Protein therapeutics are available as cytokines, clotting factors, enzymes, hormones, growth factors, antibodies et al. They have been shown to be effective in treating a variety of important human diseases. Since human insulin was approved as the first recombinant protein therapeutic, this field has experienced rapid growth. One of the biggest challenges for protein therapeutics in clinical application is their short half-life. Except for monoclonal antibodies, which have serum half-life for weeks, most of the protein therapeutics have half-lives ranging from minutes to hours. Kidney filtration, proteasome degradation and liver metabolism are the main factors that attribute to their short half-lives. The short half-life of protein therapeutics requires a higher dose or frequent application to maintain therapeutic concentration over a certain period. However, higher dose is easy to cause large plasma concentration fluctuation, which is easy to cause side effects. Most of protein therapeutics are not orally bioavailable. Frequent application will increase the burden of patients, affect their life quality, and reduce patient compliance. Thus, it is important to generate long-lasting therapeutics with improved pharmacokinetic properties. The current half-life extension approaches for protein therapeutics include PEGylation, albumin fusion or binding and fusion to an immunoglobulin Fc region. Their primary aim is to increase the size of biotherapeutics or to implement recycling by the neonatal Fc receptor (FcRn). However, the half-life extension by PEGylation, albumin fusion or Fc fusion is at the cost of binding affinity reduction. And the increase of size has limited their application in the field of anticancer agents where tumor penetration is required. Noncovalent albumin binding using albumin binding ligands such as fatty acids could maintain the small size and binding affinity. However, it would increase hydrophobicity, therefore is not suitable for protein therapeutics with low solubility. Here, we present a new approach for half-life extension for biotherapeutics. Human interleukin 2 (IL-2), a low solubility cytokine, was used as a model protein. By conjugating IL-2 with a hydrophilic small molecule that binds reversibly to the serum protein transthyretin, we enhanced its circulation half-life in rodents while maintained its in vitro bioactivity. To the best of our knowledge, this is the first demonstration of a successful approach that harnesses a small molecule in extending the circulation half-life of a protein while at the same time maintains the small size and hydrophilicity.

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Interleukin-2-Rezeptor-Antikorper (IL-2RA) sind monoklonale Anti-IgG-Antikörper, die den Interleukin-2-Rezeptor aktivierter T-Zellen blockieren und so zu einer signifikanten Reduktion von akuten Abstoßungsreaktionen (AR) nach Nierentransplantation führen. Ziel dieser Arbeit ist die Durchführung einer Meta-Analyse aller verfügbaren kontrollierten Studien, die Erwachsene und Kinder nach primarer Lebertransplantation mit einer Induktionstherapie mit IL-2RA behandelten und diese mit Placebo oder keiner Heilbehandlung verglichen. Die Meta-Analyse soll zeigen, dass durch IL-2RA-Gabe die AR, SRAR (steroidresistente AR), Tod des Patienten (D), Transplantatverlust (GL) sowie CNI- und Steroid-bedingte Nebenwirkungen durch Dosisreduktion signifikant reduziert werden. Sechs Studien mit pädiatrischen und 20 Studien mit adulten Transplantatempfängern erfüllten die Einschlusskriterien. Die Analyse der Endpunkte wurde mit dem Modell mit zufälligen Effekten durchgeführt. Die IL-2RA-Induktionstherapie kann als sicher und ohne signifikante Nebenwirkungen für mindestens zwölf Monate bei Patienten nach Lebertransplantation beurteilt werden. IL-2RA reduziert signifikant die AR bei pädiatrischen (RR 0,38 CI [0,22-0,66]; p=0,0126; NNT=4) und adulten Patienten (RR 0,83 CI [0,74-0,93]; p=0,0007; NNT=18) nach Lebertransplantation und SRAR bei adulten Patienten (RR 0,66 CI [0,48-0,91]; p=0,011; NNT=29). D und GL werden reduziert. In adulten Studien der Vergleichsgruppe delayed/reduced CNI wurden eine signifikante Reduktion der gepoolten renalen Dysfunktionen (RR 0,46; CI [0,27-0,78]; p=0,004; 5 Kohorten), des Serum-Kreatinin (MD -0,05; [0,11-0,01]; p=0,03; 3 Kohorten) sowie eine signifikante Steigerung der eGFR beobachtet. Bei adulten Patienten der Vergleichsgruppe no/low steroids zeigte sich eine signifikante Reduktion des PTDM (RR 0,42; CI [0,31-0,55]; p<0,0001; NNT=12) und des HTN (RR 0,49; CI [0,25-0,96]; p=0,04; NNT=11).

Eine mangelhafte Produktion des Zytokins Interleukin-2 (IL-2), sowie Veränderungen in der Population der CD4+Foxp3+ regulatorischen T Zellen (Treg) wurden im Zusammenhang mit der Autoimmunkrankheit Systemischer Lupus erythematodes (SLE) beschrieben. Jedoch wurde ein möglicher kausaler Zusammenhang zwischen diesen beiden Auffälligkeiten und der Pathogenese des SLE bis jetzt nicht aufschlussreich untersucht. Durchflusszytometrische Analysen zeigten hier, dass der Anteil an Treg mit hoher Expression der IL-2 Rezeptoruntereinheit CD25, die mit funktioneller und metabolischer Treg Aktivität assoziiert wurde, in SLE Patienten erniedrigt ist. Außerdem ist das homöostatische Gleichgewicht zwischen Treg und konventionellen T Zellen gestört. In vitro Experimente zeigten, dass eine defekte IL-2 Produktion der CD4+ T Zellen für die niedrige CD25 Expression der Treg von SLE Patienten verantwortlich ist, wohingegen Stimulation mit IL-2 in vitro die CD25 Expression der Treg wiederherstellt und auch das Überleben der Treg erhöht. Vor allem niedrige IL-2 Konzentrationen hatten einen selektiven Effekt auf die Treg Population, während andere Lymphozyten nur wenig beeinflusst wurden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde eine klinische Studie mit niedrig dosiertem IL-2 zur Behandlung von Patienten mit refraktärem SLE implementiert. Niedrig dosiertes IL-2 führte zu einer peripheren Expansion suppressiver Treg mit stark erhöhter CD25 Expression und verbesserte das homöostatische Gleichgewicht zwischen Treg und konventionellen T Zellen. Diese Effekte wurden von einer klinischen Remission in drei der fünf mit IL-2 behandelten SLE Patienten begleitet. Zusammenfassend machen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die Bedeutung des IL-2 Defizits für die Veränderungen in der Treg Population und die Pathogenese des SLE deutlich, und zeigen, dass niedrig dosiertes IL-2 einen sicheren und effizienten neuen Therapieansatz darstellt, der direkt in die Pathogenese des SLE eingreift. / A defective production of the cytokine Interleukin-2 (IL-2), as well as abnormalities in the population of CD4+Foxp3+ regulatory T cells (Treg), have been described in association with the autoimmune disease systemic lupus erythematosus (SLE). However, a possible causal relationship between these two features and SLE pathogenesis has not been adequately investigated so far. Here, flow-cytometric analyses showed that the proportion of Treg expressing high levels of the IL-2 receptor subunit CD25, which was associated with functional and metabolic Treg activity, is reduced in SLE patients. In addition, the homeostatic balance between Treg and conventional T cells is disturbed in SLE. In vitro experiments showed that a defective IL-2 production by CD4+ T cells accounts for the low CD25 expression in Treg from SLE patients. In contrast, in vitro stimulation with IL-2 restores CD25 expression in Treg and enhances their survival. Especially low IL-2 concentrations had a selective effect on the Treg population, while other lymphocytes were only marginally affected. Based on these results, a clinical trial with low-dose IL-2 was implemented for the treatment of patients with refractory SLE. Low-dose IL-2 treatment of SLE patients caused a selective peripheral expansion of suppressive Treg with strongly increased CD25 expression levels, and improved the homeostatic balance between Treg and conventional T cells. These effects were accompanied by clinical remission in three of the five SLE patients that were treated with low-dose IL-2 during the course of this study. In summary, this work demonstrates the impact of IL-2 deficiency for the Treg abnormalities and disease pathogenesis in SLE, and it proposes low-dose IL-2 as a safe and efficient novel therapeutic approach, which directly targets SLE pathogenesis.

The fatty acid amides, a structurally diverse endogenous congener of molecules active in cell signaling, may prove to have diverse activity due to their interface with a number of receptor systems, including, but not limited to cannabinoid receptor 2 (CB2) and PPARγ. Select extracts of Echinacea spp. contain the fatty acid amides known as alkylamides. These extracts were a previously popular remedy relied on by U.S. physicians, one of the top sellers in the natural products industry and are currently a frequently physician prescribed remedy in Germany. In the series of experiments contained within, Galenic ethanolic extracts of Echinacea spp. root were used for the quantification, identification, degradation and bioactivity studies. On extraction, depending on the ratio of plant to solvent and fresh or dry, the data indicate that there is variability in the alkylamide classes extracted. For example the acetylene alkylamides appear to extract under different concentrations, as well as degrade faster than the olefinic alkylamides. In addition, the alkylamides are found to degrade significantly in both cut/sift and powdered forms of echinacea root. Human liver microsome oxidation of the major alkylamide dodeca-2E,4E,8Z,10Z-tetraenoic acid isobutylamide generate hydroxylated, caboxylated and epoxidized metabolites. The carboxylated metabolite has, thus far, shown different immune activity than the native tetraene isobutylamide. Bioactivity studies, based on cytokine modulation of the alkylamides have been assumed to be due to a classic CB2 response. However, the results of experiments contained herein suggest that IL-2 inhibition by the alkylamide undeca-2E-ene-8,10-diynoic acid isobutylamide, which does not bind to CB2, is due to PPARγ activation. These data, combined with data generated by other groups, suggest that the alkylamides of Echinacea spp. are polyvalent in effect, in that they modulate multiple biochemical pathways.

Zytotoxische CD8+ T-Zellen spielen eine bedeutende Rolle in der Immunantwort gegen HIV-1. Trotz allem kommt es jedoch im Verlauf der Infektion bei den meisten Betroffenen zum Anstieg der Viruslast und Abfall der CD4 Zellzahl, obwohl auch in diesem fortgeschrittenen Stadium der Infektion virusspezifische CD8+ T-Zellantworten mittels INF-&#947;-Produktion nachgewiesen werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, weitere funktionelle und phänotypische Merkmale von CD8+ T-Zellen zu untersuchen, um eine mögliche Ursache für die im Verlauf der Infektion ineffizient werdende Immunantwort zu finden. Einen statistisch signifikanten Unterschied der INF-&#947; Produktion CD8+ T-Zellen zwischen Progressors und Controllers ließ sich mittels INF-&#947; Elispot bei den von uns untersuchten Patienten nicht nachweisen. Es ist also davon auszugehen, dass CD8+-T-Zellen im fortgeschrittenen, chronischen Stadium der Infektion funktionelle Lücken aufweisen, die sich nicht durch INF&#61543;-basierte Untersuchungsmethoden nachweisen lassen. Anhand intrazellulärer Zytokinfärbung ließ sich unabhängig vom Schweregrad der Infektion eine erhaltene Produktion der Zytokine INF&#947; und TNF&#945;, nicht hingegen eine Produktion von IL-2 nachweisen. Bei der Untersuchung HIV spezifischer CD8+ T-Zellen mit Hilfe von Tetramerfärbungen zeigte sich in Bezug auf den Aktivierungsgrad, gemessen an der CD38-Expression, ein deutlicher Unterschied zwischen Progressors und Controllers, der innerhalb der HIV-spezifischen CD8+ T-Zellen im Vergleich zur gesamten CD8+ T-Zellpopulation noch ausgeprägter zu erkennen war. Hier gab es eine signifikante positive Korrelation zur Viruslast und eine signifikante negative Korrelation zur CD4-Zellzahl der HIV-Infizierten. Anhand des Aktivierungsmarkers HLA-DR ließ sich dieser Unterschied nicht nachweisen. Im Bezug auf die Proliferationsfähigkeit, Apoptoseempfindlichkeit und lytische Funktion HIV-spezifischer Zellen konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Progressors und Controllers ausgemacht werden. Schlüsse für die Gesamtheit der HIV-spezifischen Zellen eines HIV-Infizierten kann man natürlich nicht ziehen. Man darf nicht außer Acht lassen, dass uns lediglich eine begrenzte Anzahl von Epitopen bei den durchgeführten Untersuchungen zur Verfügung stand. Es wurde jedoch deutlich, dass es feine Unterschiede und Trends zu geben scheint, die eine gezielte weiterführende Untersuchung erfordern. Weiterhin ist auch zu bedenken, dass möglicherweise andere Faktoren, als die von uns untersuchten, für den unterschiedlichen Krankheitsverlauf verantwortlich sein können. Welche Faktoren nun tatsächlich die Ursache sind dafür, dass das menschliche Immunsystem gegen das HI-Virus in der Regel früher oder später verliert, bleibt weiterhin offen. Sehr wahrscheinlich handelt es sich hierbei um das Zusammenspiel mehrerer Mechanismen. Die gezielte Untersuchung HIV-spezifischer Zellen ist bei der weiteren Erforschung der genauen Zusammenhänge unerlässlich.

Neste estudo investigamos os efeitos dos ácidos graxos sobre a função e sinalização intracelular de linfócitos humanos. Os ácidos oléico (OA) e linoléico (LA), em baixas concentrações, estimularam a proliferação celular induzida pela IL-2 através do aumento da fosforilação da proteína PKC-<font face=\"symbol\">Z que levou a um aumento da fosforilação de ERK 1/2. Já os ácidos palmítico (PA), esteárico (SA), DHA e EPA diminuíram a proliferação destas células e inibiram a fosforilação de JAK1 e 3, STAT5, ERK e Akt. Os resultados obtidos são sugestivos de que o efeito inibitório promovido por PA, SA, DHA e EPA sobre a proliferação de linfócitos ocorreu devido à diminuição da fosforilação de proteínas fundamentais para a proliferação celular. Por outro lado, OA e LA estimularam a proliferação de linfócitos aumentando a fosforilação de ERK 1/2 através da ativação de PKC-<font face=\"symbol\">Z, efeito dependente da PI3K. O efeito inibitório promovido pelo DHA está associado a uma alteração na quantidade de lipid rafts na membrana plasmática nos quais o receptor de IL-2 está localizado. / The effect of fatty acids (FA) on interleukin -2 (IL-2) signaling pathway in human lymphocytes was investigated. Docosahexaenoic (DHA), eicosapentaenoic (EPA), palmitic (PA) and stearic (SA) acids decreased lymphocyte proliferation in concentrations above 50 <font face=\"symbol\">mM. However, oleic (OA) and linoleic (LA) acids increase lymphocyte proliferation at 25 <font face=\"symbol\">mM. PA, SA, DHA and EPA decreased JAK 1, JAK 3, STAT 5 and AKT phosphorylation induced by IL-2 but OA and LA did not cause any effect. OA and LA increased ERK1/2 phosphorylation whereas the other FA caused a marked decrease. PKC-<font face=\"symbol\">Z phosphorylation was decreased by OA and LA only. In conclusion, the inhibitory effect of PA, SA, DHA and EPA on lymphocyte proliferation observed in our previous study was due to a decrease in protein phosphorylation activated by IL-2. Probably, OA and LA stimulated lymphocyte proliferation by increasing ERK 1/2 phosphorylation throught PKC-<font face=\"symbol\">Z activation. The inhibition of JAK 1, JAK3, STAT 5, ERK1/2 and Akt phosphorylation caused by DHA is associated to a decrease in membrane lipid rafts contend.

Nos travaux décrivent l’identification et la caractérisation d’une cellule immunitaire : l’IKDC pour Interferon Producing killer dendritic cell. Cette population cellulaire, découverte à la faveur de la combinaison Imatinib mesilate et Interleukine 2 dans le traitement des métastases pulmonaires de mélanome B16F10 chez la souris, combine des caractéristiques de cellule dendritique (présentation antigénique) et de cellule natural killer (lyse sans apprentissage). Le phénotype des IKDC est le suivant :CD3-, CD19-, CD11c+,B220+, NK1.1+. Nous avons établi une stratégie de culture des IKDC ex vivo grâce à la trans-présentation de l’IL-15 et montré que ces cellules sont capables de présenter des antigènes aux lymphocytes T et de vacciner une souris contre une tumeur. Ce projet se poursuit par la mise en place d’un essai clinique de phase I utilisant Imatinib mesilate et l’Interleukine 2. / In this manuscript, we describe the isolation and the characterisation of a novel immune cell: the IKDC for Interferon Producing killer dendritic cell. This cell population, discovered thanks to the combination Imatinib mesilate and Interleukine 2 for the treatment of lung metastases of B16F10 murine melanoma, shares dendritic cell (antigen presentation) and natural killer cell (non specific lysis) properties. IKDC phenotype is the following: CD3-, CD19-, CD11c+, B220+, NK1.1+. We established a culture strategy for the IKDC ex vivo thanks to the trans-presentation of IL-15 and demonstrated that these cells once cultivated are able to prime lymphocytes and to protect mice from tumor development. This project has led to a phase I clinical trial testing the antitumor effect of the combination Imatinib mesilate and Interleukin 2.