Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-19Bitstream added on 2014-06-13T19:01:04Z : No. of bitstreams: 1 cortezi_m_dr_rcla.pdf: 3248087 bytes, checksum: e21c1b169fc2c393d875a28a8db50b9a (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Penas consistem principalmente de queratina, estas são produzidas em grande quantidade como subproduto das indústrias de processamento de frangos, são ricas em aminoácidos os quais podem ser utilizados como suplemento protéico para ração animal, entretanto o processo de produção de farinha de penas é caro, já que requer uma grande quantidade de energia. Geralmente, as penas são cozidas em vapor sob pressão e quimicamente tratadas antes do uso. Portanto, a degradação microbiana de penas representa uma alternativa biotecnológica para aumentar o valor nutricional das mesmas. Porém as penas não podem ser degradadas por proteases comuns, sendo degradadas por enzimas denominadas queratinases. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção da enzima queratinase pela cepa Bacillus amyloliquefaciens isolada de uma indústria de processamento de frangos, sendo que esta cepa apresentou eficiência para ser utilizada em processos biotecnológicos. A produção da enzima e o crescimento da cepa foram influenciados pelas condições de cultivo, sendo que as condições ótimas para a produção da enzima foram 40ºC, 150 rpm, 1% de penas, pH 7.5. Os resultados mostraram que a liberação de aminoácidos no caldo de cultura, evidenciada pela cromatografia em camada delgada, permite seu uso em ração animal. A enzima foi parcialmente purificada, sendo inibida por EDTA podendo pertencer assim as metaloproteases. / Feathers consisting primarily of keratin, this are generated in huge quantities as a waste by-product in commercial poultry- processing plants, these are rich in aminoacids wich they can be utilizated as a dietary protein supplement for animal feed, however the meal production is an expensive process, requiring significant amounts of energy. Generally, the feathers are steam pressure cooked and chemically treated before use. Therefore, the microbial degradation of feathers represents an alternative technology to improve the nutritional value of feathers as wastes. Therefore in native state, keratin is not degradable by common proteolytic enzymes, its degradation by microorganisms is performed by specific proteases (keratinases). The objective this work was study the production of the enzyme keratinase produced for strain Bacillus amyloliquefaciens isolated of poultry processing plant, this strain showed efficient for application in biotechnological processes. The keratinase production and cell growth were affected by cultivation conditions. The results obtained under optimal conditions were 40ºC, 150 rpm, 1% of feather, pH 7.5. The results showed that the release of amino acids evidenced for the chromatography in thin layer, in the broth of the culture of Bacillus amyloliquefaciens can allow its use in the industries of animal ration (meal feather). The enzyme was partially purified, this was inhibited by EDTA belong the metaloproteases.

Orientador: Jonas Contiero / Banca: Flávio Faria de Moraes / Banca: Luis Henrique Souza Guimarães / Banca: Cecília Laluce / Banca: Fernando Carlos Pagnocca / Resumo: Penas consistem principalmente de queratina, estas são produzidas em grande quantidade como subproduto das indústrias de processamento de frangos, são ricas em aminoácidos os quais podem ser utilizados como suplemento protéico para ração animal, entretanto o processo de produção de farinha de penas é caro, já que requer uma grande quantidade de energia. Geralmente, as penas são cozidas em vapor sob pressão e quimicamente tratadas antes do uso. Portanto, a degradação microbiana de penas representa uma alternativa biotecnológica para aumentar o valor nutricional das mesmas. Porém as penas não podem ser degradadas por proteases comuns, sendo degradadas por enzimas denominadas queratinases. O objetivo deste trabalho foi estudar a produção da enzima queratinase pela cepa Bacillus amyloliquefaciens isolada de uma indústria de processamento de frangos, sendo que esta cepa apresentou eficiência para ser utilizada em processos biotecnológicos. A produção da enzima e o crescimento da cepa foram influenciados pelas condições de cultivo, sendo que as condições ótimas para a produção da enzima foram 40ºC, 150 rpm, 1% de penas, pH 7.5. Os resultados mostraram que a liberação de aminoácidos no caldo de cultura, evidenciada pela cromatografia em camada delgada, permite seu uso em ração animal. A enzima foi parcialmente purificada, sendo inibida por EDTA podendo pertencer assim as metaloproteases. / Abstract: Feathers consisting primarily of keratin, this are generated in huge quantities as a waste by-product in commercial poultry- processing plants, these are rich in aminoacids wich they can be utilizated as a dietary protein supplement for animal feed, however the meal production is an expensive process, requiring significant amounts of energy. Generally, the feathers are steam pressure cooked and chemically treated before use. Therefore, the microbial degradation of feathers represents an alternative technology to improve the nutritional value of feathers as wastes. Therefore in native state, keratin is not degradable by common proteolytic enzymes, its degradation by microorganisms is performed by specific proteases (keratinases). The objective this work was study the production of the enzyme keratinase produced for strain Bacillus amyloliquefaciens isolated of poultry processing plant, this strain showed efficient for application in biotechnological processes. The keratinase production and cell growth were affected by cultivation conditions. The results obtained under optimal conditions were 40ºC, 150 rpm, 1% of feather, pH 7.5. The results showed that the release of amino acids evidenced for the chromatography in thin layer, in the broth of the culture of Bacillus amyloliquefaciens can allow its use in the industries of animal ration (meal feather). The enzyme was partially purified, this was inhibited by EDTA belong the metaloproteases. / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-08-25Bitstream added on 2014-06-13T21:03:26Z : No. of bitstreams: 1 santos_e_dr_arafcf.pdf: 7245371 bytes, checksum: cb0c4511a4ad674226e788f40dc0c01a (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Enzimas são catalisadores fundamentais para os sistemas biológicos sendo amplamente estudadas e aplicadas em todo o mundo, especialmente na área da saúde. Neste trabalho foi avaliada a aplicação de enzimas quitinolíticas e queratinolíticas em ensaios in vitro contra Pedicullus humanus capitis e na degradação de calos humanos, respectivamente. Foram selecionados os micro-organismos com maior potencial para produção dessas enzimas e determinados os parâmetros de produção, as condições de separação, purificação e caracterização das enzimas. Os micro-organismos com maior potencial para a produção de quitinases e queratinases foram os fungos Metarhizium anisopliae CG374 e Aspergillus oryzae, respectivamente. As maiores produções de quitinases foram obtidas em biorreator a 28°C, pH 7,0, 1,5 vvm e 200 rpm após 120 h. Quando produzida em biorreator hiperbárico sob pressão de 5 bar, apresentou um aumento de 21,3% na produtividade em relação ao biorreator convencional. Para queratinases em biorreator, os parâmetros de produção foram 28°C, pH 6, 200 rpm, 1,5 vvm e 120 h. A produção das quitinases e queratinases em biorreator foi 83 e 154% maior do que em frascos Erlenmeyer, respectivamente. A quitinase foi concentrada 5,12 vezes na purificação apresentando massas molares aproximadas de 24, 28 e 80 kDa. Fração purificada contendo quitinase apresentou estabilidade a 40°C por 60 minutos. A queratinase foi concentrada 4,52 vezes após purificação com massas molares de 40 e 50 kDa apresentando estabilidade térmica a 40°C por 60 min. A avaliação das enzimas quitinolíticas frente a piolhos humanos apontou para uma eficiência 9,1% maior quando comparadas com produtos comerciais. A avaliação da ação de enzimas queratinolíticas na degradação de calos humanos demonstrou resultados significativos quando comparados com produtos disponíveis no mercado... / Enzymes are catalysts for fundamental biological systems is extensively studied and applied worldwide, especially in health. In this study were evaluated the application of enzymes chitinolytic and keratinolytic in tests in vitro against Pedicullus humanus capitis and degradation of human callus, respectively. Were selected microorganisms with the greatest potential for production of these enzymes and determined the production parameters, conditions of separation, purification and characterization of enzymes. The microorganisms with the higher potential for the production of chitinases and keratinases were Metarhizium anisopliae CG374 and Aspergillus oryzae, respectively. The highest yields of chitinases obtained in fermentations in a bioreactor were 28°C, pH 7.0, 1.5 vvm and 200 rpm after 120 h. When produced in the hyperbaric bioreactor at a pressure of 5 bar, an increase of 21.3% in yield over conventional production in a conventional bioreactor was observed. To keratinases in a bioreactor, the production parameters were 28°C, pH 6.0, 200 rpm, and 1.5 vvm after 120h. The production of chitinases and keratinases in bioreactor was 83 and 154% higher than in Erlenmeyer flasks, respectively. The chitinase was 5.12 times concentred on the purification presenting molar weight of approximately 24, 28 and 78 kDa. Fraction containing purified chitinase showed thermal stability of 40°C for 60 min. Keratinase was concentred 4.52 times after purification and presents molar weight of 40 and 50 kDa. The purified fraction was thermal stability at 40°C for 60 min. Evaluation of chitinolytic enzymes against human lice showed an efficiency of 9.1% higher for the enzymatic extract when compared with commercial products. The evaluation of the action of keratinolytic enzyme in the degradation of human callus showed significative results when compared to products on the market less time reaching maximum degradation

A recombinant Bacillus megaterium strain with a chromosomally integrated gene kerA, expressing keratinase, was analyzed regarding action in specific environmental stresses to obtain optimum parameters necessary for bacterial growth and optimal expression of the recombinant gene.The strain was grown on chicken feathers as substrate and the degradation of feather keratin during the growth was investigated with different levels of pH, temperature and feather concentration in the broth. Two strains were analyzed, capable to grow with 575 x and 1025 x amounts of antibiotics, erythromycin, where the strain of 1025 x showed higher potential for expression. Maximum keratinolytic activity was achieved at a pH of value 8.5, at temperature of 45 °C and substrate concentration of 0.2 % (w/v). The growth rate was determined by total plate count, which indicated that there was an increasing number of colony forming units together with increasing concentration of soluble keratin. The diluted fractions did not appear to produce colonies to any significant amount. However the results for which reason the results for optimal growth conditions are guidelines for future analysis for a chromosomally recombinant Bacillus megaterium. / Program: Master of Science with a Major in Resource Recovery – Industrial Biotechnology

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-08-25Bitstream added on 2014-06-13T18:31:30Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_gm_me_rcla.pdf: 243960 bytes, checksum: a79bd4d2995d8e646a1a343bffbaba1d (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Neste trabalho estudou-se a queratinase produzida por uma cepa de Streptomyces sp LMI-1 isolada de uma fábrica de processamento de aves domésticas. A enzima degradou 87% das penas após 120h de cultivo. Ela foi estimulada por íons Ba+2 e inibida por Ca+2, Mn+2, EDTA e Hg+. O pH ótimo de atividade da enzima foi 8,5 e a temperatura de maior atividade foi 60oC. A enzima é estável por até 2h em 50oC. Na análise do caldo de cultura detectou-se a presença dos aminoácidos serina, metionina, prolina, tirosina e leucina logo após 72h de cultivo. A enzima apresenta potencial para utilização industrial na produção de ração animal. / In the present work was studied keratinase produced by Streptomyces sp LMI-1 isolated of an industrial plant of poultry processing when cultived with feathers as a carbon source. The enzyme degraded 87% of feathers after 120 hours. The enzyme was stimulated by Ba+2 and inhibited by Ca+2, Mn+2, EDTA and Hg+. The optimum pH and temperature for the enzyme was 8,5 and 60oC, respectively. The enzyme was stable after 2 hours at 50oC. The culture broth analysis by thin layer chromatogram showed presence of amino acids serine, methionine, proline, tyrosine and leucine after 72 hours of incubation. The enzyme presents potential for industrial use in the production of animal feed preparation.

Orientador: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Suraia Said / Banca: Luiz Henrique Souza Guimarães / Banca: Tais Maria Bauab / Banca: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Resumo: Enzimas são catalisadores fundamentais para os sistemas biológicos sendo amplamente estudadas e aplicadas em todo o mundo, especialmente na área da saúde. Neste trabalho foi avaliada a aplicação de enzimas quitinolíticas e queratinolíticas em ensaios in vitro contra Pedicullus humanus capitis e na degradação de calos humanos, respectivamente. Foram selecionados os micro-organismos com maior potencial para produção dessas enzimas e determinados os parâmetros de produção, as condições de separação, purificação e caracterização das enzimas. Os micro-organismos com maior potencial para a produção de quitinases e queratinases foram os fungos Metarhizium anisopliae CG374 e Aspergillus oryzae, respectivamente. As maiores produções de quitinases foram obtidas em biorreator a 28°C, pH 7,0, 1,5 vvm e 200 rpm após 120 h. Quando produzida em biorreator hiperbárico sob pressão de 5 bar, apresentou um aumento de 21,3% na produtividade em relação ao biorreator convencional. Para queratinases em biorreator, os parâmetros de produção foram 28°C, pH 6, 200 rpm, 1,5 vvm e 120 h. A produção das quitinases e queratinases em biorreator foi 83 e 154% maior do que em frascos Erlenmeyer, respectivamente. A quitinase foi concentrada 5,12 vezes na purificação apresentando massas molares aproximadas de 24, 28 e 80 kDa. Fração purificada contendo quitinase apresentou estabilidade a 40°C por 60 minutos. A queratinase foi concentrada 4,52 vezes após purificação com massas molares de 40 e 50 kDa apresentando estabilidade térmica a 40°C por 60 min. A avaliação das enzimas quitinolíticas frente a piolhos humanos apontou para uma eficiência 9,1% maior quando comparadas com produtos comerciais. A avaliação da ação de enzimas queratinolíticas na degradação de calos humanos demonstrou resultados significativos quando comparados com produtos disponíveis no mercado... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Enzymes are catalysts for fundamental biological systems is extensively studied and applied worldwide, especially in health. In this study were evaluated the application of enzymes chitinolytic and keratinolytic in tests in vitro against Pedicullus humanus capitis and degradation of human callus, respectively. Were selected microorganisms with the greatest potential for production of these enzymes and determined the production parameters, conditions of separation, purification and characterization of enzymes. The microorganisms with the higher potential for the production of chitinases and keratinases were Metarhizium anisopliae CG374 and Aspergillus oryzae, respectively. The highest yields of chitinases obtained in fermentations in a bioreactor were 28°C, pH 7.0, 1.5 vvm and 200 rpm after 120 h. When produced in the hyperbaric bioreactor at a pressure of 5 bar, an increase of 21.3% in yield over conventional production in a conventional bioreactor was observed. To keratinases in a bioreactor, the production parameters were 28°C, pH 6.0, 200 rpm, and 1.5 vvm after 120h. The production of chitinases and keratinases in bioreactor was 83 and 154% higher than in Erlenmeyer flasks, respectively. The chitinase was 5.12 times concentred on the purification presenting molar weight of approximately 24, 28 and 78 kDa. Fraction containing purified chitinase showed thermal stability of 40°C for 60 min. Keratinase was concentred 4.52 times after purification and presents molar weight of 40 and 50 kDa. The purified fraction was thermal stability at 40°C for 60 min. Evaluation of chitinolytic enzymes against human lice showed an efficiency of 9.1% higher for the enzymatic extract when compared with commercial products. The evaluation of the action of keratinolytic enzyme in the degradation of human callus showed significative results when compared to products on the market less time reaching maximum degradation / Doutor

Resumo: Neste trabalho estudou-se a queratinase produzida por uma cepa de Streptomyces sp LMI-1 isolada de uma fábrica de processamento de aves domésticas. A enzima degradou 87% das penas após 120h de cultivo. Ela foi estimulada por íons Ba+2 e inibida por Ca+2, Mn+2, EDTA e Hg+. O pH ótimo de atividade da enzima foi 8,5 e a temperatura de maior atividade foi 60oC. A enzima é estável por até 2h em 50oC. Na análise do caldo de cultura detectou-se a presença dos aminoácidos serina, metionina, prolina, tirosina e leucina logo após 72h de cultivo. A enzima apresenta potencial para utilização industrial na produção de ração animal. / Abstract: In the present work was studied keratinase produced by Streptomyces sp LMI-1 isolated of an industrial plant of poultry processing when cultived with feathers as a carbon source. The enzyme degraded 87% of feathers after 120 hours. The enzyme was stimulated by Ba+2 and inhibited by Ca+2, Mn+2, EDTA and Hg+. The optimum pH and temperature for the enzyme was 8,5 and 60oC, respectively. The enzyme was stable after 2 hours at 50oC. The culture broth analysis by thin layer chromatogram showed presence of amino acids serine, methionine, proline, tyrosine and leucine after 72 hours of incubation. The enzyme presents potential for industrial use in the production of animal feed preparation. / Orientador: Jonas Contiero / Coorientador: Eleonora Cano Carmona / Banca: José Carlos Marconato / Banca: Eloízio Júlio Ribeiro / Mestre

The keratinase gene (kerA) of Bacillus licheniformis ATCC®53757 was PCR amplified and subsequently cloned into Bacillus megaterium expression vector; pHIS1525.SPlipA and transformed in Bacillus megaterium ATCC®14945. The kerA gene carrying the recombinant plasmid pKERHIS1525.SPlipA was expressed in Bacillus megaterium under xylose inducible promoter, purified using Ni-NTA affinity column chromatography and consequently produced an extracellular keratinase activity of 29 U ml-1 after 18 h of incubation. The recombinant strain was further examined for feather degradation of intact chicken feathers. The chopped chicken feathers were partially degraded by the recombinant strain after 3days and the total macroscopic digestion was ultimately observed after seven days resulting in a yellowish peptide rich fermentation broth.

In order to develop a stable strain of Bacillus megaterium for Keratinase production, the Keratinase gene (KerA) of Bacillus lichiniformis ATCC 53757 and SPlipA gene from plasmid pHIS1525.SPlipA (Bacillus megaterium origin) were PCR amplified and constructed to give a gene cassette called SPK . Then the gene cassette SPK was cloned into the Integration vector, pMUTIN-GFP+ 6192bps and transformed in Bacillus megaterium ATCC 14945. The chromosomal integration was created using homologous single crossing over mechanism. The strong natural promoter from the chromosomal locus of the SPK not only produced the increased extracellular enzyme, but also functions as a non inducible promoter which does not require any inducer for the production of the enzyme in the new integrant strain. The integrant strain was subjected to feather degradation test and found that it could totally digest the feather meal in complete seven days, resulting in a rich fermentation broth.

Estudou-se Microsporum gypseum de diferentes fontes regiões geográficas do Brasil.Os fungos foram isolados do solo, de animais e obtidos em coleções de cultura. Em 692 amostras de solo e a taxa de recuperação foi de 19,2%. A atividade queratinolítica e elastinolítica foi avaliada quantitativamente em 138 amostras de M. gypseum. A biotipagem molecular foi realizado através da técnica de PCR-RFLP com a enzima MvaI. O seqüenciamento da região ITS1 do rDNA foi realizado em amostras representativas. M. gypseum de amostras clínicas e do solo mostraram diferenças quantitativas significantes na expressão das enzimas. A PCR-RFLP para a região ITS1 não mostrou diferença. Pelo seqüenciamento foram obtidas duas espécies sexuadas (A. gypseum e A. incurvatum). As atividades enzimáticas sugerem um importante papel na patogenicidade e uma provável adaptação desta espécie de fungo ao parasitismo animal. A análise dos resultados pode auxiliar a identificação e o conhecimento de mecanismos de virulência destes fungos. / Microsporum gypseum from different geographical sources and regions of Brazil were studied. The fungi were isolated from the soil, animals and obtained in collections of culture. In 692 samples of soil, the recovery rate was 19.2%. The keratinolytic and elastinolytic activities were quantitatively performed on 138 samples of M. gypseum. The molecular biotyping was carried out by the technique of PCR-RFLP with the enzyme MvaI. The sequencing of the region ITS1 rDNA was carried out on representative samples. Samples of M. gypseum from clinical isolates and from soil showed significant quantitative differences in the expression of enzymes. The PCR-RFLP for the ITS1 region showed no difference. For the sequencing was obtained two sexual species (A. gypseum and A. incurvatum). The enzyme activities suggest an important role in pathogenicity and a likely adjustment of this kind of parasitic fungus to feed. The results may help the identification and knowledge of mechanisms of virulence of these fungi.