In order to develop a stable strain of Bacillus megaterium for Keratinase production, the Keratinase gene (KerA) of Bacillus lichiniformis ATCC 53757 and SPlipA gene from plasmid pHIS1525.SPlipA (Bacillus megaterium origin) were PCR amplified and constructed to give a gene cassette called SPK . Then the gene cassette SPK was cloned into the Integration vector, pMUTIN-GFP+ 6192bps and transformed in Bacillus megaterium ATCC 14945. The chromosomal integration was created using homologous single crossing over mechanism. The strong natural promoter from the chromosomal locus of the SPK not only produced the increased extracellular enzyme, but also functions as a non inducible promoter which does not require any inducer for the production of the enzyme in the new integrant strain. The integrant strain was subjected to feather degradation test and found that it could totally digest the feather meal in complete seven days, resulting in a rich fermentation broth.

Die genomische Insel (GI) FhaGI 1 des Stammes Francisella hispaniensis (Fhis) AS02 814 kann sowohl in die tRNAVal integriert als auch als episomale Form vorliegen und kodiert für einen putativen Prophagen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch Verwendung synthetisch hergestellter, verkürzter Varianten von FhaGI-1 gezeigt werden, dass die GI auf andere Francisella Spezies übertragbar ist. Die ortsspezifische Integration und Exzision der GI sind Integrase-abhängige Prozesse, die durch weitere regulatorische Gene beeinflusst werden. Die Identifizierung der GI FphGI 1 in drei F. philomiragia-Stämmen zeigt, dass die tRNAVal als Integrationsort für GIs in Francisella dient. Die vermutlich nicht funktionale Integrase von FphGI 1 ist wahrscheinlich die Ursache für das Fehlen einer episomalen Form der GI. Das Vorhandensein von GIs in Francisella liefert einen Hinweis darauf, dass horizontaler Gentransfer zwischen verschiedenen Francisella Spezies möglich ist. Auf Grundlage von FhaGI 1 wurden zwei Varianten eines Francisella- Phagenintegrationsvektors (pFIV1-Val und pFIV2 Val) generiert. Der FIV Teil der Vektoren bildet eine zirkuläre, episomale Form, die nach der Transformation in verschiedene Francisella Spezies ortspezifisch in die tRNAVal integriert. Es konnte gezeigt werden, dass die Vektoren für die Expression von Reportergenen sowie die Komplementation von Francisella Deletionsmutanten geeignet sind. Sie sind sowohl in vitro als auch während der Infektion von Wirtszellen ohne Selektionsdruck stabil und zählen zu den low-copy-Vektoren. Damit erweitern die FIV-Vektoren das Repertoire der vorhandenen Werkzeuge zur genetischen Manipulation von Francisellen. Da der Stamm Fhis AS02 814 für Untersuchungen nicht zur Verfügung stand, wurde FhaGI 1 synthetisch in zwei Hälften hergestellt, die jedoch bisher nicht zusammengeführt werden konnten. Damit ist eine Aussage darüber, ob es sich bei FhaGI 1 tatsächlich um einen funktionalen Prophagen handelt, bis jetzt nicht möglich / The genomic island (GI) FhaGI 1 of strain Francisella hispaniensis (Fhis) AS02 814 can exist as a circular episomal form or integrated into the tRNAVal gene and codes for a putative prophage. In this work small-sized variants of FhaGI 1 were used to show that the GI can be transferred to other Francisella species. The site-specific integration and excision of the GI are integrase-dependent processes that are influenced by further regulatory genes. The identification of the GI FphGI 1 in three F. philomiragia strains shows that the tRNAVal gene serves as an integration site for GIs in Francisella. The integrase of FphGI 1 is probably non-functional and hence presumably the reason for the missing episomal form of the GI. The presence of GIs in Francisella might be an indication that horizontal gene transfer between different Francisella species could be possible. Two variants of a Francisella phage integration vector (pFIV1 Val and pFIV2 Val) were successfully constructed based on FhaGI 1. The FIV Val part of the vectors integrates site-specifically into the tRNAVal after transformation into different Francisella species. It was demonstrated that the vectors can be used for the expression of reporter genes as well as for the complementation of Francisella deletion mutants. They remain stable without selective pressure during in vitro growth and during the infection of host cells and fall into the group of low-copy-vectors. The FIV Val vectors expand the repertoire of tools that can be used for the genetic manipulation of Francisella. As strain Fhis AS02 814 could not be obtained for further analysis, FhaGI 1 was synthetically generated in two halves which could not be joined so far. Consequently, it is not possible to state whether FhaGI 1 actually codes for a functional prophage.