Devido à gravidade da manifestação clínica e pelas altas taxas de mortalidade em populações de risco, o controle e a prevenção da listeriose, doença causada pela L. monocytogenes, representa um importante desafio às autoridades sanitárias. A dificuldade de recuperar organismos envolvidos nos surtos, a sub-notificação e a demora na realização de análises convencionais são alguns dos fatores que retardam ou impedem intervenções em situações de surto. Com o advento da biologia molecular,novas técnicas têm sido empregadas para a identificação e tipificação da L. monocytogenes, com o intuito de contribuir com os estudos epidemiológicos e de vigilância sanitária de alimentos. O presente estudo visou confirmar a taxonomia e o perfil genotípico de 31 cepas isoladas de diversos tipos de carne, supostamente identificadas como L. monocytogenes, por intermédio das técnicas de Reação de Cadeia pela Polimerase (PCR), com o emprego de iniciadores de identificação dos genes 16S rRNA e Internalina A e B, para confirmação da espécie. Os resultados indicaram que apenas 20 (65%) das cepas foram confirmadas como sendo da espécie investigada. Foi realizada ainda a avaliação de similaridade nas 20 cepas confirmadas, através da Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), que revelou grande diversidade genotípica, caracterizada por 18 diferentes perfis, segundo o coeficiente de similaridade de Pearson. Os resultados demonstraram que as técnicas moleculares são de grande utilidade para a identificação e tipificação de L. monocytogenes, caracterizando-se como importantes ferramentas epidemiológicas. / Due to the seriousness of clinical manifestations and high rates of mortality of the listeriosis disease in populations at risk, control and prevention of this disease, caused by L. monocytogenes, represent an important challenge to sanitation authorities. Difficulties of recovering organisms involved in outbreaks; sub notification; and, the delay in accomplishing conventional analysis are some of the factors that slow-down or even prevent health interventions in outbreak occurrences. With the advent of the molecular biology, new techniques have been employed for identifying and typifying the L. monocytogenes aiming at contributing to studies on epidemiology and sanitary surveillance of foods. The present study aimed at ratifying the taxonomy and the genotypic profile of 31 isolated stocks of varied types of meats supposedly identified as L. monocytogenes by means of the Polymerase Chain Reaction (PCR) employing identification starters of genes 16 rRNA and A and B Internalin in order to confirm the species. Results indicated that only 20 (65.0%) of the stocks were confirmed as being from the investigated species. Another evaluation of similarity were also carried out along with the 20 stocks ratified through pulsed field gel electrophoresis (PFGE), which disclosed a great genotypic diversity characterized by 18 different profiles, according to the Pearson’s similarity coefficient. Results demonstrated that the molecular techniques are very helpful for identifying and typifying the L. monocytogenes, characterizing themselves as important epidemiological tools.

Devido à gravidade da manifestação clínica e pelas altas taxas de mortalidade em populações de risco, o controle e a prevenção da listeriose, doença causada pela L. monocytogenes, representa um importante desafio às autoridades sanitárias. A dificuldade de recuperar organismos envolvidos nos surtos, a sub-notificação e a demora na realização de análises convencionais são alguns dos fatores que retardam ou impedem intervenções em situações de surto. Com o advento da biologia molecular,novas técnicas têm sido empregadas para a identificação e tipificação da L. monocytogenes, com o intuito de contribuir com os estudos epidemiológicos e de vigilância sanitária de alimentos. O presente estudo visou confirmar a taxonomia e o perfil genotípico de 31 cepas isoladas de diversos tipos de carne, supostamente identificadas como L. monocytogenes, por intermédio das técnicas de Reação de Cadeia pela Polimerase (PCR), com o emprego de iniciadores de identificação dos genes 16S rRNA e Internalina A e B, para confirmação da espécie. Os resultados indicaram que apenas 20 (65%) das cepas foram confirmadas como sendo da espécie investigada. Foi realizada ainda a avaliação de similaridade nas 20 cepas confirmadas, através da Eletroforese em Campo Pulsado (PFGE), que revelou grande diversidade genotípica, caracterizada por 18 diferentes perfis, segundo o coeficiente de similaridade de Pearson. Os resultados demonstraram que as técnicas moleculares são de grande utilidade para a identificação e tipificação de L. monocytogenes, caracterizando-se como importantes ferramentas epidemiológicas. / Due to the seriousness of clinical manifestations and high rates of mortality of the listeriosis disease in populations at risk, control and prevention of this disease, caused by L. monocytogenes, represent an important challenge to sanitation authorities. Difficulties of recovering organisms involved in outbreaks; sub notification; and, the delay in accomplishing conventional analysis are some of the factors that slow-down or even prevent health interventions in outbreak occurrences. With the advent of the molecular biology, new techniques have been employed for identifying and typifying the L. monocytogenes aiming at contributing to studies on epidemiology and sanitary surveillance of foods. The present study aimed at ratifying the taxonomy and the genotypic profile of 31 isolated stocks of varied types of meats supposedly identified as L. monocytogenes by means of the Polymerase Chain Reaction (PCR) employing identification starters of genes 16 rRNA and A and B Internalin in order to confirm the species. Results indicated that only 20 (65.0%) of the stocks were confirmed as being from the investigated species. Another evaluation of similarity were also carried out along with the 20 stocks ratified through pulsed field gel electrophoresis (PFGE), which disclosed a great genotypic diversity characterized by 18 different profiles, according to the Pearson’s similarity coefficient. Results demonstrated that the molecular techniques are very helpful for identifying and typifying the L. monocytogenes, characterizing themselves as important epidemiological tools.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_marcelo_mendonca.pdf: 563837 bytes, checksum: b7cfe13cc7ba52f1c762a5c48b290205 (MD5) Previous issue date: 2008-03-10 / The food pathogen Listeria monocytogenes is the causative agent of listeriosis, a severe disease that courses with high rates of morbid and mortality. The conventional methods used for detection of this bacterium are laborious and expensive, requiring several days for final identification. Monoclonal antibody (Mab) based immunoassays used for rapid detection of L. monocytogenes have the advantage of being highly specific, particularly if the MAbs are directed against virulence factors conserved among pathogenic strains. Membrane protein internalin A (InlA) from L. monocytogenes is a well characterized virulence factor involved in its adhesion to and internalization in non-phagocytic cells of the host. This work reports on the production and characterization of a panel of MAbs against InlA of L. monocytogenes. For MAbs production, isogenic BALB/c mice were immunized with a recombinant fragment of InlA (rInlA) expressed in Escherichia coli. Five hybridomas secreting MAbs anti-rInlA were generated. The MAbs affinity constants (Ka) were among 7x107 L.mol-1 e 4x106 L.mol-1. The MAbs recognized specifically the species L. monocytogenes by indirect ELISA and Western blot. In indirect ELISA using live or heat-killed L. monocytogenes the MAbs recognized InlA only in bacteria that were grown in Listeria enrichment broth and that were not heated. Western blot analysis revealed that MAbs recognized a band around 88kDa in the L. monocytogenes strains, the molecular mass expected for InlA in its native form. The MAbs produced in this study have potential for use in immunoassays for the detection of L. monocytogenes. / O patógeno alimentar Listeria monocytogenes é o agente causador da listeriose, uma doença severa que cursa com altas taxas de morbidade e de mortalidade. Os métodos convencionais empregados para detecção desta bactéria são laboriosos e onerosos, requerendo vários dias para sua identificação final. Imunoensaios usados para detecção rápida desta bactéria que utilizam anticorpos monoclonais (MAbs) tem como vantagem a alta especificidade, especialmente quando os MAbs são dirigidos contra fatores de virulência conservados nas cepas patogênicas. Entre os diversos fatores de virulência de L. monocytogenes, a proteína de membrana internalina A (InlA), necessária para a aderência e internalização em células não fagocíticas do hospedeiro, é umas das mais bem caracterizadas. Neste trabalho é relatado a produção e caracterização de um painel de MAbs contra a InlA. Na produção dos MAbs, camundongos isogênicos BALB/c foram imunizados com um fragmento recombinante da proteína InlA (rInlA) expresso em Escherichia coli. Foram gerados cinco hibridomas secretores de MAbs anti-rInlA. A constante de afinidade (Ka) dos cinco MAbs situou-se entre 7x107 L.mol-1 e 4x106 L.mol-1. Na caracterização por ELISA indireto e Western blot os MAbs reconheceram especificamente a espécie L. monocytogenes. No ELISA indireto com células de L. monocytogenes vivas ou mortas por tratamento térmico, os MAbs reconheceram somente a InlA nas bactérias que não sofreram tratamento térmico e que foram cultivadas em caldo de enriquecimento para Listeria (LEB). No Western blot os MAbs reconheceram uma banda de aproximadamente 88kDa nas cepas de L. monocytogenes, massa molecular esperada para a proteína InlA em sua forma nativa. Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que os MAbs produzidos possuem potencial para serem utilizados em imunoensaios de detecção de L. monocytogenes.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:33:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_marcelo_mendonca.PDF: 4204978 bytes, checksum: e41a9490cdb350a5e7add8e129afdd82 (MD5) Previous issue date: 2011-12-01 / The conventional methods used to detect the Listeria monocytogenes in foods are laborious and expensive, requiring several days for final identification. Monoclonal antibody (MAb) based immunoassays are highly specific and rapid to perform, especially when MAbs are raised to conserved virulence factors in the pathogen. Among diverse virulence factors of L. monocytogenes, the surface protein internalin A (InlA) is one of the most well-known and characterized protein, being an excellent target as it is highly exposed on the surface and exclusive of pathogenic species. In this work we report the production, characterization and use of a panel of MAbs against InlA (2D12, 3B7, 4E4), and a MAb (3F8) which specifically recognizes all bacteria belonging the genus Listeria. MAbs were produced by the immunization of BALB/c mice with a recombinant InlA together with heat killed L. monocytogenes. The MAbs produced showed excellent reativities by indirect ELISA, Western blot and immunofluorescence. A Cy5 conjugated anti-InlA MAb-2D12 was used as detection antibody for L. monocytogenes in a sandwich-like fiber optic immunoassay. Using MAb-2D12 as capture antibody on the waveguides, the limit of detection was ~3 x 102 CFU.mL-1, and when MAb-3F8 was used for capture the limit of detection was ~1 x 105 CFU.mL-1. Furthermore, MAbs 2D12 and 3F8 were used to coat paramagnetic beads and tested in the immunomagnetic separation (IMS) of L. monocytogenes from pure cultures, and artificially contaminated cheeses and hotdogs. After IMS capture, bacteria were released from the beads, used in the fiber optic assay or plated on agar for counting. In parallel, the capture of L. monocytogenes was confirmed by real-time qPCR and light-scattering technology (BARDOT). Using IMS to concentrate and separate L. monocytogenes, followed by a fiber optic platform, it was possible to detect in less than 22 h, approximately 40 CFU/g of L. monocytogenesi, even in the presence of L. innocua in cheese and hot dogs artificially contaminated. In addition, using mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) the protein to which MAb-3F8 binds, was identified as fructose 1,6-bisphosphate aldolase (FBA). The results presented in this work indicate that using both systems together, the IMS and fiber optic immunosensor, were more reliable and faster, and could be applied in the routinely for detection of L. monocytogenes in food. Moreover, both MAbs have the potential to useful in others biosensor platforms, as well as in other detection and functionality immunoassays for InlA and FBA in Listeria. / Os métodos convencionais empregados para detecção de Listeria monocytogenes em alimentos são laboriosos e onerosos, requerendo vários dias para sua identificação final. A utilização de anticorpos monoclonais (MAbs) em imunoensaios para detecção rápida de bactérias tem como vantagem a alta especificidade e rapidez, principalmente quando direcionados para fatores de virulência conservados. Dentre os diversos fatores de virulência de Listeria, a proteína de membrana internalina A (InlA), é umas das mais bem caracterizadas, sendo um excelente alvo por ser altamente exposta na superfície e exclusiva de espécies patogênicas. Neste trabalho é relatado a produção, caracterização e utilização em métodos de diagnósticos de um painel de MAbs contra a InlA (2D12, 3B7, 4E4), e de um MAb (3F8) que reconhece especificamente todas as bactérias do gênero Listeria. Na produção dos MAbs, camundongos BALB/c foram imunizados com uma proteína recombinante InlA (rInlA) concomitantemente com L. monocytogenes inativadas por fervura. Os MAbs gerados demonstraram excelente reatividade por ELISA indireto, Western blot e imunofluorescência. O MAb anti-InlA 2D12 marcado com Cy5 foi usado como anticorpo de detecção de L. monocytogenes, no sistema tipo sanduíche de sensor de fibra óptica. Usando MAb-2D12 como anticorpo de captura nas fibras ópticas, obteve-se um limite de detecção de ~3 x 102 CFU.mL-1, e um limite de detecção de ~1 x 105 CFU.mL-1 foi visualizado com MAb-3F8 como captura. Os MAbs anti-InlA 2D12 e anti-Listeria 3F8 foram posteriormente utilizados para sensibilizar esferas paramagnéticas e testados na separação imunomagnética (IMS) de L. monocytogenes em culturas puras, e em queijo e salsichas tipo hotdog artificialmente contaminados. Após a captura por IMS, as bactérias foram liberadas, incubadas com a fibra óptica ou plaqueadas em agares para contagem. Em paralelo, a confirmação da captura de L. monocytogenes foi realizada por PCR quantitativo em tempo real e por light-scattering technology (BARDOT). Utilizando IMS para separar e concentrar L. monocytogenes, seguido da utilização em plataforma de fibra óptica, foi possível realizar a detecção em menos de 22 horas, de aproximadamente 40 UFC/g de L. monocytogenes em presença de L. innocua, em queijo e salsicha artificialmente contaminados. Além disso, a proteína alvo do MAb3F8 foi identificado como frutose 1,6-bifosfato aldolase através de espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS). Os resultados obtidos nesse trabalho indicam que a utilização em conjunto dos sistemas de IMS e fibra óptica com os MAb-2D12 e MAb3F8, foram confiáveis e rápidos, e assim, podendo ser empregados em imunoensaios de rotina para detecção de L. monocytogenes em alimentos. Contudo, ambos MAbs possuem ainda grande potencial para serem mais explorados em outras plataformas de biossensores, assim como, em outros imunoensaios de detecção e funcionalidade de InlA e FBA em Listeria