Universiẗat, Diss., 2005--Hamburg. / Erscheinungsjahr an der Haupttitelstelle: 2004.

University, Diss., 2005--Bonn.

Univ., Diss., 2006--Kassel

Zugl.: Giessen, Univ., Diss., 2009

Die extrazellulär Signal-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) spielen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung kardialer Hypertrophie und dem Zellüberleben. Hypertrophe Stimuli aktivieren ERK1/2, triggern deren Dimerisierung und in der Folge die ERK188-Autophosphorylierung. Diese neu entdeckte Autophosphorylierung ist eine Voraussetzung für den nukleären Import von ERK1/2 und führt zum Entstehen pathologischer kardialer Hypertrophie. Da das Dimer Interface von ERK eine mögliche Zielstruktur darstellt, um selektiv die nukleären Signalwege von ERK zu unterbrechen, wurde untersucht, ob man mit Hemmung der ERK-Dimerisierung eine therapeutische Möglichkeit hat, um pathologische kardiale Hypertrophie zu verhindern. Dazu wurden verschiedene ERK2 Mutanten und Peptide generiert, um die ERK-Dimerisierung zu verhindern. Die Effekte dieser Konstrukte auf die ERK-Dimerisierung und den Kernimport wurden in verschiedenen Zelltypen mittels Fluoreszenzmikroskopie, Co-Immunopräzipitationen und Duolink proximity ligation assays getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Peptide effektiv die ERK-ERK Interaktion nach Stimulation mit Phenylephrin und/oder Carbachol verhindern. Zusätzlich reduzierten die Peptide ERKT188-Phosphorylierung und in der Folge den ERK-Import in den Nukleus und Kardiomyozytenhypertrophie. Normale ERK-Aktivierung wurde jedoch durch die Peptide nicht verhindert. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass das ERK-Dimer Interface eine wertvolle Zielstruktur ist, mit dem man nukleäre ERK1/2 Signalwege selektiv unterbrechen und damit effektiv Kardiomyozytenwachstum reduzieren kann, ohne gleichzeitig das Zellüberleben zu gefährden. / The extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) have a central role in cardiac hypertrophy and cell survival. Hypertrophic stimuli activate ERK1/2, trigger ERK dimerization and subsequently ERKT188-autophosphorylation. This newly discovered autophosphorylation is a prerequisite for nuclear ERK1/2 translocation and leads to the development of pathological cardiac hypertrophy. As the ERK dimer interface is a potential target to selectively interfere with nuclear ERK1/2 signaling, we investigated whether the interference with ERK dimerization may serve as a therapeutic strategy to prevent pathological cardiac hypertrophy. For this, we generated ERK2 mutants and peptide constructs that interfere with ERK dimerization. These constructs were evaluated in various cell types by their effects on nuclear ERK translocation and dimerization by fluorescence microcopy, co-immunoprecipitation and Duolink proximity ligation assays. We showed that the peptides indeed prevented ERK-ERK interaction in response to phenylephrine and/or carbachol stimulation. In addition, the peptides prevented ERKT188-phosphorylation and interfered with all ERK1/2 effects that are associated with ERKT188-phosphorylation e.g. nuclear ERK translocation and cardiomyocyte hypertrophy. Interestingly, the peptide did not inhibit the general activation of ERK1/2. These data indicate that the ERK dimer interface is a valuable target for selective inhibition of nuclear ERK1/2 signaling, that is able to effectively attenuate ERK1/2 mediated cardiomyocyte growth but without impairing cell survival.

Das Multiple Myelom (MM) ist ungeachtet neuer medikamentöser Therapien weiterhin eine für die allermeisten Patienten unheilbare Erkrankung. Aktuelle Whole-Genome-Sequenzierungen konnten die Annahme, dass hierfür die genetische Heterogenität des MM verantwortlich ist, bestätigen. Um dieses onkogene Signalnetzwerk auf effiziente Weise zu untersuchen, wurde ein induzierbares Knock-down-System basierend auf der weitverbreiteten RNA-Interferenz und dem neuen, innovativen Sleeping Beauty Transposon System (SBTS) entwickelt. Die Etablierung des SBTS im MM zeigte, dass die CMV-Promotor-vermittelte EGFP-Expression über 231 Tage stabil ist. Die Verwendung des SBTS ermöglicht es, Zellen bei niedrigster biologischer Schutzstufe (S1) stabil zu transfizieren. Am Beispiel des MAPK-Signalweges konnten stabile shRNA-vermittelte Knock-downs in verschiedenen MM-Zelllinien erfolgreich durchgeführt werden. Um ein induzierbares Tet-On-System zur shRNA-Expression zu erstellen, wurden zum einen dem verwendeten H1-Promotor zwei TetO-Sequenzen hinzugefügt. Zum anderen wurde durch die Verwendung eines zweiten, neu konstruierten SBTS Vektors mit anderer Selektionsresistenz in den verwendeten Zellen das Tet-Repressor-Protein (TetR) stabil exprimiert. Die notwendige Expression von TetR konnte nur mittels CAG-Promotors erreicht werden. Am Beispiel von ERK2 konnte gezeigt werden, dass es durch die stabile Transfektion und die Induktion des Knock-downs mit Doxycyclin möglich ist, den Knock-down Effekt zu erzielen. Das etablierte Plasmid-basierte System stellt somit ein versatiles, einfach anwendbares, kostengünstiges und zeitsparendes Werkzeug dar, induzierbare Knock-downs durch RNA-Interferenz für einzelne oder mehrere Proteine gleichzeitig zu erzielen. Es ist davon auszugehen, dass die Anwendung aufgrund der Verwendung etablierter Techniken und der leichten Modifizierbarkeit nicht nur auf das MM begrenzt sein wird. / Multiple Myeloma (MM) is regardless of new drug therapies still an incurable disease for the majority of patients. Large-scale whole-genome-sequencing studies strongly support the assumption that the reason for this is the large genetic heterogeneity of MM. To gain knowledge about the complex oncogenetic signalling efficiently, in this work, a system for inducible knock-downs based on the wide-spread RNA-interference and the new innovative Sleeping Beauty Transposon System (SBTS) was developed. The successful establishment of the SBTS in MM revealed that EGFP-expression by a CMV-promotor is stable for at least 231 days without any further selection by antibiotics. The use of SBTS makes it possible to transfect cells stably at the lowest biological safety level (S1). Utilizing the MAPK-signal path as an example it was possible to successfully demonstrate shRNA-provided knock-downs for up to four targets at once in several different MM-cell lines. To create an inducible Tet-on-system for shRNA-Expression, two TetO-sequences were added to the used H1-Promotor. Furthermore, the required Tet-repressor-protein (TetR) was expressed by another newly constructed SBTS vector, which contains another selection resistance. After trying different approaches, it was possible to express the necessary amount of TetR by using the CAG-Promotor, which was verified by Western Blot. Using ERK2 as a sample target, it was possible to show that with stable transfection and induction of the knock-down with doxycycline it is possible to measure knock-down results without the toxic side effects of the electroporation necessary for transfection. The established plasmid-based system serves as an easily applicable, cost-efficient and time-saving tool for inducible knock-downs by RNAi for single or multiple proteins. Due to the fact that yet established techniques were used and thanks to the simplicity of the customization it is assumed that the application is not only limited to MM.

Semantische Kontexte können die Benennleistung von gesunden Sprechern, ebenso wie von Menschen mit erworbener Sprachstörung, beeinflussen. Im picture-word interference (PWI) paradigm (Bild-Wort Interferenz Paradigma) ist es die Aufgabe, ein Zielbild unter Anwesenheit eines visuellen oder auditiv präsentierten Ablenkerwortes so schnell und akkurat wie möglich zu benennen. Die Art der Verwandtschaft zwischen Ablenkerwort und Zielbild kann den Benennprozess des Bildes in unterschiedliche Richtungen beeinflussen. Besteht eine semantisch-kategorielle Verwandtschaft zwischen Wort und Bild („Katze“ – HUND) kommt es zu steigenden Benennlatenzen und Fehlerzahlen bei Patient*innen und neurotypischen Proband*innen. Dies wird als semantische bzw. kategorielle Interferenz bezeichnet (Abel et al., 2009; Glaser & Düngelhoff, 1984; Henseler et al., 2014; Piai et al., 2016; Piai & Knight, 2018; Python et al., 2018; Schriefers et al., 1990). Besteht hingegen eine semantisch-assoziative Relation zwischen Wort und Bild („Knochen“ – HUND), kommt es zu einer Beschleunigung des Benennprozesses, was als assoziative Fazilitierung bezeichnet wird (Alario et al., 2000; Henseler et al., 2014; Sailor et al., 2009). Trotz des hohen therapeutischen Potenzials existiert bisher kaum Evidenz zur erleichternden Wirkung assoziativer Relationen in Gruppen von Patient*innen mit erworbener Sprachstörung (Python et al., 2018). Das swinging lexical network model (Abdel Rahman & Melinger, 2009, 2019) ermöglicht eine theoretische Einordnung kategorieller Interferenz und assoziativer Fazilitierung innerhalb eines Modells. In beiden semantischen Kontexten kommt es zu Priming auf konzeptueller Ebene sowie zu Konkurrenz auf lexikalischer Ebene durch relatierte, ko-aktivierte Einträge. In kategoriellen Kontexten entsteht hohe Konkurrenz auf lexikalischer Ebene, die das konzeptuelle Priming überwiegt. In assoziativen Kontexten überwiegt das konzeptuelle Priming die nur geringe Konkurrenz in einer „eins-gegen-eins“ Situation auf lexikalischer Ebene zwischen Distraktorwort und Zielbild. Neben der modelltheoretischen Einordnung wurde die neuroanatomische Grundlage der Effekte kontrovers diskutiert. Im Mittelpunkt der Debatte stehen der Gyrus temporalis medius (MTG) links und der Gyrus frontalis inferior (IFG) links. Der MTG links wird mit dem mentalen Lexikon und der semantisch-lexikalischen Verarbeitung und somit assoziativen Kontexten assoziiert. Dem linken IFG wird eine Rolle als kognitiver Kontrollmechanismus zugesprochen und im Besonderen auch im kontrollierten Lexikonzugriff, wie es in kategoriellen Kontexten notwendig ist (Henseler et al., 2014; Indefrey & Levelt, 2004). Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, zu der heterogenen und eher geringen Evidenzlage zur Wirksamkeit kategorieller und im Besonderen assoziativer Relationen in Patientengruppen mit erworbener linkshemisphärischer Hirnläsion beizutragen. Ebenso soll ein Übertrag der Daten aus dem läsionierten Netzwerk auf gängige Sprachproduktionsmodelle ermöglicht und eine mögliche Dissoziation von kategorieller Interferenz und assoziativer Fazilitierung aufgezeigt werden. Über die Methodik des voxel-based lesion-symptom mapping (VLSM) (Bates et al., 2003) sollen die neuroanatomischen Grundlagen und hier im Besonderen die Rollen des MTG und IFG links adressiert werden. Es ergeben sich hieraus die folgenden Hypothesen: (i) assoziative Relationen zwischen Ablenker und Zielbild im PWI Paradigma führen in einer Gruppe von Patient*innen mit Läsionen des funktionellen Sprachnetzwerks zu sinkenden Fehlerzahlen und Benennlatenzen, wohingegen kategorielle Relationen zu steigenden Fehlerzahlen und Latenzen führen, (ii) assoziative Fazilitierung und kategorielle Interferenz zeigen sich als voneinander distinkte Prozesse, (iii) der MTG links beeinflusst als Grundlage des mentalen Lexikons die Effekte assoziativer Relationen, wohingegen Läsionen des IFG links als Kontrollinstanz während der lexikalischen Auswahl Einfluss auf das Ausmaß kategorieller Interferenz nehmen. Zu diesem Zweck wurde in der vorliegenden Arbeit ein visuelles PWI Paradigma mit assoziativen und kategoriellen Wort-Bild Paaren in einer Gruppe von 32 Patient*innen mit linkshemisphärischer Hirnläsion durchgeführt. Die Proband*innen (Alter: M ± SD = 51.9 ± 11.51 Jahre, 17 Frauen) wiesen alle zum Zeitpunkt der Testung eine Aphasie auf oder zeigten diese in der Akutphase. Es wurden ein assoziatives und ein kategorielles Itemset, bestehend aus je 40 Zielbildern mit den zugehörigen assoziativ oder kategoriell relatierten und unrelatierten Ablenkerwörtern geschaffen. Auf zwei Familiarisierungsphasen folgte das eigentliche Hauptexperiment. Jedes Trial startete mit der Präsentation eines Fixationskreuzes, auf das das Distraktorwort folgte. In kategoriellen Blöcken folgte nach 150 ms das Zielbild. In assoziativen Blöcken wurde nach 300 ms das Zielbild präsentiert. Aufgabe der Patient*innen war es, so schnell und so genau wie möglich das Zielbild zu benennen. Ausgewertet wurden Fehlerzahlen, Fehlerarten und Reaktionszeiten. Verglichen wurde über abhängige, zweiseitige t-Tests innerhalb der assoziativen und kategoriellen Bedingung jeweils die Leistung in der relatierten und unrelatierten Bedingung. Als Maß für die Stärke kategorieller Interferenz und assoziativer Fazilitierung wurde jeweils die Differenz zwischen relatierter und unrelatierter Bedingung herangezogen. In den sich anschließenden Läsionsanalysen ermöglicht ein voxel-based lesion-symptom mapping für jedes Voxel der linken Hemisphäre (Bildvolumen von 1 mm3) eine Korrelation der Verhaltensdaten mit dem Status eines Voxels (läsioniert/nicht läsioniert). Es können folgende Ergebnisse berichtet werden: (i) Kategoriell relatierte Distraktoren führten in der hier untersuchten Patientengruppe zu signifikant langsamerem Benennen und höheren Fehlerzahlen als in der unrelatierten Kontrollbedingung. Assoziative Relationen führten zu signifikant geringeren Fehlerzahlen in der relatierten Bedingung. Ein Einfluss der assoziativen Ablenker auf die Benennlatenz konnte nicht nachgewiesen werden. (ii) Insgesamt korrelierte die individuelle Gesamtleistung mit den Leistungen in den einzelnen Testbedingungen. Allerdings bestand kein Zusammenhang zwischen der Stärke assoziativer Fazilitierung und kategorieller Interferenz, ausgedrückt in Form der Differenz zwischen relatierter und unrelatierter Bedingung für Fehler und Benennlatenz. Die beiden Effekte waren demnach unabhängig voneinander unterschiedlich stark ausgeprägt und sind somit als distinkt zu bewerten. (iii) Läsionen des MTG und IFG links korrelierten kontext-unspezifisch mit der Gesamtfehlerzahl und der durchschnittlichen Benennlatenz. Spezifischer führten Läsionen des MTG links zu signifikant stärkerer assoziativer Fazilitierung auf die Fehlerzahl. Unter Berücksichtigung der kontext-unabhängigen Benennleistung als Kovariate ergab sich eine Zweiteilung des MTG. Läsionen des posterioren Anteils des MTG links führen zu einer Zunahme assoziativer Fazilitierung, Läsionen im anterioren Anteilen des MTG hingegen hatten eine Abnahme der erleichternden Wirkung zur Folge. Läsionen des IFG links führten zu steigender kategorieller Interferenz auf die Benennlatenz. Es konnten sowohl assoziative Fazilitierung als auch kategorielle Interferenz in der hier untersuchten Patientengruppe nachgewiesen werden. Diese beiden semantischen Kontexteffekte sind als voneinander distinkte Effekte anzunehmen. Kategorielle Interferenz beeinflusste neben der Benennlatenz auch die Akkuratheit des Benennens. Assoziative Relationen hingegen ermöglichten keine Beschleunigung, allerdings aber eine Verbesserung der Genauigkeit des Benennens. Unter Annahmen eines läsions-induzierten erhöhten Rauschens innerhalb des Netzwerks und reduzierten Aktivierungszuständen (Dell et al., 1997; Foygel & Dell, 2000; Harvey & Schnur, 2015) ermöglicht das swinging lexical network model (Abdel Rahman & Melinger, 2009, 2019) eine Darstellung assoziativer Fazilitierung und kategorieller Interferenz auch im läsionierten Sprachnetzwerk. Die Läsionsanalyse bestätigt die hohe Relevanz des MTG und IFG links. Der IFG links nimmt eine entscheidende Rolle in der erschwerten lexikalischen Auswahl und Interferenzkontrolle ein. Der MTG links weist eine funktionelle Zweiteilung in einen anterioren Anteil, der mit dem Zugriff auf konzeptuelle Repräsentationen assoziiert ist und einen posterioren Anteil auf, welchem der Zugriff auf lexikalische Repräsentationen zugesprochen wird (vgl. Harvey & Schnur, 2015; Lambon Ralph, 2014). Läsionen des pMTG führen zu einer schlechteren Verfügbarkeit der lexikalischen Repräsentation des Zielbildes und aller Konkurrenten im Netz, weshalb bei reduzierter Konkurrenz eine assoziative Verbindung zwischen Zieleintrag und Ablenker auf konzeptueller Ebene effektiver genutzt werden kann und die Fazilitierung zunimmt. Beeinträchtigungen des konzeptuellen Wissens durch anteriore Läsionen des MTG verhindern dies und führen zu einer Abnahme der Fazilitierung. Neben neuen theoretischen Erkenntnissen zeigt sich zudem ein hohes klinisch-therapeutisches Potential semantischer Kontexteffekte. Assoziative Relationen ermöglichen eine verbesserte Hilfestellung, wohingegen über kategorielle Relationen ein Benenntraining auf hohem Niveau zur Behandlung leichter Aphasien geschaffen werden kann.

Glukokortikoide induzieren Apoptose in vielen verschiedenen Zelltypen. Wenngleich die Glukokortikoid-induzierte Apoptose eine der zuerst entdeckten Formen des Programmierten Zelltodes war, ist sie dennoch kaum verstanden und daher heute noch Teil vieler Forschungen. Eine Bcl-2 Überexpression resultiert in einer Resistenz gegenüber GC- induzierter Apoptose in einer Reihe von Zellen wie einigen Lymphomzell-linien, aber auch normalen Thymozyten, sowie reifen T- und B-Zellen. Glukokortikoide können die Transkription der BH3-only Gene Bim (BCL-2-interacting mediator of cell death) und Puma (p53-upregulated modulator of apoptosis), einer proapoptotischen Untergruppe der Bcl-2 Familie, induzieren. Dies legt nahe, dass Bim und Puma am Weg der GC-induzierten Apoptose beteiligt sind. Ceramid ist in der Lage über die Aktivierung der proapoptotischen Bcl-2 Mitglieder Bax und Bak die äußere Mitochondrienmembran zu schädigen und damit zur Aktivierung von Caspasen zu führen. Verschiedene apoptotische Stimuli, wie z.B. Glukokortikoide, führen so über eine Erhöhung des endogenen Ceramid Levels zur Apoptose. Ceramid kann auf zwei verschiedenen Wegen gebildet werden: zum einen durch Hydrolyse von Sphingomyelin (katalysiert durch saure (a), oder neutrale (n) Sphingomyelinase (SMase)), zum anderen durch de novo Biosynthese. Studien an Thymozyten zeigen, dass von den beiden Möglichkeiten der Ceramidsynthese, lediglich die Inhibition der aSMase zu einer Resistenz gegenüber GC-induzierter Apoptose führt. Um nun die Rolle von Bim und der aSMase bei der Glukokortikoid-induzierten Apoptose zu untersuchen, wurde die murine T-Zelllymphomlinie WEHI7.15a zu Hilfe genommen. Während die Überexpression retroviral eingebrachter shRNAs gegen Bim und aSMase keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose zeigten, führte der knockdown des Glukokortikoid-Rezeptors selbst zu einer Resistenz gegenüber Dexamethason. Auch der pharmakologische Inhibitor der Sphingomyelin-Hydrolyse, Imipramin, zeigte sowohl in vitro, als auch in vivo keine Wirkung auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose. Darüber hinaus waren sowohl Thymozyten, als auch periphere T-Zellen von aSMase knockout Mäusen genauso sensitiv auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose wie Wildtyp-Zellen. Die in vitro knockdown Ergebnisse von Bim und vom Glukokortikoid-Rezeptor selbst, konnten weiterhin ex vivo, durch das Einbringen der shRNAs in hämatopoetische Stammzellen, welche zur Rekonstitution bestrahlter Mäuse genutzt wurden, bestätigt werden. Während der Bim knockdown keinerlei Einfluss auf die Glukokortikoid-induzierte Apoptose ex vivo zeigte, konnte die verminderte Expression des Glukokortikoid-Rezeptors den Zelltod verhindern. Im Gegensatz hierzu zeigten sowohl der GR knockdown, als auch der Bim knockdown im hämatopoetischen System einen Einfluss auf die Thymozytenentwicklung in vivo. / Glucocorticoids (GC) induce apoptosis in many cell types, but the mechanisms are not well understood. Recently it was reported that the proapoptotic Bcl-2 family member Bim and an upregulation of ceramides by a caspase-activated acidic sphingomyelinase (aSMase) play important roles. In order to study their involvement in GC-induced apoptosis I took advantage of the GC-sensitive murine T-cell lymphoma line WEHI 7.15a. Overexpression of retrovirally expressed shRNAs against Bim or aSMase had no influence, whereas knockdown of the GC receptor (GR) itself rendered these cells resistant to Dexamethasone. In addition, various pharmacological inhibitors of ceramide production had no influence on GC-induced apoptosis. Moreover, thymocytes and peripheral T-cells from aSMase knockout mice were equally sensitive to GC induced apoptosis as wildtype cells. Furthermore, I confirmed the in vitro knock down results of Bim and the GR by introducing shRNAs into hematopoietic stem cells that were used to reconstitute lethally irradiated mice. While Bim inactivation did not impact ex vivo GC-induced apoptosis, loss of GR expression prevented cell death. In contrast both, the GR knockdown as well as the Bim knockdown in reconstituted mice, showed an influence in T-cell development in vivo.

Type 1 diabetes affects around 0.5% of the population in developed countries and the incidence rates have been rising over the years. The destruction of beta cells is irreversible and the current therapy available to patients only manages the symptoms and does not prevent the associated pathological manifestations. The patients need lifelong therapy and intensive research is being carried out to identify ways to eliminate autoimmune responses directed against pancreatic beta cells and to replace or regenerate beta cells. The work presented herein aimed at analyzing the role of the Th17 T cell subset, characterized by secretion of the pro- inflammatory cytokine IL-17A, in autoimmune diabetes and also at generating a beta cell reporter mouse line in the NOD background, the most widely- used mouse model for type 1 diabetes. We generated IL- 17A knockdown (KD) NOD mice, using RNAi in combination with lentiviral transgenesis. We analyzed diabetes frequency in IL-17A deficient mice and found that the loss of IL-17A did not protect the transgenic mice from diabetes. Based on these observations, we believe that Th17 cells do not play a critical role in type 1 diabetes through the IL-17A pathway, though they might still be involved in the disease process through alternate pathways. We also generated NOD and NOD-SCID mice with a transgene that drives the beta cell specific expression of a luciferase reporter gene. We used a lentiviral construct, which combined a luciferase sequence and a short- hairpin RNA (shRNA) expression cassette, allowing gene- knockdown under the beta cell specific rat insulin promoter (RIP). These mice will be of use in studying beta cell phenotypes resulting from the knockdown of target genes, using non- invasive bioimaging. We believe that the generation of these reporter mouse lines for diabetes studies will prove valuable in future investigations. Furthermore, the demonstration that the loss of IL-17A does not alter susceptibility to type 1 diabetes should help clarify the controversial involvement of Th17 cells in this disease. / In Industrieländern erkranken etwa 0,5 % der Bevölkerung an Typ-1-Diabetes und die Krankheitsrate ist in den letzten Jahren angestiegen. Die dabei stattfindende Zerstörung der insulinproduzierenden Beta-Zellen ist irreversibel und die derzeitig verfügbaren Therapien behandeln lediglich Symptome, verhindern die pathologischen Auswirkungen aber nicht. Patienten benötigen daher eine lebenslange Therapie und es wird intensiv daran gearbeitet, Wege zu identifizieren, die die autoimmune Antwort gegen pankreatische Beta-Zellen unterbinden, oder aber Beta-Zellen ersetzen, beziehungsweise regenerieren lassen. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, die Rolle der Th17 T-Zellen, welche durch die Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-17A gekennzeichnet sind, in Typ-1- Diabetes zu analysieren. Zusätzlich wurden Reportermauslinien im NOD Hintergrund, dem am weitesten verbreiteten Mausmodell für Typ-1-Diabetes, generiert. Durch RNAi, in Kombination mit lentiviraler transgener Technologie, wurden IL-17A Knockdown (KD) NOD Mäuse generiert. Die Diabeteshäufigkeit in IL-17A defizienten Mäusen wurde mit dem Ergebnis untersucht, dass der Verlust von IL-17A die transgenen Mäuse nicht vor Diabetes schützt. Von dieser Beobachtung ausgehend wurde gefolgert, dass Th17 Zellen zumindest über den IL-17A Signalweg keine entscheidende Rolle bei Typ-1-Diabetes spielen, diese allerdings durch alternative Signalwege durchaus im Krankheitsprozess beteiligt sein könnten. Außerdem wurden NOD und NOD-SCID Mäuse mit einem Transgen, das die Beta-Zell spezifische Expression eines Luciferasereporters steuert, generiert. Hierbei wurde ein lentivirales Konstrukt genutzt, welches sowohl die Luciferase, als auch eine short-hairpin RNA (shRNA) Expressionssequenz beinhaltet, um einen Genknockdown unter Kontrolle des spezifischen Insulinpromotors der Ratte (RIP) zu erlauben. Diese Mäuse werden bei zukünftigen nicht-invasiven bildgebenden Untersuchungen des Beta-Zell Phänotyps, der aus dem Knockdown von Zielgenen resultiert, von großem Nutzen sein. In zukünftigen Untersuchungen wird sich die Generierung dieser Reportermauslininien für Diabetesstudien sicherlich als wertvoll erweisen. Des Weiteren sollte die Erkenntnis, dass der Verlust von IL-17A die Anfälligkeit für Typ-1-Diabetes nicht verändert, zu einem besseren Verständnis der kontrovers diskutierten Beteiligung der Th17 Zellen führen.

In contrast to c-Myc, a deregulated expression of the MYCN gene is restricted to human neuroendocrine tumours. In most cases, the excessive activity of N-Myc results from a MYCN amplification. In neuroblastoma, amplification of MYCN is a predictor of poor prognosis and resistance to therapy. The inability to target the N-Myc protein directly necessitates the search for alternative targets. This project aimed at identifying genes specifically required for growth and survival of cells that express high levels of N-Myc using high-throughput shRNA screening combined with next generation sequencing. The identification and analysis of these genes will shed light on functional interaction partners of N-Myc. We screened a shRNA library containing 18,327 shRNAs and identified 148 shRNAs, which were selectively depleted in the presence of active N-Myc. In addition, shRNAs targeting genes that are involved in p53 and ARF turnover and apoptosis were depleted in the cell population during the screen. These processes are known to affect N-Myc-mediated apoptosis. Consequently, these results biologically validated the screen. The 148 shRNAs that showed a significant synthetic lethal interaction with high levels of N-Myc expression were further analysed using the bioinformatics program DAVID. We found an enrichment of shRNAs that target genes involved in specific biological processes. For example, we validated synthetic lethal interactions for genes such as, THOC1, NUP153 and LARP7, which play an important role in the process of RNA polymerase II-mediated transcription elongation. We also validated genes that are involved in the neddylation pathway. In the screen we identified Cullin 3, which is a component of the BTB-CUL3-Rbx1 ubiquitin ligase that is involved in the turnover of Cyclin E. Depletion of cullin 3 and activation of N-Myc was found to synergistically increase Cyclin E expression to supraphysiological levels, inducing S-phase arrest and a strong DNA damage response. Together with results from a proteomics analysis of N-Myc associated proteins, our results lead us to the following hypothesis: In a neuroblastoma cell, the high levels of N-Myc result in a conflict between RNA polymerase II and the replication machinery during S-phase. The newly identified interaction partners of N- Myc are required to solve this conflict. Consequently, loss of the interaction leads to a massive DNA damage and the induction of apoptosis. In addition, inhibition or depletion of the essential components of the neddylation pathway also results in an unresolvable problem during S-phase. / 6.2 Zusammenfassung Im Gegensatz zu c-Myc findet man eine Deregulation von N-Myc nur in einer begrenzten Anzahl maligner Tumore die neuroektodermalen Ursprungs sind. Die übermäßige Aktivität ist dabei fast immer durch eine genomische Amplifikation von N-Myc begründet. Im Neuroblastom korreliert eine MYCN-Amplifikation mit einer schlechten Prognose. Da es auf Grund einer fehlenden katalytischen Domäne nicht möglich ist N-Myc direkt zu inhibieren, ist die Suche nach alternativen Targets notwendig. Das Ziel dieser Arbeit war es neue Gene zu identifizieren, die notwendig für das Wachstum und Überleben von MYCN amplifizierten Zellen sind. Dies wurde durch eine Kombination von Hochdurchsatz-RNAi-Screens und Next-Generation-Sequenzierung erreicht. Durch das Screenen einer shRNA-Bibliothek, die insgesamt 18327 shRNAs beinhaltet, konnten 148 shRNAs identifiziert werden, die selektiv nachteilig für das Überleben N-Myc überexpremierender Zellen sind. Die statistische Auswertung der Ergebnisse des Screens zeigte zusätzlich eine Anreichung von shRNAs gegen Gene, die p53-und ARF-abhängig Apoptose vermitteln. Da es bekannt ist, dass diese Gene in der N-Myc-vermittelten Apoptose involviert sind, konnte dadurch der Screen validiert werden. Die weitere Auswertung mit dem bioinformatischen Programm DAVID ergab, dass unter den 148 als synthetisch letal identifizierten shRNAs solche angereichert waren, die gegen Gene spezifischer biologischer Prozesse gerichtet sind. Zum einen wurden Gene wie THOC1, NUP153 und LARP7 validiert, die eine Rolle im Prozeß der Elongation der RNA Polymerase II spielen. Zum anderen konnten Gene validiert werden die einen Beitrag bei der Neddylierung von Proteinen leisten. Durch die Depletion von Cullin 3, ein Bestandteil des BTB-CUL3-Rbx1 Ubiquitin-Ligase-Komplexes, der am Abbau von Cyclin E beteiligt ist, konnte gezeigt werden, dass zusammen mit der Aktivierung von N-Myc eine supraphysiologische Erhöhung von Cyclin E induziert wird. Dies führt zu einem S-Phase Arrest in der Zelle, der die DNA-Schadens-Signalkaskade auslöst. Zusammen mit den Ergebnissen einer Proteomanalyse, bei der neue N-Myc-assoziierte Proteine identifiziert wurden, konnte folgende Hypothese aufgestellt werden: In einer Neuroblastomzelle helfen diese neuen Interaktionspartner den durch die N-Myc Überexpression in der S-phase entstehenden Konflikt zwischen RNA-Polymerase II und Replikationsmaschinerie zu lösen. Der Verlust dieser Interaktion führt zu einer massiven Schädigung der DNA, worauf in der Zelle Apoptose ausgelöst wird. Des Weiteren führen auch die Inhibition oder Ausschaltung wesentlicher Komponenten des Neddylierungs-Signalwegs zu unlösbaren Problemen in der S-Phase des Zellzyklus.