Orientador : Prof. Dr. Nelson Augusto Rosário Filho / Coorientador : Drª. Laura Lúcia Cogo / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 15/08/2017 / Inclui referências : f. 59-68 / Resumo: Em pacientes com fibrose cística (FC) ocorre a produção de secreção respiratória viscosa, que aumenta a probabilidade de infecções bacterianas. Staphylococcus aureus é o primeiro patógeno capaz de colonizar e promover infecções nas vias aéreas nestes pacientes. Variantes de colônias pequenas (SCVs) têm surgido em S. aureus relacionadas a infecções crônicas e recorrentes. SCVs são um desafio para o laboratório, principalmente porque são mutantes auxotróficos, que necessitam de substratos específicos para seu crescimento. Os objetivos deste trabalho foram avaliar as técnicas de diagnóstico para a detecção das colônias pequenas variantes de S. aureus (SCVs) em infecções pulmonares de pacientes com Fibrose Cística, atendidos nos ambulatórios do HC-UFPR, assim como determinar a prevalência deste fenótipo e o melhor método para a detecção da suscetibilidade aos agentes antimicrobianos. Foram coletadas e semeadas em Ágar Manitol, amostras respiratórias de 246 pacientes com FC atendidos entre 2014 e 2016. Colônias pequenas suspeitas de SCVs foram identificadas usando ágar com 7,5% de NaCl, teste da catalase e da coagulase, painel de identificação do Vitek®2 Compact, MALDI-TOF MS (Vitek® MS - bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) e PCR para o gene nuc. Foi determinada a dependência nutricional à hemina, menadiona ou timidina em Mueller Hinton Agar (MHA) por dois métodos: 1) MHA suplementado com estes substratos antes da semeadura e, 2) adição de discos contendo estes substratos sobre a superfície do MHA previamente semeado. O teste de suscetibilidade antimicrobiana foi realizado por disco difusão e microdiluição em caldo, e os meios utilizados nos testes foram suplementados com timidina. Determinantes de resistência aos beta-lactâmicos e macrolídeos foram pesquisados por PCR. Dos 246 pacientes, S. aureus foi isolado em 182 (74%) pacientes. SCVs foram isolados em 11pacientes (4,5%) e todos foram timidina-dependentes. O antibiograma demonstrou que 91% dos isolados eram resistentes a múltiplos fármacos, 9% eram resistentes à oxacilina (MRSA) e rifampicina, e todos eram suscetíveis à vancomicina e linezolida. Os genes mecA (1), ermA (1), ermB (1), ermC (2) e msrB (11) foram encontrados entre os isolados. Esta pesquisa indica um alerta para os microbiologistas sobre a dificuldade no reconhecimento e identificação de SCVs de S. aureus na rotina laboratorial. Além disso, mostra uma preocupação com o tratamento, uma vez que a maioria dos isolados demonstrou ser multirresistente. Palavras-chave: S. aureus; Variantes de colônias pequenas; Dependente de timidina; SCVs / Abstract: In patients with cystic fibrosis (CF) the production of viscous respiratory secretion occurs, which increases the probability of bacterial infections. Staphylococcus aureus is the first pathogen able to colonize and promote infections in the airways in these patients. Variants of small colonies (SCVs) have arisen in S. aureus related to chronic and recurrent infections. SCVs are a large challenge for the laboratory, mainly because they are auxotrophic mutants, which require specific substrates for their growth. The objectives of this study were to evaluate the diagnostic techniques for detection of S. aureus small colony variants (SCVs) in pulmonary infections of patients with cystic fibrosis attended at HC-UFPR ambulatory, as well as to determine the prevalence and the best method for detection of susceptibility to antimicrobial agents. Respiratory samples from 246 patients with CF were collected and inoculated in Mannitol Agar from 2014 to 2016. Small colonies suspected of SCV were identified using 7,5% NaCl agar, catalase and coagulase tests, Vitek®2 Compact identification panel, MALDI-TOF (Vitek® MS - bioMérieux, Marcy l'Etoile, France) and PCR for the nuc gene. Nutritional dependence was determined to hemin, menadione or thymidine in Mueller Hinton Agar (MHA) by two methods: 1) MHA supplemented with these substrates before inoculation; and 2) addition of disks containing these substrates on the surface of the MHA previously inoculated. The antimicrobial susceptibility test was performed by disk diffusion technique and broth microdilution technique, both supplemented with thymidine. Determinants of resistance to beta-lactams and macrolides were investigated by PCR. Of the 246 patients S. aureus was isolated in 182 (74%) patients. SCVs were isolated in 11 patients (4,5%) and all were thymidine-dependent. The antibiogram showed that 91% of the isolates were resistant to multiple drugs, 9% were resistant to oxacillin (MRSA) and rifampicin, and all were susceptible to vancomycin and linezolid. The mecA (1), ermA (1), ermB (1), ermC (2) and msrB (11) genes were found among the isolates. This research indicates an alert for the microbiologists about the difficulty in the recognizing and identifying of SCVs of S. aureus in the laboratory routine. In addition, it is concern with treatment, since the majority of the isolates proved to be multiresistant. Keywords: S. aureus; small colony variants; Thymidine dependent; SCVs

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El virus herpes felino es uno de los principales agentes etiológicos involucrados en el Complejo Viral Felino. Posee distribución mundial y afecta a gatos domésticos provocando lesiones tanto oculares como del tracto respiratorio superior. Su casuística en Chile es común, pese a ello su diagnóstico es sólo clínico, a diferencia de otros países donde se utilizan diversas técnicas para ello, siendo la reacción en cadena a la polimerasa (PCR) la más recomendada y con mejores resultados. El objetivo de este estudio fue implementar un método diagnóstico molecular en Chile, para ello se seleccionaron gatos menores de un año con signología clínica sugerente de la infección con herpes felino, para la detección del gen de la proteína Timidin Kinasa del virus, altamente específico y conservado, mediante la técnica de PCR anidado y posterior determinación del porcentaje de identidad nucleotídica del amplificado obtenido respecto de la base de datos genómica GenBank®. Como resultado se obtuvo una tasa de detección del 100% de las muestras y el control positivo, y una identidad nucleotídica de un 92 % comparado con la base de datos genómica del GenBank® (número de acceso E12463.1), probando que los amplificados corresponden al virus herpes felino. De esta forma se logra implementar un método diagnóstico efectivo para ser utilizado en complementación al diagnóstico clínico

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:22:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lidia Yileng Tay Chu Jon.pdf: 1011394 bytes, checksum: 9cfa95ca6ba9d9c4b6cb8db597101aa8 (MD5) Previous issue date: 2010-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to evaluate the effect of water storage time and of a heat treatment on the cytotoxicity of soft lining denture material using the 3H-thymidine incorporation test. Sample disks (10 mm X 1 mm) of soft lining denture Dentusoft, Dentuflex, Trusoft, Ufi Gel P and of denture base acrylic resin Lucitone 550 were fabricated under aseptic conditions. Twelve specimens of each material were prepared and divided into four groups: GN: The specimens received no treatment or storage in water, G24: The specimens were stored in distilled water at 37°C for 24 hours; G48: The specimens were stored in distilled water at 37°C for 48 hours, GHW: The specimens were immersed in water at 55 °C for 10 minutes. To analyze the cytotoxic effect, three samples of each experimental group were placed in test tubes with 9 ml of DMEM's medium supplemented and incubated at 37 °C for 24 hours. During this incubation period, the toxic substances were broadcast to the culture medium, forming the extracts that were used for the cytotoxicity test. The cytotoxicity of each material was analyzed quantitatively by the incorporation of radioactivity 3H - thymidine by checking the number of viable cells for the synthesis of DNA. The results of DNA synthesis were subjected to analysis of variance in a factorial two-way (material and storage time in water). Comparing the averages of cell viability with the classification of cytotoxic established by ISO 10993-5, it was found that Ufi Gel P had non-cytotoxic effect, Trusoft had slightly cytotoxic effect, Dentuflex had a moderated cytotoxic effect, all in any experimental condition. It was also observed that the Dentusoft alternated between slightly cytotoxic and non-cytotoxic effect because their average viability ranged around 75% and Lucitone 550 had non-cytotoxic effect when stored in water for 48 hours, but the others had around 50% cell viability, the slightly moderated cytotoxic effect. It is concluded that the soft lining denture based in acrylic resin had a slightly and moderated cytotoxic effect, Ufi Gel P, the silicone based soft liner, was not cytotoxic; the effect of water storage after 24 hours or 48 hours and the heat treatment did not reduce the cytotoxicity effect of soft lining denture materials. / O objetivo deste estudo foi avaliar, por meio do teste quantitativo de incorporação de 3H-timidina, a citotoxicidade de materiais reembasadores resilientes em função do tempo de armazenamento em água e em função de um tratamento térmico. Doze corpos-de-prova de cada material reembasador resiliente (Dentusoft, Dentuflex, Trusoft e Ufi Gel P) e da resina termopolimerizável (Lucitone 550) foram confeccionados de forma asséptica em forma de discos e divididos em 4 grupos: GN: os corpos-de-prova não receberam nenhum tipo de tratamento ou armazenamento; G24: os corpos-de-prova foram armazenados em água destilada à 37ºC por 24 horas; G48: os corpos-de-prova foram armazenados em água destilada à 37ºC por 48 horas; GAQ: os corpos-de-prova foram imersos em água a 55°C por 10 minutos. Para a análise do efeito citotóxico, três corpos-de-prova de cada grupo experimental foram colocados dentro de tubos de ensaio com 9 mL de meio de cultura DMEM suplementado e incubados a 37ºC por 24 horas. Durante esse período, as substâncias tóxicas foram difundidas para o meio de cultura, formando os extratos que foram utilizados no teste de citotoxicidade. Esta foi analisada quantitativamente por meio da incorporação do radioisótopo 3H-timidina, verificando o número de células viáveis pela síntese de DNA. Os resultados foram submetidos à análise de variância em esquema fatorial de dois fatores incluindo ainda um grupo controle, ao nível de 5% de significância. Confrontando-se as médias obtidas de viabilidade celular com a classificação do efeito citotóxico estabelecida pela ISO 10993-5, verificou-se que o Ufi Gel P foi considerado não-citotóxico, o Trusoft levemente citotóxico e o Dentuflex discretamente citotóxico, em qualquer condição experimental. Observou-se também que o Dentusoft alternou entre levemente citotóxico e não-citotóxico porque suas médias de viabilidade variaram em torno de 75% e o Lucitone 550 apresentou efeito não-citotóxico quando armazenado em água por 48 horas, mas as outras médias ficaram em torno de 50% de viabilidade celular, entre levemente-citotóxico e discretamente citotóxico. Concluiu-se que os reembasadores resilientes a base de resina acrílica (Trusoft e Dentuflex) foram classificados como levemente citotóxico e discretamente citotóxico, respectivamente. O condicionador de tecido (Dentusoft) alternou entre levemente citotóxico e não citotóxico e o reembasador resiliente a base de silicone (Ufi Gel P) não teve efeito citotóxico. O armazenamento em água ou o tratamento térmico não diminuiu a citotoxicidade dos reembasadores resilientes e o armazenamento em água reduziu a citotoxicidade da resina acrílica para base de prótese (Lucitone 550).

Os tratamentos convencionais para carcinoma medular de tireóide (CMT) metastático são insatisfatórios. Tanto a quimioterapia quanto a radioterapia são pouco eficazes para a doença avançada. Portanto, a terapia gênica é uma promissora opção. Trabalhos de construção de vetores plasmidiais ou adenovirais específicos para cultura de células de carcinoma medular de tireóide e/ou animais têm demonstrado resultados encorajadores, conseguindo significativa redução do tumor. O objetivo deste trabalho foi construir e avaliar a eficácia do plasmídio pTCPtkevIL-12 contendo o gene da timidina quinase (HSV-tk) e da interleucina 12 otimizada/evolved (evIL-12), ambos sob controle do promotor da calcitonina modificado (TCP), visando terapia gênica do CMT. A associação entre um gene ?suicida? (TK) e um gene imunomodulador (IL12) é sabidamente sinérgica, o que motivou o emprego destes dois genes no vetor terapêutico. Por melhoramento genético, obteve-se recentemente a IL-12 otimizada/evolved, com elevada capacidade em induzir resposta imune. O promotor TCP é mais forte e mais específico que o promotor de calcitonina natural , e já foi usado em diversos trabalhos em CMT. Para determinar a atividade biológica das interleucinas 12 (evIL-12 e mIL-12), os sobrenadantes das culturas de células TT transfectadas foram utilizados para avaliar proliferação linfocitária e estimulação de células dendríticas (DCs). As células TT (carcinoma medular humano de tireóide) foram transfectadas com o plasmídio pTCPtkevIL-12 ou pTCPmIL-12 (plasmídio com o gene da IL-12 murina, sob controle do promotor TCP). A proliferação linfocitária foi quantificada por citometria de fluxo e a diferenciação de linfócitos T para um padrão Th1 foi verificada através da dosagem de IFN-? e IL-4 por ELISA. A avaliação do perfil fenotípico das DCs, cultivadas com sobrenadante contendo mIL-12 ou evIL-12 durante a diferenciação, foi feita através de marcação com anticorpos das moléculas de membrana marcadoras de maturação CD80, CD83, CD86 e CD40, com leitura também por citometria de fluxo. Também foi avaliada e comprovada a capacidade do plasmídio pTCPevIL-12 de promover apoptose induzida pelo sistema suicida timidina quinase/ganciclovir, nas células TT transfectadas. Os experimentos de proliferação linfocitária verificaram que ambas IL-12 promoveram intensa proliferação linfocitária, em similar magnitude. A principal função da IL12, todavia, não é estimular proliferação linfocitária, mas sim, induzir fortemente diferenciação para Th1, fundamental para uma eficiente resposta anti-tumoral. Foi observado que ambas IL-12 proporcionaram forte resposta Th1. Porém, a evIL-12 mostrou-se superior à mIL-12 na diferenciação dos linfócitos T para o padrão Th1. Os experimentos que avaliaram a capacidade da IL-12 maturar DCs diferenciadas, mostraram um aumento na expressão de CD40 nas DCs sob estímulo de ambas IL-12, porém a expressão foi discretamente maior com evIL-12 que com mIL-12 . Não foi observada alteração na expressão das outras proteínas marcadoras de maturação (CD80, CD83, CD86). Comparando-se o sobrenadante das células TT transfectadas com o plasmídio pTCPtkevIL-12 antes e após adição de GCV, verificou-se que ele se tornou mais eficiente para induzir expressão de CD40 nas células dendríticas após a adição do GCV. O incremento de expressão de CD40 nas DCs após tratamento com GCV poderia explicar, ao menos em parte, o efeito anti-tumoral sinérgico observado com a expressão simultânea dos genes timidina quinase e IL-12, já descritos em estudos in vivo, na literatura. Considerando-se que a evIL-12 mostrou-se mais eficiente em promover diferenciação dos linfócitos T para padrão Th1 e em promover uma maturação/ativação de melhor qualidade das células dendríticas diferenciadas (maior expressão de CD40), poderia-se afirmar que esta IL- 12 é extremamente imunogênica, superior inclusive à IL-12 murina , a única utilizada até o momento em terapia gênica de CMT. Os resultados satisfatórios alcançados neste trabalho oferecem perspectivas de aplicação futura ao plasmídio terapêutico pTCPtkevIL-12 para uso em terapia gênica em CMT. O plasmídio poderia ser utilizado em aplicação intra-tumoral e em estimulação de células dendríticas. A vacinoterapia com células dendríticas estimuladas com sobrenadante de células TT transfectadas com pTCPtkevIL-12 e tratadas com ganciclovir, devido a elevada expressão de CD40, pode ser uma esperança de um tratamento mais eficaz das metástases do CMT. Diversos estudos afirmam haver uma correlação direta entre maior expressão de CD40 e maior regressão do tumor primário e das metástases. / Present treatments of advanced and metastatic medullary thyroid carcinoma (MTC) are unsatisfactory. Tissue-specific cancer gene therapy is a promising alternative approach. IL-12 gene is a good citokyne to be used in gene therapy because it appears to be the most effective immunomodulatory gene. Literature data shows synergism in the association of two antitumor methods: suicide gene thymidine kinase (HSV-tk) and interleukin genes; therefore, they should ideally be together in the vector. The evolved interleukin12, obtained by DNA shuffling, is believed to elicit more antitumoral immune response than the human IL-12. None of them has been tested in MTC, only the murine IL-12 has been employed in MTC gene therapy. To explore a more efficient multi-gene antitumor treatment, development and evaluation of a plasmid expressing both herpes simplex virus thymidine kinase type 1 (HSVtk) and evolved interleukin-12 (evIL-12) under the control of modified calcitonin promoter (TCP) were done in this study. TCP promoter is more specific and efficient than the natural calcitonin promoter CT/CGRP, and has already been used in several studies. To verify IL-12 biological activity, lymphocyte proliferation and dendritic cell stimulation after IL-12 were studied. TT cells (human MTC) were transfected by pTCPtkevIL-12 plasmid or by pTCPmIL-12 (plasmid containing murine IL-12 gene, under control of TCP promoter). Lymphocyte proliferation was analysed by flow cytometry, and Th1 response was assessed by IFN-? and IL-4 ELISA measurement. The phenothypic analysis of dendritic cells (DCs) by flow cytometry was based on the expression of the maturative surface markers CD80, CD83, CD86 and CD40. Also, plasmid pTCPtkevIL-12 ability to promote TT transfected cells apoptosis, through the suicide system HSV-tk/ganciclovir, was evaluated and confirmed. Both IL-12 elicited similar intense lymphocyte proliferation. Nevertheless, the main IL-12 function is not to stimulate lymphocyte proliferation but induce Th1 immune response, which is essential for efficient anti-tumour response. Both IL-12, showed great Th1 response; however fortunately, ev-IL12 was superior to mIL-12 in promoting T cell Th1 response. Flow cytometry analysis of DCs revealed significant higher expression of CD40 surface molecule after differentiated DCs were exposed to TT transfected cells, either with pTCPtkevIL-12 or pTCPmIL-12, supernatants. DCs stimulated with supernatants containing evIL-12 were 36.91% CD40+, whereas when stimulated by supernatants containing mIL-12 were 14.74% CD40+. The other maturative markers (CD80, CD83, CD86) remained with the same expression level. Moreover, TT pTCPtkevIL-12- transfected cells supernatants, showed a even higher ability of increasing CD40 expression in DCs after treatment with GCV. At least partially, this increase in dendritic cells CD40 expression could explain the synergism observed with the simultaneous expression of thymidine kinase and interleukin genes. Outstanding lymphocyte proliferation and dendritic cell stimulation were achieved by the evIL-12 secreted in the supernatants, confirming that this interleukin 12 is really very potent. The good results achieved by the present study justify further experiments with this therapeutic plasmid. It could be used intra-tumorally and to stimulate/mature dendritic cells. Vaccine with DCs stimulated by TT pTCPtkevIL-12-transfected cells after GCV treatment supernatants, due to higher CD40 expression, could be very suitable for the treatment of MTC metastasis. Several studies show better primary tumor and metastasis regression in the presence of high levels of CD40 expression.

Nenhuma / 3-Desoxi-3-[18F]Fluor-Timidina (18FLT) é um análogo radioativo do nucleosídeo timidina usado desde 1998 em exames de tomografia por emissão de pósitrons (PET) para diagnóstico de vários tipos de tumores, como de mama, pulmonar, colorretal, cerebral, entre outros. Seu uso amplia a cobertura dos exames PET em diagnóstico de câncer, já que existem limitações da [18F]Fludesoxiglicose (18FDG), o radiofármaco PET mais usado no mundo atualmente. Para implementação da produção de 18FLT, na Unidade de Pesquisa e Produção de Radiofármacos do Centro de Desenvolvimento da Tecnologia Nuclear (UPPR/CDTN), o módulo de síntese de 18FDG foi adaptado usando-se 3 protocolos nos quais se variou a concentração de etanol (0; 8 e 10% V/V). Também foram desenvolvidos testes de Controle de Qualidade, como pH, determinação de catalisador, determinação de etanol e acetonitrila, pureza química e radioquímica, entre outros. A formulação foi avaliada in vitro quanto a sua segurança, pelos ensaios de viabilidade metabólica (MTT) e toxicidade clonogênica, e quanto a sua eficácia para a detecção de tumores pelo ensaio de interação (Binding). Os rendimentos corrigidos obtidos da síntese de 18FLT foram 6,52%; 253% e 233% para o 1, o 2 e o 3 protocolo, respectivamente. O produto do protocolo 3 (Etanol 8%) apresentou menor citotoxicidade no teste in vitro MTT do que o do segundo (Etanol 10%). Além disso, a formulação de 18FLT e as impurezas químicas presentes na mesma não afetaram a clonogenicidade das células testadas. Com base nestes resultados o protocolo 3 foi escolhido como a síntese padrão de 18FLT. A interação da 18FLT com as linhagens celulares foi saturável, com ligação específica maior que 90%, atestando a eficácia do radiofármaco na detecção de tumores. A afinidade do radiofármaco 18FLT por células de glioblastoma humano (U87MG) foi da ordem de 0,24 μmol/L (Kd). Por fim, constatou-se que quantidades adicionais de timidina e clorotimidina, duas impurezas presentes na formulação, reduziram significativamente a interação de 18FLT (IC50 ~ 1 - 34 μmol/L) com as células tumorais, o que pode reduzir sua eficácia para o diagnóstico. Assim, sugere-se que um valor máximo seja estabelecido para a concentração destas impurezas como um dos critérios de Pureza Química de 18FLT, baseando-se no ensaio de eficácia de interação. Portanto, a UPPR/CDTN está apta a fornecer rotineiramente o radiofármaco 18FLT para estudos não clínicos e clínicos, de acordo com os requisitos de Boas Práticas de Fabricação de Medicamentos exigidos pela ANVISA. / 3-Deoxy-3-[18F]Fluorothymidine (18FLT) is a Thymidine radioactive analog that is being used since 1998 for cancer diagnostics by Positron Emission Tomography (PET) for several types of cancer, as breast, lung, colorectal, brain, among others. Its use extends coverage of PET scans in diagnosis of cancers in certain organs and tissues, since there are limitations of [18F] Fludeoxyglucose (18FDG), which is the most used PET radiopharmaceutical in the world today. An 18FDG synthesis module was adapted to implement 18FLT production in Research and Production Unit of Radiopharmaceuticals from Center of Nuclear Technology Development (UPPR/CDTN). Three protocols were used varying the concentration of ethanol (0%, 8% and 10%). Quality control tests were also developed, as pH, catalyst determination, ethanol and acetonitrile determination, chemical and radiochemical purity, amongst others. The formulation was evaluated in vitro for its safety, using the metabolic viability (MTTs assay) and clonogenic toxicity assays, and for its effectiveness in tumors, using the binding test. The corrected yields were 6.52%; 253%; and 233% for the first, second and third synthesis protocols, respectively. The third protocol (Ethanol 8%) was found to be less cytotoxicity comparing to the second one (Ethanol 10%). Furthermore, 18FLT chemical impurities and the entire formulation did not affect the clonogenicity of the cells in Clonogenic Assay. Based on these results the protocol 3 was chosen as the standard 18FLT synthesis. The interaction of 18FLT with the cell lines was saturable, with specific binding higher than 81%, confirming the effectiveness of the radiopharmaceutical in tumor detection. The affinity between 18FLT and human glioblastoma cells (U87MG) was found to be 0.24 μmol/L (Kd). Finally, it was found that additional quantities of thymidine and chlorothymidine reduced significantly 18FLT interaction (IC50 ~ 1 - 34 μmol/L) with tumor cells, which can reduce its effectiveness in PET diagnosis. For this reason it is suggested that a maximum value must be set for the concentration of these impurities in the 18FLT Chemical Purity quality control test based in efficacy binding assays. Therefore, CDTN is able to routinely provide 18FLT radiopharmaceutical for clinical and non clinical studies, according to the Brazilian Good Manufacturing Practices for Radiopharmaceuticals required by ANVISA.

Os tratamentos convencionais para carcinoma medular de tireóide (CMT) metastático são insatisfatórios. Tanto a quimioterapia quanto a radioterapia são pouco eficazes para a doença avançada. Portanto, a terapia gênica é uma promissora opção. Trabalhos de construção de vetores plasmidiais ou adenovirais específicos para cultura de células de carcinoma medular de tireóide e/ou animais têm demonstrado resultados encorajadores, conseguindo significativa redução do tumor. O objetivo deste trabalho foi construir e avaliar a eficácia do plasmídio pTCPtkevIL-12 contendo o gene da timidina quinase (HSV-tk) e da interleucina 12 otimizada/evolved (evIL-12), ambos sob controle do promotor da calcitonina modificado (TCP), visando terapia gênica do CMT. A associação entre um gene ?suicida? (TK) e um gene imunomodulador (IL12) é sabidamente sinérgica, o que motivou o emprego destes dois genes no vetor terapêutico. Por melhoramento genético, obteve-se recentemente a IL-12 otimizada/evolved, com elevada capacidade em induzir resposta imune. O promotor TCP é mais forte e mais específico que o promotor de calcitonina natural , e já foi usado em diversos trabalhos em CMT. Para determinar a atividade biológica das interleucinas 12 (evIL-12 e mIL-12), os sobrenadantes das culturas de células TT transfectadas foram utilizados para avaliar proliferação linfocitária e estimulação de células dendríticas (DCs). As células TT (carcinoma medular humano de tireóide) foram transfectadas com o plasmídio pTCPtkevIL-12 ou pTCPmIL-12 (plasmídio com o gene da IL-12 murina, sob controle do promotor TCP). A proliferação linfocitária foi quantificada por citometria de fluxo e a diferenciação de linfócitos T para um padrão Th1 foi verificada através da dosagem de IFN-? e IL-4 por ELISA. A avaliação do perfil fenotípico das DCs, cultivadas com sobrenadante contendo mIL-12 ou evIL-12 durante a diferenciação, foi feita através de marcação com anticorpos das moléculas de membrana marcadoras de maturação CD80, CD83, CD86 e CD40, com leitura também por citometria de fluxo. Também foi avaliada e comprovada a capacidade do plasmídio pTCPevIL-12 de promover apoptose induzida pelo sistema suicida timidina quinase/ganciclovir, nas células TT transfectadas. Os experimentos de proliferação linfocitária verificaram que ambas IL-12 promoveram intensa proliferação linfocitária, em similar magnitude. A principal função da IL12, todavia, não é estimular proliferação linfocitária, mas sim, induzir fortemente diferenciação para Th1, fundamental para uma eficiente resposta anti-tumoral. Foi observado que ambas IL-12 proporcionaram forte resposta Th1. Porém, a evIL-12 mostrou-se superior à mIL-12 na diferenciação dos linfócitos T para o padrão Th1. Os experimentos que avaliaram a capacidade da IL-12 maturar DCs diferenciadas, mostraram um aumento na expressão de CD40 nas DCs sob estímulo de ambas IL-12, porém a expressão foi discretamente maior com evIL-12 que com mIL-12 . Não foi observada alteração na expressão das outras proteínas marcadoras de maturação (CD80, CD83, CD86). Comparando-se o sobrenadante das células TT transfectadas com o plasmídio pTCPtkevIL-12 antes e após adição de GCV, verificou-se que ele se tornou mais eficiente para induzir expressão de CD40 nas células dendríticas após a adição do GCV. O incremento de expressão de CD40 nas DCs após tratamento com GCV poderia explicar, ao menos em parte, o efeito anti-tumoral sinérgico observado com a expressão simultânea dos genes timidina quinase e IL-12, já descritos em estudos in vivo, na literatura. Considerando-se que a evIL-12 mostrou-se mais eficiente em promover diferenciação dos linfócitos T para padrão Th1 e em promover uma maturação/ativação de melhor qualidade das células dendríticas diferenciadas (maior expressão de CD40), poderia-se afirmar que esta IL- 12 é extremamente imunogênica, superior inclusive à IL-12 murina , a única utilizada até o momento em terapia gênica de CMT. Os resultados satisfatórios alcançados neste trabalho oferecem perspectivas de aplicação futura ao plasmídio terapêutico pTCPtkevIL-12 para uso em terapia gênica em CMT. O plasmídio poderia ser utilizado em aplicação intra-tumoral e em estimulação de células dendríticas. A vacinoterapia com células dendríticas estimuladas com sobrenadante de células TT transfectadas com pTCPtkevIL-12 e tratadas com ganciclovir, devido a elevada expressão de CD40, pode ser uma esperança de um tratamento mais eficaz das metástases do CMT. Diversos estudos afirmam haver uma correlação direta entre maior expressão de CD40 e maior regressão do tumor primário e das metástases. / Present treatments of advanced and metastatic medullary thyroid carcinoma (MTC) are unsatisfactory. Tissue-specific cancer gene therapy is a promising alternative approach. IL-12 gene is a good citokyne to be used in gene therapy because it appears to be the most effective immunomodulatory gene. Literature data shows synergism in the association of two antitumor methods: suicide gene thymidine kinase (HSV-tk) and interleukin genes; therefore, they should ideally be together in the vector. The evolved interleukin12, obtained by DNA shuffling, is believed to elicit more antitumoral immune response than the human IL-12. None of them has been tested in MTC, only the murine IL-12 has been employed in MTC gene therapy. To explore a more efficient multi-gene antitumor treatment, development and evaluation of a plasmid expressing both herpes simplex virus thymidine kinase type 1 (HSVtk) and evolved interleukin-12 (evIL-12) under the control of modified calcitonin promoter (TCP) were done in this study. TCP promoter is more specific and efficient than the natural calcitonin promoter CT/CGRP, and has already been used in several studies. To verify IL-12 biological activity, lymphocyte proliferation and dendritic cell stimulation after IL-12 were studied. TT cells (human MTC) were transfected by pTCPtkevIL-12 plasmid or by pTCPmIL-12 (plasmid containing murine IL-12 gene, under control of TCP promoter). Lymphocyte proliferation was analysed by flow cytometry, and Th1 response was assessed by IFN-? and IL-4 ELISA measurement. The phenothypic analysis of dendritic cells (DCs) by flow cytometry was based on the expression of the maturative surface markers CD80, CD83, CD86 and CD40. Also, plasmid pTCPtkevIL-12 ability to promote TT transfected cells apoptosis, through the suicide system HSV-tk/ganciclovir, was evaluated and confirmed. Both IL-12 elicited similar intense lymphocyte proliferation. Nevertheless, the main IL-12 function is not to stimulate lymphocyte proliferation but induce Th1 immune response, which is essential for efficient anti-tumour response. Both IL-12, showed great Th1 response; however fortunately, ev-IL12 was superior to mIL-12 in promoting T cell Th1 response. Flow cytometry analysis of DCs revealed significant higher expression of CD40 surface molecule after differentiated DCs were exposed to TT transfected cells, either with pTCPtkevIL-12 or pTCPmIL-12, supernatants. DCs stimulated with supernatants containing evIL-12 were 36.91% CD40+, whereas when stimulated by supernatants containing mIL-12 were 14.74% CD40+. The other maturative markers (CD80, CD83, CD86) remained with the same expression level. Moreover, TT pTCPtkevIL-12- transfected cells supernatants, showed a even higher ability of increasing CD40 expression in DCs after treatment with GCV. At least partially, this increase in dendritic cells CD40 expression could explain the synergism observed with the simultaneous expression of thymidine kinase and interleukin genes. Outstanding lymphocyte proliferation and dendritic cell stimulation were achieved by the evIL-12 secreted in the supernatants, confirming that this interleukin 12 is really very potent. The good results achieved by the present study justify further experiments with this therapeutic plasmid. It could be used intra-tumorally and to stimulate/mature dendritic cells. Vaccine with DCs stimulated by TT pTCPtkevIL-12-transfected cells after GCV treatment supernatants, due to higher CD40 expression, could be very suitable for the treatment of MTC metastasis. Several studies show better primary tumor and metastasis regression in the presence of high levels of CD40 expression.

O melanoma maligno é um tipo de câncer com grande risco de produzir metástases e com altas taxas de mortalidade resultantes de diagnósticos tardios e falta de tratamentos eficazes. Ao longo dos últimos anos, a terapia gênica voltada para o câncer e o desenvolvimento de métodos capazes de visualizar processos moleculares e celulares ao longo da terapia, tem recebido especial atenção. Diante deste quadro, nossos objetivos foram utilizar o sistema de Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET) para diagnosticar precocemente tumores e investigar a eficácia terapêutica de uma nova imunoterapia em um modelo animal de melanoma metastático. Visando atingir esses objetivos, padronizou-se a síntese e realizou-se o controle de qualidade do 9- [4-18F-fluoro-3-hidroximetil-butil) guanina, [18F] FHBG, considerado o padrão-ouro em estudos clínicos, para acompanhamento de terapia gênica por PET. Métodos: Sintetizou-se o [18F] FHBG, por substituição nucleofílica tipo 2 do precursor tosilato com [18F-] fluoreto de potássio /Kryptofix 2.2.2, seguido de desproteção com HCl 1 M e purificação por HPLC. A identidade química, pureza radioquímica e atividade específica do [18F] FHBG foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Introduziu-se o gene de timidina quinase (TK) com o vetor retroviral pCL-TK nas linhagens B16F10 (melanoma murino) e LLC (carcinoma de pulmão murino). Os estudos de captação in vitro dos radiotraçadores [18F] FHBG e [18F] FDG foram realizados nas linhagens celulares tumorais murinas transduzidas ou não com a proteína TK. Para os estudos in vivo, camundongos C57BL6 previamente inoculados intravenosamente com células de melanoma expressando a enzima TK, foram imageados subsequentemente utilizando os radiotraçadores [18F] FDG e [18F] FHBG. A eficácia da imunoterapia foi testada em modelo profilático e terapêutico animal de melanoma metastático. Resultados: O tempo de síntese total do [18F] FHBG variou entre 80-150 minutos. O rendimento radioquímico variou entre 1-4%, (n = 19) decaimento corrigido. A pureza radioquímica foi superior a 99% e a atividade específica variou entre 0,14GBq/μmoL-0,21GBq/μmoL. Com a introdução do gene timidina quinase (TK), obtiveram-se as linhagens repórter B16F10-TK e LLC-TK, para os estudos in vitro. As células B16F10 e LLC, expressando GFP foram utilizadas como linhagens controles. Estudos in vitro com o [18F] FHBG revelaram uma captação cerca de 4 vezes maior em células que expressam TK (B16-TK e LLC-TK) em comparação com as células controle GFP. O [18F] FDG apenas captou cerca de duas vezes mais em células TK do que em células que expressam GFP. A detecção de tumores em modelo animal de metástase pulmonar com o [18F] FDG ocorreu a partir de 15 dias do estabelecimento das lesões. No entanto, nos estudos in vivo com [18F] FHBG, houve captação apenas na região intestinal, durante as três semanas em que os animais foram acompanhados. A imunoterapia com células tratadas pela combinação de p19Arf e IFNβ, em camundongos C57BL6 com metástase pulmonar, conferiu redução do tamanho dos focos metastáticos aos animais tratados. Conclusões: Neste trabalho padronizou-se a síntese manual do [18F] FHBG, o qual foi avaliado em estudos in vitro e in vivo. Os estudos in vitro confirmaram a especificidade do [18F] FHBG no monitoramento da expressão de HSV1-tk em linhagens celulares. No entanto, o [18F] FHBG não se acumulou nas lesões metastáticas in vivo e estudos posteriores serão necessários para uma melhor caracterização utilizando o [18F] FHBG. O resultado do tratamento combinado de p19Arf e IFNβ foi promissor para o tratamento de lesões metastáticas. / Malignant melanoma is a type of cancer with a great risk of producing metastases and with high mortality rates resulting from late diagnosis and lack of effective treatments. Over the past few years, directed gene therapy for cancer and the development of methods to visualize molecular and cellular processes throughout therapy, have received special attention. In this context, our aim was to use the Positron Emission Tomography (PET) system, as a tool, for early detection of tumors and investigate the therapeutic efficacy of a new immunotherapy in an animal model of metastatic melanoma. To achieving these goals, the synthesis of [18F] FHBG, the gold standard in clinical studies for monitoring gene therapy by PET, was standardized and the quality control was performed. We also present the results of in vitro uptake and in vivo evaluation of [18F] FHBG, compared to [18F] FDG, the most commonly used radiopharmaceutical for diagnosis in oncology by PET. The vaccine was derived from transduced B16F10-TK cells with the adenoviral vectors AdRGDPGp19Arf and AdRGDPGIFNβ. Methods: [18F] FHBG was synthesized by type 2 nucleophilic radiofluorination of a tosylate precursor with [18F-] potassium fluoride / Kryptofix 2.2.2, followed by deprotection with 1N HCl and purification by HPLC. The chemical identity, radiochemical purity and specific activity of [18F] FHBG were determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The thymidine kinase (TK) gene was introduced with the pCL-TK retroviral vector into the B16F10 (murine melanoma) and LLC (murine lung carcinoma) lines. In vitro uptake studies of [18F] FHBG and [18F] FDG were performed on cell lines transduced or not with TK protein. For in vivo studies, C57BL6 mice, previously injected with HSV1tk expressing tumors, were subsequently imaged using the [18F] FDG and [18F] FHBG radiotracers. The efficacy of immunotherapy was tested in a prophylactic and therapeutic animal model of metastatic melanoma. Results: The total synthesis time of [18F] FHBG ranged from 80-150 min. The radiochemical yield ranged from 1-4%, (n = 19) corrected decay. Radiochemical purity was greater than 99% and the specific activity ranged from 0.14GBq / μmoL- 0.21GBq / μmoL. With the introduction of the thymidine kinase (TK) gene, the B16F10-TK and LLC-TK reporter lines were obtained for in vitro studies, B16F10 cells and LLC, expressing GFP, were used as controls. In vitro studies with [18F] FHBG revealed about 4-fold uptake in TK-expressing cells (B16-TK and LLC-TK) compared to GFP control cells. [18F] FDG binds only about twice as much in TK cells as in cells expressing GFP. The detection of tumors in an animal model of pulmonary metastasis with [18F] FDG occurred 15 days after lesion establishment. However, the in vivo studies with [18F] FHBG, the uptake was only found in the intestinal region, over the 3 weeks in which the mice were followed. Immunotherapy with cells treated by the combination of p19Arf and IFNβ, in C57BL6 mice with pulmonary metastasis, reduced the size of the metastatic foci in treated animals. Conclusions: In this study we demonstrate the standardization of [18F] FHBG synthesis and its use in in vitro and in vivo. The in vitro studies have confirmed the specificity of [18F] FHBG to monitor HSV1-tk expression in cell lines. However, [18F] FHBG did not accumulate in the metastatic lesions in vivo and further studies will be required for a better characterization using [18F] FHBG. The outcome of the combined treatment of p19Arf and IFNβ was promising for the treatment of metastatic lesions.

O melanoma maligno é um tipo de câncer com grande risco de produzir metástases e com altas taxas de mortalidade resultantes de diagnósticos tardios e falta de tratamentos eficazes. Ao longo dos últimos anos, a terapia gênica voltada para o câncer e o desenvolvimento de métodos capazes de visualizar processos moleculares e celulares ao longo da terapia, tem recebido especial atenção. Diante deste quadro, nossos objetivos foram utilizar o sistema de Tomografia por Emissão de Pósitrons (PET) para diagnosticar precocemente tumores e investigar a eficácia terapêutica de uma nova imunoterapia em um modelo animal de melanoma metastático. Visando atingir esses objetivos, padronizou-se a síntese e realizou-se o controle de qualidade do 9- [4-18F-fluoro-3-hidroximetil-butil) guanina, [18F] FHBG, considerado o padrão-ouro em estudos clínicos, para acompanhamento de terapia gênica por PET. Métodos: Sintetizou-se o [18F] FHBG, por substituição nucleofílica tipo 2 do precursor tosilato com [18F-] fluoreto de potássio /Kryptofix 2.2.2, seguido de desproteção com HCl 1 M e purificação por HPLC. A identidade química, pureza radioquímica e atividade específica do [18F] FHBG foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE). Introduziu-se o gene de timidina quinase (TK) com o vetor retroviral pCL-TK nas linhagens B16F10 (melanoma murino) e LLC (carcinoma de pulmão murino). Os estudos de captação in vitro dos radiotraçadores [18F] FHBG e [18F] FDG foram realizados nas linhagens celulares tumorais murinas transduzidas ou não com a proteína TK. Para os estudos in vivo, camundongos C57BL6 previamente inoculados intravenosamente com células de melanoma expressando a enzima TK, foram imageados subsequentemente utilizando os radiotraçadores [18F] FDG e [18F] FHBG. A eficácia da imunoterapia foi testada em modelo profilático e terapêutico animal de melanoma metastático. Resultados: O tempo de síntese total do [18F] FHBG variou entre 80-150 minutos. O rendimento radioquímico variou entre 1-4%, (n = 19) decaimento corrigido. A pureza radioquímica foi superior a 99% e a atividade específica variou entre 0,14GBq/μmoL-0,21GBq/μmoL. Com a introdução do gene timidina quinase (TK), obtiveram-se as linhagens repórter B16F10-TK e LLC-TK, para os estudos in vitro. As células B16F10 e LLC, expressando GFP foram utilizadas como linhagens controles. Estudos in vitro com o [18F] FHBG revelaram uma captação cerca de 4 vezes maior em células que expressam TK (B16-TK e LLC-TK) em comparação com as células controle GFP. O [18F] FDG apenas captou cerca de duas vezes mais em células TK do que em células que expressam GFP. A detecção de tumores em modelo animal de metástase pulmonar com o [18F] FDG ocorreu a partir de 15 dias do estabelecimento das lesões. No entanto, nos estudos in vivo com [18F] FHBG, houve captação apenas na região intestinal, durante as três semanas em que os animais foram acompanhados. A imunoterapia com células tratadas pela combinação de p19Arf e IFNβ, em camundongos C57BL6 com metástase pulmonar, conferiu redução do tamanho dos focos metastáticos aos animais tratados. Conclusões: Neste trabalho padronizou-se a síntese manual do [18F] FHBG, o qual foi avaliado em estudos in vitro e in vivo. Os estudos in vitro confirmaram a especificidade do [18F] FHBG no monitoramento da expressão de HSV1-tk em linhagens celulares. No entanto, o [18F] FHBG não se acumulou nas lesões metastáticas in vivo e estudos posteriores serão necessários para uma melhor caracterização utilizando o [18F] FHBG. O resultado do tratamento combinado de p19Arf e IFNβ foi promissor para o tratamento de lesões metastáticas. / Malignant melanoma is a type of cancer with a great risk of producing metastases and with high mortality rates resulting from late diagnosis and lack of effective treatments. Over the past few years, directed gene therapy for cancer and the development of methods to visualize molecular and cellular processes throughout therapy, have received special attention. In this context, our aim was to use the Positron Emission Tomography (PET) system, as a tool, for early detection of tumors and investigate the therapeutic efficacy of a new immunotherapy in an animal model of metastatic melanoma. To achieving these goals, the synthesis of [18F] FHBG, the gold standard in clinical studies for monitoring gene therapy by PET, was standardized and the quality control was performed. We also present the results of in vitro uptake and in vivo evaluation of [18F] FHBG, compared to [18F] FDG, the most commonly used radiopharmaceutical for diagnosis in oncology by PET. The vaccine was derived from transduced B16F10-TK cells with the adenoviral vectors AdRGDPGp19Arf and AdRGDPGIFNβ. Methods: [18F] FHBG was synthesized by type 2 nucleophilic radiofluorination of a tosylate precursor with [18F-] potassium fluoride / Kryptofix 2.2.2, followed by deprotection with 1N HCl and purification by HPLC. The chemical identity, radiochemical purity and specific activity of [18F] FHBG were determined by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). The thymidine kinase (TK) gene was introduced with the pCL-TK retroviral vector into the B16F10 (murine melanoma) and LLC (murine lung carcinoma) lines. In vitro uptake studies of [18F] FHBG and [18F] FDG were performed on cell lines transduced or not with TK protein. For in vivo studies, C57BL6 mice, previously injected with HSV1tk expressing tumors, were subsequently imaged using the [18F] FDG and [18F] FHBG radiotracers. The efficacy of immunotherapy was tested in a prophylactic and therapeutic animal model of metastatic melanoma. Results: The total synthesis time of [18F] FHBG ranged from 80-150 min. The radiochemical yield ranged from 1-4%, (n = 19) corrected decay. Radiochemical purity was greater than 99% and the specific activity ranged from 0.14GBq / μmoL- 0.21GBq / μmoL. With the introduction of the thymidine kinase (TK) gene, the B16F10-TK and LLC-TK reporter lines were obtained for in vitro studies, B16F10 cells and LLC, expressing GFP, were used as controls. In vitro studies with [18F] FHBG revealed about 4-fold uptake in TK-expressing cells (B16-TK and LLC-TK) compared to GFP control cells. [18F] FDG binds only about twice as much in TK cells as in cells expressing GFP. The detection of tumors in an animal model of pulmonary metastasis with [18F] FDG occurred 15 days after lesion establishment. However, the in vivo studies with [18F] FHBG, the uptake was only found in the intestinal region, over the 3 weeks in which the mice were followed. Immunotherapy with cells treated by the combination of p19Arf and IFNβ, in C57BL6 mice with pulmonary metastasis, reduced the size of the metastatic foci in treated animals. Conclusions: In this study we demonstrate the standardization of [18F] FHBG synthesis and its use in in vitro and in vivo. The in vitro studies have confirmed the specificity of [18F] FHBG to monitor HSV1-tk expression in cell lines. However, [18F] FHBG did not accumulate in the metastatic lesions in vivo and further studies will be required for a better characterization using [18F] FHBG. The outcome of the combined treatment of p19Arf and IFNβ was promising for the treatment of metastatic lesions.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / The unit of sugar and base connected by a N-β-glycosyl linkage is named a nucleoside. In the present work the nucleoside thymidine, whose molecular formula is C10N2O5H14, was studied by Raman spectroscopy, subjecting it extreme conditions of pressure and temperature, as well as X ray diffraction measurements. An auxiliary analysis of normal crystal vibration modes was performed using first principles calculations using the B3LYP functional together with the Gaussian bases 6-31G+(d) and potential energy distribution analysis (PED). These results, together with literature data and Raman spectroscopy measurements in several thymidine scattering geometries, allowed the identification of the various normal modes of crystal vibration. X-ray diffraction experiments were performed in the temperature range between 83 and 413 K. Experiments of Raman spectroscopy under extreme temperature conditions (20 to 380 K) were performed in the spectral range of 20 to 3400 cm-1. From the analysis of the results, it is possible to draw some conclusions. (i) The thymidine crystal remained stable throughout the investigated temperature range, indicating that the temperature effect is not sufficient to modify the hydrogen bonds present between the molecules in such a way as to modify the symmetry of the crystal. (ii) The material studied showed some slight changes in the vibrational spectra in the experiment performed at low temperatures, suggesting, if not a structural phase transition, at least some conformational modification of the thymidine molecules. Raman spectra of thymidine crystal were obtained for pressures up to 5.0 GPa in a diamond anvil cell. The results show the presence of anomaly in the Raman spectrum at pressures close to 3.0 GPa. This anomaly is characterized by disappearance of lattice modes, appearance of some internal modes, splitting of high wavenumbers modes, downshift of modes associated with hydrogen bonds, changes in the intensity of internal modes and discontinuities of the slopes of the wavenumbers versus pressure for several Raman modes. This set of modifications was interpreted as consequence of a phase transition undergone by thymidine close to 3.0 GPa. Further, decompression to atmospheric pressure generates the original Raman spectrum, showing that the pressure-induced phase transition undergone by thymidine crystals is reversible. A comparison with results on other nucleosides submitted to high pressure is also furnished. / Quando a pentose (glicose) e uma base nitrogenada unem-se por meio de uma ligaÃÃo N-β glicosÃdica forma-se uma molÃcula denominada de nucleosÃdeo. No presente trabalho o nucleosÃdeo timidina, cuja fÃrmula molecular à C10N2O5H14, foi estudado atravÃs de espectroscopia Raman, submetendo-o a condiÃÃes extremas de pressÃo e de temperatura, alÃm de medidas de difraÃÃo de raios X. Uma anÃlise auxiliar a respeito dos modos normais de vibraÃÃo do cristal foi realizada atravÃs de cÃlculos de primeiros princÃpios utilizando-se o funcional B3LYP em conjunto com as bases gaussianas 6-31G+(d) e anÃlise de distribuiÃÃo de energia potencial (PED). Esses resultados, juntamente com dados da literatura e medidas de espectrocopia Raman em diversas geometrias de esplalhamento na timidina permitiram uma identificaÃÃo dos vÃrios modos normais de vibraÃÃo do cristal. Os experimentos por difraÃÃo de raios X foram realizados no intervalo de temperatura entre 83 e 413 K. Experimentos de espectroscopia Raman sob condiÃÃes extremas de temperatura (20 a 380 K) foram realizados no intervalo espectral compreendido entre 20 e 3400 cm-1. Da anÃlise dos resultados, à possÃvel tirar algumas conclusÃes. (i) O cristal de timidina manteve-se estÃvel em todo o intervalo de temperatura investigado, indicando que o efeito de temperatura nÃo à suficiente para modificar as ligaÃÃes de hidrogÃnio presentes entre as molÃculas de tal forma que haja modificaÃÃo da simetria do cristal. (ii) O material estudado apresentou algumas leves mudanÃas nos espectros vibracionais no experimento realizado a baixas temperaturas, sugerindo, se nÃo uma transiÃÃo de fase estrutural, pelo menos alguma modificaÃÃo conformacional das molÃculas da timidina. Experimentos submetendo o cristal a pressÃes de atà 5 GPa foram realizados utilizando-se uma cÃlula de pressÃo a extremos de diamantes. Os resultados mostraram anomalias nos espectros Raman por volta de 3.0 GPa. Essas anomalias foram caracterizadas pelo desaparecimento de alguns modos de rede, surgimento de alguns modos internos, deslocamento para menores nÃmeros de onda de modos associados a ligaÃÃes de hidrogÃnio e descontinuidades dos coeficientes lineares de vÃrios modos nos grÃficos de nÃmero de onda em funÃÃo da pressÃo. Essa sÃrie de modificaÃÃes foram interpretadas como consequÃncia de uma transiÃÃo de fase sofrida pela timidina por volta de 3.0 GPa. AlÃm disso, a descompressÃo da amostra atà a pressÃo atmosfÃrica mostrou que a transiÃÃo de fase à reversÃvel. TambÃm fornecemos uma comparaÃÃo com resultados de outros nucleosÃdeos submetidos a altas pressÃes.

BARBOZA, F. M. Estudo das propriedades vibracionais do cristal de timidina em condições extremas de pressão e temperatura. 2017. 187 f. Tese (Doutorado em Física) – Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Giordana Silva (giordana.nascimento@gmail.com) on 2017-04-17T18:08:44Z No. of bitstreams: 1 2017_tese_fmbarboza.pdf: 14915098 bytes, checksum: 92c70871f92588cea1807a2552402d46 (MD5) / Approved for entry into archive by Giordana Silva (giordana.nascimento@gmail.com) on 2017-04-17T18:09:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_tese_fmbarboza.pdf: 14915098 bytes, checksum: 92c70871f92588cea1807a2552402d46 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T18:09:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_tese_fmbarboza.pdf: 14915098 bytes, checksum: 92c70871f92588cea1807a2552402d46 (MD5) Previous issue date: 2017 / The unit of sugar and base connected by a N-β-glycosyl linkage is named a nucleoside. In the present work the nucleoside thymidine, whose molecular formula is C10N2O5H14, was studied by Raman spectroscopy, subjecting it extreme conditions of pressure and temperature, as well as X ray diffraction measurements. An auxiliary analysis of normal crystal vibration modes was performed using first principles calculations using the B3LYP functional together with the Gaussian bases 6-31G+(d) and potential energy distribution analysis (PED). These results, together with literature data and Raman spectroscopy measurements in several thymidine scattering geometries, allowed the identification of the various normal modes of crystal vibration. X-ray diffraction experiments were performed in the temperature range between 83 and 413 K. Experiments of Raman spectroscopy under extreme temperature conditions (20 to 380 K) were performed in the spectral range of 20 to 3400 cm-1. From the analysis of the results, it is possible to draw some conclusions. (i) The thymidine crystal remained stable throughout the investigated temperature range, indicating that the temperature effect is not sufficient to modify the hydrogen bonds present between the molecules in such a way as to modify the symmetry of the crystal. (ii) The material studied showed some slight changes in the vibrational spectra in the experiment performed at low temperatures, suggesting, if not a structural phase transition, at least some conformational modification of the thymidine molecules. Raman spectra of thymidine crystal were obtained for pressures up to 5.0 GPa in a diamond anvil cell. The results show the presence of anomaly in the Raman spectrum at pressures close to 3.0 GPa. This anomaly is characterized by disappearance of lattice modes, appearance of some internal modes, splitting of high wavenumbers modes, downshift of modes associated with hydrogen bonds, changes in the intensity of internal modes and discontinuities of the slopes of the wavenumbers versus pressure for several Raman modes. This set of modifications was interpreted as consequence of a phase transition undergone by thymidine close to 3.0 GPa. Further, decompression to atmospheric pressure generates the original Raman spectrum, showing that the pressure-induced phase transition undergone by thymidine crystals is reversible. A comparison with results on other nucleosides submitted to high pressure is also furnished. / Quando a pentose (glicose) e uma base nitrogenada unem-se por meio de uma ligação N-β glicosídica forma-se uma molécula denominada de nucleosídeo. No presente trabalho o nucleosídeo timidina, cuja fórmula molecular é C10N2O5H14, foi estudado através de espectroscopia Raman, submetendo-o a condições extremas de pressão e de temperatura, além de medidas de difração de raios X. Uma análise auxiliar a respeito dos modos normais de vibração do cristal foi realizada através de cálculos de primeiros princípios utilizando-se o funcional B3LYP em conjunto com as bases gaussianas 6-31G+(d) e análise de distribuição de energia potencial (PED). Esses resultados, juntamente com dados da literatura e medidas de espectrocopia Raman em diversas geometrias de esplalhamento na timidina permitiram uma identificação dos vários modos normais de vibração do cristal. Os experimentos por difração de raios X foram realizados no intervalo de temperatura entre 83 e 413 K. Experimentos de espectroscopia Raman sob condições extremas de temperatura (20 a 380 K) foram realizados no intervalo espectral compreendido entre 20 e 3400 cm-1. Da análise dos resultados, é possível tirar algumas conclusões. (i) O cristal de timidina manteve-se estável em todo o intervalo de temperatura investigado, indicando que o efeito de temperatura não é suficiente para modificar as ligações de hidrogênio presentes entre as moléculas de tal forma que haja modificação da simetria do cristal. (ii) O material estudado apresentou algumas leves mudanças nos espectros vibracionais no experimento realizado a baixas temperaturas, sugerindo, se não uma transição de fase estrutural, pelo menos alguma modificação conformacional das moléculas da timidina. Experimentos submetendo o cristal a pressões de até 5 GPa foram realizados utilizando-se uma célula de pressão a extremos de diamantes. Os resultados mostraram anomalias nos espectros Raman por volta de 3.0 GPa. Essas anomalias foram caracterizadas pelo desaparecimento de alguns modos de rede, surgimento de alguns modos internos, deslocamento para menores números de onda de modos associados a ligações de hidrogênio e descontinuidades dos coeficientes lineares de vários modos nos gráficos de número de onda em função da pressão. Essa série de modificações foram interpretadas como consequência de uma transição de fase sofrida pela timidina por volta de 3.0 GPa. Além disso, a descompressão da amostra até a pressão atmosférica mostrou que a transição de fase é reversível. Também fornecemos uma comparação com resultados de outros nucleosídeos submetidos a altas pressões.