Doctor en Ciencias con Mención Biología Molecular, Celular y Neurociencias / Los linfocitos B (LB) son las únicas células del sistema inmune capaces de producir anticuerpos. La activación de LB comienza con el reconocimiento de un antígeno específico en la superficie de una célula presentadora, promoviendo la formación de una región especializada en la membrana plasmática conocida como sinapsis inmunológica. Esta estructura permite la extracción, procesamiento y presentación de antígenos a linfocitos T, etapas necesarias para la activación del LB. Durante la extracción la célula adquiere un fenotipo polarizado. El centrosoma, o centro organizador de microtúbulos, se reposiciona hacia la sinapsis inmunológica y actúa como guía para el reclutamiento y posterior fusión de lisosomas a la membrana sináptica, liberando proteasas e hidrolasas que facilitan la extracción del antígeno. La secreción del contenido lisosomal es un proceso esencial para la extracción antigénica, sin embargo, aún se desconocen los mecanismos involucrados en el reclutamiento y fusión de lisosomas. Para indagar en las proteínas involucradas en el mecanismo de regulación de la fusión de lisosomas a la membrana sináptica se utilizó un estudio de proteómica asociado a la sinapsis inmunológica. Tomando en consideración que el centrosoma se polariza y recluta muy cercanamente hacia la sinapsis inmune en LB, se aislaron centrosomas de células activadas y no activadas para detectar cambios en la composición de la sinapsis. Usando esta aproximación se observó un aumento en las células activadas de 4 proteínas del complejo Exocisto. El Exocisto es un complejo proteico encargado del anclaje de vesículas secretorias a la membrana plasmática. Está involucrado en múltiples procesos de secreción polarizada, aunque su rol en LB X se desconoce. En este trabajo se muestra que Exo70, una proteína del complejo Exocisto, se encuentra asociada al centrosoma y se recluta a la sinapsis inmune. La localización y el reclutamiento a la sinapsis de Exo70 se encuentran regulados por la dinámica de microtúbulos y por la proteína de polaridad Par3. Más aun, el silenciamiento de Exo70 inhibe la fusión de los lisosomas a la membrana sináptica, disminuyendo la capacidad de extraer antígeno y presentarlos a linfocitos T. De esta forma, Exo70 surge como un regulador de la extracción de antígenos mediada por la secreción de lisosomas, esencial para el procesamiento y presentación de antígenos. / B lymphocytes are the only cells of the immune system able to produce antibodies. B cells activation starts with a specific antigen recognition presented on the surface of an antigen presenting cell, promoting the formation of a specialized membrane region known as the immune synapse. This structure allows the extraction, processing and presentation of antigens to T lymphocytes, necessary stages for the LB activation. During antigen extraction, B cells adopt a polarized phenotype. The centrosome, or microtubule-organizing center, is repositioned towards the immune synapse and guides the recruitment and posterior fusion of lysosomes to the immune synapse, releasing proteases and hydrolases that facilitate the antigen extraction. The secretion of lysosomal content at the synaptic membrane is an essential process for antigen extraction; however, the mechanisms involved in the recruitment and fusion of the lysosomes remain unknown. To inquire on the proteins involved in the regulation mechanism of lysosome fusion at the synaptic membrane we used a proteomic study associated to the immune synapse. Considering that the centrosome polarizes and is recruited closely to the synaptic membrane, centrosomes from activated and resting cells were isolated to detect protein changes associated to the immune synapse. Using this approach, we observed an increase in 4 proteins belonging to the exocyst complex in the centrosome obtained from activated B cells. The Exocyst is a protein complex involved in the tethering of secretory vesicles to the plasma membrane. It has been associated in multiple processes of polarized secretion, however, its role on the B cells is unknown. In this work we show that Exo70, an exocyst complex subunit, is XII concentrated in the centrosome and is recruited to the immune synapse. Exo70 localization and recruitment depends on the microtubule dynamics and the polarity protein Par3. Moreover, Exo70 silencing inhibits lysosome fusion to the synaptic membrane, impairing efficient antigen extraction and presentation to T lymphocytes. Thus, Exo70 emerges as a regulator of the lysosome-dependent antigen extraction, essential for the processing and presentation of antigens. / Beca de doctorado nacional 2013 CONICYT. - Proyectos FONDECYT 1141182 y 1180900. - Ayuda para estadías cortas de investigación, convocatoria 2015-2016. Vicerrectoría de asuntos académicos, Universidad de Chile. - Proyecto ECOS-CONICYT 111329, convocatoria 2014.

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:22:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lidia Yileng Tay Chu Jon.pdf: 1011394 bytes, checksum: 9cfa95ca6ba9d9c4b6cb8db597101aa8 (MD5) Previous issue date: 2010-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the effect of water storage time and of a heat treatment on the cytotoxicity of soft lining denture material using the 3H-thymidine incorporation test. Sample disks (10 mm X 1 mm) of soft lining denture Dentusoft, Dentuflex, Trusoft, Ufi Gel P and of denture base acrylic resin Lucitone 550 were fabricated under aseptic conditions. Twelve specimens of each material were prepared and divided into four groups: GN: The specimens received no treatment or storage in water, G24: The specimens were stored in distilled water at 37°C for 24 hours; G48: The specimens were stored in distilled water at 37°C for 48 hours, GHW: The specimens were immersed in water at 55 °C for 10 minutes. To analyze the cytotoxic effect, three samples of each experimental group were placed in test tubes with 9 ml of DMEM's medium supplemented and incubated at 37 °C for 24 hours. During this incubation period, the toxic substances were broadcast to the culture medium, forming the extracts that were used for the cytotoxicity test. The cytotoxicity of each material was analyzed quantitatively by the incorporation of radioactivity 3H - thymidine by checking the number of viable cells for the synthesis of DNA. The results of DNA synthesis were subjected to analysis of variance in a factorial two-way (material and storage time in water). Comparing the averages of cell viability with the classification of cytotoxic established by ISO 10993-5, it was found that Ufi Gel P had non-cytotoxic effect, Trusoft had slightly cytotoxic effect, Dentuflex had a moderated cytotoxic effect, all in any experimental condition. It was also observed that the Dentusoft alternated between slightly cytotoxic and non-cytotoxic effect because their average viability ranged around 75% and Lucitone 550 had non-cytotoxic effect when stored in water for 48 hours, but the others had around 50% cell viability, the slightly moderated cytotoxic effect. It is concluded that the soft lining denture based in acrylic resin had a slightly and moderated cytotoxic effect, Ufi Gel P, the silicone based soft liner, was not cytotoxic; the effect of water storage after 24 hours or 48 hours and the heat treatment did not reduce the cytotoxicity effect of soft lining denture materials. / O objetivo deste estudo foi avaliar, por meio do teste quantitativo de incorporação de 3H-timidina, a citotoxicidade de materiais reembasadores resilientes em função do tempo de armazenamento em água e em função de um tratamento térmico. Doze corpos-de-prova de cada material reembasador resiliente (Dentusoft, Dentuflex, Trusoft e Ufi Gel P) e da resina termopolimerizável (Lucitone 550) foram confeccionados de forma asséptica em forma de discos e divididos em 4 grupos: GN: os corpos-de-prova não receberam nenhum tipo de tratamento ou armazenamento; G24: os corpos-de-prova foram armazenados em água destilada à 37ºC por 24 horas; G48: os corpos-de-prova foram armazenados em água destilada à 37ºC por 48 horas; GAQ: os corpos-de-prova foram imersos em água a 55°C por 10 minutos. Para a análise do efeito citotóxico, três corpos-de-prova de cada grupo experimental foram colocados dentro de tubos de ensaio com 9 mL de meio de cultura DMEM suplementado e incubados a 37ºC por 24 horas. Durante esse período, as substâncias tóxicas foram difundidas para o meio de cultura, formando os extratos que foram utilizados no teste de citotoxicidade. Esta foi analisada quantitativamente por meio da incorporação do radioisótopo 3H-timidina, verificando o número de células viáveis pela síntese de DNA. Os resultados foram submetidos à análise de variância em esquema fatorial de dois fatores incluindo ainda um grupo controle, ao nível de 5% de significância. Confrontando-se as médias obtidas de viabilidade celular com a classificação do efeito citotóxico estabelecida pela ISO 10993-5, verificou-se que o Ufi Gel P foi considerado não-citotóxico, o Trusoft levemente citotóxico e o Dentuflex discretamente citotóxico, em qualquer condição experimental. Observou-se também que o Dentusoft alternou entre levemente citotóxico e não-citotóxico porque suas médias de viabilidade variaram em torno de 75% e o Lucitone 550 apresentou efeito não-citotóxico quando armazenado em água por 48 horas, mas as outras médias ficaram em torno de 50% de viabilidade celular, entre levemente-citotóxico e discretamente citotóxico. Concluiu-se que os reembasadores resilientes a base de resina acrílica (Trusoft e Dentuflex) foram classificados como levemente citotóxico e discretamente citotóxico, respectivamente. O condicionador de tecido (Dentusoft) alternou entre levemente citotóxico e não citotóxico e o reembasador resiliente a base de silicone (Ufi Gel P) não teve efeito citotóxico. O armazenamento em água ou o tratamento térmico não diminuiu a citotoxicidade dos reembasadores resilientes e o armazenamento em água reduziu a citotoxicidade da resina acrílica para base de prótese (Lucitone 550).

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / El desarrollo de una respuesta inmune anti-tumoral requiere de la comunicación entre diferentes células del sistema inmune, así como del reconocimiento de la célula tumoral. Una vez que los Linfocitos T Citotóxicos (CTL) y las células Natural Killers (NK) reconocen la célula tumoral, forman la Sinapsis Inmunológica Citotóxica (SIC), una estructura supramolecular altamente especializada que resulta fundamental para la liberación localizada de los gránulos citotóxicos y la eliminación específica de la célula tumoral. Recientemente, se ha descrito la participación de canales Gap Junction (GJ) formados por la isoforma Cx43 (GJ-Cx43) en la actividad citotóxica de las células NK durante la SIC. A pesar de las similitudes funcionales y estructurales presentadas por la SIC mediada por las células NK y por CTL, la participación de los canales GJ-Cx43 en la sinapsis mediada por CTL aún no ha sido determinada. En este trabajo se estudió el rol de los canales GJ-Cx43 en la actividad de la SIC entre CTL obtenidos desde ratones pMEL-1 y células de melanoma murino B16F10. Primero, se evaluó la polarización de Cx43 hacia la zona de contacto entre CTL pMEL-1 y células B16F10, durante la SIC. Se determinó que Cx43 se acumula en el sitio de contacto entre estas células de manera antígeno específica y que esta polarización es dependiente de la activación de los CTL. Luego, se disminuyó la expresión de Cx43 en células B16F10 utilizando un RNA interferente contra Cx43 y luego se evaluó la participación de Cx43 en la formación de canales GJ mediante ensayos de transferencia de calceína y en la actividad citotóxica de los CTL, mediante ensayos de actividad de Granzima B (GrzB). Se observó que los CTL transfieren calceína a las células B16F10 formando canales GJ funcionales, al contrario de cuando se utilizan LT CD8+ vírgenes como células efectoras. Además, cuando se utilizaron las células B16F10 que expresan bajos niveles de Cx43 como células blanco, se observó una disminución en la transferencia de calceína y en la actividad de GrzB en comparación al control. Nuestros resultados demuestran que durante el reconocimiento citotóxico se forman canales GJ-Cx43 entre CTL y células B16F10 y que la formación de estos canales durante la SIC son importantes para la eliminación de células tumorales mediada por CTL. / Development of antitumor immune responses requires communication between different immune cells, and specific immune recognition of tumor cells. Upon tumor cell recognition, CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells form the “Cytotoxic Immunological Synapse (SIC)”, a specialized molecular structure fundamental for the polarized delivery of cytotoxic granules and the specific tumor cell killing. Recently, it has been described the participation of Gap Junction Intercellular Communications formed by Connexin 43 (GJIC-Cx43) in the NK cell SIC activity. Despite that CTL and NK cells present functional and structural similarities in SIC formation, the participation of GJIC-Cx43 in CTL-mediated SIC remains unclear. In this work we studied the role of GJIC-Cx43 in the activity of SIC formed between CTL from pMEL-1 mice and B16F10 murine melanoma cells. First, we evaluated by immunofluorescence the polarization of Cx43 to contact site between CTL and B16F10 during SIC. We found that this protein localizes at the contact site of SIC and this polarization dependent on activation of CTL and is an antigenic-specific process. Then, we decrease Cx43 expression in B16F10 cells using interference RNA against Cx43 and we evaluated the participation of Cx43 in the formation of functional GJ channels by calcein transfer assay and in the cytotoxic activity of CTL by Granzyme B (GrzB) activity assay. We found that CTL transfer calcein to B16F10 forming functional GJ in contrast with when we used a naïve CD8+ T cells as an effector cells. In addition, when we used a B16F10 that express low levels of Cx43 as target cells, we observed a decrease in calcein transfer and GrzB activity in comparison to the control. Our results demonstrate that GJIC-Cx43 are formed between CTL and B16F10 during SIC, and suggest that their formation is important for tumor cells-killing by CTL

Objective: The aim of this study was to evaluate the antibacterial effect of Physalis peruviana on Streptococcus mutans (ATCC 25175) and Streptococcus sanguinis (ATCC 10556). Materials y Methods: The present in vitro experimental study was to determinate the antibacterial effect of the fruit of Physalis Peruviana’s methanolic extract against Streptococcus mutans (ATCC 25175) and Streptococcus sanguinis (ATCC 10556) and Clorhexidine (CHX) as control group, the minimum inhibitory concentration (MIC) and citotoxicity. For the antibacterial assay, 14 wells were prepared from the extract and Clorhexidine 0.12% as a positive control for each bacteria. The method used was agar diffusion test preparing wells with the experimental solutions cultivated in anaerobic conditions for 48 hours at 37ºC, after this time, the growth inhibition was analysed in milimiters. with wells. Results: It was found antibacterial effect of the metanolic extract of the fruit in Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis. In the first group, the inhibicion halo of the extract was 19.15mm ± 1.83 and for Clorhexidine 25.78mm ± 2.27, while for the group of Streptococcus sanguinis, the Physalis Peruviana’s extract had 18.56mm ± 1.59 for inhibicion halos and 22.92mm ± 1.96 for Clorhexidine. On the other hand, the extract’s MIC was 50mg/ml. Finally, the methanolic extract of Physalis peruviana inhibited 50% of viability cells (CC50) at 241.01ug/ml concentration. Conclusions: The methanolic extract of Physalis Peruviana had antibacterial effect against Streptococcus mutans and Streptococcus sanguinis. Besides, this fruit wasn’t citotoxic for Jurkat’s line cell. / Objetivo: evaluar in vitro el efecto antibacteriano del extracto metanólico de Physalis peruviana sobre cepas de Streptococcus mutans (ATCC 25175) y Streptococcus sanguinis (ATCC 10556). Materiales y Métodos: el presente estudio fue de tipo experimental in vitro. Se evaluó el efecto antibacteriano del extracto metanólico del fruto de Physalis peruviana frente a cepas de Streptococcus mutans (ATCC 25175) y Streptococcus sanguinis (ATCC 10556) y la Clorhexidina (CHX) como grupo control, determinando la concentración mínima inhibitoria (CMI) y citotoxicidad. Para realizar la actividad antibacteriana se trabajó con una muestra de 14 pocillos por grupo, mediante el método de difusión en agar con pocillos. Por otro lado, para la MIC se utilizó el método de dilución en caldo en medio Brain Heart infusión Broth (BHI) y para evaluar la citotoxicidad se empleó la línea celular Jurkat mediante el ensayo de MTT. Resultados: se observaron halos de inhibición de 19.15mm ± 1.83 para el extracto de physalis peruvina y 25.78mm ± 2.27 para la clorhexidina sobre Streptococcus mutans, mientras que para el grupo de Streptococcus sanguinis, se observaron halos de inhibición de 18.56mm ± 1.59 del extracto de la planta y 22.92mm ± 1.96 para la clorhexidina. Por otro lado, la MIC del extracto fue de 50mg/ml. Finalmente, el extracto metanólico de la Physalis peruviana inhibió la viabilidad celular al 50% (CC50) en una concentración de 241.01ug/ml. Conclusiones: el extracto metanólico de Physalis Peruviana tuvo efecto antibacteriano sobre cepas de Streptococcus mutans y Streptococcus sanguinis. Además, no fue citotóxico para la línea celular Jurkat. / Tesis