Nosso trabalho foi dividido em um primeiro capítulo dedicado à análise do peptidoma do estriado de camundongos no modelo da 6-OHDA e também à atividade das oligopeptidases EP 24.15 e EP 24.16; e um segundo capítulo com os dados referentes a uma colaboração resultante de estágio sanduíche no Instituto Max-Planck de Psiquiatria em Munique, Alemanha, e que se refere a estudos peptidômicos em amostras post-mortem do lobo temporal anterior e do corpo caloso de pacientes esquizofrênicos. Para desenvolver os trabalhos utilizamos a técnica de marcação isotópica e label free aplicadas ao LC-MS/MS. No caso do modelo de Parkinson, os resultados indicaram alterações significativas em 5 diferentes fragmentos peptídicos e para a esquizofrenia, 2 fragmentos mostraram-se biologicamente diferentes. Ambos os trabalhos geraram grande quantidade de dados que abrem possibilidades investigativas para novos alvos de estudos em ambas as doenças. / The thesis is divided in one chapter, which was dedicated to peptidomic analysis of the striatum in the 6-OHDA mice model and also to oligopeptidase activity such as EP 24.15 and EP 24.16. The second chapter refers to data obtained during a research internship in the Max-Planck Institute of Psychiatry, Munich, Germany, in which we ran peptidomic analysis of post-mortem samples of the anterior temporal lobe and corpus callosum from schizophrenia patients. Both projects used mass spectrometry techniques such as isotopic labeling and label free applied to LC-MS/MS. In the Parkinsons disease model we observed significant changes in 5 different peptide fragments, and for schizophrenia samples, 2 peptide fragments were biologically different. The resulting data acquired in both projects lead to a substantial increase in prospective possibilities to new targets associated to the disorders studied here.

Os hormônios tireoidianos atuam sobre o metabolismo dos diversos tecidos do organismo e participam da regulação do consumo de glicose pelas células. Estudos já evidenciaram que o T3 atua, dependendo do tipo celular, aumentando a expressão de algumas isoformas dos transportadores de glicose (GLUTs) e a translocação do GLUT4 para a membrana plasmática, melhorando, também, a captação de glicose (CGlic) em poucos minutos. Os mecanismos envolvidos nessas ações do T3, contudo, ainda não estão bem esclarecidos. O objetivo do presente estudo foi investigar as possíveis vias de sinalização envolvidas na ação aguda do T3 sobre a CGlic em células adiposas 3T3-L1. Nossos dados demonstraram que o T3 promove aumento na CGlic, com pico aos 10 min, retornando ao nível do controle após 30 min de incubação das células com o hormônio. Sugerimos que essa ação depende, ao menos, de duas vias de sinalização. Uma delas envolve a ativação das proteínas Src, PI3K e Akt. A outra, aparentemente, é iniciada a partir da membrana plasmática via integrina aVb3 / Thyroid hormones act on the metabolism of many tissues and participate in the regulation of glucose consumption by cells. Studies from this and other laboratories have demonstrated in muscle and adipose cells that T3 increases, in a short period (minutes), the expression of some glucose transporter (GLUTs) isoforms and GLUT4 translocation to the plasma membrane leading to an improvement of glucose uptake. However, the mechanisms involved in these T3 actions are still not clear. The aim of this study was to investigate the possible signaling pathways involved in the acute T3 action on glucose uptake in 3T3-L1 adipocytes. Our results have shown that T3 increases glucose uptake with a peak at 10 min returning to the control level after 30 min of the cell incubation with the hormone. We suggest that this action depends on at least two parallel signaling pathways. One involves the activation of Src, PI3K and Akt proteins, while the other involves another mechanism triggered by T3, apparently, from the plasma membrane at aVb3 integrin.

Orientador: Daniel Carneiro Carrettiero. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:56:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2531.pdf: 1826513 bytes, checksum: 1b4aeefe4e23520d603b495bbd0b8832 (MD5) Previous issue date: 2009-04-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / Using recombinant DNA techniques, the lipase BTL2 gene of Bacillus thermocatenulatus was cloned in E. coli BL321 under control of the strong temperature-inducible λPL promoter. It was investigated, initially, in this work, the influence of different variables in cell growth and expression of lipase BTL2 by recombinant E. coli, through experiments performed in agitated flasks with LB medium. First, it was studied the influence of temperature of growth (between 27 ° C and 34.2 °C) and heat shock temperature (between 37.8 °C and 46.2 °C) in the expression of lipase BTL2 by E. coli recombinant, using statistical design of experiments. The results of this study, where the shock was performed in the early exponential phase, indicated as the best Tcresc = 27 °C and Tchoque = 45 °C, yielding cellular concentration of 0.6 g dry weight / L and enzyme activity of 121.000 U/g.wet.cel. Then, it was investigated the influence of the growth phase of the microorganism at the shock, through cultures with Tcresc = 27 °C and Tchoque = 45 °C, the results of these experiments showed how heat shock condition at the end of exponential phase, resulting in activity of 258.000 U/g.wet.cel It investigated the influence of different initial concentrations of glucose in the medium on cell growth and expression of the enzyme. The best results were obtained from cell mass with 10 g/L glucose and μmax = 0,16 h-1, Yx/s = 0,19 g/g, resulting in 1.2 g / L dry cel, enzymatic activity of about 250.000 U / g.wet.cel. Lower concentrations of glucose and higher concentrations led to smaller cell, but did not affect enzyme activity in the final. Based on previous cultures of E.coli were conducted simulations to calculate the best condition for feed-batch. The experimental test was performed with 10 g/L glucose at the beginning of cultivation, Tcresc = 30 °C, Tchoque = 45 °C. In this test, we were able to achieve 15 g/L dry.cel μmax = 0,38 h-1 with enzyme activity of 231.000 U/g.wet.cel, with resulting in 100 times more enzyme in this test than in cultivation in shaker in the best condition. The results of the simulation, obtained using model of Monod, predicted quite well those obtained experimentally. There was no significant accumulation of organic acids and all aminoacids consumed by the moment of shock. From the heat shock, those who were not exhausted with concentration remained constant. The enzyme produced in the test batch was recovered by breaking the cells in a French press to obtain with this methodology 272.000 U/g wet cells, whereas the results of the samples, which were disrupted by sonication resulted in much lower value. Was then investigated the efficiency of the protocol of sonication that was being used, by subjecting the cells to successive rounds of sonication. The results showed that actually the first cycle only 50% of the enzyme was released, indicating that the maximum production achieved was actually around 462.000 U/gcél.úmida. Study characterization of enzyme kinetics showed that the temperature of maximum activity is 65 °C with activation energy equal to 142.3 kJ/mol. Study of stability in solvent showed that the enzyme retains activity in the presence of 2- propanol. / Utilizando técnicas de DNA recombinante, o gene da lípase BTL2 de Bacillus thermocatenulatus foi clonado em E. coli BL321 sob controle do promotor λPL, com o qual a indução na produção da enzima é obtida através de choque térmico. Investigou-se, inicialmente, neste trabalho, a influência de diferentes variáveis no crescimento celular e na expressão da lípase BTL2 por E.coli recombinante, através de experimentos realizados em frascos agitados, com meio LB. Primeiramente, estudou-se a influência da temperatura de crescimento (entre 27°C e 34,2°C) e da temperatura de choque térmico (entre 37,8°C e 46,2°C) na expressão de BTL2 por E.coli recombinante, usando planejamento estatístico de experimentos. Os resultados desse estudo, onde o choque era realizado no início da fase exponencial, indicaram como as melhores temperaturas Tcresc=27°C e Tchoque=45°C, obtendose concentração celular de 0,6 g massa seca/L e atividade enzimática de 121.000U/gcél.úmida. A seguir, foi investigada a influência da fase de crescimento do microrganismo no momento do choque, através de cultivos com Tcresc=27°C e Tchoque =45°C, os resultados desses experimentos indicaram como melhor condição choque térmico no final da fase exponencial, obtendo-se nessa condição atividade de BTL2 de 258.000U/gcél. Úmida. Investigou-se assim a influência de diferentes concentrações iniciais de glicose no meio de cultivo no crescimento celular e expressão da enzima. Os melhores resultados de massa celular foram obtidos com 10g/L de glicose, obtendo-se 1,2 g/L de massa seca, μmax = 0,16 h- 1, Yx/s=0,19 g/g e atividade enzimática em torno de 250.000 U/gcél, úmida. Concentrações de glicose menores e maiores conduziram a menores concentrações celulares, mas não influenciaram na atividade enzimática final. Baseando-se em cultivos anteriores de E.coli foram realizadas simulações para cálculo de alimentação de meio em ensaio em batelada alimentada. O ensaio experimental foi realizado com 10 g/L de glicose no início do cultivo, Tcresc=30°C, Tchoque=45°C. Nesse ensaio, conseguiu-se atingir 15 g/L de massa seca, com μmax =0,38 h-1 e com atividade enzimática de 231.000 U/gcel.úmida, obtendo-se 100 vezes mais enzima nesse ensaio do que no cultivo em frasco agitado na melhor condição. Os resultados da simulação, obtidos usando modelo de Monod, previram bastante bem os obtidos experimentalmente. Não se observou acúmulo significativo de ácidos orgânicos e todos os aminoácidos.eram consumidos até o momento do choque. A partir do choque térmico, aqueles que não estavam esgotados permaneceram com concentração constante. A enzima produzida no ensaio em batelada foi recuperada rompendo-se as células em uma prensa francesa, obtendo-se com essa metodologia 272.000 U/g cel úmida, enquanto que os resultados das amostras , que eram rompidas por sonicação resultaram em valor muito menor. Investigou-se então a eficiência do protocolo de sonicação que vinha sendo utilizado, submetendo-se as células a sucessivos ciclos de sonicação. Os resultados mostraram que realmente no primeiro ciclo apenas 50% da enzima era liberada, o que indica que a máxima produção obtida estava na verdade em torno de 462.000U/gcél.úmida.Estudo de caracterização cinética da enzima mostrou que a temperatura de máxima atividade é 65°C, com energia de ativação igual a 142,3 kJ/mol. Estudo de estabilidade em solvente mostrou que a enzima mantém atividade na presença de 2-propanol.

Arranjos supramoleculares combinando o lípide catiônico brometo de dioctadecildimetilamônio (DOD) com polímeros, como carboximetilcelulose (CMC) e cloreto de poli(dialildimetilamônio) (PDDA), foram preparados na forma de nanopartículas (NPs), na ausência ou presença de antimicrobiano tradicional, como a claritromicina (CLA). NPs preparadas por atração eletrostática entre os fragmentos de bicamada (BF) de DOD, CMC e PDDA foram avaliadas, in vitro, quanto à atividade contra isolados clínicos de micro-organismos multirresistentes (MR) a antimicrobianos, como Pseudomonas aeruginosa MR, Klebsiella pneumoniae produtora da enzima carbapenemase do tipo KPC, Staphylococcus aureus resistente à meticilina/oxacilina (MRSA) e Candida albicans resistente ao fluconazol, através do método de plaqueamento e contagem de viáveis. As NPs de DOD BF/CMC/PDDA apresentam alta atividade de amplo espectro contra micro-organismos MR, em que o PDDA é o componente responsável pela excelente atividade biocida das NPs. O mecanismo de ação antimicrobiana indica a dissociação dessas NPs na presença dos micro-organismos, com a remoção de biopolímeros da parede celular microbiana pelo PDDA, conforme visualizado por microscopia eletrônica de varredura, ocorrendo lise da membrana microbiana e liberação de compostos fosforilados para o meio extracelular. Também foram desenvolvidas neste trabalho NPs carreadoras de CLA à base de DOD e polímeros. Solução etanólica contendo CLA/DOD foi injetada em solução aquosa de CMC, formando arranjos coloidalmente estáveis e aniônicos, que posteriormente foram adicionados de solução de PDDA, para a obtenção de arranjos estáveis e catiônicos. CLA/DOD/CMC e CLA/DOD/CMC/PDDA NPs incorporaram CLA em quantidade suficiente para inibir o crescimento de M. abscessus no interior de macrófagos bem como evitar a formação de biofilmes, sendo que altas doses de CLA foram tóxicas aos macrófagos, enquanto doses menores apresentaram baixa toxicidade e boa atividade antimicrobiana. NPs catiônicas carreando CLA foram tóxicas aos macrófagos nas concentrações de PDDA testadas. A natureza particulada das CLA NPs possivelmente aumenta a retenção intracelular de CLA em comparação com CLA livre, podendo prolongar atividade da CLA contra patógenos intracelulares. Desta maneira, arranjos supramoleculares combinando lípide e polímeros, com ou sem antimicrobianos tradicionais poderão encontrar diversas aplicações nas áreas farmacêutica, médica, alimentícia e biotecnológica. / Supramolecular assemblies combining cationic lipid dioctadecyldimethylammonium bromide (DOD) and polymers, such as sodium carboxymethylcellulose (CMC) and poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDDA), were prepared as nanoparticles (NPs), in the absence or presence of traditional antibiotic, such as clarithromycin (CLA). NPs prepared by electrostatic attraction between DOD bilayer fragments (BF), CMC and PDDA were evaluated against clinical strains of multidrug resistant (MDR) microorganisms, such as Pseudomonas aeruginosa MDR, Klebsiella pneumoniae producer of KPC carbapenemase enzyme, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Candida albicans fluconazole resistant, by plating and colony forming unities counting. DOD BF/CMC/PDDA NPs display high and broad-spectrum activity against MDR microrganisms, and PDDA is the excellent biocidal component in the NPs. The mechanism of antimicrobial action shows that NPs disassembly in the presence of microrganisms, with biopolymers withdrawn from the cell wall, as observed by scanning electron microscopy, consecutively lysing bacterial membrane as determined from the leakage of inner phosphorylated compounds. In this work there have also been developed NPs, based on lipid and polymers, as carriers for CLA. Ethanolic solution co-solubilizing CLA/DOD was injected in CMC aqueous solution, yielding colloidaly stable and anionic NPs, that were further added of PDDA solution, yielding stable and cationic NPs. CLA/DOD/CMC NPs and CLA/DOD/CMC/PDDA NPs incorporated CLA at doses high enough to inhibit M. abscessus growth inside macrophages or in biofilms. Larger CLA doses were toxic to macrophages while lower CLA doses reduced toxicity to macrophages despite their high antimicrobial activity. Cationic CLA NPs exhibited substantial toxicity against macrophages at the PDDA concentrations tested. The particulate nature of these CLA NPs possibly increases intracellular CLA retention in comparison to free CLA, probably extending CLA activity against intracellular pathogens. In conclusion, supramolecular assemblies combining cationic lipid and polymers, with or without traditional antibiotics, may find multiple possibilities of applications at pharmaceutical, medical, food and biotecnological fields.

Arranjos supramoleculares combinando o lípide catiônico brometo de dioctadecildimetilamônio (DOD) com polímeros, como carboximetilcelulose (CMC) e cloreto de poli(dialildimetilamônio) (PDDA), foram preparados na forma de nanopartículas (NPs), na ausência ou presença de antimicrobiano tradicional, como a claritromicina (CLA). NPs preparadas por atração eletrostática entre os fragmentos de bicamada (BF) de DOD, CMC e PDDA foram avaliadas, in vitro, quanto à atividade contra isolados clínicos de micro-organismos multirresistentes (MR) a antimicrobianos, como Pseudomonas aeruginosa MR, Klebsiella pneumoniae produtora da enzima carbapenemase do tipo KPC, Staphylococcus aureus resistente à meticilina/oxacilina (MRSA) e Candida albicans resistente ao fluconazol, através do método de plaqueamento e contagem de viáveis. As NPs de DOD BF/CMC/PDDA apresentam alta atividade de amplo espectro contra micro-organismos MR, em que o PDDA é o componente responsável pela excelente atividade biocida das NPs. O mecanismo de ação antimicrobiana indica a dissociação dessas NPs na presença dos micro-organismos, com a remoção de biopolímeros da parede celular microbiana pelo PDDA, conforme visualizado por microscopia eletrônica de varredura, ocorrendo lise da membrana microbiana e liberação de compostos fosforilados para o meio extracelular. Também foram desenvolvidas neste trabalho NPs carreadoras de CLA à base de DOD e polímeros. Solução etanólica contendo CLA/DOD foi injetada em solução aquosa de CMC, formando arranjos coloidalmente estáveis e aniônicos, que posteriormente foram adicionados de solução de PDDA, para a obtenção de arranjos estáveis e catiônicos. CLA/DOD/CMC e CLA/DOD/CMC/PDDA NPs incorporaram CLA em quantidade suficiente para inibir o crescimento de M. abscessus no interior de macrófagos bem como evitar a formação de biofilmes, sendo que altas doses de CLA foram tóxicas aos macrófagos, enquanto doses menores apresentaram baixa toxicidade e boa atividade antimicrobiana. NPs catiônicas carreando CLA foram tóxicas aos macrófagos nas concentrações de PDDA testadas. A natureza particulada das CLA NPs possivelmente aumenta a retenção intracelular de CLA em comparação com CLA livre, podendo prolongar atividade da CLA contra patógenos intracelulares. Desta maneira, arranjos supramoleculares combinando lípide e polímeros, com ou sem antimicrobianos tradicionais poderão encontrar diversas aplicações nas áreas farmacêutica, médica, alimentícia e biotecnológica. / Supramolecular assemblies combining cationic lipid dioctadecyldimethylammonium bromide (DOD) and polymers, such as sodium carboxymethylcellulose (CMC) and poly(diallyldimethylammonium chloride) (PDDA), were prepared as nanoparticles (NPs), in the absence or presence of traditional antibiotic, such as clarithromycin (CLA). NPs prepared by electrostatic attraction between DOD bilayer fragments (BF), CMC and PDDA were evaluated against clinical strains of multidrug resistant (MDR) microorganisms, such as Pseudomonas aeruginosa MDR, Klebsiella pneumoniae producer of KPC carbapenemase enzyme, methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Candida albicans fluconazole resistant, by plating and colony forming unities counting. DOD BF/CMC/PDDA NPs display high and broad-spectrum activity against MDR microrganisms, and PDDA is the excellent biocidal component in the NPs. The mechanism of antimicrobial action shows that NPs disassembly in the presence of microrganisms, with biopolymers withdrawn from the cell wall, as observed by scanning electron microscopy, consecutively lysing bacterial membrane as determined from the leakage of inner phosphorylated compounds. In this work there have also been developed NPs, based on lipid and polymers, as carriers for CLA. Ethanolic solution co-solubilizing CLA/DOD was injected in CMC aqueous solution, yielding colloidaly stable and anionic NPs, that were further added of PDDA solution, yielding stable and cationic NPs. CLA/DOD/CMC NPs and CLA/DOD/CMC/PDDA NPs incorporated CLA at doses high enough to inhibit M. abscessus growth inside macrophages or in biofilms. Larger CLA doses were toxic to macrophages while lower CLA doses reduced toxicity to macrophages despite their high antimicrobial activity. Cationic CLA NPs exhibited substantial toxicity against macrophages at the PDDA concentrations tested. The particulate nature of these CLA NPs possibly increases intracellular CLA retention in comparison to free CLA, probably extending CLA activity against intracellular pathogens. In conclusion, supramolecular assemblies combining cationic lipid and polymers, with or without traditional antibiotics, may find multiple possibilities of applications at pharmaceutical, medical, food and biotecnological fields.