Zugl.: Hannover, Univ., Diss., 2008

Zugl.: Würzburg, Univ., Diss., 2006

Zugl.: Zürich, Univ., Diss., 2004/2005

Zugl.: Zürich, Techn. Hochsch., Diss., 2008

Techn. Universiẗat, Diss., 2003--Darmstadt.

Die Vorliegende Arbeit beschäftige sich mit der Etablierung eines lentiviralen Vektorsystems, mit dem es möglich ist die RNA-Interferenz experimentell zu nutzen. Dafür wurden SEC Sequenzen in den Vektor pGJ3-eGFP kloniert. Nach Optimierung der Transfektions und Transduktionsschritte wurden im Anschluss rekombinante virale Partikel hergestellt. Zur Überprüfung der Effektivität der Induzierten RNA-Interferenz erfolgte die Transduktion einer persistierend mit Masern infizierten Zelllinie (C6SSPE). Ziel der siRNA Sequenzen war dabei die mRNA des N-Proteins, welches eine zentrale Rolle im viralen Replikationszyklus spielt. Die Reduktion der mRNA wurde über quantitative real time RT-PCR nachgewiesen.

Motivation: Although various high-throughput technologies provide a lot of valuable information, each of them is giving an insight into different aspects of cellular activity and each has its own limitations. Thus, a complete and systematic understanding of the cellular machinery can be achieved only by a combined analysis of results coming from different approaches. However, methods and tools for integration and analysis of heterogenous biological data still have to be developed. Results: This work presents systemic analysis of basic cellular processes, i.e. cell viability and cell cycle, as well as embryonic stem cell pluripotency and differentiation. These phenomena were studied using several high-throughput technologies, whose combined results were analysed with existing and novel clustering and hit selection algorithms. This thesis also introduces two novel data management and data analysis tools. The first, called DSViewer, is a database application designed for integrating and querying results coming from various genome-wide experiments. The second, named PhenoFam, is an application performing gene set enrichment analysis by employing structural and functional information on families of protein domains as annotation terms. Both programs are accessible through a web interface. Conclusions: Eventually, investigations presented in this work provide the research community with novel and markedly improved repertoire of computational tools and methods that facilitate the systematic analysis of accumulated information obtained from high-throughput studies into novel biological insights.

Within the scope of this thesis, spin related transport phenomena have been investigated in HgTe/HgCdTe quantum well structures. This material exhibits peculiar band structure properties, which result in a strong spin-orbit interaction of the Rashba type. An inverted band structure, i.e., a reversed ordering of the energy states in comparison to common semiconductors, is obtained for quantum well layers above a critical thickness. Furthermore, the band structure properties can be controlled in the experiments by moderate gate voltages. Most prominently, the type of carriers in HgTe quantum wells can be changed from n to p due to the narrow energy gap. Along with the inverted band structure, this unique transition is the basis for the demonstration of the Quantum Spin Hall state, which is characterized by the existence of two one-dimensional spin-polarized edge states propagating in opposite directions, while the Fermi level in the bulk is in the energy gap. Since elastic scattering is suppressed by time reversal symmetry, a quantized conductance for charge and spin transport is predicted. Our experiments provide the first experimental demonstration of the QSH state. For samples with characteristic dimensions below the inelastic mean free path, charge conductance close to the expected value of 2e^2/h has been observed. Strong indication for the edge state transport was found in the experiments as well. For large samples, potential fluctuations lead to the appearance of local n-conducting regions which are considered to be the dominant source of backscattering. When time reversal symmetry is broken in a magnetic field, elastic scattering becomes possible and conductance is significantly suppressed. The suppression relies on a dominant orbital effect in a perpendicular field and a smaller Zeeman-like effect present for any field direction. For large perpendicular fields, a re-entrant quantum Hall state appears. This unique property is directly related to the non-trivial QSH insulator state. While clear evidence for the properties of charge transport was provided, the spin properties could not be addressed. This might be the goal of future experiments. In another set of experiments, the intrinsic spin Hall effect was studied. Its investigation was motivated by the possibility to create and to detect pure spin currents and spin accumulation. A non-local charging attributed to the SHE has been observed in a p-type H-shaped structure with large SO interaction, providing the first purely electrical demonstration of the SHE in a semiconductor system. A possibly more direct way to study the spin Hall effects opens up when the spin properties of the QSH edge states are taken into account. Then, the QSH edge states can be used either as an injector or a detector of spin polarization, depending on the actual configuration of the device. The experimental results indicate the existence of both intrinsic SHE and the inverse SHE independently of each other. If a spin-polarized current is injected from the QSH states into a region with Rashba SO interaction, the precession of the spin can been observed via the SHE. Both the spin injection and precession might be used for the realization of a spin-FET similar to the one proposed by Datta and Das. Another approach for the realization of a spin-based FET relies on a spin-interference device, in which the transmission is controlled via the Aharonov-Casher phase and the Berry phase, both due to the SO interaction. In the presented experiments, ring structures with tuneable SO coupling were studied. A complex interference pattern is observed as a function of external magnetic field and gate voltage. The dependence on the Rashba splitting is attributed to the Aharonov-Casher phase, whereas effects due to the Berry phase remain unresolved. This interpretation is confirmed by theoretical calculations, where multi-channel transport through the device has been assumed in agreement with the experimental results. Thus, our experiments provide the first direct observation of the AC effect in semiconductor structures. In conclusion, HgTe quantum well structures have proven to be an excellent template for studying spin-related transport phenomena: The QSHE relies on the peculiar band structure of the material and the existence of both the SHE and the AC effect is a consequence of the substantial spin-orbit interaction. While convincing results have been obtained for the various effects, several questions can not be fully answered yet. Some of them may be addressed by more extensive studies on devices already available. Other issues, however, ask, e.g., for further advances in sample fabrication or new approaches by different measurements techniques. Thus, future experiments may provide new, compelling insights for both the effects discussed in this thesis and, more generally, other spin-orbit related transport properties. / Im Rahmen dieser Arbeit wurden spin-bezogene Transportphänomene in HgTe/HgCdTe-Quantentrogstrukturen untersucht. Dieses Materialsystem weist besondere Bandstruktureigenschaften auf, die u.a. zu einer starken Rashba-Spin-Bahn-Wechselwirkung führen. Eine invertierte Bandstruktur, d.h. eine umgekehrte Anordnung der energetischen Zustände im Vergleich zu üblichen Halbleitern, ergibt sich für Quantentrogschichten oberhalb einer kritischen Dicke. Darüber hinaus können die Bandstruktur-Eigenschaften im Experiment mittels moderater Gatespannungen kontrolliert werden. Hervorzuheben ist, dass die Art der Ladungsträger im HgTe-Quantentrog aufgrund der geringen Bandlücke von n- nach p-Typ geändert werden kann. Dieser einzigartige Übergang bildet zusammen mit der invertierten Bandstruktur die Grundlage für den Nachweis der Quanten-Spin-Hall-Zustands, bei dem sich zwei eindimensionale spinpolarisierte Randkanäle in entgegen gesetzte Richtung ausbreiten, während die Fermi-Energie im Probeninneren in der Bandlücke liegt. Da elastische Streuprozesse aufgrund der Zeitumkehr-Invarianz verboten sind, ist der Leitwert für Ladungs- und Spintransport quantisiert. Unsere Messungen liefern den ersten experimentellen Nachweis des QSH-Zustands. Für Proben mit charakteristischen Abmessungen unterhalb der inelastischen freien Weglänge wurde ein Leitwert nahe des theoretisch erwarteten Wertes von 2e^2/h beobachtet. Die Experimente lieferten außerdem deutliche Anzeichen für den Randkanaltransport. In größeren Proben verursachen Potenzialfluktuationen lokale n-leitende Bereiche, die als Hauptursache für Rückstreuung angesehen werden können. Wird die Zeitumkehr-Invarianz im Magnetfeld gebrochen, können elastische Streuprozesse auftreten und der Leitwert sinkt deutlich. Die Ursache dafür sind ein dominanter orbitaler Effekt für senkrechte Felder sowie ein schwächerer Zeeman-ähnlicher Effekt für beliebige Feldrichtungen. Bei starken senkrechten Feldern kommt es zu einem Wieder-Eintritt in den Quanten-Hall-Zustands, was direkt mit dem nicht-trivialen isolierenden Zustand des QSH-Effekts verknüpft ist. Während die Messungen einige Eigenschaften des Ladungstransports deutlich belegen, können die Spineigenschaften nicht untersucht werden. Dies kann jedoch ein Ziel zukünftiger Messungen sein. Außerdem wurde der intrinsische Spin-Hall-Effekt untersucht, um die Erzeugung von Spinungleichgewichten und reinen Spinströmen nachzuweisen. Eine nicht-lokale Spannung, die auf den SHE zurückzuführen ist, wurde in einer p-leitenden H-förmigen Struktur beobachtet und liefert somit den ersten rein elektrischen Nachweis des SHE in einem Halbleiter-System. Ein direkterer Weg zur Untersuchung von Spin-Hall-Effekten ergibt sich, wenn die Spinpolarisation der QSH-Randkanäle berücksichtigt wird. Dabei können die QSH-Kanäle - abhängig von der Probenkonfiguration - eine Spinpolarisation wahlweise injizieren oder detektieren. Die experimentellen Ergebnisse weisen unabhängig voneinander den intrinsischen SHE und den inversen SHE nach. Wenn durch die QSH-Kanäle ein spin-polarisierter Strom in ein Gebiet mit Rashba-Spin-Bahn-Wechselwirkung injiziert wird, kann die resultierende Spinpräzession mittels des SHE beobachtet werden. Sowohl die Spininjektion als auch die Präzession können zur Umsetzung eines Spin-FETs verwendet werden, wie er von Datta und Das vorgeschlagen wurde. Eine andere Herangehensweise zur Realisierung eines spin-basierten FETs beruht auf einem Spin-Interferenz-Bauteil, in dem die Transmission über Spin-Bahn-abhängige Phasen - die Aharonov-Casher-Phase und die Berry-Phase - gesteuert wird. Bei der Untersuchung von Ringstrukturen mit variabler Spin-Bahn-Wechselwirkung zeigt sich bei einer Variation des Magnetfeld und der Gate-Spannung ein komplexes Interferenzmuster. Die Abhängigkeit von der Rashba-Aufspaltung wird der Aharonov-Casher-Phase zugeschrieben, wohingegen Effekte aufgrund der Berry-Phase nicht nachgewiesen werden können. Diese Interpretation wird durch theoretische Berechnungen bestätigt, in denen Mehr-Kanal-Transport durch den Ring angenommen wurde. Somit liefern unsere Experimente den ersten direkten Nachweis des AC-Effektes in Halbleiterstrukturen. Insgesamt stellen die HgTe-Quantentröge ein als exzellentes System zur Untersuchung von spin-bezogenen Transportphänomenen dar: Der QSHE beruht auf der besonderen Bandstruktur; und sowohl der SHE als auch der AC-Effekt treten aufgrund der deutlichen Spin-Bahn-Wechselwirkung auf. Für alle Effekte wurden überzeugende Ergebnisse erzielt; allerdings konnten einige Fragen noch nicht vollständig beantwortet werden. Einige können möglicherweise mittels umfangreicherer Untersuchungen geklärt werden. Andere jedoch verlangen z.B. nach Fortschritten in der Probenherstellung oder anderen Untersuchungsmethoden. Daher können zukünftige Experimente weitere neue faszinierende Einblicke sowohl in die hier diskutierten Effekte als auch in andere Spin-Bahn-bezogene Transportphänomene bieten.

Phosducin-like Protein existiert in zwei Splicevarianten: PhLPLONG (PhLPL) und PhLPSHORT (PhLPS). Sie unterscheiden sich in der Länge ihres N-Terminus und in ihrem Expressionsmusters: Die lange Form (PhLPL) wird ubiquitär exprimiert und bindet G-Protein-betagamma-Untereinheiten (Gbetagama), was zur Hemmung von Gbetagamma-abhängigen Funktionen führt. Der um 83 Aminosäuren verlängerte N-Terminus besitzt ein hoch konserviertes Motiv, welches für die Gbetagamma-Bindung und Regulation von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz hierzu besitzt die kurzen Spliceform PhLPS, deren Expression in verschiedenen Gewebetypen deutlich geringer ist, diese hoch konservierte Region nicht. In der vorliegenden Arbeit wurde nun erstmals die Rolle von PhLPL und PhLPS bei der Gbetagamma-Regulation in intakten Zellen untersucht. Hierbei konnte überraschenderweise gefunden werden, dass PhLPS der potentere und effizientere Regulator für Gbetagamma-abhängige Signale war. PhLPL hingegen schien in seiner Gbetagamma-regulierenden Fähigkeit limitiert zu werden. Die Ursache dieser Limitierung von PhLPL in intakten Zellen wurde auf eine konstitutive Phosphorylierung seines verlängerten N-Terminus durch die ubiquitäre Casein Kinase 2 (CK2) zurückgeführt. Die verantwortlichen Phosphorylierungsstellen (S18, T19, S20) wurde identifiziert und die Mutation der CK2-Phosphorylierungsstellen (PhLPLA18-20) führte zu einer Verbesserung der hemmenden Funktion von PhLPL in Zellen. In vitro-Assays zur Bindungsfähigkeit von rekombinantem PhLPL (vor und nach CK2-Phosphorylierung) zeigten allerdings: die Phosphorylierung beeinflusste die Affinität nicht. Eine genaue Analyse der N-terminalen Strukuren von PhLPL zeigte indes, dass die Regulationsfähigkeit von PhLPL in intakten Zellen vor allem in dem konservierten Gbetagamma-Bindungsmotiv zu suchen war. Die Mutation einer einzigen Aminosäure (W66V) war ausreichend, um sowohl die Gbetagamma-Bindungsfähigkeit, als auch die Fähigkeit zur funktionellen Hemmung in intakten Zellen zu verlieren. Was war also der Mechanismus der Hemmung von Gbetagamma durch PhLPS und die phophorylierungsdefiziente Mutante von PhLPL? Ein erster Hinweis hierauf kam von der Beobachtung, dass die Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten in Anwesenheit von PhLPS in ihrem Proteingehalt deutlich reduziert vorlagen (wie in Western Blots gezeigt). Dieser Mechanismus schien von proteasomalen Abbauwegen abzuhängen (gezeigt durch Effekte des spezifischen Proteasominhibitors Lactazystin). Allerdings schien eine Stabilisierung der Gbeta- und Ggamma-Untereinheiten (durch N-terminale Fusion mit einem Protein zur vitalen Proteinfärbung) nicht die Funktionsfähigkeit von Gbetagamma in Anwesenheit von PhLPS bewahren zu können. Ganz im Gegenteil, es wurde gezeigt, dass Gbeta und Ggamma hierbei nicht mehr zu einem funktionellen Dimer assoziierten. Dies war ein Hinweis darauf, dass möglicherweise Proteinfaltungsmechanismen bei der Regulation essentiell sein könnten. Eine postulierte Rolle bei der Faltung von WD40-Repeatproteinen wie der Gbeta-Untereinheit wurde dem Chaperonin-Komplex CCT (chaperonin containing TCP) zugedacht. Folgerichtig konnte PhLPS mit seinen funktionell aktiven Domänen an endogenes TCP-1alpha (einer Untereinheit von CCT) binden. Ferner konnte gezeigt werden, dass die Hemmung des CCT-Komplexes durch RNA-Interferenz mit TCP-1alpha ebenso wie PhLPS zur spezifischen Reduktion von Gbetagamma führte. In dieser Arbeit wurde also ein neuartiger Mechanismus der G-Protein-Regulation durch Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma beschrieben. Ein Schaltmechanismus zwischen direkter Gbetagamma-Bindung (induziert durch CK2-Phosphorylierung von PhLPL) und Hemmung der Proteinfaltung von Gbetagamma (induziert durch alternatives Splicen oder durch Dephosphorylierung von PhLP) wird postuliert. / Phosducin-like protein (PhLP) exists in two splice variants PhLPLONG (PhLPL) and PhLPSHORT (PhLPS): They differ in the length of their N-termini and their expression pattern: The long form (PhLPL) is a ubiquitously expressed protein and binds G-protein betagamma-subunits (Gbetagamma) and thereby inhibits Gbetagamma-mediated function. The extended N-terminus of PhLPL (83 amino acids) contains a highly conserved Gbetagamma-binding motif which plays the crucial role in binding and regulating Gbetagamma-subunits. In contrast, the short splice variant PhLPS, which has a more restricted expression, lacks this motif and did not seem to exert a major Gbetagamma-inhibition, when tested with purified proteins. In the present work, for the first time, we investigated the Gbetagamma-inhibiting properties of PhLPL and PhLPS in intact cells. Surprisingly, PhLPS was the more potent and effective Gbetagamma inhibitor, while PhLPL was limited in this respect. The reason for the limited ability to inhibit Gbetagamma in intact cells was found in a constitutive phosphorylation by the ubiquitious kinase casein kinase 2 (CK2). The responsible phosphorylation sites could be identified (S18, T19, S20) and mutation of those sites into alanines could ameliorate the function of PhLPL. We therefore hypothesised that CK2 dependent phosphorylation of PhLPL should reduce binding affinity towards Gbetagamma subunits. But instead, direct phosphorylation of recombinant PhLPL by CK2 did not reduce its binding affinites. A thorough analysis of the N terminus of PhLPL revealed that a single mutation of the conserved N terminal binding motif (W66V) was sufficient to ablate Gbetagamma binding and Gbetagamma inhibition in intact cells. A first hint to an alternative mechanism came from the observation that - in the presence of PhLPS - the protein content of Gbeta and Ggamma subunits was dramatically reduced (as determined by Western blotting). This phenomenon seemed to be dependent on a proteasomal pathway (which was shown by effects of the specific proteasome inhibitor lactacystine). But a stabilization of the Gbeta and Ggamma subunits through N terminal fusion of a dye-labeling protein could not restore the function of Gbetagamma in the presence of PhLPS. Instead, it could be demonstrated that under these conditions Gbeta and Ggamma did not form functional dimers any more. This finding led to the conclusion that a protein folding mechanism was possibly involved. A postulated role in the folding of WD40 repeat proteins (like the Gbeta subunit) was assumed for the cytosolic chaperonin complex CCT in the literature. PhLPS was able to bind to TCP-1alpha, a subunit of CCT, as were the functionally active domains of PhLPS. We further demonstrated that the inhibition of CCT by RNA interference with TCP-1alpha also led to down-regulation of Gbeta and Ggamma subunits. So, in this thesis, a novel mechanism of G-protein regulation through inhibition of Gbetagamma protein folding was described. Further, a switch mechanism between direct Gbetagamm binding (induced by phosphorylation of PhLPL) and inhibition of Gbetagamm folding (induced by alternative splicing or dephosphorylation of PhLP) is postulated.

Das 1995 entdeckte GB-Virus C (GBV-C) gehört als Pegivirus zur Familie der Flaviviridae und ist nichtpathogen. In Industrieländern sind 2 bis 12,5 % der gesunden Bevölkerung und bis zu 45 % der Personen aus Risikokollektiven, z.B. Patienten mit Infektionen mit dem humanen Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) oder dem Hepatitis-C-Virus (HCV), virämisch. Die Mehrzahl der klinischen Studien und Metaanalysen zu GBV-C/HIV-1-Koinfektionen zeigten, dass GBV-C mit einem verlangsamten Krankheitsverlauf und einer erhöhten Überlebenswahrscheinlichkeit von GBV-C/HIV-1-koinfizierten Patienten korreliert. In der Hemophilia Growth and Development Study konnte dieser Effekt bei GBV-C/HCV-/HIV-1-infizierten Kindern und Jugendlichen jedoch nur bedingt nachgewiesen werden. Dafür wurde ein Zusammenhang zwischen einer GBV-C/HCV-Koinfektion und dem Ausheilen der HCV-Infektion beobachtet und in einer weiteren Patientenkohorte aus der Anti-D-Studie bestätigt. GBV-C/HCV-koinfizierte Patienten haben schlechtere Chancen, die HCV-Infektion auszuheilen. Der Einfluss von GBV-C auf die HIV-1-Replikation wurde in Zellkulturexperimenten untersucht. Es zeigte sich, dass sich die verschiedenen GBV-C-Isolate hinsichtlich ihrer inhibitorischen Kompetenz unterschieden. Folgende mögliche Ursachen wurden untersucht: 1.) die IRES-Aktivität als Indikator für die Translationseffizienz, 2.) die NS5A-Sequenz des in der Literatur beschriebenen HIV-1-inhibitorisch aktiven 16mer-Peptids sowie 3.) die E2-Sequenz und die HIV-1-inhibitorische Wirkung von 18mer-E2-Peptiden. Es konnten weder Unterschiede in der IRES-Aktivität noch in der NS5A-Sequenz zwischen den unterschiedlich inhibitorisch-kompetenten GBV-C-Isolaten nachgewiesen werden. Im E2-Protein hingegen wurden zwei für alle HIV-1-nichtinhibitorischen GBV-C-Isolate einheitliche Mutationen, E143K/H und T204A, identifiziert. Diese könnten eine Ursache für die Varianz in der Fähigkeit, HIV-1 zu inhibieren, darstellen. Die Mutation an Position E143 ist an der Oberfläche des nativen E2-Proteins exponiert und spielt möglicherweise im Hemmmechanismus eine wichtige Rolle. Hinweise darauf gaben die Untersuchungen mit synthetischen 18mer-Peptiden, von denen das Peptid mit dem größten inhibitorischen Potenzial die Aminosäure an Position 143 beinhaltete. Eine mögliche Theorie des Wirkmechanismus des E2-Proteins wäre wie folgt denkbar: Das E2-Protein interagiert über eine Domäne um die Aminosäure E143 mit dem gp41 des HIV-1, verhindert somit die Fusion von Virus- und Zellmembran und in der Folge den Eintritt des HIV-1 in die Zielzelle.