Orientador: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T17:37:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vaz_ThaisHaline_D.pdf: 13126521 bytes, checksum: 672f3c7b0345ee333ab24793e624068d (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A resposta individual das células está na base da resistência do organismo à infecção viral. O principal mecanismo de resistência envolve a participação de inúmeros genes da via de sinalização dos interferons. Vários estudos vêm sendo conduzidos em larga escala para identificar genes que respondem aos mais variados tratamentos, assim como clusters gênicos relacionados a determinadas enfermidades, como a leucemia. A função do produto de muitos destes genes ainda não foi caracterizada. Numa ampla revisão destes artigos identificamos a proteína KIAA0082/ISG95 respondendo a interferon, à infecção pelo vírus da hepatite C (HCV), ao tratamento celular com oligodeoxinucleotídeos CpG, fazendo parte de um cluster de genes relacionados à leucemia e sendo super-expressa em linfócitos T ativados. Embora não possua função conhecida, esta proteína apresenta quatro domínios que indicam uma possível atividade relacionada ao metabolismo de RNA. Neste trabalho demonstramos que o promotor do gene ISG95 responde à estimulação por interferon num sistema repórter em células Vero. As atividades bioquímicas de ISG95 foram determinadas usando a proteína recombinante expressa em células de inseto Sf9. ISG95 interage com RNA e com S-adenosilmetionina, possuindo também atividade de metiltransferase in vitro. Ensaios de localização sub-celular demonstraram sua distribuição nuclear. Além disso, através do método duplo-híbrido de levedura e de ensaio de co-imunoprecipitação, foi possível identificar sua interação com o domínio C-terminal (CTD) da RNA polimerase II, o que é consistente com sua localização nuclear e com a função predita para o domínio WW localizado na extremidade C-terminal de ISG95. Os resultados indicam que ISG95 é parte da via de resposta a interferon e tem função associada possivelmente a eventos de processamento de prémRNA mediados pelo domínio CTD da RNA polimerase II / Abstract: A major mechanism of cellular resistance to viral invasion involves genes from the interferon signaling pathway, called ISGs (interferon stimulated genes). Global transcriptional profiling studies have linked increased expression of ISG95 (KIAA0082) to response to interferon treatment and to viral infection, suggesting that it may be part of the cellular defense against viral replication. In this work, we shown that the ISG95 promoter can drive interferoninduced transcription of a reporter gene in Vero cell cultures. The biochemical functions of ISG95 were assessed using recombinant protein. ISG95 shows RNA- and S-adenosyl-methionine binding and protein methyltransferase activity in vitro. ISG95 interacts with the C-terminal domain of RNA polymerase II, which is consistent with its nuclear localization and with the predicted function of the WW domain found in the C-terminal region of ISG95. The results presented in this work indicate that ISG95 is part of the interferon response pathway and functions in the pre-mRNA processing events mediated by the C-terminal domain of the RNA polymerase II / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Chronic hepatitis C has been associated with non-organ-specific autoantibodies (NOSA) production. Despite of increasing number of researches about this subject, there is no agreement among the authors of which autoantibodies are produced during combinated therapy of interferon and ribavirin or the clinical relevance of NOSA in patientâs organism. Our aim was to evaluate the profile of NOSA in patients with chronic hepatitis C who attended to Walter CantÃdio Hospital (HUWC) and received combinated antiviral therapy (interferon-ribavirin). A total of 34 patients with hepatitis C were studied. Anti-nuclear antibody (ANA), anti-smooth muscle antibody (SMA), anti-liver/kidney microsomal antibody type 1 (LKM-1) and anti-mitochondrial antibody (AMA) were detected by indirect immunofluorescence. The presence of NOSA was related to clinical and epidemiological variables and to the outcome of antiviral combination therapy with interferon-alfa and ribavirin. Patients were classified as nonresponders, relapsers or long-term responders depending on the outcome of treatment. In our study, before therapy, 23 patients were NOSA positive (SMA was detected in 6 patients, SMA and AMA in 10 and SMA, AMA and ANA in 7). On the 24th week of treatment, 24 patientes were NOSA positive (SMA was detected in 4 patients, SMA and AMA in 10, ANA and SMA in 1, ANA and AMA in 1 and SMA, AMA and ANA in 8). NOSA behavior did not show significant variation during treatment. The overall rate of long-term response was 26,5% (9/34). Long-term response occurred in 17,4% (4/23) of NOSA positive patients and 45,5% (5/11) of NOSA negative patients. Positivity of autoantibodies was not associated with gender, age, viral genotype or aminotransferase levels. In conclusion, ANA was the only NOSA associated with treatment outcome. The absence of NOSA might indicate a significantly higher chance for viral clearance in response to combination therapy for chronic hepatitis C infection. / A hepatite crÃnica pelo vÃrus C tem sido associada à produÃÃo de autoanticorpos nÃo-ÃrgÃo especÃficos (NOSA). Apesar do aumento do nÃmero de pesquisas nessa Ãrea, ainda nÃo existe um consenso entre quais autoanticorpos tÃm seus nÃveis elevados devido ao tratamento combinado de interferon e ribavirina, nem sua influÃncia no desfecho do mesmo ou a relevÃncia clÃnica da presenÃa desses autoanticorpos no organismo do pacientes. O objetivo do presente estudo foi avaliar o perfil de NOSA em pacientes com hepatite C crÃnica atendidos no Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio (HUWC) e submetidos à terapia combinada de interferon-alfa e ribavirina. Para isso, um total de 34 pacientes com hepatite C foram estudados. Os anticorpos anti-nuclear (FAN), anti-mÃsculo liso (SMA), anti-microssomal de fÃgado e rim do tipo 1 (LKM-1) e anti-mitocÃndria (AMA) foram detectados atravÃs de imunofluorescÃncia indireta. A presenÃa de NOSA foi relacionada a variÃveis clÃnicas e epidemiolÃgicas e à resposta ao tratamento. Os pacientes foram classificados, em relaÃÃo à resposta ao tratamento, como nÃo respondedores, recidivantes ou respondedores (resposta virolÃgica sustentada). Em nosso estudo, 23 pacientes foram NOSA reagentes (SMA foi detectado em 6 pacientes, SMA e AMA em 10 e SMA, AMA e FAN em 7). Na 24 semana de tratamento, 24 pacientes foram NOSA reagentes (SMA foi detectado em 4 pacientes, SMA e AMA em 10, FAN e SMA em 1, FAN e AMA em 1 e SMA, AMA e FAN em 8). A variaÃÃo dos tÃtulos dos autoanticorpos durante o tratamento nÃo foi significativa. O percentual total de respondedores foi de 26,5% (9/34). A resposta virolÃgica sustentada foi obtida por 17,4% (4/23) dos pacientes NOSA reagentes e 45,5% (5/11) dos pacientes nÃo reagentes para NOSA. A presenÃa de autoanticorpos nÃo foi associada a gÃnero, idade, genÃtipo viral ou nÃveis de transaminases. Conclui-se que o FAN foi o Ãnico NOSA significativamente associado à resposta à terapia. A ausÃncia de NOSA indica uma tendÃncia à resposta virolÃgica sustentada no tratamento da hepatite C crÃnica.

O melanoma representa menos de 5% de todos os cânceres de pele, porém, quando em estádio metastático possui prognóstico ruim. Entretanto, o genótipo dos melanomas pode prover uma oportunidade para intervenção terapêutica pelo fato de 90% dos casos de melanoma possuem p53 selvagem e grande parte destes possuem deleção na região cromossômica codificadora de interferon beta. Em prévios estudos, desenvolvemos o vetor adenoviral AdRGD-PG que fornece expressão do transgene em resposta à p53 através do promotor PG e ainda o tripeptídeo RGD, que possibilita que o adenovírus transduza uma maior gama de células pela alteração de seu mecanismo de entrada. Temos utilizado este vetor para entrega da versão murina de interferon beta em modelos de terapia gênica e imunoterapia de melanoma murino, revelando uma significativa habilidade do interferon beta em inibir a proliferação celular in vitro e in vivo e promover resposta imune antitumoral. No presente trabalho, os esforços se aplicam em adaptar essa estratégia em modelo de melanoma humano para observar se a mesma interação é encontrada. O vetor AdRGD-PGhIbeta, portador do cDNA de interferon beta humano (hIbeta) foi construído e expressão do transgene observada após transdução das linhagens estabelecidas de melanoma humano SK-MEL-05 e SK-MEL-147 (ambas p53 selvagem). Foi observado um robusto efeito antitumoral in vitro onde transferência de hIbeta promoveu acumulo de células hipodiploides (mais que 80% da população celular 96 horas após transdução) e evidências de morte por apoptose (exposição de fosfatidilserina e atividade de caspases 3/7) em ambas as linhagens. Nas duas linhagens, o efeito bystander foi demonstrado quando a presença de poucas células transduzidas (ex., 10%) foi suficiente para promover o acumulo significativo de células hipodiploides (mais que 40% neste exemplo). Em modelo de terapia gênica in situ utilizando células SK-MEL-147, também foi observado forte efeito antitumoral da hIbeta com total remissão do tumor de todos os animais tratados sem recidiva durante noventa dias. A presença de hIbeta na circulação dos animais foi confirmada 48h após o tratamento com AdRGD-PG hbeta mas presente em somente dois de sete animais 90 dias após o tratamento, sugerindo que o tratamento inicial e não um efeito off target foi responsável pela resposta. Com a finalidade de investigar efeitos colaterais do sequestro do vetor adenoviral pelo fígado, observamos a concentração circulante das enzimas aminotransferase de aspartate e aminotransferase de alanine (AST e ALT, respectivamente), que se mostrou não alterada quando comparadas entre animais que receberam injeção do vetor tratamento, vetor controle e solução salina. Com nossos resultados concluímos que vetores adenovirais carreando interferon-beta humano são capazes de transduzir a linhagem de melanoma SK-MEL-147 in vitro e in vivo, promovendo efeito bystander e remissão tumoral sem indução de efeitos adversos / Melanoma represents less than 5% of all cases of skin cancer, although, when metastatic, prognosis is dire. However, the genotype of melanomas might provide an opportunity for therapeutic intervention since 90% of melanoma cases possess wild-type p53 and a great portion of these possess deletion of the chromosomal region encoding interferon beta. In previous studies, we developed the adenoviral vector AdRGD-PG that supplies expression of the transgene in response to p53 through the PG promoter and that utilizes the RGD tripeptide, allowing the adenovirus to transduce a wider range of cells due to the alterated mechanism of entrance. We have used this vector to deliver the murine version of interferon beta in murine models of melanoma gene therapy and immunotherapy, revealing a significant ability of interferon beta to inhibit cellular proliferation in vitro and in vivo and promote an anti-tumor immune response. In the present project, we aimed to adapt this strategy for a human melanoma model in order to reveal if the same impact will be observed. The AdRGD-PGhIbeta vector encoding the human interferon beta (hIbeta) cDNA was constructed and expression of the transgene confirmed after transduction of the established human melanoma cell lines SK-MEL-05 and SK-MEL-147 (both wild-type p53). A striking anti-tumor effect was observed in vitro where the transfer of hIbeta promoted an accumulation of hypodiploid cells (over 80% of the cellular population 96 hours after transduction) and evidence of death by apoptosis (exposure of phosphatidylserine and activity of caspases 3/7) in both cell lines. In these cell lines, a bystander effect was demonstrated when the presence of few transduced cells (ex., 10%) was enough to promote significant accumulation of hypodiploid cells (over 40% in this example). In a model of in situ gene therapy using SK-MEL-147 cells, hIbeta induced a strong anti-tumor effect including total tumor remission in all treated animals without relapse during ninety days. The presence of hIbeta in the circulation of the animals was confirmed 48h after treatment with AdRGD-PGhIbeta, but was present in only two of the seven animals 90 days post-treatment, suggesting that the initial treatment, not off target effects, was responsible for the response. With the goal of investigating collateral effects of adenoviral sequestration by the liver, we assayed the circulating concentration of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase (AST and ALT, respectively), which showed no alteration when compared with animals that received the treatment with a control vector or saline solution. We conclude that our adenoviral vector carrying human interferon-beta is capable of transducing the human melanoma cell line SK-MEL-147 in vitro and in vivo, promoting a bystander effect and tumor remission without inducing adverse effects

INTRODUÇÃO: A urticária crônica é caracterizada pelo aparecimento de placas eritêmato-edematosas, pruriginosas que perduram por mais de seis semanas. A investigação da imunidade inata é de grande importância para a compreensão da imunopatologia de doenças dermatológicas crônicas como a Urticária Crônica Idiopática (UCI). Entre os componentes da resposta inata, a avaliação das células dendríticas plasmocitóides (pDCs) e sua capacidade de ativação por agonistas de Toll Like receptor 9 (TLR9) pode contribuir para avaliar o desequilíbrio imunológico encontrado na UCI. OBJETIVOS: Investigar a imunidade inata em pacientes com UCI e os mecanismos envolvidos na modulação da produção de IFN- por pDCs induzida pela ativação do TLR9. MÉTODOS: A secreção de IFN- e IL-10 por leucócitos de pacientes UCI (n=26) e indivíduos normais (Co, n=50) induzida pelo agonista de TLR9, CpGA (1.0 e 2.0M), ou IL12p40 induzida pelo ODN inibitório (ODN S) foi realizado por ensaio imunoenzimático. Quantificação de pDCs em sangue periférico, expressão de moléculas coestimulatórias, expressão intracelular de IFN- por pDCs e fosforilação de STAT (1 e 4) foram analisados por citometria de fluxo. Expressão do mRNA de TLR9 e fator regulador de interferon-7 foi realizado por real time PCR. A presença da pDC (CD123+) em lesões de pele de pacientes UCI foi avaliada por imunoistoquímica. RESULTADOS: Os resultados mostraram uma diminuição na produção de IFN- e IL-10 por leucócitos de pacientes UCI após estímulo com CpGA. O estímulo com ODN S induziu a produção de IL12p40 e suprimiu ainda mais a produção de IL-10 e IFN- induzida pelo CpGA, até 98% de inibição. O número de pDCs no sangue periférico e a capacidade de ativação da pDC nos pacientes, avaliada pela expressão de moléculas co-estimuladoras foi semelhante aos indivíduos normais. Além disto, foram detectadas raras pDCs nas lesões de pele dos pacientes. Um aumento constitutivo da fosforilação de STAT1 foi detectado em linfócitos não estimulados de pacientes UCI associado a uma diminuição da expressão de mRNA de TLR9 após estímulo com CpGA e alterada expressão de mRNA de IRF-7, que podem contribuir para a baixa produção de IFN-. CONCLUSÃO: Os achados mostram uma inibição na produção de IFN- via TLR9, tendo como alvo a pDC e sua participação na resposta inata na Urticária Crônica / INTRODUCTION: Chronic urticaria is a skin disorder characterized by recurrent and transitory itchy weals occurring regularly more than 6 weeks. The investigation of the innate immunity is an important parameter to understand the immunopathology of chronic dermatological diseases, such as Chronic Idiopathic Urticaria (CIU). Among the innate immune components, such as plasmacytoid dendritic cells (pDC) and their functional study activation thorough TLR-9 ligand could contribute to evaluate the immunologic disequilibrium founded in the CIU. OBJECTIVES: We decided to investigate innate immunity in CIU and the mechanisms implicated in the modulation of IFN- production by pDCs upon TLR9 activation. METHODS: The secretion of IFN- and IL-10 secretion by leucocytes of patients with CIU (n=26) and healthy control (HC, n=50) induced by TLR9 ligand, CpG type A (1.0 and 2.0M), or IL12p40 secretion induced by inhibitory ODN (ODN S) was assessed by enzyme-linked immunosorbent assay. Enumeration of pDC, coestimulatory molecules expression, intracellular IFN- expression, and STAT (1 and 4) phosphorylation were assessed by flow cytometry. TLR9 and interferon regulatory factor-7 mRNA transcripts were evaluated by real-time PCR. The presence of pDCs (CD123+) in the skin lesion of patients with CIU were assessed by means of immunohistochemistry staining. RESULTS: The findings showed a decreased IFN- and IL-10 secretion by leucocytes of CIU patients induced by CpGA. Inhibitory ODN was able to induce IL12p40 and further inhibited the IFN- secretion in both HC and patients achieving up 98% inhibition. A normal pDC percentage and degree of activation by costimulatory molecules expression was observed in CIU in patients was similar to control group. Moreover, rare presence of pDCs was detected in the skin lesion of patients. An increased constitutive STAT1 phosphorylation on non-stimulated lymphocytes and CpGA activation induced a down-regulation of TLR9 mRNA transcripts associated with altered IRF-7 along the time of CpG activation which may contribute to the decreased IFN- secretion. CONCLUSIONS: Altogether, the findings showed an impaired IFN- secretion via TLR-9, implicating innate immunity through pDCs as target in Chronic Urticaria

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-06-01T13:35:42Z No. of bitstreams: 1 carloseduardopelinsontoledo.pdf: 607534 bytes, checksum: 4be22c339daceeb5a28d5226bd766121 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-07-02T12:58:11Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carloseduardopelinsontoledo.pdf: 607534 bytes, checksum: 4be22c339daceeb5a28d5226bd766121 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-02T12:58:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carloseduardopelinsontoledo.pdf: 607534 bytes, checksum: 4be22c339daceeb5a28d5226bd766121 (MD5) Previous issue date: 2012-02-14 / O ambiente bucal é particularmente favorável à biodegradação de metais devido às suas propriedades iônicas, térmicas, microbiológicas e enzimáticas. Estudos têm demonstrado que íons metálicos podem ser liberados de matérias metálicos como resultado da corrosão. Outros apontam que o Níquel é um componente comum em muitos materiais ortodônticos e uma alergia ao Níquel é comumente observada na população. Juntamente com os testes de citotoxicidade tradicionais, o estudo da produção celular de Óxido Nítrico (NO) estimulado por determinado material é um método capaz de avaliar seu potencial citotóxico. O presente estudo teve como objetivo avaliar pelo método MTT [3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil tetrazólio brometo] a viabilidade celular de macrófagos murinos J774 na presença de 9 diferentes fios ortodônticos e o estímulo dos fios à produção de NO produzido por estas células. A avaliação das culturas celulares foi realizada em três intervalos de tempo: 24, 48 e 72 horas. A viabilidade celular em todos os grupos foi maior no intervalo de tempo final, que no intervalo de tempo inicial. Este aumento foi significativo no grupo controle. Nos grupos dos materiais, a média final da viabilidade celular no tempo de 72 horas não mostrou diferença significativa quando comparado com o grupo controle. A produção de NO em todos os grupos foi maior no intervalo de tempo final, que no intervalo de tempo inicial. Este aumento foi estatisticamente significativo no grupo controle. Nos grupos dos materiais, a média final da produção de NO apresentou diferença significativa apenas no grupo 8 (beta-Titânio), quando comparado com o grupo controle. Numa segunda etapa do estudo os macrófagos foram ativados com interferon-gama (IFN-) procurando simular uma condição comum no organismo humano no qual estas citocinas são produzidas e liberadas frente à presença de antígenos. As médias da análise da viabilidade celular dos macrófagos murinos ativados com interferon-gama nos grupos dos fios ortodônticos não apresentaram diferença estatisticamente significativa quando comparada com a média das células do grupo controle. As médias da análise da produção de óxido nítrico pelos macrófagos murinos ativados com interferon-gama nos grupos dos fios ortodônticos não apresentaram diferença estatisticamente significativa quando comparada com a média das células do grupo controle. / The oral environment is particularly favorable to metal biodegradation due to is ionic, thermal, microbiological, and enzymatic properties. Studies have shown that metal ions may be released from metallic materials as the result of corrosion. Other studies demonstrate that Nickel is a common component in many orthodontic materials and that an allergy to Nickel is commonly observed in the population. In addition to the traditional cytotoxicity tests, the study of nitric oxide cellular production stimulated by a specific material has shown to be a reliable tool for evaluating its cytotoxic potential. The present study was aimed at assessing cellular viability by MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] assay in a murine macrophage cell line J774 in the presence of 9 different orthodontics wires and quantify nitric oxide production by these cells. Evaluation of cell culture was undertaken in three time intervals: 24, 48 and 72 hours. The cellular viability in all groups was higher at the final time interval than at the initial time interval. This increase was statistically significant in the control group. In the material groups, the final mean of cellular viability at 72 hours showed no statistically significant difference when compared with the control group. NO production in all groups was higher at the final time interval than at the initial time interval. This increase was statistically significant in the control group. In the material groups, the final mean of NO production at 72 hours was only significant in group 8 (beta-Titanium) when compared with the control group. In a second step of the study, macrophages were activated with gamma interferon (IFN-) in order to stimulate a common condition of the human body in which these cytokines are produced and released with the presence of antigens. The means of the analysis of cell viability of murine macrophages activated with gamma interferon in the groups of orthodontic wires did not show statistically significant difference when compared to the mean of cells in the control group. The means of the analysis of NO production by the murine macrophages activated with gamma interferon in the groups of orthodontic wires did not show statistically significant difference when compared to the mean of cells in the control group.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-05-22T11:45:37Z No. of bitstreams: 1 juliacristinadeandradevitral.pdf: 529680 bytes, checksum: 9fd909fe70a3ba1771ad60581b326891 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-05-22T17:23:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 juliacristinadeandradevitral.pdf: 529680 bytes, checksum: 9fd909fe70a3ba1771ad60581b326891 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-22T17:23:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 juliacristinadeandradevitral.pdf: 529680 bytes, checksum: 9fd909fe70a3ba1771ad60581b326891 (MD5) Previous issue date: 2008-02-19 / Estudos apontam para o fato de os bráquetes cerâmicos serem quimicamente inertes no meio bucal, enquanto os bráquetes de policarbonato podem degradar-se liberando bisfenol-A (BPA) e os bráquetes de polioximetileno, o formaldeído. Juntamente com os testes de citotoxicidade tradicionais, o estudo da produção celular de Óxido Nítrico (NO) estimulado por determinado material é um método capaz de avaliar seu potencial citotóxico. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a viabilidade celular (citotoxicidade) destes três grupos de bráquetes sobre cultura celular da linhagem de macrófagos murinos J774 pelo método MTT {3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide} e o estímulo dos bráquetes à produção de óxido nítrico pelos macrófagos. A avaliação das culturas celulares foi realizada em três intervalos de tempo: 24, 48 e 72 horas. A viabilidade celular em todos os grupos foi maior no período final da avaliação (72 horas) em relação ao período inicial (24 horas), aumento este significativo nos grupos controle e bráquetes cerâmicos. As médias finais nos grupos de bráquetes não apresentaram diferenças significativas em relação ao controle. A produção de NO foi significativamente maior em todos os grupos no período final em relação ao período inicial. Não houve diferença significativa entre as médias finais dos grupos de bráquetes e do grupo controle, embora os bráquetes de polioximetileno tenham apresentado médias significativamente maiores nos períodos de 24 e 48 horas. Numa segunda etapa do trabalho os macrófagos foram ativados com interferon-gama (IFN-Y) procurando simular uma condição comum no organismo humano no qual estas citocinas são produzidas e liberadas frente à presença de antígenos. A viabilidade celular em todos os grupos foi significativamente maior no período final da avaliação em relação ao período inicial. As médias finais da viabilidade celular nos grupos de bráquetes não apresentaram diferenças significativas em relação ao controle. A produção de NO foi significativamente maior em todos os grupos no período final da avaliação em relação ao período 24 horas. Todavia não houve uma maior produção de óxido nítrico relacionado à presença dos bráquetes associada ao estímulo com Interferon-Y. / Studies point to the fact that ceramic brackets are chemically inert to the oral cavity, whereas polycarbonate and polyoxymethylene brackets may degradate releasing bisphenol-A and formaldehyde, respectively. In addition to the traditional cytotoxicity tests, the study of nitric oxide cellular production stimulated by a specific material has shown to be a reliable tool for evaluating its cytotoxic potential. The present study was aimed at assessing cellular viability by MTT {3,(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide} assay in a murine macrophage cell line J774 in the presence of esthetic brackets, and quantify nitric oxide production by these macrophages. Evaluation of cell culture was undertaken in three time intervals: 24, 48, and 72 hours. Cellular viability in all groups was higher at the final time interval (72 hours) in relation to the initial time (24 hours). This increase was significant in the control and ceramic bracket groups. Final means in the bracket groups did not show significant differences when compared to the control group. Nitric oxide production was significantly greater in all groups at the final time interval in relation to the initial time. There was no significant difference between the final means of the bracket groups and the control group, although polyoxymethylene brackets have shown significantly greater means at times 24 and 48 hours. In a second step of the study, macrophages were activated with gamma interferon (IFN-γ) in order to simulate a common condition of the human body in which these citocines are produced and released with the presence of antigens. Cellular viability in all groups was higher at the final time interval (72 hours) in relation to the initial time. Final means in the bracket groups did not show significant differences when compared to the control group. Nitric oxide production was significantly greater in all groups at the final time interval in relation to the initial time. However, there was not an increase of nitric oxide production in relation to the presence of brackets associated with the Interferon-Y stimulus.

Bunyaviridae is one of the biggest known viral families, and includes many viruses of clinical and economic importance. The major virulence factor of most bunyaviruses is the non-structural protein (NSs). NSs is expressed early in infection and inhibits the innate immune response of the host by blocking several steps in the interferon induction and signalling pathways. Hence, NSs significantly contributes to the establishment of a successful viral infection and replication, persistent infection and the zoonotic capacity of bunyaviruses. Although functions and structures of many viral interferon antagonists are known, no structure of a bunyavirus NSs protein has been solved to date. This strongly limits our understanding of the role and the mechanism of interferon antagonism in this large virus family. In this work the first structure for a bunyavirus interferon antagonist, the core domain crystal structure of NSs from the Rift Valley fever virus (RVFV) is presented. RVFV is one of the most clinically significant members of the Bunyaviridae family, causing recurrent epidemics in Africa and Arabia, often featuring high-mortality haemorrhagic fevers. The structure shows a novel all-helical fold. The unique molecular packing of NSs in the crystal creates stable fibrillar networks, which could correspond to the characteristic fibrillation of NSs observed in vivo in the nuclei of RVFV infected cells. This first NSs structure might be a useful template for future structure-aided design of drugs that target the RVFV interferon antagonism. Attempts at characterising other bunyavirus NSs proteins of other genera were made, but were hampered by problems with obtaining sufficient amounts of soluble and folded protein. The approaches that proved unsuccessful for the solubilisation of these NSs proteins, however, should inform future experiments aimed at obtaining recombinant NSs for structural studies.

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La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable, qui touche les motoneurones de la moelle épinière et du cerveau. Elle se manifeste par une faiblesse musculaire qui évolue rapidement vers une paralysie générale, entrainant la mort du patient. Les principes moléculaires conduisant à la dégénérescence sélective des motoneurones demeurent encore mal connus, entravant le développement de nouvelles thérapies. Mon travail de thèse a permis l'identification d'une nouvelle voie de mort spécifique aux motoneurones, qui dépend du récepteur LT-βR et de son ligand LIGHT. De plus, cette voie de mort peut être déclenchée par une cytokine pro-inflammatoire, qui est l'interféron gamma (IFNγ). Nous avons pu montrer des signes d'activation de cette voie de mort chez des souris modèles de la SLA ainsi que dans les tissus de patients atteints de la maladie. En effet, on observe au cours de la maladie une augmentation des niveaux d'IFNγ dans les astrocytes et les motoneurones. Une approche génétique a par la suite permis de démontrer l'implication fonctionnelle de cette voie de mort dans le processus pathologique. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a progressive, fatal neurodegenerative disease affecting primarily motoneurons in the brain and spinal cord. Symptoms of the disease include general muscle weakness, rapidly evolving in an overall paralysis, leading to the death of the patient. The precise mechanisms responsible for the selective vulnerability of motoneurons remain largely unknown, impeding therefore the development of effective therapies. My thesis work led to the discovery of a novel motoneuron selective death pathway dependent on the activation of LT-βR by LIGHT. This death pathway might also be triggered by the pro-inflammatory cytokine interferon gamma (IFNγ). Interestingly, we have documented signs of activation of this pathway in ALS mice and sporadic ALS patients, with IFNγ being upregulated in astrocytes and motoneurons. Furthermore, a genetic approach has provided evidence of the functional involvement of this death pathway in the pathogenic process.

Upon viral infection, host cells produce type I interferon (IFN), which activates the JAK-STAT signaling pathway and induces the expression of hundreds of interferon-stimulated genes (ISGs) to establish an antiviral state. In West Nile virus (WNV)-infected cells, the JAK-STAT signaling pathway is blocked by viral proteins. However, the expression of a subset of ISGs, which includes 2¢-5¢-oligoadenylate synthetase 1a (Oas1a), Oas1b, interferon regulatory factor 7 (Irf7), Mx1, and interferon-induced proteins with tetratricopeptide repeats 1 (Ifit1), is still upregulated by an IFN-independent mechanism in WNV-infected mouse embryonic fibroblasts (MEFs). Studies in cells with one or more components of RNA-sensing pathway knocked out showed that the alternative ISG upregulation is activated through RIG-I or MDA5, and the downstream adaptor IPS-1. In cells with IRF3, 5 and 7 knocked out, the alternative ISG upregulation by WNV infection is reduced but not eliminated. As an initial means of discovering the transcription factors involved in this non-canonical ISG upregulation, the critical regulatory regions in the promoters of two representative ISGs, Oas1b and Ifit1, were mapped using a dual luciferase assay system with a NanoLuc luciferase promoter reporter in WNV-infected Ifnar1-/- MEFs. The region from -299 to -28 in the Oas1b promoter, and the region from -192 to -50 in the Ifit1 promoter were identified as being important for upregulating non-canonical gene expression after WNV infection. Fine mapping identified enhancer and repressor sub-regions as well as transcription factor binding sites (TFBSs) putatively involved in the IFN-independent antiviral mechanism. Mutation of one identified TFBS in the ISG promoters reduced Oas1b and Ifit1 promoter activities. In electrophoretic mobility shift assays (EMSAs), a unique band, which was detected in WNV-infected but not in mock-infected Ifnar1-/- MEF nuclear extracts, was not observed when a probe with the identified TFBS mutated was used, suggesting that a unique complex forms at the identified TFBS when it is in the context of the adjacent flanking regions. The unique complex appears to contain NF-κB components and IRF3, IRF5 or IRF7. Our findings provide new insights into the mechanism involved in non-canonical upregulation of ISGs after WNV infection.