Gangstörungen 2.4.1 Gewichts- und Materialmodifikationen 2.4.1.1 Gewichtszunahme durch Beschlagsmodifikationen 2.4.1.2 Gewichtsabnahme durch Beschlagsmodifikationen 2.4.2 Modifikationen der mediolateralen Ebene 2.4.2.1 Anwendung von Seitenkeilen 2.4.2.2 Anbringen von Extensionen 2.4.3 Modifikationen der dorsopalmaren Ebene 2.4.3.1 Anwendung von Trachtenkeilen 2.4.3.2 Einsatz von Stegeisen 2.4.4 Modifikationen des Abrollpunktes 2.4.4.1 Anbringen einer Zehenrichtung 2.4.4.2 Positionierung des Eisens 2.5 Bewegungsanalyse zur Untersuchung der distalen Gliedmaße des Pferde 2.5.1 Kinetische Methoden 2.5.1.1 Kraftmessungen 2.5.1.2 Druckmessungen 2.5.2 Kinematische Methoden 2.5.2.1 Optoelektronische Bewegungsanalyse 2.5.2.2 Sensorbasierte Bewegungsanalyse 2.6 Ausblick auf die Studie 3 Material und Methoden 3.1 Tiermaterial 3.1.1 Eigenschaften der Pferde 3.1.2 Selektion und Dokumentation der Tiere 3.2 Studiendesign und Versuchsaufbau 3.3 Datenerhebung 3.3.1 Technik 3.3.2 Hufzubereitung und Hufbeschlag 3.3.3 Praktische Durchführung und Dokumentation 3.4 Datenanalyse 3.4.1 Datenexport und Datenaufbereitung 3.4.2 Statistische Analyse 4 Ergebnisse 4.1 Dauer der einzelnen Schrittphasen Barhuf vor der Hufzubereitung 4.2 Einflussfaktoren auf die Dauer der Schrittphasen Barhuf vor der Hufzubereitung 4.2.1 Einfluss durch morphometrische Faktoren 4.2.2 Einfluss durch Gliedmaße und Gangart 4.3 Übersicht über die Wirkung der untersuchten Modifikationen auf die Dauer der einzelnen Schrittphasen an den Vordergliedmaßen im Schritt und im Trab 4.4 Wirkung der untersuchten Modifikationen auf die Dauer der einzelnen Schrittphasen an den Vordergliedmaßen im Schritt und im Trab 4.4.1 Vergleich der Werte nach unterschiedlichen Manipulationen am Huf mit den Werten Barhuf vor bzw. nach der Hufzubereitung 4.4.1.1 Einfluss durch Hufzubereitung 4.4.1.2 Einfluss der Verwendung zusätzlicher Gewichte 4.4.1.3 Einfluss einer veränderten Hufstellung 4.4.2 Vergleich der zeitlichen Parameter Barhuf und bei Verwendung unterschiedlicher Standardbeschläge 4.4.2.1 Einfluss durch Standardbeschläge mit unterschiedlicher Modifikation des Zehenteils bzw. der Eisenposition 4.4.3 Vergleich der Wirkung verschiedener Beschlagsmodifikationen auf die zeitlichen Parameter 4.4.3.1 Einfluss von Beschlagsmodifikationen zur Veränderung des Abrollpunktes 4.4.3.2 Einfluss durch einen Aluminiumbeschlag 4.4.3.3 Einfluss durch Modifikationen der Eisenoberfläche 5 Diskussion 5.1 Material und Methoden 5.1.1 Tiermaterial 5.1.2 Hufzubereitung und Hufbeschlag 5.1.3 Messbedingungen 5.1.4 Technik 5.1.5 Datenanalyse 5.2 Ergebnisse 5.2.1 Zeitliche Parameter Barhuf vor der Hufzubereitung 5.2.2 Einflussfaktoren auf die zeitlichen Parameter Barhuf vor der Hufzubereitung 5.2.3 Wirkung der untersuchten Modifikationen auf die Dauer der einzelnen Schrittphasen an den Vordergliedmaßen im Schritt und im Trab 5.2.3.1 Einfluss durch Hufzubereitung 5.2.3.2 Einfluss einer dorsopalmaren/ mediolateralen Änderung der Zehenstellung 5.2.3.3 Einfluss der Verwendung zusätzlicher Gewichte 5.2.3.4 Beeinflussung der zeitlichen Parameter durch Standardbeschläge im Vergleich zu Barhuf 5.2.3.5 Beeinflussung der zeitlichen Parameter durch Standardbeschläge mit unterschiedlichen Abrollpunkten 5.2.3.6 Beeinflussung der zeitlichen Parameter durch unterschiedliche Beschlagsmaterialien 5.2.3.7 Einfluss durch Modifikationen der Eisenoberfläche 5.3 Neuromuskuläre Prägung 5.4 Schlussfolgerungen und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang / The aim of the current study was to examine the influence of different horseshoe modifications on the duration of the stride phases by means of hoof mounted IMU sensors. Examined modifications were modifications of weight, modifications of the dorsopalmar and mediolateral plane as well as different points of breakover. The study used a cohort of ten clinically healthy, sound horses. Data were collected at walk and trot on a hard, level surface. The relevant parameters were the step duration, the duration of swing phase and the duration of stance phase including landing duration, midstance duration and breakover duration as well as speed. In addition, the influence of morphometric factors on the duration of the single stride phases was determined. In this study, an obvious influence of the horseshoe modifications was shown mainly on the duration of the single stride phases. A significant decrease of breakover duration at walk could be proven after rolling the toe or setting back the horseshoe. Attaching heel wedges was associated to a significant decrease of breakover duration and a significant increase of midstance duration in both gaits. In comparison to the results of the barefoot measurement, a significant increase of the landing duration was detected at the trot by attaching iron horseshoes, independent of the position of the point of breakover. Characteristic of this study was the differentiation of the single stride phases which was possible due to the high sampling frequency and the direct placement of the sensors on the hoof.:Inhaltsverzeichnis: Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 2 Literatur 2.1 Funktionelle Anatomie der distalen Gliedmaße 2.1.1 Knochen und Gelenke 2.1.2 Muskeln, Sehnen, Bänder 2.1.3 Der Huf 2.1.3.1 Definition und Aufbau 2.1.3.2 Hufschichten und Hufsegmente 2.1.3.3 Hufbeinträger 2.1.3.4 Hufmechanismus 2.1.3.5 Blutgefäße und Innervation 2.2 Biomechanische Grundlagen 2.2.1 Allgemeine Grundlagen der Biomechanik 2.2.1.1 Dynamik: Statik und Kinetik 2.2.1.2 Kinematik 2.2.2 Spezielle Biomechanik der distalen Gliedmaße des Pferdes 2.3 Hufzubereitung und Hufbeschlag 2.3.1 Überblick Hufzubereitung 2.3.2 Allgemeine Beschlagslehre 2.4 Beschlagsmodifikationen und ihre Anwendung bei Erkrankungen der distalen Gliedmaße sowie Fehlstellungen und Gangstörungen 2.4.1 Gewichts- und Materialmodifikationen 2.4.1.1 Gewichtszunahme durch Beschlagsmodifikationen 2.4.1.2 Gewichtsabnahme durch Beschlagsmodifikationen 2.4.2 Modifikationen der mediolateralen Ebene 2.4.2.1 Anwendung von Seitenkeilen 2.4.2.2 Anbringen von Extensionen 2.4.3 Modifikationen der dorsopalmaren Ebene 2.4.3.1 Anwendung von Trachtenkeilen 2.4.3.2 Einsatz von Stegeisen 2.4.4 Modifikationen des Abrollpunktes 2.4.4.1 Anbringen einer Zehenrichtung 2.4.4.2 Positionierung des Eisens 2.5 Bewegungsanalyse zur Untersuchung der distalen Gliedmaße des Pferde 2.5.1 Kinetische Methoden 2.5.1.1 Kraftmessungen 2.5.1.2 Druckmessungen 2.5.2 Kinematische Methoden 2.5.2.1 Optoelektronische Bewegungsanalyse 2.5.2.2 Sensorbasierte Bewegungsanalyse 2.6 Ausblick auf die Studie 3 Material und Methoden 3.1 Tiermaterial 3.1.1 Eigenschaften der Pferde 3.1.2 Selektion und Dokumentation der Tiere 3.2 Studiendesign und Versuchsaufbau 3.3 Datenerhebung 3.3.1 Technik 3.3.2 Hufzubereitung und Hufbeschlag 3.3.3 Praktische Durchführung und Dokumentation 3.4 Datenanalyse 3.4.1 Datenexport und Datenaufbereitung 3.4.2 Statistische Analyse 4 Ergebnisse 4.1 Dauer der einzelnen Schrittphasen Barhuf vor der Hufzubereitung 4.2 Einflussfaktoren auf die Dauer der Schrittphasen Barhuf vor der Hufzubereitung 4.2.1 Einfluss durch morphometrische Faktoren 4.2.2 Einfluss durch Gliedmaße und Gangart 4.3 Übersicht über die Wirkung der untersuchten Modifikationen auf die Dauer der einzelnen Schrittphasen an den Vordergliedmaßen im Schritt und im Trab 4.4 Wirkung der untersuchten Modifikationen auf die Dauer der einzelnen Schrittphasen an den Vordergliedmaßen im Schritt und im Trab 4.4.1 Vergleich der Werte nach unterschiedlichen Manipulationen am Huf mit den Werten Barhuf vor bzw. nach der Hufzubereitung 4.4.1.1 Einfluss durch Hufzubereitung 4.4.1.2 Einfluss der Verwendung zusätzlicher Gewichte 4.4.1.3 Einfluss einer veränderten Hufstellung 4.4.2 Vergleich der zeitlichen Parameter Barhuf und bei Verwendung unterschiedlicher Standardbeschläge 4.4.2.1 Einfluss durch Standardbeschläge mit unterschiedlicher Modifikation des Zehenteils bzw. der Eisenposition 4.4.3 Vergleich der Wirkung verschiedener Beschlagsmodifikationen auf die zeitlichen Parameter 4.4.3.1 Einfluss von Beschlagsmodifikationen zur Veränderung des Abrollpunktes 4.4.3.2 Einfluss durch einen Aluminiumbeschlag 4.4.3.3 Einfluss durch Modifikationen der Eisenoberfläche 5 Diskussion 5.1 Material und Methoden 5.1.1 Tiermaterial 5.1.2 Hufzubereitung und Hufbeschlag 5.1.3 Messbedingungen 5.1.4 Technik 5.1.5 Datenanalyse 5.2 Ergebnisse 5.2.1 Zeitliche Parameter Barhuf vor der Hufzubereitung 5.2.2 Einflussfaktoren auf die zeitlichen Parameter Barhuf vor der Hufzubereitung 5.2.3 Wirkung der untersuchten Modifikationen auf die Dauer der einzelnen Schrittphasen an den Vordergliedmaßen im Schritt und im Trab 5.2.3.1 Einfluss durch Hufzubereitung 5.2.3.2 Einfluss einer dorsopalmaren/ mediolateralen Änderung der Zehenstellung 5.2.3.3 Einfluss der Verwendung zusätzlicher Gewichte 5.2.3.4 Beeinflussung der zeitlichen Parameter durch Standardbeschläge im Vergleich zu Barhuf 5.2.3.5 Beeinflussung der zeitlichen Parameter durch Standardbeschläge mit unterschiedlichen Abrollpunkten 5.2.3.6 Beeinflussung der zeitlichen Parameter durch unterschiedliche Beschlagsmaterialien 5.2.3.7 Einfluss durch Modifikationen der Eisenoberfläche 5.3 Neuromuskuläre Prägung 5.4 Schlussfolgerungen und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang

- Einleitung - Coxiella burnetii (C. burnetii) ist der Erreger des Q-Fiebers, einer zoonotischen Erkrankung, welche insbesondere kleine und große Wiederkäuer betrifft. Während Tiere meist asymptomatisch erkranken, kann die Erkrankung beim Menschen von akuten grippeähnlichen Symptomen bis hin zur chronischen Organschädigung führen. Die Diagnostik von Q-Fieber im veterinärmedizinischen Bereich wird durch unspezifische Symptome sowie diagnostische Lücken erschwert: Einerseits ist die direkte Diagnostik aufgrund langer Anzuchtzeiten der Bakterien häufig unpraktikabel. Andererseits weisen die Leistungen der Serodiagnostika in Untersuchungen teilweise inakzeptable Spezifitäten und Sensitivitäten auf. - Ziel der Untersuchungen - Ziel war es, das Potential des rekombinant hergestellten C. burnetii Außenmembran-proteins Com1 als diagnostischen Marker zu bestimmen und darauf aufbauend einen indirekten Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) zu entwickeln, welcher die Grundlage für neue, praxistaugliche und verbesserte Serodiagnostika bieten kann. - Material und Methoden - Hierfür wurde die kodierende Sequenz für Com1 von C. burnetii Nine Mile Phase II RSA 439 unter Ausschluss der Signalsequenz mittels Polymerase-Kettenreaktion amplifiziert. Das Amplifikat com1 wurde in ein Expressionsplasmid kloniert und anschließend mittels Transformation in Escherichia coli (E. coli) als Com1 exprimiert. Das Expressionsprodukt wurde nach der Aufreinigung über Nickel-NTA (Nitrilotriessigsäure) mittels SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese), Coomassie-Blau-Färbung und Western Blot überprüft. Die 96-Well-Mikrotiterplatten wurden mit 1 µg/Well des rekombinanten Proteins beschichtet und 404 Seren von Schafen (111), Ziegen (100) und Rindern (193) auf ihre Reaktion im rekombinanten Com1-ELISA analysiert. Die Seren stammten sowohl aus definierten Ausbrüchen als auch aus Q-Fieber-freien Beständen, geimpften Herden und von Tieren mit fraglichem Infektionshintergrund. Daneben wurden die Seren mit kommerziellen ELISAs getestet und daraufhin in positive und negative Seren eingeteilt. Die OD450-Werte (optische Dichte bei 450 nm) der Seren aus dem rekombinanten Com1-ELISAs wurden in Pivot-Tabellen angeordnet und anschließend in einer ROC-Kurve (receiver operating characteristic) dargestellt, wodurch das Integral als Area under the curve (AUC) berechnet und hinsichtlich der Diskrimination zwischen positiven und negativen Ergebnissen ausgewertet wurde. Nach Festlegung von tierart-spezifischen Cut-off-Werten wurden Sensitivität und Falsch-Positiv-Rate bestimmt. - Ergebnisse - Die ermittelten tierart-spezifischen OD450-Cut-off-Werte betrugen für Schafe 0,32, für Ziegen 0,23 und für Rinder 0,18. Als Spezifität bzw. Sensitivität ergaben sich für Schafe 85 % bzw. 68 %, für Ziegen 94 % bzw. 77 % und für Rinder 71 % bzw. 70 %. Die Diskrimination wurde bei Schafen als „exzellent“, bei Ziegen als „herausragend“ und bei Rindern als „akzeptabel“ eingeschätzt. - Schlussfolgerungen - Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass das Coxiella-Außenmembranprotein Com1 als Basis für die Entwicklung neuer, sensitiverer und spezifischerer (Schnell)-Diagnostika dienen kann, um weitere Q-Fieber-Epidemien einzudämmen und damit das Risiko einer C. burnetii-Infektion für Mensch und Tier zu minimieren. / - Introduction - Coxiella burnetii (C. burnetii) is the causative agent of Q fever, a zoonotic disease with small and large ruminants as the target hosts. While an infection in ruminants is often symptomless, the disease in humans can lead from acute flu-like symptoms to chronic organ damage. In addition to the non-specific symptoms in the veterinary field, for which reason it is difficult to directly conclude on a Q fever outbreak, the detection of infections with C. burnetii is in need of improvement. On the one hand, direct diagnosis is often impracticable due to long cultivation periods of the bacteria. On the other hand, the performance of serodiagnostics shows partially unacceptable specificities and sensitivities. - Objectives - The aim of the study was to determine the potential of the recombinantly produced C. burnetii outer membrane protein Com1 as a diagnostic marker and, subsequently, to develop an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), which can provide the basis for the development of new and improved serodiagnostics. - Material and methods - For this purpose, primers for com1 were designed in silico and the open reading frame (ORF) was amplified by polymerase chain reaction (PCR) using phenol-chloroform-isolated DNA (deoxyribonucleic acid) from C. burnetii Nine Mile Phase II RSA 439 without signal sequence. After control by gel electrophoresis, the amplified product was cloned into the two-stage gateway system (Invitrogen) and transformed into Escherichia coli (E. coli) TOP10. The expression vector was cloned into E. coli BL21(DE3) and Com1 was expressed. The protein was analyzed after native purification via Nickel-NTA (nitrilotriacetic acid) by SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis), Coomassie blue staining and Western blot and subsequently concentrated. Microtiter plates were coated with the recombinant protein and 404 sera from sheep (111), goats (100) and cattle (193) were tested for their reaction in the recombinant Com1-ELISA. The sera were derived from 36 different flocks, both from defined outbreaks and from Q fever-free flocks, vaccinated herds and from animals with questionable infection background. In addition, the sera were tested with commercial ELISAs and could thus be divided into positive and negative sera. The OD450 values (optical density at 450 nm) of the sera from the recombinant Com1 ELISAs were arranged in pivot tables and then plotted on a ROC curve (receiver operating characteristic), allowing the integral to be calculated as the area under the curve (AUC) and evaluated regarding the discrimination between positive and negative results. After establishing animal species-specific cut-off values, sensitivity and false positive rate were determined. - Results - The animal species-specific OD450 cut-off values determined were 0.32 for sheep, 0.23 for goats and 0.181 for cattle. Specificity and sensitivity were 85 % and 68 % for sheep, 94 % and 77 % for goats and 71 % and 70 % for cattle. Discrimination was assessed as 'excellent' in sheep, 'outstanding' in goats and 'acceptable' in cattle. - Conclusions - The results of this study suggest that the Coxiella outer membrane protein Com1, together with other immunogenic marker proteins, may serve as a basis for the development of new more sensitive and specific diagnostic tools to contain further Q fever epidemics and thus minimize the risk of C. burnetii infection for humans and animals. Com1 could also lay the foundation for direct rapid diagnostics.

Einleitung Der Einsatz und die Beliebtheit von 3D-Visualisierungen im Fachgebiet der Anatomie und Veterinäranatomie sind in den vergangenen Jahren stetig gewachsen. Vor allem vor den Hintergrund einer potentiell besseren und leichteren Wissensrezeption von räumlichen Informationen durch den Einsatz von 3D- im Vergleich zu 2D-Modellen wurden diverse Studien zum Lernerfolg mit diesen Medien durchgeführt. Ziele der Untersuchung Ziel dieser Arbeit war es, ein Lehr- und Lernprogramm, das „Laminitis Tool“ als Modul des „Equine Hoof Explorers“ in Kooperation mit der Effigos AG zu entwickeln und nachfolgend zu evaluieren. Das Programm soll die morphologischen Veränderungen (mikroskopisch und makroskopisch) während der einzelnen Hufrehephasen ausgehend von den physiologisch anatomischen Gegebenheiten durch 3D-Visualisierungen sowie eine modular aufbereitete Zusammenfassung der Forschungsergebnisse zur Hufrehe in Textform präsentieren. Die Hypothese des Lernvorteils durch das 3D-Programm im Vergleich zu illustrierten Texten wurde überprüft. Material und Methoden 3D-Visualisierungen und Texte für das „Laminitis Tool“ wurden auf Basis von Literaturquellen erstellt, die einen Rückschluss auf den klinischen Grad der Hufrehe und das verwendete Versuchsmodell bzw. die Ätiopathologie erlaubten. Die Evaluation des „Laminitis Tools“ wurde in zwei Durchläufen (Crossover-Design) durchgeführt. Dazu wurden 87 Studierende des 2. Fachsemesters (2. FS) und 26 Studierenden des 4. Fachsemesters (4. FS) den Gruppen A und B zugeteilt. Jede Gruppe enthielt in etwa gleichgroße Anteile aus jedem Fachsemester. Alle Teilnehmer:innen mussten vorab eine subjektive Einschätzung zu ihren Vorkenntnissen zur Hufrehe geben. Retrospektiv wurden anhand dieser Angabe sowie der angegebenen Fachsemester die Wissensgruppen „mit Vorkenntnissen“ (mVK) und „ohne Vorkenntnisse“ (oVK) sowie 2. FS und 4. FS gebildet. Im Durchgang 1 (DG 1) arbeitete Gruppe A mit dem Text und Gruppe B mit dem Tool. Dies wechselte im Durchgang 2 (DG 2). Vor Beginn des Tests erhielt die jeweilige Toolgruppe eine kurze Einführung in die Bedienung des Tools. Nach Arbeit mit dem entsprechenden Medium wurde ein Single-Choice-Test durchgeführt. Ergebnisse Das „Laminitis Tool“ ist eine 3D-Visualisierungssoftware, die ein animiertes 3D-Modell des Hufes von außen (Modell „Klinik“) und innen (Modell „Huf“) sowie des Hufbeinträgers (Modell „Histologie“) vor und während einer Hufreheerkrankung zeigt. Alle Modelle werden durch einen modularisierten Text begleitet. Ein Video zeigt die Veränderungen an der dermo-epidermalen Grenze des Hufbeinträgers. In Gruppe A gaben 56,4 % und in Gruppe B 48,3 % der Teilnehmenden an, Vorkenntnisse zur Hufrehe zu haben. Im DG 1 ist die Anzahl der Fragen, die von Gruppe A signifikant besser beantwortet wurden als von Gruppe B, mit drei von zehn Fragen größer als in DG 2, wo es nur eine von zehn Fragen war. Betrachtet man die Gesamtheit der Fragen konnte Gruppe A im DG 1 ein signifikant besseres Ergebnis (p = 0,0286) erzielen als Gruppe B, wohingegen im DG 2 kein signifikanter Unterschied (p = 0,2071) zwischen den Gruppen bestand. Teilnehmer:innen der Gruppe A aus dem 2. FS und aus der Wissensgruppe oVK konnten ihre Gesamtleistung von DG 1 zu DG 2 steigern. Teilnehmer:innen der Gruppe A aus dem 4. FS und aus der Wissensgruppe mVK erzielten im DG 2 ein geringeres Gesamtergebnis als im DG 1. Schlussfolgerungen Teilnehmer:innen aus Gruppen mit geringem oder keinen Vorkenntnissen (Gruppe B; 2. FS; oVK) erhielten möglicherweise einen Lernvorteil durch die Arbeit mit dem Tool und konnten so den Wissensunterschied zu wissensstärkeren Gruppe (Gruppe A; 4. FS; mVK) ausgleichen.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Hufrehe, Pododermatitis aseptica diffusa 3 2.1.1 Definition 3 2.1.2 Der Hufbeinträger, Apparatus suspensorius ossis ungulae 3 2.1.2.1 Dermale Anteile 4 2.1.2.2 Epidermale Anteile 4 2.1.2.3 Die Basalmembran 4 2.1.3 Makroskopisch-anatomische Veränderungen des Hufes während einer Hufreheerkrankung 6 2.1.4 Mikroskopisch-anatomische Veränderungen des Hufbeinträgers während einer Hufreheerkrankung 8 2.1.5 Metabolisch-induzierte Hufrehe 10 2.1.6 Toxininduzierte Hufrehe 12 2.1.7 Belastungsinduzierte Hufrehe 15 2.2 Mediendidaktik – Begriffsbestimmung 17 2.2.1 Digitale Medien 17 2.2.2 Multimedia 17 2.2.3 E-Learning, Blended Learning und didaktisches Design 17 2.3 Von der Theorie zur Praxis - Gestaltungsmerkmale auf Basis klassischer Lerntheorien und deren Anwendung in E-Learning-Programmen 18 2.3.1 Der Behaviorismus 18 2.3.2 Der Kognitivismus 19 2.3.3 Der Konstruktivismus 20 2.4 Codierungsformen (der Computertechnologie): 3D-Bilder, Animationen und Hypertext 21 2.4.1 Bilder (Definition, 3D-Bilder, Animation, Video) 21 2.4.2 Hypertext (Definition, Aufbau, Gefahren und Potentiale) 22 2.5 Lernen mit Text und Bild 23 2.5.1 Gestaltungsempfehlungen für Bilder und Texte 26 2.6 Interaktivität und selbstgesteuertes Lernen 27 2.6.1 Graphical User Interface 28 2.7 Interaktive Lehr- und Lernprogramme in der Veterinärmedizin 28 3 Material, Methoden 30 3.1 Entwicklung des Lehr- und Lernprogramms 30 3.1.1 Allgemeiner Herstellungsprozess 30 3.1.2 Formulierung von Anforderungskriterien und Festlegung von inhaltlichen Schwerpunkten für das Modul 30 3.1.3 Formulierung der Texte 32 3.1.4 Erstellen von Abbildungen für die Texte 33 3.1.5 Graphische Inhalte - 3D-Modelle, Animationen und Video 35 3.1.5.1 Entwicklung von 3D-Modellen 35 3.1.5.2 Animation der 3D-Modelle 37 3.1.5.3 Entwicklung des Videos „Hufrehe an der dermo-epidermalen Grenze“ 39 3.1.6 Entwicklung der Benutzeroberfläche (GUI) 40 3.1.7 Formatierung der Texte 42 3.1.8 Einpflegen der Modulelemente und Validierung 45 3.2 Evaluation des Lehr- und Lernprogramms 45 3.2.1 Testvorbereitung 45 3.2.1.1 Akquise der Studienteilnehmer:innen 45 3.2.1.2 Geräte 45 3.2.1.3 Test mit Single-Choice-Fragen 46 3.2.2 Studienteilnehmer:innen 46 3.2.3 Studiendesign 47 3.2.4 Gruppen, Abschnitte der Studiendurchgänge 47 3.2.4.1 Abschnitte erster Durchgang – Übersicht 48 3.2.4.2 Abschnitte zweiter Durchgang - Übersicht 49 3.2.5 Statistische Auswertung 49 4 Ergebnisse 51 4.1 Das „Laminitis Tool“ 51 4.1.1 Inhaltsverzeichnis 51 4.1.2 Texte und Abbildungen für die Texte 51 4.1.3 Graphische Inhalte: 3D-Modelle, Animationen, Video 52 4.1.3.1 3D-Modelle: Allgemeine Eigenschaften 52 4.1.3.2 3D-Modell und Animation „Klinik“ 53 4.1.3.3 3D-Modell und Animation „Huf“ 53 4.1.3.4 3D-Modell und Animation „Hufbeinträger“ 54 4.1.3.5 Video „Hufrehe an der dermo-epidermalen Grenze“ 56 4.1.4 GUI des Themenbereichs „Klinik“ 58 4.1.5 GUI des Themenbereichs „Huf“ 60 4.1.6 GUI des Themenbereichs „Histologie“ 61 4.1.7 Weitere Bedienelemente 62 4.2 Evaluation des Lernprogramms 62 4.2.1 Präevaluation 62 4.2.2 Eigenschaften der Studienteilnehmer:innen in den Gruppen 63 4.2.3 Einteilung in Wissensgruppen 64 4.2.4 Aufgabenqualität und Reliabilitätsprüfung des Tests mit Single-Choice-Fragen 65 4.2.5 Test mit Single-Choice-Fragen, Testergebnisse der Text- und Toolgruppe 66 4.2.6 Test mit Single-Choice-Fragen, Testergebnisse der Wissensgruppen für die Attribute „Fachsemester“ und „Vorkenntnisse“ 71 5 Diskussion 76 5.1 Entwicklung des „Laminitis Tools“ 76 5.1.1 Kooperation mit der Effigos AG 77 5.1.2 Toolinhalt und Inhaltsverzeichnis 78 5.1.3 Texte und Abbildungen für die Texte 81 5.1.4 Benutzeroberfläche – Navigation und Orientierungshilfen 82 5.1.5 Benutzeroberfläche – Konsistente und intuitive Bedienbarkeit 83 5.1.6 3D-Modelle 85 5.1.7 Animationen 86 5.1.8 Video 87 5.2 Lernförderlicher Effekt des „Laminitis Tools“ im Vergleich zu einem konventionellen Text 88 5.2.1 Einteilung von Wissensgruppen 89 5.2.2 Vergleich der Gruppen 89 5.2.3 Entwicklung der Gruppen im Verlauf der Studie 91 5.2.4 Betrachtung der Fachsemester 92 5.2.5 Betrachtung der Einzelfragen 93 5.2.6 Betrachtung der Fragengruppe 94 5.2.7 Aussagekraft der Evaluation 94 5.3 Fazit 95 6 Zusammenfassung 97 7 Summary 99 8 Literaturverzeichnis 101 9 Anhang 121 9.1 Entwicklung des Lernprogramms 121 9.1.1 Skript des Videos „Hufrehe an der dermo-epidermalen Grenze“ 121 9.1.2 Beispiel einer Änderungsanweisung für den Bauplan zum Design und zur Funktion der GUI 123 9.2 Evaluation des Lernprogramms 129 9.2.1 Studienaufruf 129 9.2.2 Anweisung zur Nutzung des Tools 130 9.2.3 Fragebogen zur Präevaluation 131 9.2.4 Angaben zum Ausbildungsstand der Studienteilnehmenden 132 9.2.5 Single-Choice-Fragen 133 9.2.6 Aufgabenqualität und Reliabilitätsprüfung des Tests mit Single-Choice-Fragen 139 9.2.7 Test mit Single-Choice-Fragen, Testergebnisse der Text- und Toolgruppe 151 9.2.8 Test mit Single-Choice-Fragen, Testergebnisse der Wissensgruppe für das Attribut „Fachsemester“ 152 9.2.9 Test mit Single-Choice-Fragen, Testergebnisse der Wissensgruppe für das Attribut „Vorkenntnisse“ 160 / Introduction In recent years the use and popularity of three-dimensional (3D) visualizations has grown substantially in the field of anatomy and veterinary anatomy. 3D anatomical models providing a potentially better and easier reception of spatial information compared to two-dimensional (2D) anatomical models was subject of various studies looking into the learning success. Objectives Aim of this study was to develop and subsequently evaluate a 3D anatomical program („Laminitis Tool“) as a module of the „Equine Hoof Explorer“ in cooperation with the Effigos AG. The „Laminitis Tool“ was designed to demonstrate the morphological changes (microscopic and macroscopic) before and during each stadium of equine laminitis by 3D visualizations and text modules summarizing the state of scientific knowledge. The hypothesis that the 3D learning program leads to a better learning success than a text was tested. Material und Methods Development of 3D visualizations and texts for the „Laminitis Tool“ was based on references allowing conclusions regarding clinical phase and experimental set up or cause of equine laminitis. The „Laminitis Tool“ was evaluated in two trials. 87 students of the second semester (2nd SM) and 26 students of the fourth semester (4th SM) were randomly allocated into group A and B. Each group consisted of nearly the same number of students from both semesters. In advance all participants had to subjectively assess their preexisting knowlegde of equine laminitis. According to the prior assessment groups „with preexisting knowledge“ (mVK) and „without preexisting knowledge“ (oVK) as well as groups 2nd SM and 4th SM were formed retrospectively. In the first trail (DG 1), group A was working with the illustrated text and group B with the 3D program. The set up was vice versa in the second trial (DG 2). The respective tool group received a brief instruction in how to use the program. After working with the particular medium students had to undergo a single choice test. Results The „Laminitis Tool“ is a 3D visualization software showing an animated 3D model of the outside (model „clinic“) and inside (model „hoof“) of the equine hoof as well as of the suspensory apparatus of the distal phalanx (model „histology“) before and after the onset of equine laminitis. Each model is accompanied by a modularized text. A video is providing information about the morphological changes at the dermo-epidermal layer of the suspensory apparatus of the distal phalanx. 56.4 % of the participants in group A and 48.3 % in group B ware rated mVK. In the first trial group A achieved a significantly better result in three out of ten questions than group B. Whereas there was only a significant difference in one out of ten questions in the second trial. According to the overall result group A was significantly better than group B (p = 0.0286) in the first trial, but there was no significant difference (p = 0.2071) between groups in the second trial. Participants in group A from the 2nd FS and from the knowledge group oVK were able to increase their overall performance from DG 1 to DG 2. Participants of group A from the 4th FS and from the knowledge group mVK achieved a lower overall result in DG 2 than in DG 1. Conclusion Participants of groups with lower knowledge (group B; 2nd SM; oVK) may have received a learning advantage from working with the tool and thus were able to compensate for the knowledge gap with more knowledgeable groups (group A; 4th SM; mVK).:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 3 2.1 Hufrehe, Pododermatitis aseptica diffusa 3 2.1.1 Definition 3 2.1.2 Der Hufbeinträger, Apparatus suspensorius ossis ungulae 3 2.1.2.1 Dermale Anteile 4 2.1.2.2 Epidermale Anteile 4 2.1.2.3 Die Basalmembran 4 2.1.3 Makroskopisch-anatomische Veränderungen des Hufes während einer Hufreheerkrankung 6 2.1.4 Mikroskopisch-anatomische Veränderungen des Hufbeinträgers während einer Hufreheerkrankung 8 2.1.5 Metabolisch-induzierte Hufrehe 10 2.1.6 Toxininduzierte Hufrehe 12 2.1.7 Belastungsinduzierte Hufrehe 15 2.2 Mediendidaktik – Begriffsbestimmung 17 2.2.1 Digitale Medien 17 2.2.2 Multimedia 17 2.2.3 E-Learning, Blended Learning und didaktisches Design 17 2.3 Von der Theorie zur Praxis - Gestaltungsmerkmale auf Basis klassischer Lerntheorien und deren Anwendung in E-Learning-Programmen 18 2.3.1 Der Behaviorismus 18 2.3.2 Der Kognitivismus 19 2.3.3 Der Konstruktivismus 20 2.4 Codierungsformen (der Computertechnologie): 3D-Bilder, Animationen und Hypertext 21 2.4.1 Bilder (Definition, 3D-Bilder, Animation, Video) 21 2.4.2 Hypertext (Definition, Aufbau, Gefahren und Potentiale) 22 2.5 Lernen mit Text und Bild 23 2.5.1 Gestaltungsempfehlungen für Bilder und Texte 26 2.6 Interaktivität und selbstgesteuertes Lernen 27 2.6.1 Graphical User Interface 28 2.7 Interaktive Lehr- und Lernprogramme in der Veterinärmedizin 28 3 Material, Methoden 30 3.1 Entwicklung des Lehr- und Lernprogramms 30 3.1.1 Allgemeiner Herstellungsprozess 30 3.1.2 Formulierung von Anforderungskriterien und Festlegung von inhaltlichen Schwerpunkten für das Modul 30 3.1.3 Formulierung der Texte 32 3.1.4 Erstellen von Abbildungen für die Texte 33 3.1.5 Graphische Inhalte - 3D-Modelle, Animationen und Video 35 3.1.5.1 Entwicklung von 3D-Modellen 35 3.1.5.2 Animation der 3D-Modelle 37 3.1.5.3 Entwicklung des Videos „Hufrehe an der dermo-epidermalen Grenze“ 39 3.1.6 Entwicklung der Benutzeroberfläche (GUI) 40 3.1.7 Formatierung der Texte 42 3.1.8 Einpflegen der Modulelemente und Validierung 45 3.2 Evaluation des Lehr- und Lernprogramms 45 3.2.1 Testvorbereitung 45 3.2.1.1 Akquise der Studienteilnehmer:innen 45 3.2.1.2 Geräte 45 3.2.1.3 Test mit Single-Choice-Fragen 46 3.2.2 Studienteilnehmer:innen 46 3.2.3 Studiendesign 47 3.2.4 Gruppen, Abschnitte der Studiendurchgänge 47 3.2.4.1 Abschnitte erster Durchgang – Übersicht 48 3.2.4.2 Abschnitte zweiter Durchgang - Übersicht 49 3.2.5 Statistische Auswertung 49 4 Ergebnisse 51 4.1 Das „Laminitis Tool“ 51 4.1.1 Inhaltsverzeichnis 51 4.1.2 Texte und Abbildungen für die Texte 51 4.1.3 Graphische Inhalte: 3D-Modelle, Animationen, Video 52 4.1.3.1 3D-Modelle: Allgemeine Eigenschaften 52 4.1.3.2 3D-Modell und Animation „Klinik“ 53 4.1.3.3 3D-Modell und Animation „Huf“ 53 4.1.3.4 3D-Modell und Animation „Hufbeinträger“ 54 4.1.3.5 Video „Hufrehe an der dermo-epidermalen Grenze“ 56 4.1.4 GUI des Themenbereichs „Klinik“ 58 4.1.5 GUI des Themenbereichs „Huf“ 60 4.1.6 GUI des Themenbereichs „Histologie“ 61 4.1.7 Weitere Bedienelemente 62 4.2 Evaluation des Lernprogramms 62 4.2.1 Präevaluation 62 4.2.2 Eigenschaften der Studienteilnehmer:innen in den Gruppen 63 4.2.3 Einteilung in Wissensgruppen 64 4.2.4 Aufgabenqualität und Reliabilitätsprüfung des Tests mit Single-Choice-Fragen 65 4.2.5 Test mit Single-Choice-Fragen, Testergebnisse der Text- und Toolgruppe 66 4.2.6 Test mit Single-Choice-Fragen, Testergebnisse der Wissensgruppen für die Attribute „Fachsemester“ und „Vorkenntnisse“ 71 5 Diskussion 76 5.1 Entwicklung des „Laminitis Tools“ 76 5.1.1 Kooperation mit der Effigos AG 77 5.1.2 Toolinhalt und Inhaltsverzeichnis 78 5.1.3 Texte und Abbildungen für die Texte 81 5.1.4 Benutzeroberfläche – Navigation und Orientierungshilfen 82 5.1.5 Benutzeroberfläche – Konsistente und intuitive Bedienbarkeit 83 5.1.6 3D-Modelle 85 5.1.7 Animationen 86 5.1.8 Video 87 5.2 Lernförderlicher Effekt des „Laminitis Tools“ im Vergleich zu einem konventionellen Text 88 5.2.1 Einteilung von Wissensgruppen 89 5.2.2 Vergleich der Gruppen 89 5.2.3 Entwicklung der Gruppen im Verlauf der Studie 91 5.2.4 Betrachtung der Fachsemester 92 5.2.5 Betrachtung der Einzelfragen 93 5.2.6 Betrachtung der Fragengruppe 94 5.2.7 Aussagekraft der Evaluation 94 5.3 Fazit 95 6 Zusammenfassung 97 7 Summary 99 8 Literaturverzeichnis 101 9 Anhang 121 9.1 Entwicklung des Lernprogramms 121 9.1.1 Skript des Videos „Hufrehe an der dermo-epidermalen Grenze“ 121 9.1.2 Beispiel einer Änderungsanweisung für den Bauplan zum Design und zur Funktion der GUI 123 9.2 Evaluation des Lernprogramms 129 9.2.1 Studienaufruf 129 9.2.2 Anweisung zur Nutzung des Tools 130 9.2.3 Fragebogen zur Präevaluation 131 9.2.4 Angaben zum Ausbildungsstand der Studienteilnehmenden 132 9.2.5 Single-Choice-Fragen 133 9.2.6 Aufgabenqualität und Reliabilitätsprüfung des Tests mit Single-Choice-Fragen 139 9.2.7 Test mit Single-Choice-Fragen, Testergebnisse der Text- und Toolgruppe 151 9.2.8 Test mit Single-Choice-Fragen, Testergebnisse der Wissensgruppe für das Attribut „Fachsemester“ 152 9.2.9 Test mit Single-Choice-Fragen, Testergebnisse der Wissensgruppe für das Attribut „Vorkenntnisse“ 160

Introduction: Stenotic nares are one of the most important characteristics of brachycephalic obstructive airway syndrome (BOAS), which was first described in 1949. However, although they have been mentioned in most texts about brachycephalic malformations, few studies have attempted to characterize the nasal entrance of dogs morphologically or functionally, and none of them have described it objectively with landmarks. Recently, as the popularity of brachycephalic dogs has exploded worldwide, innumumberable dogs are suffering from BOAS due to structural malformations. In the point of view of animal welfare, stenotic nares should be objectively evaluated to provide evidence of torture breeding. Objectives: The aim of this study was to objectively measure and thus characterize the nasal entrance stenosis of brachycephalic dogs in comparison to non-brachycephalic dogs. To this end, the following objectives were defined: 1. Our aim is to use three-dimensional (3D) soft-tissue morphometry to objectively measure the externally visible part of the nasal entrance of healthy and brachycephalic dogs. 2. Our aim is to define specific soft-tissue landmarks and parameters to objectively characterize the nasal entrance of dogs. 3. Compare 3D high-resolution scanning with computed tomography (CT) using the newly defined parameters. 4. Reexamine the nasal entrance with 3D scan six months after surgical correction of nasal entrance stenosis (Ala-vestibuloplasty). Animals, Material and Methods: Forty-five brachycephalic and 45 non-brachycephalic dogs were included in this study between 2018 and 2020. All the animals were referred to the Ear, Nose, and Throat Unit of the Small Animal Department at the University of Leipzig, either for surgical correction of BOAS or for endoscopic examination. Animals were excluded if their nasal entrance was potentially affected due to disease or previous surgery. All dogs were scanned with a 3D scanner under general anesthesia using a standardized anesthetic protocol before endoscopic intervention. The 3D scans and CT images were later imported into two advanced software (Amira, Thermo Fisher and Facial Analysis Tool) for objective measurement of the nasal entrance. Intra-observer error and ala-vestibuloplasty (AVP) efficacy of the CT images and 3D scans were tested and compared. All the data were normalized using Shapiro–Wilk normality test. All statistical analyses were later performed using Pearson or Spearman test for correlation, paired t-test, or t-test. Paired t-test was used to test whether the mean difference between pairs of measurements was zero. If it was not the same group of animals, t-test was used instead. Results: We defined new specific soft-tissue landmarks to calculate the nasal opening area (NOA) and stenotic angle (SA) to objectively describe the canine nasal entrance. The NOA and SA were significantly smaller in brachycephalic dogs than in non-brachycephalic dogs, and the NOA was significantly correlated with body weight, whereas SA was not. After nasal entrance correction via AVP, the nasal entrances were 295%left and 233%right larger than before surgery in brachycephalic dogs. Intra-observer reliability was tested with excellent significance through NOA measurements. Comparison between the 3D scanner and CT was measured with the NOA, and it did not show a significant difference between the methods. Conclusion: Obtaining the NOA and SA using 3D surface scans seems to be a reliable and reproducible tool for precise objective evaluation of the visible canine nasal entrance. With the measurement of derived NOA and SA, all the brachycephalic dogs in the study were found to have stenotic nares, and all they required AVP to relieve breathing difficulty. The brachycephalic nasal entrances were increased significantly after AVP, the modified nare correction surgery. We consider the results of our study strong evidence that the breeding of brachycephalic dogs is torture breeding. The restriction of nasal breathing due to the extreme reduction of the nasal entrance to a fraction of the size of that of non-brachycephalic dogs is obvious evidence of this.:1 INTRODUCTION - 1 - 1.1 General Introduction - 1 - 1.2 Objectives - 2 - 2 OVERVIEW OF THE LITERATURE - 3 - 2.1 Brachycephalic Obstructive Airway Syndrome (BOAS) - 3 - 2.1.1 General Introduction of BOAS - 3 - 2.1.2 How to Define Brachycephalic Dogs - 3 - 2.1.3 Commonly Affected Breeds - 4 - 2.2 The Canine Nasal Entrance - 4 - 2.2.1 Anatomy of the Canine Nasal Entrance and Stenosis - 4 - 2.2.2 Pathophysiology of Stenotic Nares in Brachycephalic Dogs - 5 - 2.3 Diagnosis of Stenotic Nares - 9 - 2.3.1 Visual Assessment - 9 - 2.3.2 Nostril Ratio - 11 - 2.3.3 Air Volume of the Nasal Entrance - 11 - 2.4 Development of Morphometry in Brachycephalic Dogs - 11 - 2.5 3D Scanners for 3D Model Reconstruction - 12 - 2.6 Landmarks - 14 - 2.6.1 Introduction of Landmarks - 14 - 2.6.2 Development of Landmarks in Human Medicine - 15 - 2.6.3 Development of Landmarks in Veterinary Medicine - 16 - 2.6.4 Cephalometric Analysis Software - 17 - 3 ANIMALS AND METHODS - 19 - 3.1 Animals - 19 - 3.2 Methods - 19 - 3.2.1 3D Scanning Process and Set-ups of Canine Nasal Entrance - 19 - 3.2.2 Cephalomorphometric Software - 20 - 3.2.3 Cephalometric Landmarks - 20 - 3.2.4 Advanced Morphometric Parameters for Nares - 22 - 3.2.5 Efficacy of Ala-Vestibuloplasty (AVP) - 24 - 3.2.6 Comparison between CT and the 3D Scanning Tool - 24 - 3.2.7 Intra-observer Reliability - 25 - 3.2.8 Statistics - 25 - 4 RESULTS - 26 - 4.1 Brachycephalic Dogs and Non-brachycephalic Dogs - 26 - 4.2 The Nasal Opening Area (NOA) - 28 - 4.3 Efficacy of Ala-Vestibulopasty - 30 - 4.4 Stenotic Angle (SA) - 31 - 4.5 Comparison between CT and the 3D Scanning Tool - 32 - 4.6 Intra-observer Reliability - 34 - 5 DISCUSSION - 36 - 5.1 The Nasal Entrance - 36 - 5.2 Method: the 3D Scanner - 37 - 5.3 Method: Comparison between CT and the 3D Scanner - 38 - 5.4 Method: Landmarks and Reproducibility, Intra-observer Reliability - 39 - 5.5 Nasal Opening Area (NOA) and Efficacy of Ala-Vestibuloplasty (AVP) - 42 - 5.6 Stenotic Angle (SA) - 44 - 5.7 Animal Welfare - 45 - 6 SUMMARY - 47 - 7 ZUSAMMENFASSUNG - 49 - 8 REFERENCES - 51 - / Einleitung: Die Naseneingangstenose ist eine der wichtigsten Merkmale des brachyzephalen Syndroms (BOAS), das erstmals 1949 beschrieben wurde. Obwohl diese komplexe Stenose in den meisten Texten über brachyzephale Fehlbildungen erwähnt wird, haben nur wenige Studien versucht, den Naseneingang von Hunden morphologisch oder funktionell zu charakterisieren. Eine objektive Beschreibung mit Landmarken ist bisher nicht bekannt. In den letzten Jahren ist die Popularität brachyzephaler Hunde weltweit explodiert. Unzählige Hunde leiden aufgrund struktureller Fehlbildungen an BOAS. Unter dem Gesichtspunkt des Tierschutzes sollte die einzige, mit bloßem Auge sichtbare Stenose der oberen Atemwege brachyzephaler Hunde, die Stenose des Naseneingangs objektiv bewertet werden können, um Hinweise auf eine Qualzucht zu belegen. Zielsetzung: Ziel dieser Studie war es, den Naseneingang von brachyzephalen Hunden im Vergleich zu nicht-brachyzephalen Hunden objektiv zu messen und damit die Stenose des Naseneingangs zu charakterisieren und eine chirurgische Therapie, die Ala-Vestibuloplastie (AVP), zu evaluieren. Zu diesem Zweck wurden die folgenden Ziele definiert: 1. Anwendung der dreidimensionalen (3D) Weichteilmorphometrie zur objektiven Messung des äußerlich sichtbaren Teils des Naseneingangs von gesunden und brachyzephalen Hunden. 2. Definition spezifischer Weichteil-Landmarken und Parameter zur objektiven Charakterisierung des Naseneingangs von Hunden. 3. Methoden-Vergleich zwischen den hochauflösenden 3D-Scans und der Computertomographie (CT) unter Verwendung der neu definierten Parameter. 4. Kontrolluntersuchung mit 3D-Scan sechs Monate nach der chirurgischen Korrektur der Naseneingangsstenose (Ala-Vestibuloplastik). Tiere und Methoden: 45 brachyzephale und 45 nicht-brachyzephale Hunde wurden zwischen 2018 und 2020 in diese Studie aufgenommen und wurden an die Hals-Nasen-Ohren-Abteilung der Kleintierklinik der Universität Leipzig überwiesen, zur endoskopischen Untersuchung der oberen Atemwege und gegebenenfalls zur chirurgischen Korrektur der BOAS-assozierten Stenosen. Ausgeschlossen wurden Tiere, deren Naseneingang aufgrund von Krankheiten oder einer früheren Operation verändert war. Alle Hunde wurden nach einem standardisierten Anästhesieprotokoll anästhesiert, ein Computertomogramm des Kopfes erstellt und vor dem endoskopischen Eingriff wurde der Kopf mit einem 3D-Scanner gescannt. Die 3D-Scans und CT-Bilder wurden in zwei Softwareprogramme (Amira, Thermo Fisher und Facial Analysis Tool) zur objektiven Messung des Naseneingangs importiert. Zur genauen Charakterisierung wurden neue Landmarken am Naseneingang definiert und zur Berechnung von zwei neuen, abgeleiteten Parametern, der Nasenöffnungsfläche (NOA) und dem stenotischen Winkel (SA) verwendet. Der Intraobserver-Fehler und die Wirksamkeit der Ala-Vestibuloplastie wurden anhand der CT-Bilder und 3D-Scans mit demselben Verfahren geprüft und verglichen. Alle statistischen Analysen wurden später mit dem Pearson-Test oder dem Spearman-Test für die Korrelation, dem gepaarten t-Test oder dem t-Test durchgeführt. Der gepaarte t-Test wurde verwendet, um zu prüfen, ob der Mittelwertunterschied zwischen Paaren von Messungen gleich Null war. Handelte es sich nicht um dieselbe Gruppe von Tieren, wurde stattdessen der t-Test verwendet. Ergebnisse: Mit den neu definierten spezifischen Weichteil-Landmarken und den abgeleiteten Parametern NOA und SA konnte der Naseneingang aller brachyzephalen und nicht-brachyzephalen Hunde objektiv beschrieben werden. NOA und SA waren bei brachyzephalen Hunden signifikant kleiner als bei nicht-brachyzephalen Hunden. NOA korrelierte in beiden Gruppen signifikant mit dem Körpergewicht. Dagegen zeigte SA keine Korrelation mit dem Körpergewicht. Nach der chirurgischen AVP waren die Naseneingänge bei allen brachyzephalen Hunden größer als vor der Operation, mit einer Zunahme der NOA links um 295 % und rechts um 233 %. Die Intraobserver-Zuverlässigkeit wurde durch NOA-Messungen getestet und war hoch signifikant. Zum Methoden-Vergleich zwischen 3D-Scanner und CT wurde die Nasenöffnungsfläche jeweils am gemessen und zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den Methoden. Schlussfolgerungen: Morphometrische Messungen mit 3D-Oberflächenscans scheinen ein zuverlässiges und reproduzierbares Instrument zur präzisen, objektiven Bewertung des Naseneingangs des Hundes zu sein. Bei der Messung der abgeleiteten Flächen (NOA) und Winkel (SA) wurde bei allen brachyzephalen Hunden dieser Studie eine Naseneingangsstenose festgestellt. Nach der chirurgischen Korrektur der brachyzephalen Naseneingangsstenose, der AVP, waren die Nasenöffnungen deutlich vergrößert. Die Einschränkung der Nasenatmung durch die extreme Verkleinerung des Naseneingangs auf einen Bruchteil der Größe von nicht-brachyzephalen Hunden, betrachten wir als eindeutigen Beweis dafür, dass die Zucht von brachyzephalen Hunden eine Qualzucht ist.:1 INTRODUCTION - 1 - 1.1 General Introduction - 1 - 1.2 Objectives - 2 - 2 OVERVIEW OF THE LITERATURE - 3 - 2.1 Brachycephalic Obstructive Airway Syndrome (BOAS) - 3 - 2.1.1 General Introduction of BOAS - 3 - 2.1.2 How to Define Brachycephalic Dogs - 3 - 2.1.3 Commonly Affected Breeds - 4 - 2.2 The Canine Nasal Entrance - 4 - 2.2.1 Anatomy of the Canine Nasal Entrance and Stenosis - 4 - 2.2.2 Pathophysiology of Stenotic Nares in Brachycephalic Dogs - 5 - 2.3 Diagnosis of Stenotic Nares - 9 - 2.3.1 Visual Assessment - 9 - 2.3.2 Nostril Ratio - 11 - 2.3.3 Air Volume of the Nasal Entrance - 11 - 2.4 Development of Morphometry in Brachycephalic Dogs - 11 - 2.5 3D Scanners for 3D Model Reconstruction - 12 - 2.6 Landmarks - 14 - 2.6.1 Introduction of Landmarks - 14 - 2.6.2 Development of Landmarks in Human Medicine - 15 - 2.6.3 Development of Landmarks in Veterinary Medicine - 16 - 2.6.4 Cephalometric Analysis Software - 17 - 3 ANIMALS AND METHODS - 19 - 3.1 Animals - 19 - 3.2 Methods - 19 - 3.2.1 3D Scanning Process and Set-ups of Canine Nasal Entrance - 19 - 3.2.2 Cephalomorphometric Software - 20 - 3.2.3 Cephalometric Landmarks - 20 - 3.2.4 Advanced Morphometric Parameters for Nares - 22 - 3.2.5 Efficacy of Ala-Vestibuloplasty (AVP) - 24 - 3.2.6 Comparison between CT and the 3D Scanning Tool - 24 - 3.2.7 Intra-observer Reliability - 25 - 3.2.8 Statistics - 25 - 4 RESULTS - 26 - 4.1 Brachycephalic Dogs and Non-brachycephalic Dogs - 26 - 4.2 The Nasal Opening Area (NOA) - 28 - 4.3 Efficacy of Ala-Vestibulopasty - 30 - 4.4 Stenotic Angle (SA) - 31 - 4.5 Comparison between CT and the 3D Scanning Tool - 32 - 4.6 Intra-observer Reliability - 34 - 5 DISCUSSION - 36 - 5.1 The Nasal Entrance - 36 - 5.2 Method: the 3D Scanner - 37 - 5.3 Method: Comparison between CT and the 3D Scanner - 38 - 5.4 Method: Landmarks and Reproducibility, Intra-observer Reliability - 39 - 5.5 Nasal Opening Area (NOA) and Efficacy of Ala-Vestibuloplasty (AVP) - 42 - 5.6 Stenotic Angle (SA) - 44 - 5.7 Animal Welfare - 45 - 6 SUMMARY - 47 - 7 ZUSAMMENFASSUNG - 49 - 8 REFERENCES - 51 -

Einleitung: Mangan (Mn) ist ein essentielles Spurenelement, welches als integraler Bestandteil von Metalloenzymen oder als Kofaktor zahlreiche Stoffwechselprozesse katalysiert. Häufig wird der Versorgungsstatus von Pferden über eine Blutanalyse im Serum überprüft, obwohl wissenschaftlich belegte Referenzbereiche für Pferde bislang nicht etabliert wurden. Es liegen für Pferde kaum Untersuchungen vor, die Effekte einer Supplementierung bei definierter Mn-Aufnahme betrachtet haben. In der Literatur finden sich im Allgemeinen nur wenige Untersuchungen zu Mn bei Pferden. Ziel der Studie: Das Ziel dieser Untersuchung war die Etablierung von Mn-Referenzintervallen für adulte Warmblutpferde im Plasma, Serum und Vollblut sowie die Überprüfung von Effekten einer oralen Mn-Supplementierung mit unterschiedlichen Verbindungen (organisch vs. anorganisch) auf die Mn-Konzentrationen im Blut und in der Milch von Stuten und auf die Mn-Blutkonzentrationen von deren Saugfohlen. Tiere, Material und Methoden: Für die Referenzwerterhebung wurden von 270 gesunden, adulten Warmblutpferden im Alter von 3-25 Jahren einmalig Blutproben gewonnen, um im Lithium Heparin (LH)-Plasma, Serum und Vollblut die Mn-Konzentration mittels Atomabsorptionsspektrometrie (AAS) und Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-MS) zu analysieren. Zeitgleich entnommene Futterproben ermöglichten die Bestimmung des Mn-Gehaltes der korrespondierenden Fütterung. In eine 90-tägige, randomisierte, placebo-kontrollierte Supplementierungsphase wurden 33 laktierende Stuten und deren Saugfohlen einbezogen und in drei Fütterungsgruppen (Placebo n = 11, MnChelat n = 11, MnSulfat n = 11) eingeteilt. Zusätzlich zur Basisration (Heu ad libitum, Mischration: Mn-Aufnahme ca. 100 mg/kg Trockenmasse (TM)) erhielten die Stuten täglich 200 g eines Ergänzungsfutters entweder als Placebo oder mit 560 mg Mn als Mn-Sulfat oder Mn-Chelat zugesetzt. Blut- und Milchanalysen wurden mittels ICP-MS an 14-tägig gewonnenen Proben von Stuten und Fohlen durchgeführt. Die Daten wurden unter Verwendung der kommerziellen Software Statistica®, IBM SPSS Statistics 27 und XLSTAT statistisch ausgewertet. Die Referenzintervalle wurden nach den Empfehlungen des Clinical and Laboratory Standards Institute und der International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine berechnet, wonach sie den Bereich zwischen 2,5. und 97,5. Perzentil der analysierten Mn-Konzentrationen umfassen. Ein Methodenvergleich für die AAS und ICP-MS erfolgte mittels Passing-Bablok-Regression. Daten aus der Mn-Supplementierungsstudie wurden mittels des Shapiro-Wilks-Testes auf Normalverteilung überprüft. Die Daten waren nicht normalverteilt, sodass Tests für nicht-parametrische Daten angewendet wurden. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Die Darstellung der Daten erfolgt als Median und dem 25./75. Perzentil. Ergebnisse: Die Mn-Aufnahme (587 – 1702 mg/Tag) war bei allen Pferden deutlich höher als die Mn-Versorgungsempfehlung von 485-545 mg/Tag. Die Pferde zeigten bei der Referenzwerterhebung im Vollblut mit medianen Mn-Konzentrationen von 12,4 µg/l (Interquartilsbereich: 9,10-16,1 µg/l) signifikant höhere Mn-Werte (p < 0,0001) als im korrespondierenden Serum (Median: 1,65 µg/l; Interquartilsbereich: 1,39-1,95 µg/l) oder LH-Plasma (Median: 1,35 µg/l; Interquartilsbereich: 1,01-1,71 µg/l). Diese Ergebnisse ließen sich auch durch die Supplementierungsstudie bestätigen. Die Stuten wiesen im Vollblut (Median: 15,6 µg/l; Interquartilsbereich: 12,8 - 18,5 µg/l) zehnfach höhere Mn-Konzentrationen als im Serum (Median: 1,54 µg/l; Interquartilsbereich: 1,20 - 1,90 µg/l) auf. Auch die Fohlen wiesen 16,4-fach höhere Mn-Konzentrationen im Vollblut (Median: 21,3 µg/l; Interquartilsbereich: 16,7 - 28,1 µg/l) im Vergleich zum Serum (Median: 1,50 µg/l; Interquartilsbereich: 1,30 - 1,70 µg/l) auf. Die Mn-Vollblutspiegel der Fohlen entsprachen der 1,6-fachen Mn-Konzentration ihrer Mutterstuten und unterschieden sich signifikant (p < 0,01). Die Milch enthielt mediane Mn-Konzentrationen von 0,012 mg/kg. Die Mn-Supplementierung hatte keinen Effekt auf die Mn-Spiegel in der Milch oder im Blut von Stuten und deren Fohlen. Im Methodenvergleich ergaben sich für LH-Plasma und Serum zwischen der AAS und der ICP-MS statistisch signifikante Abweichungen in den Mn-Bestimmungen, wohingegen beide Verfahren für das Vollblut vergleichbare Ergebnisse lieferten. Schlussfolgerung: Vollblut zeigt durchschnittlich 10-fach höhere Mn-Konzentrationen als Serum oder LH-Plasma. Bei der Bewertung von Mn-Konzentrationen im Blut muss daher beachtet werden, welches Probenmaterial analysiert wurde und welche Methode angewandt wird, da es zwischen AAS und ICP-MS in Serum und Plasma zu relevanten Unterschieden kommen kann. Die Mn-Supplementierung beeinflusste die Mn-Konzentrationen im Blut nicht. Darüber hinaus waren die Mn-Spiegel im Vollblut der Fohlen im Vergleich zu den Stuten höher, obwohl die Mn-Konzentrationen unabhängig von der Supplementierung in der Stutenmilch niedrig waren. Aufgrund des geringen Mn-Gehaltes in der Milch ist eine frühzeitige Mn-Ergänzung, vorzugsweise über Raufutter notwendig, um die Mn-Versorgung der Fohlen sicherzustellen. Die kalkulierte Mn-Aufnahme der Pferde in dieser Studie zeigt, dass aufgrund der hohen Mn-Gehalte im Raufutter ein Mn-Mangel in der Praxis selten vorkommt.:Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Vorkommen und chemische Eigenschaften von Mangan 2 2.2 Manganstoffwechsel 3 2.2.1 Absorption und Verdaulichkeit 3 2.2.2 Transport im Blut 3 2.2.3 Retention und Speicherung 4 2.2.4 Exkretion 4 2.3 Funktionen von Mangan im Stoffwechsel 5 2.3.1 Modulation von oxidativem Stress 5 2.3.2 Kohlenhydratstoffwechsel 5 2.3.3 Fettstoffwechsel 6 2.3.4 Harnstoffsynthese 6 2.3.5 Fruchtbarkeit und Reproduktion 7 2.3.6 Knorpel- und Knochenstoffwechsel 7 2.4 Manganmangel 7 2.5 Toxizität von Mangan 8 2.6 Mangan in der Pferdefütterung 9 2.6.1 Manganbedarf von Pferden 9 2.6.2 Manganversorgung von Stute und Fohlen 10 2.6.3 Mangangehalte in pferdetypischen Futtermitteln 10 2.6.3.1 Native Mangangehalte in Futtermitteln 10 2.6.3.2 Rechtliche Grundlagen zur Manganergänzung 11 2.6.3.3 Manganverbindungen zur Ergänzung 12 2.7 Diagnostik der Manganversorgung 12 2.7.1 Referenzintervalle 12 2.7.2 Blut 13 2.7.2.1 Plasma und Serum 13 2.7.2.2 Vollblut 13 2.7.3 Haar 14 2.7.4 Leber und andere Gewebe 14 2.7.5 Mangan-abhängige Superoxid-Dismutase 15 3 Publikationen 16 3.1 Mangankonzentrationen im Vollblut, Plasma und Serum adulter Warmblutpferde an drei Standorten in Deutschland 16 3.2 Effekte einer oralen Mangan-Supplementierung mit unterschiedlichen Verbindungen auf die Mangan-Vollblut- und Serumkonzentrationen von Stuten und Saugfohlen 32 4 Diskussion 45 4.1 Manganreferenzintervalle im Blut und Supplementierungseffekte 45 4.2 Diagnostik in der Praxis 48 4.3 Schlussfolgerungen 49 5 Zusammenfassung 50 6 Summary 52 7 Literaturverzeichnis 54 8 Anhang 65 8.1 Liste der Kongressbeiträge im Rahmen dieser Arbeit 65 8.2 Sonstige Kongressbeitrage 65 9 Danksagung 66 / Introduction: Manganese (Mn) is an essential trace element that catalyzes numerous metabolic processes as an integral component of metalloenzymes or as a cofactor. The supply status of horses is often monitored by means of blood serum analysis, although scientifically proven reference ranges for horses have not yet been established. There are only limited studies available for horses that have examined the effects of supplementation with a defined Mn intake. In general, there are only few studies on Mn in horses in the literature. Aim of the study: The aim of this study was to establish Mn reference intervals for adult warm-blooded horses in plasma, serum and whole blood and to investigate the effects of oral Mn supplementation with different compounds (organic vs. inorganic) on the Mn concentrations in the blood and milk of mares and the Mn concentrations in the blood of their suckling foals. Animals, material and methods: For the reference value survey, blood samples were taken once from 270 healthy, adult warm-blooded horses aged 3-25 years in order to determine the Mn concentration in lithium heparin (LH) plasma, serum and whole blood by means of atomic absorption spectrometry (AAS) and inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS). Accompanying feed samples were taken to confirm the Mn content of the corresponding feed. In a 90-day, randomized, placebo-controlled supplementation phase, 33 lactating mares and their suckling foals were included and divided into three feeding groups (placebo n = 11, MnChelat n = 11, MnSulfat n = 11). In addition to the routine ration (hay ad libitum, mixed ration: Mn intake approx. 100 mg / kg dry matter), the mares received 200 g of a supplementary feed daily either as a placebo or with 560 mg of Mn added as Mn sulfate or Mn chelate. Blood and milk analysis were performed using ICP-MS on samples taken from mares and foals biweekly. All data were statistically assessed with commercial software packages (Statistica®, IBM SPSS Statistics 27, XLSTAT). The reference intervals were calculated according to the recommendations of the Clinical and Laboratory Standards Institute and the International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, according to which they range between 2.5. and 97.5. percentile of the analyzed Mn concentrations. A comparison of methods for AAS and ICP-MS was carried out using Passing-Bablok regression. Data from the Mn supplementation study were checked for normal distribution using the Shapiro-Wilks test. As the data were not normally distributed, tests for non-parametric data were subsequently used for analyses. Level of significance was set at p < 0.05. Data are presented as median and 25. /75. percentile. Results: In all horses Mn intake (587-1702 mg/day) was significantly higher than the current recommendations for Mn supply (485-545 mg/day). Analyses verified significantly (p < 0.0001) higher Mn whole-blood concentrations in horses (median 12.4 µg/L; interquartile range: 9.10-16.1 µg/L) than in the corresponding serum (median: 1.65 µg/L; interquartile range: 1.39-1.95 µg/L) or LH plasma (median: 1.35 µg/L; interquartile range: 1.01-1.71 µg/L). These results could also be confirmed by the supplementation study. The mares showed 10-fold Mn concentrations in whole blood (median: 15.6 µg/L; interquartile range: 12.8-18.5 µg/L) compared to the serum (median: 1.54 µg/L; interquartile range: 1, 20-1.90 µg/L). The foals also had Mn whole blood concentrations 16.4 times higher (median: 21.3 µg/L; interquartile range: 16.7-28.1 µg/L) compared to the serum Mn concentrations (median: 1.50 µg/L; interquartile range: 1.30-1.70 µg/L). Additionally, Mn whole blood levels of the foals corresponded to 1.6 times the Mn concentration of their dams and thus differed significantly (p < 0.01). The milk contained median Mn concentrations of 0.012 mg/kg. Mn supplementation had no effect on Mn levels in milk or blood of mares and their foals. A comparison of methods showed statistically significant deviations in the Mn determinations for LH plasma and serum between the AAS and the ICP-MS, whereas they provided comparable results for whole blood. Conclusion: Whole blood shows an average of 10 times higher Mn concentrations than serum or LH plasma. When evaluating Mn concentrations, it must therefore be taken into consideration which sample material is analyzed and which method is used, as relevant differences were found between AAS and ICP-MS in serum and plasma. Blood Mn concentrations were not affected by the Mn supplementation. However, the Mn levels differed significantly between serum and whole blood. In addition, the Mn concentrations in whole blood of suckling foals were higher compared to their dams, although the Mn concentrations in the mare's milk were low regardless of the supplementation. Due to low Mn content in milk, early Mn supplementation, preferably by forages, is necessary to ensure that foals are supplied with Mn according to their requirement. The calculated Mn intake of the horses in this study shows that due to the high Mn content in roughage, Mn deficiency rarely occurs in practice.:Inhaltsverzeichnis Seite 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Vorkommen und chemische Eigenschaften von Mangan 2 2.2 Manganstoffwechsel 3 2.2.1 Absorption und Verdaulichkeit 3 2.2.2 Transport im Blut 3 2.2.3 Retention und Speicherung 4 2.2.4 Exkretion 4 2.3 Funktionen von Mangan im Stoffwechsel 5 2.3.1 Modulation von oxidativem Stress 5 2.3.2 Kohlenhydratstoffwechsel 5 2.3.3 Fettstoffwechsel 6 2.3.4 Harnstoffsynthese 6 2.3.5 Fruchtbarkeit und Reproduktion 7 2.3.6 Knorpel- und Knochenstoffwechsel 7 2.4 Manganmangel 7 2.5 Toxizität von Mangan 8 2.6 Mangan in der Pferdefütterung 9 2.6.1 Manganbedarf von Pferden 9 2.6.2 Manganversorgung von Stute und Fohlen 10 2.6.3 Mangangehalte in pferdetypischen Futtermitteln 10 2.6.3.1 Native Mangangehalte in Futtermitteln 10 2.6.3.2 Rechtliche Grundlagen zur Manganergänzung 11 2.6.3.3 Manganverbindungen zur Ergänzung 12 2.7 Diagnostik der Manganversorgung 12 2.7.1 Referenzintervalle 12 2.7.2 Blut 13 2.7.2.1 Plasma und Serum 13 2.7.2.2 Vollblut 13 2.7.3 Haar 14 2.7.4 Leber und andere Gewebe 14 2.7.5 Mangan-abhängige Superoxid-Dismutase 15 3 Publikationen 16 3.1 Mangankonzentrationen im Vollblut, Plasma und Serum adulter Warmblutpferde an drei Standorten in Deutschland 16 3.2 Effekte einer oralen Mangan-Supplementierung mit unterschiedlichen Verbindungen auf die Mangan-Vollblut- und Serumkonzentrationen von Stuten und Saugfohlen 32 4 Diskussion 45 4.1 Manganreferenzintervalle im Blut und Supplementierungseffekte 45 4.2 Diagnostik in der Praxis 48 4.3 Schlussfolgerungen 49 5 Zusammenfassung 50 6 Summary 52 7 Literaturverzeichnis 54 8 Anhang 65 8.1 Liste der Kongressbeiträge im Rahmen dieser Arbeit 65 8.2 Sonstige Kongressbeitrage 65 9 Danksagung 66

Zusammenfassung Yauhen Karliuk Einfluss der 3' nichttranslatierten Region von Chikungunya-Virus auf die Replikation in verschiedenen Stechmückenarten Institut für Tierhygiene und Öffentliches Veterinärwesen der Veterinärmedizinischen Fakultät, Universität Leipzig Eingereicht im Februar 2022 52 Seiten, 7 Abbildungen, 116 Literaturangaben, 1 Publikation Schlüsselwörter: Chikungunya-Virus; 3′ UTR; direct repeats (DRs); CHIKV 3́ UTR-Deletionsmutante; Vektorkompetenz; Aedes vexans; Culex pipiens Einleitung: Arthropoden-übertragene Viren (Arboviren) spielen weltweit eine große Rolle für die Gesundheit von Menschen und Tieren. Das Chikungunya-Virus (CHIKV) wird v.a. durch Stechmücken der Gattung Aedes übertragen. Die Hauptvektoren sind Aedes aegypti (Ae. aegypti) und Aedes albopictus (Ae. albopictus), wobei letzterer sich zunehmend auch in gemäßigten Breiten etabliert. Ziele der Untersuchungen: Zum einen sollte untersucht werden, ob auch die Stechmückenarten Aedes vexans (Ae. vexans) und Culex pipiens molestus (Cx. pipiens), die in gemäßigten Klimazonen vorkommen, als CHIKV-Vektoren fungieren können. Zum anderen sollte der Einfluss von Deletionen der Sequenzwiederholungen (DR) in der 3‘ nichttranslatierten Region (3‘ UTR) auf die virale Replikation in Zellkultur und in Stechmücken untersucht werden. Tiere, Material und Methoden: Zunächst wurde eine CHIKV 3́ UTR-Deletionsmutante mit einer Deletion von DR1a und DR2a in der 3́ UTR (CHIKV-ΔDR) hergestellt und diese bezüglich der Wachstumskinetik mit Chikungunya-Wildtyp-Virus (CHIKV-WT) in C6/36- und Aag2-Stechmückenzellen sowie in BHK-21/J- Wirbeltier-Zellen verglichen. Um die Vektorkompetenz von beiden Viren in Stechmücken zu untersuchen, wurden Ae. aegypti, Ae. albopictus, Ae. vexans und Cx. pipiens in einem Insektarium gezüchtet. Bei den Infektionsexperimenten im S3-Labor wurden insgesamt 27 Ae. aegypti, 20 Ae. albopictus, 78 Ae. vexans und 62 Cx. pipiens Stechmücken verwendet. In diesen Experimenten wurden diese mit CHIKV-ΔDR und CHIKV-WT sowohl oral mit je 1x 10^6 PFU/ml über eine Fütterungsmembran als auch intrathorakal mit je 200 PFU (zur Umgehung der Mitteldarmbarriere) infiziert und an verschiedenen Tagen nach der Infektion und in verschiedenen Körperteilen sowie im Speichel auf virale RNA mittels Real-Time Reverser Transkription-Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) untersucht. Unterschiede in der Virusreplikation wurden entweder mit Mann-Whitney- oder Fisher’s Exakt-Test überprüft. Das Signifikanzniveau lag bei p < 0,05. Ergebnisse: Beide Viren, das CHIKV-WT und das CHIKV-ΔDR, zeigten ein vergleichbares Wachstum in Wirbeltier-Zellen (BHK-21/J) und erreichten einen Titer von 5x 10^8 PFU/ml. Das Wachstum beider Viren war auch in von Ae. albopictus abgeleiteten C6/36- Stechmückenzellen effizient, wobei CHIKV-WT ein um knapp eine Log-Stufe höheres Wachstum zeigte als CHIKV-ΔDR. In unseren Experimenten zeigte CHIKV-WT ein weniger effizientes Wachstum in von Ae. aegypti abgeleiteten Aag2-Stechmückenzellen, als in Ae. albopictus abgeleiteten C6/36-Stechmückenzellen, obwohl Ae. aegypti als Hauptvektor für CHIKV-WT gilt. In einer intrathorakalen und oralen Infektion konnten sowohl die bekannten CHIKV-Vektoren Ae. aegypti und Ae. albopictus als auch die einheimische Stechmückenarten Ae. vexans und Cx. pipiens erfolgreich infiziert werden. Bei einer intrathorakalen Infektion mit Umgehung der Mitteldarmbarriere wurde bei Ae. vexans oder Cx. pipiens eine effizientere Virusreplikation beobachtet als bei einer oralen Infektion. CHIKV-WT zeigte eine signifikant höhere Replikation in Ae. vexans im Vergleich zu CHIKV-ΔDR am Tag 7 und am Tag 14 nach der Infektion. Bei Cx. pipiens wurden signifikante Unterschiede für CHIKV-WT im Vergleich zu CHIKV-ΔDR nur am Tag 7 beobachtet. Schlussfolgerungen: Das beeinträchtigte Wachstum in C6/36- und Aag2-Zellen von CHIKV-ΔDR deutet darauf hin, dass die deletierten Sequenzwiederholungen spezifisch mit noch unbekannten Faktoren in Stechmückenzellen interagieren. Dennoch konnte CHIKV-ΔDR die bekannten CHIKV-Vektoren Ae. aegypti und Ae. albopictus problemlos nach intrathorakaler und oraler Infektion infizieren. Die Mitteldarm-Entweichungsbarriere scheint also nicht der einzige Faktor zu sein, der die Vektorkompetenz von Stechmücken beeinflusst. Auch die Replikationskinetik des Virus in den Sekundärgeweben scheint bei den verschiedenen Stechmückenarten unterschiedlich zu sein. Zwar umfassten unsere Studien zur oralen Infektion mit CHIKV nur einige einheimische Ae. vexans und Cx. pipiens Stechmücken, jedoch deuten die Ergebnisse darauf hin, dass diese Stechmücken potenziell als Vektoren für CHIKV dienen können.:Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Alphaviren 2 2.1.1 Klassifikation 2 2.1.2 Virusmorphologie und Genomaufbau 2 2.1.3 Virusreplikation 4 2.2 Chikungunya-Virus 5 2.2.1 Übertragungszyklus 5 2.2.2 Epidemiologie 7 2.2.3 Genotypen und die 3′ UTR Region 9 2.2.4 Chikungunya-Fieber 12 2.3 Stechmücken 13 2.3.1 Taxonomie und Stechmückenarten in Deutschland 13 2.3.2 Allgemeine Morphologie, Biologie und Ökologie 14 2.3.2.1 Eiablage und Schlüpfen der Larven 15 2.3.2.2 Aquatische Entwicklungsstadien 16 2.3.2.3 Adulte 17 2.3.2.4 Flugverhalten und Überwinterungsstrategien 19 2.3.3 Arboviren in Deutschland 20 3 Publikation 26 3.1 Stellungnahme zum Eigenanteil an den Arbeiten zur Publikation 26 3.2 Publikation 27 4 Diskussion 42 5 Zusammenfassung 49 6 Summary 51 7 Literaturverzeichnis 53 8 Danksagung 66

Einleitung: Die Osteoarthritis ist für einen Großteil der Lahmheiten beim Pferd verantwortlich. Durch die starken Belastungen der equinen Gelenke schreitet die Osteoarthritis unweigerlich fort und setzt diese Tiere einem hohen Leidensdruck aus. Bisherige Therapien reichen nicht aus, um in osteoarthritischen Gelenken die physiologische Integrität des Knorpels wiederherzustellen. Humane und caprine nasale Knorpelzellen zeigten in präklinischen und klinischen Studien ein hohes Regenerationspotential und eine hohe Integrität nach autologer Implantation in Defekte des Gelenkknorpels. Dies wurde auf ihr „Hox-Gen-negatives“ Expressionsprofil zurückgeführt, das sich nach der Implantation dem des artikulären Knorpels anpasste. Ziel der Studie: Das Hox-Genexpressionsprofil nasaler Chondrozyten sollte mit denen artikulärer Chondrozyten in der Zellkultur verglichen werden, um den nasalen Knorpel auch beim Pferd als mögliche autologe Knorpelquelle zu identifizieren. Tiere, Material und Methoden: Knorpelgewebe wurde von 7 verstorbenen Pferden aus dem Nasenseptum und einem vorderen sowie hinterem Fesselgelenk entnommen, Chondrozyten isoliert und bis zur vierten Passage zweidimensional kultiviert. Während der Kultivierung wurden die Chondrozyten alle 3 bis 4 Tage mittelseines eigens erstellten Beurteilungsbogens evaluiert. Zellen aus der ersten (T1) und der dritten (T2) Subkultivierung wurden lysiert, die RNA extrahiert und in cDNA umgeschrieben. Es folgte eine qPCR, um die Expressionslevel von drei Hox-Genen (A3, D1, D8) und zwei knorpeltypischen Genen (SOX9, Kollagen II) an den drei verschiedenen Lokalisationen während T1 und T2 zu bestimmen. Die Quantifizierung der relativen Genexpression erfolgte anschließend mit der ΔΔCT-Methode unter Verwendung von RPL32 und GAPDH als Housekeeping-Gene. Zur statistischen Auswertung wurden die Multiple Lineare Regression, eine einfaktorielle Varianzanalyse (ANOVA) und ein zweiseitiger t-Test herangezogen. Die Signifikanzniveaus aller statistischen Tests wurden auf α= 0,05 festgesetzt. Ergebnisse: Die Hox-Genexpressionen unterschieden sich in Bezug auf die drei Lokalisation und die Messzeitpunkte nicht signifikant voneinander. Die nasalen Chondrozyten wiesen während der ersten Subkultivierung gegenüber den artikulären Chondrozyten signifikant höhere Kollagen-II-Expressionen auf. Eine „Hox-Gen-negative“ Expression konnte für die Tierart Pferd nicht bestätigt werden. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Pferde wahrscheinlich ein speziesspezifisches Hox- Gen-Expressionsmuster aufweisen und dass die equinen Hox-Genexpressionsprofile statistisch signifikanten individuellen Einflüssen unterliegen. Schlussfolgerung: Das equine Hox-Genexpressionsprofil unterliegt statistisch signifikanten individuellen Einflüssen, die bei einer potenziellen Zelltherapie zu beachten sind. Nasale Chondrozyten eignen sich beim Pferd aufgrund ihrer genetischen Ähnlichkeit, bezogen auf die Expressionen der untersuchten Hox-Gene, zu artikulären Chondrozyten und ihrer hohen Bereitschaft zur Kollagen-II-Bildung wahrscheinlich als potenzielle Quelle für die autologe chondrozytäre Implantation (ACI).:1. Einleitung ...................................................................................................... 1 2. Literaturübersicht .......................................................................................... 2 2.1 Knorpel ..................................................................................................... 2 2.1.1 Allgemeiner Überblick ....................................................................... 2 2.1.2 Chondrogenese und Regeneration .................................................. 3 2.1.3 Intraartikulärer Hyaliner Knorpel ....................................................... 3 2.1.4 Extraartikulärer Hyaliner Knorpel....................................................... 6 2.2 Osteoarthritis bei Mensch und Pferd ........................................................ 8 2.2.1 Bedeutung und Ätiologie ................................................................... 8 2.2.2 Pathogenese ..................................................................................... 9 2.2.3 Diagnostik ........................................................................................ 10 2.2.4 Bisherige Therapieansätze .............................................................. 12 2.3 Knorpelgewebe in der Forschung .............................................................13 2.3.1 Kultivierung von Chondrozyten ......................................................... 13 2.3.2 Tiermodelle in der Osteoarthritisforschung ....................................... 15 2.3.3 Neue Therapieansätze ..................................................................... 17 2.3.3.1 Stammzellbasierte Verfahren ...................................................... 17 2.3.3.2 Artikuläre autologe Chondrozyten .............................................. 19 2.3.3.3 Nasale Chondrozyten ................................................................. 21 2.4 Hox-Gene ................................................................................................ 22 2.4.1 Allgemeiner Überblick ..................................................................... ..22 2.4.2 Regulation der Hox-Gene ................................................................. 23 2.4.3 Erkrankungen im Zusammenhang mit Hox-Genen ........................... 25 3. Ziel der Studie ........................................................................................... 27 4. Publikation ................................................................................................ 28 5. Diskussion................................................................................................. 45 5.1 Primer ....................................................................................................46 5.2 Auswahl der Messzeitpunkte und Proben ............................................. 47 5.3 Hox-Genprofile kultivierter equiner Chondrozyten ................................ 49 5.4 Individuelle Hox-Genprofile ................................................................... 50 5.5 SOX9 und Kollagen II .............................................................................51 5.6 Hox-Genprofile im Vergleich verschiedener Spezies ............................. 53 5.7 Ausblick ................................................................................................ 53 6. Schlussfolgerung ...................................................................................... 55 7. Zusammenfassung ................................................................................... 56 8. Summary .................................................................................................. 58 9. Referenzen .............................................................................................. 60 9.1 Literaturverzeichnis .............................................................................. 60 9.2 Abbildungsverzeichnis.......................................................................... 71 10. Anhang .................................................................................................. 72 10.1 Evaluierungsbogen Chondrozytenkulturen ........................................ 72 10.2 Auszug aus der Korrelationsmatrix ..................................................... 73 10.3 Publikationsverzeichnis Christiane Storch .......................................... 74 11. Danksagung .......................................................................................... 75 / Introduction: Osteoarthritis is responsible for most of the lameness in horses. Due to severe stress on equine joints, osteoarthritis inevitably progresses and results in a high degree of suffering. Current therapeutic options are not sufficient to restore the physiological integrity of the cartilage in osteoarthritic joints. Human and caprine nasal chondrocytes demonstrated high regenerative potential and integrity after autologous implantation into articular cartilage defects in preclinical and clinical studies. This was attributed to their “Hox gene negative” expression profile, matching the profile of articular cartilage after implantation. Aim of the study: The Hox gene expression profile of nasal chondrocytes was compared with those of articular chondrocytes in a cell culture to address nasal cartilage as a possible autologous source also in horses. Animals, Material and Methods: Cartilage was harvested from the nasal septum, one anterior and one posterior fetlock joint of deceased 7 horses, chondrocytes were isolated and cultured two-dimensionally until the fourth passage. During cultivation, chondrocytes were evaluated every 3 to 4 days using a specially designed assessment sheet. Cells were harvested during the first (T1) and third (T2) subcultivation. RNA was extracted and transcribed into cDNA. Subsequently, qPCR was performed to determine the expression levels of three Hox genes (A3, D1, D8) and two tissue-identifying genes (SOX9, collagen II) of the three locations after T1 and T2. Quantification of relative gene expression was performed with the ΔΔCT method using RPL32 and GAPDH as housekeeping genes. Multiple linear regression, one-way analysis of variance (ANOVA), and two-tailed t-test were used for statistical analysis. The significance levels of all statistical tests were set at α= 0.05. Results: Hox gene expressions were not significantly different in terms of localization and measurement time points. Nasal chondrocytes exhibited significantly higher collagen II expression than articular chondrocytes during the first subcultivation. 'Hox gene negative' expression could not be confirmed in horses. This study demonstrates that equine Hox gene expression pattern is likely species-specific and that equine Hox gene expression profiles are subject to statistically significant individual influences. Conclusion: The equine Hox gene expression profile is subject to statistically significant individual influences that should be considered in potential cell therapy. Nasal chondrocytes are probably suitable as a potential source for autologous chondrocyte implantation (ACI) in horses due to their genetic similarity, in terms of the expressions of the examined Hox genes, to articular chondrocytes and their high propensity for collagen II formation.:1. Einleitung ...................................................................................................... 1 2. Literaturübersicht .......................................................................................... 2 2.1 Knorpel ..................................................................................................... 2 2.1.1 Allgemeiner Überblick ....................................................................... 2 2.1.2 Chondrogenese und Regeneration .................................................. 3 2.1.3 Intraartikulärer Hyaliner Knorpel ....................................................... 3 2.1.4 Extraartikulärer Hyaliner Knorpel....................................................... 6 2.2 Osteoarthritis bei Mensch und Pferd ........................................................ 8 2.2.1 Bedeutung und Ätiologie ................................................................... 8 2.2.2 Pathogenese ..................................................................................... 9 2.2.3 Diagnostik ........................................................................................ 10 2.2.4 Bisherige Therapieansätze .............................................................. 12 2.3 Knorpelgewebe in der Forschung .............................................................13 2.3.1 Kultivierung von Chondrozyten ......................................................... 13 2.3.2 Tiermodelle in der Osteoarthritisforschung ....................................... 15 2.3.3 Neue Therapieansätze ..................................................................... 17 2.3.3.1 Stammzellbasierte Verfahren ...................................................... 17 2.3.3.2 Artikuläre autologe Chondrozyten .............................................. 19 2.3.3.3 Nasale Chondrozyten ................................................................. 21 2.4 Hox-Gene ................................................................................................ 22 2.4.1 Allgemeiner Überblick ..................................................................... ..22 2.4.2 Regulation der Hox-Gene ................................................................. 23 2.4.3 Erkrankungen im Zusammenhang mit Hox-Genen ........................... 25 3. Ziel der Studie ........................................................................................... 27 4. Publikation ................................................................................................ 28 5. Diskussion................................................................................................. 45 5.1 Primer ....................................................................................................46 5.2 Auswahl der Messzeitpunkte und Proben ............................................. 47 5.3 Hox-Genprofile kultivierter equiner Chondrozyten ................................ 49 5.4 Individuelle Hox-Genprofile ................................................................... 50 5.5 SOX9 und Kollagen II .............................................................................51 5.6 Hox-Genprofile im Vergleich verschiedener Spezies ............................. 53 5.7 Ausblick ................................................................................................ 53 6. Schlussfolgerung ...................................................................................... 55 7. Zusammenfassung ................................................................................... 56 8. Summary .................................................................................................. 58 9. Referenzen .............................................................................................. 60 9.1 Literaturverzeichnis .............................................................................. 60 9.2 Abbildungsverzeichnis.......................................................................... 71 10. Anhang .................................................................................................. 72 10.1 Evaluierungsbogen Chondrozytenkulturen ........................................ 72 10.2 Auszug aus der Korrelationsmatrix ..................................................... 73 10.3 Publikationsverzeichnis Christiane Storch .......................................... 74 11. Danksagung .......................................................................................... 75