Les RCPG sont exprimés dans tous types de tissus et sont impliqués dans la régulation de nombreux processus biologiques et ont pour rôle de capter un vaste panel de stimuli extracellulaires qu'ils transmettent à l'intérieur de la cellule. Récemment, le laboratoire a identifié une nouvelle famille de dix protéines, les GASP, qui interagissent avec les RCPG et moduleraient leur trafic intracellulaire. Alors que GASP-1 est le membre de cette famille le mieux caractérisé et que son interaction avec de nombreux RCPG soit documentée, peu d'informations sont disponibles sur les modalités d'interaction de cette protéineavec les RCPG au niveau moléculaire. La première partie de ce projet de thèse a consisté à étudier les modalités d'interaction entre les GASPs et les RCPG au niveau moléculaire. Nous avons ainsi pu montrer à l'aide de techniques biochimiques et biophysiques, l'importance d'un motif répété et conservé de 15 acides aminés pour l'interaction de GASP-1 avec divers RCPG. Par la suite, les résultats obtenus ont été exploités pour mettre en place un essai de criblage qui nous a permis d'identifier des petites molécules capables de perturber l'interaction entre GASP-1 et le récepteur beta-2 adrénergique. Enfin, l'absence de données structurales sur les protéines de la famille GASP nous a ensuite poussé à la réalisation d'études structurales de ces protéines à la fois par cristallographie et par RMN. Bien que les résultats obtenus ne nous aient pas encore permis d'obtenir la structure de ces protéines, des expériences préliminaires de RMN ont permis deconfirmer l'implication des acides aminés tryptophanes présents au sein des motifs GASP dans l'interaction avec les RCPG.

Les travaux décrits dans ce mémoire ont pour objectif d'une part le développementd'une nouvelle famille de protéines artificielles et d'autre part la création de nouveaux sitesde fixation spécifiques dans ces protéines. L'objectif général était de développer une approchegénérale permettant d'obtenir rapidement des protéines reconnaissant toute macromoléculecible choisie. On peut voir ces protéines artificielles spécifiques comme des sortes d'anticorpsartificiels pour leur spécificité et leur affinité mais dont les propriétés physiques : stabilité,solubilité, efficacité d'expression, insensibilité à l'agrégation sont nettement plus favorablesque celles des anticorps et de leur dérivés.Le premier chapitre, présente la conception et la construction d'une bibliothèque deprotéines artificielles dite de première génération où les protéines sont formées par larépétition d'un motif idéalisé à partir d'une famille de motifs naturels appelés HEAT repeats.Toutes les protéines de la bibliothèque, dénommées αRep, sont conçues pour avoir la mêmearchitecture générale mais diffèrent les unes des autres par le nombre de motifs et par laséquence dans certaines positions rendues variables au sein de chaque motif. Cette banquenous a permis de valider l'architecture αRep choisie : Les protéines s'expriment sous formesoluble, sont très stables et adoptent la structure secondaire et tertiaire attendue quel que soitla séquence des positions hypervariables. Le second chapitre présente alors les approchessuivies pour l'amélioration de la qualité et de la diversité de la bibliothèque et a conduit à laconstruction d'une bibliothèque d'αRep de deuxième génération. Cette dernière bibliothèque(2 .1) repose sur le même schéma général mais contient une diversité ayant été optimiséelors de la conception puis améliorée expérimentalement par une procédure dite deFiltration/shuffling. Cette bibliothèque très diverse (1.7*109 clones indépendants) a été alorsexploitée pour y rechercher, par des méthodes d'exposition sur phages, de nouvelles αRepreconnaissant des protéines cibles préalablement choisies. L'ensemble des résultats montretrès clairement que des αRep reconnaissant spécifiquement, avec une affinité élevée, desprotéines cibles choisies arbitrairement peuvent être effectivement obtenues. Les structurestridimensionnelles de plusieurs complexes formés entre les αRep et leur cible a été résoluepermet de comprendre la nature et l'organisation précise de ces capacités de reconnaissancemoléculaire nouvellement créées.

La drépanocytose est une maladie génétique qui se caractérise par des globules rouges en forme de faucille. Chez les personnes atteintes de drépanocytose, ces globules rouges (GR) adhèrent à l’endothélium vasculaire et provoquent ainsi une vaso-occlusion. Ce phénomène s’explique par la surexpression de la protéine Lutheran (Lu) à la surface des globules rouges falciformes qui se lie fortement à la Laminine (Ln) 511/521 exprimée par l’endothélium vasculaire enflammé. Le but de cette étude est d’identifier un inhibiteur d’interaction protéine-protéine (PPI) qui possède une forte probabilité de liaison à Lu afin d’inhiber l’interaction Lu-Ln 511/521. Un criblage virtuel de 1 295 678 composés ciblant la protéine Lu a été réalisé. La validation préalable d’un protocole de scoring a été envisagée sur la protéine CD80 qui présente un site de liaison avec des caractéristiquestopologiques et physico-chimiques similaires au site de liaison prédit sur Lu ainsi que plusieurs ligands avec des constantes d’affinité connues. Ce protocole contient différentes étapes de sélection basées sur les affinités calculées (scores), des simulations de dynamique moléculaire et les propriétés moléculaires. Un protocole de scoring fiable a été validé sur CD80 avec le programme de docking DOCK6 et les fonctions de scoring XSCORE et MM-PBSA ainsi qu’avec la méthode decalcul FMO. L’application de ce protocole sur Lu a permis d’obtenir deux ligands validés par des tests in vitro qui font l’objet d’un dépôt de brevet. La fonction de scoring XSCORE a permis d’identifier neuf autres ligands qui semblent aussi être des candidats prometteurs pour inhiber l’interaction Lu-Ln 511/521. / Drepanocytosis is a genetic blood disorder characterized by red blood cells that assume an abnormal sickle shape. In the pathogenesis of vaso-occlusive crises of sickle cell disease, red blood cells bind to the vascular endothelium and promote vaso-occlusion. At the surface of these sickle red blood cells, the overexpressed protein Lutheran (Lu) strongly interacts with the Laminin (Ln) 511/521.The aim of this study was to identify a protein-protein interaction (PPI) inhibitor with a highprobability of binding to Lu for the inhibition of the Lu-Ln 511/521 interaction. A virtual screening was performed with 1 295 678 compounds that target Lu. Prior validation of a robust scoring protocol was considered on the protein CD80 because this protein has a binding site with similar topological and physico-chemical characteristics and it also has a series of ligands with known affinity constants. This protocol consisted of multiple filtering steps based on calculated affinities (scores), molecular dynamics simulations and molecular properties. A robust scoring protocol was validated on the protein CD80 with the docking program DOCK6 and the scoring functions XSCORE and MM-PBSA and also with the FMO method. This protocol was applied to the protein Lu and we found two compounds that were validated by in vitro studies. The protection of these ligands by a patent is under process. Nine other compounds were identified by the scoring functionXSCORE and seem to be promising candidates for inhibiting the Lu-Ln 511/521 interaction.

Les gibbérellines (GA) sont des phytohormones qui régulent divers aspects du développement en réponse aux signaux endogènes et exogènes à la plante. Ainsi face à un stress, les niveaux de GA sont finement contrôlés, permettant une croissance adaptée aux contraintes environnementales. Au niveau moléculaire, les GA stimulent la croissance de la plante en s’opposant aux protéines DELLAs (DELLAs), facteurs nucléaires qui inhibent la croissance. Les DELLAs présentent plusieurs caractéristiques fonctionnelles notables, une activité transactivatrice et la capacité d’interagir avec d’autres protéines régulatrices, comme les répresseurs de la signalisation Jasmonate (JA), JA ZIM-domain (JAZ). Le génome d’Arabidopsis thaliana code pour cinq DELLAs possédant des fonctions redondantes et spécifiques. Le but de mon travail de thèse a été la caractérisation de la fonction biologique d’une DELLA, RGA-LIKE3 (RGL3). J’ai pu montrer que RGL3 modifie la défense de la plante face à des stresses biotiques. / The phytohormones gibberellins (GA) regulate major aspects of plant growth in response to endogenous and environmental signals. Upon the perception of stress, the levels of bioactive GA are adjusted, hence allowing a flexible growth response to environmental variability. At a molecular level, GA promote growth by stimulating the degradation of the growth repressing DELLA proteins. DELLAs are versatile nuclear proteins with several remarkable features, such as transactivation activity and protein–protein interaction capacities. Thus DELLAs interact with a series of highly divergent proteins, including different transcription factor families, but also the Jasmonate (JA) ZIM-domain (JAZ) proteins, repressors of JA signaling. The aim of this thesis work consisted in the characterization of the biological function of the DELLA RGA-LIKE3. I could show that RGL3 modulates plant defense responses against biotic stresses.

Les peptides pénétrants sont de petits peptides capables de se rentrer dans les cellules sans endommager la membrane, présentant un grand potentiel dans la délivrance de diverses cargaisons, y compris des peptides, pour le traitement du cancer ainsi que d'autres maladies. Les peptides comme médicaments, bénéficient d'être spécifiques, relativement sûrs, faciles à produire et faciles à modifier. Cependant, des défis significatifs demeurent concernant l'application de peptides en tant qu'agents thérapeutiques. L'identification des motifs de liaison des peptides est difficile et les peptides se comportent généralement avec une perméabilité cellulaire faible et une sensibilité à l'hydrolyse des proteases. Dans le présent travail, nous avons caractérisé deux interactions protéine-protéine Ras/Raf et PP2A/SET qui sont impliqués dans la régulation de la transformation tumorale et de l'apoptose. Nous avons identifié le site de liaison parmi ces protéines (peptides interférents). Ces peptides interférents ont été associés à une navette optimisée pour générer des peptides chimériques capables de dissocier ces interactions protéine/protéine. Les peptides chimeriques ont été testés in vitro et in vivo, montrant un effet anti-tumor. Ces peptides pourraient être considérés comme des candidats prometteurs pour des applications futures en tant que vecteurs pour la délivrance de médicaments intracellulaires. / Cell penetrating peptides are small peptides which are able to translocate into cells without causing membrane damage, presenting a great potential in the delivery of various cargos including peptides, for the treatment of cancer as well as other diseases. Peptides as drugs, benefit from being specific, relative safe, easy to produce and easy to modify. However, significant challenges remain regarding the application of peptides as therapeutic agents. Identification of the binding motifs of the peptides is difficult, and peptides generally behave low-cellular permeability and sensitivity to proteases hydrolysis. In the present work, we characterized two protein-protein interactions Ras/Raf and PP2A/SET that are involved in the regulation of tumor transformation and apoptosis. We have identified the binding site among these proteins (interfering peptides). These interfering peptides were associated to an optimized shuttle to generate chimeric peptides able to dissociate these protein/protein interactions. The chimeric peptides were tested in vitro an in vivo, showing an anti-tumor effect. These peptides could be considered as promising candidates for future applications as vectors for intracellular drugs delivery.

Résumé confidentiel / Résumé confidentiel

Le système de sécrétion de type II (T2SS) est largement répandu chez les bactéries à Gram négatif. Il permet la sécrétion d’enzymes lytiques et de toxines. Chez la bactérie phytopathogène Erwinia chrysanthemi, les pectinases, sécrétées par ce système appelé Out, dégradent la pectine, provoquant les symptômes de pourriture molle. La sécrétion par le T2SS se passe en 2 étapes : les protéines traversent la membrane interne par le système Sec ou le système Tat. Une fois dans le périplasme, elles sont repliées et transloquées par le T2SS à travers la membrane externe. Le système Out est composé de 14 protéines intégrées ou associées à l’une des deux membranes. Son assemblage et son fonctionnement restent obscurs. Une plateforme serait formée dans la membrane interne par OutE, -F, -L, -M et –C. Ces trois derniers composants sont des protéines bitopiques dont la stœchiométrie et le rôle sont inconnus. Pour identifier des interactions entre ses composants, nous avons utilisé le double-hybride bactérien, basé sur la reconstitution de l’activité d’adénylate cyclase. Nous avons démontré que le domaine de type ferrédoxine, situé en C-terminus d’OutL et d’OutM, est directement impliqué dans l’homo- et l’hétérodimérisation de ces protéines. Une interaction entre les régions périplasmiques d’OutC et d’OutD a été aussi détectée (Login et al., 2010). Pour mieux analyser les multiples interactions au sein du T2SS, des expériences de triple-hybride ont été réalisées en co-exprimant différentes combinaisons des régions solubles de trois composants. Nos résultats suggèrent qu’OutL empêche l’interaction entre OutC et OutD. Par ailleurs, OutL est impliquée dans l’activation de l’ATPase OutE, le moteur du système (Camberg et al., 2007). OutL serait donc impliquée dans la transmission du signal entre le périplasme et le cytoplasme et pourrait intervenir dans la dissociation du complexe OutD/OutC. Afin d’analyser le rôle des segments transmembranaires (TMS) de composants du T2SS, nous avons adapté la technique du double-hybride. Le domaine de la protéine rapporteur Cya a été fusionné au N-terminus du TMS et BlaM au C-terminus. BlaM sert à contrôler la topologie correcte des fusions dans la membrane. Plusieurs interactions bi-partenaires entre les TMS d’OutC, OutL et OutM ont été ainsi détectées. Ce travail a été complété par une étude in vitro (pull-down) et par mutagenèse dirigée. Ces interactions TMS-TMS pourraient intervenir dans la transmission du signal du périplasme vers le cytoplasme à travers la membrane interne. / The type II secretion system (T2SS) is widely used to secrete toxins and lytic enzymes by animal and plant pathogenic Gram-negative bacteria. The phytopathogen bacterium Erwinia chrysanthemi secretes several pectinases by the T2SS called Out and causes soft rot disease. The exoproteins cross the cytoplasmic membrane either by the Sec or Tat systems. Once in the periplasm, the folded exoproteins are translocated across the outer membrane by the T2S machinery. The Out system is composed of 14 proteins integrated in or associated with the two bacterial membranes. The molecular organization and the mode of action of the T2SS remain unclear. Several components of this T2SS, OutC, -L, -M, -F and -E, are thought to form a platform in the inner membrane OutC, -Land -M are bitopic inne membrane but their stoichiometry and role in secretion are unknown. We used a bacterial two-hybrid system to detect protein interactions We have shawn that the ferredoxin-like domain at the C-terminus of OutL and OutM allows homo- and - heterodimerization of these proteins. An interaction between OutC and OutD periplasmic regions has been detected (Login et al., 201 0). Three-hybrid has been performed and our results suggest that OutL would destabilize the interaction between OutC and OutD. Also, OutL is implicated in the activation of ATPase OutE, which is thought to be the motor of the system (Cam berg et al., 2007). Thus, OutL could be implicated in the signal transduction from periplasme to cytoplasm and could dissociate the OutC/ OutD complex. To analyse protein-protein interactions within bacterial membranes, we developed a system specially adapted from the bacterial two-hybrid. One of the sub-domain of Cya has been fused to the N-terminus of TMS and BlaM to the C-terminus. Correct topology of fusions can be controlled using BlaM properties. B using this assay znd site-directed mutagenesis, we detected multiple bi-partner interactions between the TMS of OutC, OutL and OutM.

ASF1 est un chaperon d’histones H3-H4 impliqué dans de nombreux cancers. Comme bon nombre de protéines, ce chaperon exerce ses fonctions dans la cellule à travers des interactions protéine-protéine qu’il établit avec d’autres partenaires protéiques. La présente thèse porte sur le développement d’une stratégie originale de design de peptides inhibiteurs de ce type d’interactions souvent associées à des maladies. Cette stratégie rationnelle et itérative repose sur le couplage d’épitopes de liaison provenant de différents partenaires de l’interaction, et leur stabilisation par l’introduction de résidus « ancre » permettant ainsi d’engager un grand nombre de contacts avec la cible. L’extension de cette approche vers des peptidomimes permet par la suite de surmonter les obstacles liés à l’utilisation des peptides en thérapeutique tels que la biodisponibilité et la demi-vie. Appliquée au ciblage d’ASF1, cette méthode a permis de concevoir un peptide, ip4, présentant une affinité de 3nM pour sa cible, soit 3000 fois supérieure au partenaire naturel H3. Ce même peptide a été mimé avec succès par un composé, if3, de nature oligourée. Efficacement internalisés à l’aide d’une Cell Penetrating Peptide clivable, ces inhibiteurs présentent un effet antiprolifératif provoquant la mort des cellules cancéreuse, vraisemblablement dû au ciblage spécifique d’ASF1. / ASF1 is a histone H3-H4 chaperone implicated in several cancers. Like many proteins, this chaperone mediates its cellular functions through protein-protein interactions involving various protein partners. The present thesis focuses on the development of an original strategy to design inhibitory peptides targeting such disease-associated type of biological interactions. This rational and iterative strategy relies on the tethering of binding epitopes isolated from different partners, and stabilized by “anchor” residues that engage large number of atomic contacts with the target. The further progression of this approach toward a peptidomimetic strategy overcomes obstacles commonly associated to the therapeutic use of peptides such as biodisponibility and half-life. Applied for targeting ASF1, such method allowed the conception of a peptide, ip4, presenting a 3nM affinity for its target, which is 3000 fold higher than that of the natural partner H3. This peptide could be successfully mimicked by an oligourea structure, giving rise to the peptidomimetic if3. When coupled to a cleavable Cell Penetrating Peptide, these inhibitors displayed an on-target effect where they impeded cancerous cells proliferation, ultimately resulting in cells death.

Au cours de cette thèse, nous avons étudié deux protéines par RMN : la créatine kinase musculaire (CK-MM) et le domaine UIM-SH3 de la protéine STAM2, seuls ou en interaction avec leurs partenaires. La CK-MM est une enzyme active sous forme dimérique. Elle appartient à la famille des guanidino-kinases et intervient dans le processus énergétique de la cellule. Le but de l'étude était d'élucider le mode de fonctionnement de la CK-MM. Pour cela, nous avons enregistré des expériences de relaxation R1, R2 et des expériences de perturbation de déplacement chimique sur la CK-MM libre et complexée avec MgADP et sous forme TSAC. Ces expériences montrent que la boucle 320s, spécifique à la reconnaissance des substrats, possède une dynamique rapide en absence de substrats et une dynamique ralentie en présence de substrats. La fixation des substrats dans les sites actifs de la CK-MM induit des modifications conformationelles importantes. La protéine STAM2 est composée de deux UBDs : VHS, et UIM et d'un domaine SH3 connu pour interagir avec des déubiquitinases UBPY et AMSH. Cette protéine est impliquée dans la voie de dégradation lysosomale. L'objectif de cette étude est la caractérisation du complexe SH3/ubiquitine. Pour cela, nous avons enregistré des expériences de perturbation de déplacement chimique et de relaxation R1, R2 et nOes sur le complexe UIM-SH3/ubiquitine. Ces expériences mettent en évidence que les domaines UIM et SH3 sont capables d'interagir chacun avec une ubiquitine, avec une affinité de l'ordre de la centaine de micromolaire. L'interface entre les UBDs et l'ubiquitine implique majoritairement des résidus hydrophobes et conservés

La réparation de l’ADN par excision des nucléotides (NER) est un mécanisme capable de retirer une large variété de lésions causant une distorsion de la double hélice, comme celles causées par les rayons ultraviolets (UV). Comme toutes les voies de réparation de l’ADN, la NER contribue à la prévention de la carcinogénèse en prévenant la mutation de l’ADN. Lors de ce processus, il y a d’abord reconnaissance de la lésion par la protéine XPC/Rad4 (humain/levure) qui recrute ensuite TFIIH. Ce complexe déroule l’ADN par son activité hélicase et recrute l’endonucléase XPG/Rad2 ainsi que d’autres protéines nécessaires à l’excision de l’ADN. Lors de son arrivée au site de lésion, XPG/Rad2 déplace XPC/Rad4. TFIIH agit également lors de la transcription de l’ADN, entre autres par son activité hélicase. Outre cette similarité de la présence de TFIIH lors de la transcription et la réparation, il est possible de se demander en quoi les deux voies sont similaires. Nous nous sommes donc intéressés aux interactions impliquant TFIIH et la machinerie de réparation de l’ADN. Nous avons donc entrepris une caractérisation structurale et fonctionnelle de ces interactions. Nous avons découvert que Rad2 et Rad4 possèdent un motif d’interaction en nous basant sur d’autres interactions de la sous-unité Tfb1 de TFIIH. Par calorimétrie à titrage isotherme, nous avons observé que les segments de ces deux protéines contenant ce motif interagissent avec une grande affinité au domaine PH de Tfb1. Le site de liaison de ces segments sur Tfb1PH est très semblable au site de liaison du domaine de transactivation de p53 et au domaine carboxy-terminal de TFIIEα avec Tfb1PH, tel que démontré par résonance magnétique nucléaire (RMN). De plus, tous ces segments peuvent faire compétition les uns aux autres pour la liaison à Tfb1PH. Nous avons aussi démontré in vivo chez la levure qu’une délétion de Tfb1PH crée une sensibilité aux radiations UV. De plus, la délétion de multiples segments de Rad2 et Rad4, dont les segments d’interaction à Tfb1PH, est nécessaire pour voir une sensibilité aux rayons UV. Ainsi, de multiples interactions sont impliquées dans la liaison de Rad2 et Rad4 à TFIIH. Finalement, les structures des complexes Rad2-Tfb1PH et Rad4-Tfb1PH ont été résolues par RMN. Ces structures sont identiques entre elles et impliquent des résidus hydrophobes interagissant avec des cavités peu profondes de Tfb1PH. Ces structures sont très semblables à la structure de TFIIEα-p62PH. Ces découvertes fournissent ainsi un lien important entre la transcription et la réparation de l’ADN. De plus, elles permettent d’émettre un modèle du mécanisme de déplacement de XPC/Rad4 par XPG/Rad2 au site de dommage à l’ADN. Ces connaissances aident à mieux comprendre les mécanismes de maintient de la stabilité génomique et peuvent ainsi mener à développer de nouvelles thérapies contre le cancer. / The nucleotide excision repair pathway (NER) is a mechanism capable of removing a wide variety of helix-distorting lesions, such as those caused by ultraviolet irradiation (UV). As all DNA repair pathways, NER contributes to the prevention of carcinogenesis by preventing DNA mutation. During this process, the lesion is first recognized by the protein XPC/Rad4 (human/yeast), which then recruits TFIIH. This complex unwinds the DNA with its helicase activity and then recruits the endonuclease XPG/Rad2 and other proteins necessary for DNA excision. Upon arrival at the lesion site, XPG/Rad2 displaces XPC/Rad4. TFIIH also acts in DNA transcription, using its helicase activity. In addition to the similarity of the presence of TFIIH in transcription and DNA repair, it is possible to ask ourselves how the two pathways are similar. We were interested in the interactions involving TFIIH and the DNA repair machinery. We have therefore undertaken a structural and functional characterization of these interactions. We have found that Rad2 and Rad4 have a motif of interaction based on other interactions of the Tfb1 subunit of TFIIH. Using isothermal titration calorimetry, we found that segments of these two proteins containing this motif interact with high affinity to the PH domain of Tfb1. The binding site of these segments is very similar to Tfb1PH binding site of transactivation domain of p53 and the carboxyl-terminal domain of TFIIEα with Tfb1PH, as demonstrated by nuclear magnetic resonance (NMR). In addition, these segments can compete with each other for binding to Tfb1PH. We also demonstrated in vivo that deletion of Tfb1PH in yeast creates a sensitivity to UV irradiation. In addition, the deletion of multiple segments of Rad2 and Rad4, including segments of interaction Tfb1PH, is required to observe a sensitivity to UV. Thus, multiple interactions are involved in the binding of TFIIH to Rad2 and Rad4. Finally, the structures of the Rad2-Tfb1PH and Rad4-Tfb1PH complexes were solved by NMR. These structures are identical to each other and involve hydrophobic residues interacting with shallow grooves on Tfb1PH. These structures are very similar to the structure of TFIIEα-p62PH. These findings provide an important mechanistic link between transcription and DNA repair. In addition, they provide a model of the mechanism of the displacement of XPC/Rad4 by XPG/Rad2 at the damaged site. This knowledge helps to better understand the mechanisms of genomic stability and can lead to novel cancer therapies.