In dieser Dissertation wurden am Ferkelmodell (8-15 kg, drei Gruppen: „Kontrolle“ n=7, „Herz-Lungen-Maschine (HLM)“ n=10, „(-)-Epigallocatechin-3-Gallat (EGCG)“ n=6, die Kontrollgruppe wurde thorakotomiert, die HLM- und die EGCG-Gruppe wurden thorakotomiert und für 90 Minuten an eine HLM angeschlossen, die EGCG-Gruppe erhielt vor und nach der HLM-Zeit EGCG) drei Fragestellungen behandelt: Erstens wurde untersucht, ob die Verwendung einer HLM während eines kardiochirurgischen Eingriffes unter hypothermen Bedingungen mit nicht-pulsatilem Blutfluss und Kardioplegie die Niere schädigte. Dafür wurden Paraffinschnitte der Niere aus der Kontroll- und der HLM-Gruppe mit Hämatoxylin-Eosin (HE) angefärbt und unterschiedliche Strukturen betrachtet, wobei histopathologische Veränderungen in der HLM-Gruppe auffielen. Paraklinisch fanden sich erhöhte nierenspezifische Blutwerte (Serumkreatinin und -harnstoff) in der HLM-Gruppe. Diese Ergebnisse waren hinweisend für eine funktionell relevante Schädigung der Niere durch die HLM. Unterstützend kam ein Absinken des Gesamteiweißes im Serum der HLM-Gruppe hinzu, was auf eine generelle Schädigung des Organismus durch die HLM hindeutete. Zweitens wurde betrachtet, ob die gesetzten Schäden die Merkmale eines Ischämie-Reperfusionsschadens aufwiesen. Hierzu wurden Paraffinschnitte der Niere aus der Kontroll- und der HLM-Gruppe immunhistochemisch (Hypoxie-induzierter-Faktor-1-alpha-Tyramide- Signal-Amplification (HIF-1-alpha-TSA)-, Nitrotyrosin-3-Amino-9-Ethylcarbazol (Nitrotyrosin-AEC)- und Apoptose-induzierender-Faktor-Tyramide-Signal-Amplification (AIF-TSA)-Färbung) angefärbt. Dabei zeigte sich, dass sich die HLM-Gruppe in einer hypoxischen Situation befand (HIF-1-alpha Akkumulation in den Zellkernen), nitrosativem Stress ausgesetzt war (Nitrotyrosin in den Tubuli) und dass sie teilweise so stark geschädigt wurde, dass Apoptose induziert wurde (AIF in Zellkernen) – alle drei Färbungsergebnisse waren hinweisend für einen ischämischen Zustand, in dem sich die HLM-Gruppe befunden hat. Auch die Ergebnisse der durchgeführten renalen Reversed Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC) deuteten auf ebendies hin. Unterstützend wirkten die Ergebnisse des arteriellen Laktats – die HLM-Gruppe zeigte eine Hyperlaktämie – und die Tatsache, dass einige der histologischen Merkmale für eine frühe Schockniere (welche ischämischen Ursprungs sein kann) in der HLM-Gruppe gefunden wurden. Dies alles zeigte, dass der HLM-assoziierte Nierenschaden vorrangig die Natur eines Ischämie-Reperfusionsschadens aufwies. Drittens wurde untersucht, ob EGCG diese HLM-assoziierte Schädigung abmildern konnte. Dafür wurden bei der EGCG-Gruppe alle oben genannten Untersuchungen durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass EGCG in der Dosierung 10 mg/kg eine renoprotektive Wirkung gegen die HLM-assoziierten Schäden hatte, und diese abmildern bzw. ihnen entgegenwirken konnte. Diese Ergebnisse sind für die pädiatrische Kardiochirurgie interessant, welche zum Beispiel bei der Korrektur angeborener Herzdefekte auf die Verwendung der HLM angewiesen ist. Komplikationen wie eine Nierenschädigung post operationem sind nicht selten und verkomplizieren den Verlauf. Die vorliegende Dissertation zeigt das renoprotektive Potential des in grünem Tee vorkommenden Katechins EGCG im Umfeld eines kardiochirurgischen Eingriffes mit Verwendung einer HLM. Die Wirksamkeit dieser Substanz ist wahrscheinlich darin begründet, dass sie mehr als ein Antioxidans ist. Neben seiner Radikalfänger- und Stickstoffmonoxidscavenger-Fähigkeiten ist EGCG außerdem antiapoptotisch wirksam. Derzeit wird die Kardiochirurgie mit Verwendung einer HLM in der Veterinärmedizin nur in wenigen Zentren angewendet. Es besteht für die Zukunft jedoch die Hoffnung, dass gerade für Kleintierbesitzer, die ihre Tiere als Familienmitglied betrachten, und auch für zoologische Einrichtungen bei der Diagnose eines Herzfehlers die Kardiochirurgie mit Verwendung einer HLM als Therapiemöglichkeit eine interessante und realistische Alternative zur bislang angewandten palliativen medikamentösen Therapie darstellen kann. / In this dissertation a piglet model (8-15 kg, three groups: “control” n=7, “extracorporeal circulation (EC)” n=10, “EGCG” n=6, the control-group was thoracotomized, the EC- and the EGCG-group were thoracotomized and underwent cardiopulmonary bypass (CPB) for 90 minutes, and the EGCG-group received EGCG before and after the CPB) is presented. Three questions were raised and answered: Firstly, it was investigated if the use of a CPB during cardiac surgery with hypothermia, non-pulsatile blood flow and cardioplegia caused damage to the kidney. In order to answer this question, paraffin slices of the kidney of the control- and the EC-group were stained with hematoxylin-eosin (HE), and different structures were evaluated – this staining showed histopathological changes in the EC-group. Paraclinical, the EC-group showed elevated kidney-specific blood parameters (serumcreatinine and -urea). These findings indicated a functionally relevant impairment of the kidney caused by the CPB. Supporting this, the EC-group also showed a decline of the total amount of proteins in the serum, which was suggestive of a generalized injury of the body by the CPB. Secondly, it was investigated whether the injury of the kidney might have been caused by an ischemia/reperfusion injury. Therefore, paraffin slices of the kidney of the control- and the EC-group were immunhistochemically stained (hypoxia-induced-factor-1-alpha-tyramidesignal-amplification (HIF-1-alpha-TSA)-, nitrotyrosine-3-amino-9-ethylcarbazole (nitrotyrosine-AEC)- and apoptosis-inducing-factor-tyramide-signal-amplification (AIF-TSA)-staining). These stainings revealed, that the EC-group had suffered from a hypoxemic situation (accumulation of HIF-1-alpha in the nuclei), from nitrosative stress (presence of nitrotyrosine in the tubuli), and that the kidney was partly damaged to the point of an induction of apoptosis (presence of AIF in the nuclei) – all three of these findings indicated, that the kidneys of the EC-group were put into an ischemic situation. The findings of the renal reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) indicated the same thing. This was also supported by the blood parameter of lactate – the EC-group showed a hyperlactemia – and by some histological findings in the EC-group, which were characteristical for an early shock-kidney (which may be caused by ischemia). Taken together, these findings showed that the CPB-associated kidney injury was primarily caused by an ischemia/reperfusion injury. Thirdly, it was investigated, whether EGCG might attenuate the CPB-associated kidney injury. For that purpose, all of the investigation methods mentioned above were carried out with the samples of the EGCG-group. The findings showed that EGCG (dose: 10 mg/kg) had a protective effect on the kidney, protecting it against the damage caused by the CPB, and was able to partly attenuate this damage and partly even fully counteract it. These findings are of interest for pediatric cardiac surgery, which for example for the correction of innate heart defects depends on the use of CPB. Complications – like acute renal injury post operationem – occur frequently and complicate the recovery. This dissertation demonstrates the renoprotective potential of the natural compound EGCG in the setting of cardiac surgery with the use of CPB. The reason for the effectiveness of EGCG in this situation probably is that EGCG is more than an antioxidant. EGCG not only works as a radical- and nitric-oxide-scavenger, but also is antiapoptotic. In veterinary medicine cardiac surgery with CPB is done by few centers only. However for the future there is hope that people – especially pet owners who view their companion animals as family members, and zoos – become more and more willing to and interested in having an animal diagnosed with a heart defect treated with cardiac surgery including the use of an CPB, instead of – like its usually done nowadays – only giving palliative medication to the animal.

In den ersten Versuchsreihen der hier vorliegenden Arbeit bestätigte sich, dass im in vitro Modell die klassische ischämische Präkonditionierung kardioprotektiv wirkt. Die Präkonditionierung bewirkte eine Infarktgrößenreduktion um 54 %; dies wird durch Literaturangaben bestätigt. Die Postkonditionierung dagegen, trotz drei verschiedener Postkonditionierungsprotokolle, ist am isoliert perfundierten Rattenherzen nicht protektiv. Im in vivo Rattenherz-Modell wurden die Präkonditionierung und die klinisch relevantere Postkonditionierung gegenüberstellend untersucht. Hier zeigte sich, dass die 3 Reperfusions-/Ischämiezyklen für jeweils 30 Sekunden der Postkonditionierung genauso protektiv wie die Präkonditionierung wirken. Infarktgrößen- und biochemische Untersuchungen belegen, dass hierbei die PI3-Kinase ein wichtiges Signaltransduktionselement ist, da einerseits durch die Inhibition der PI3-Kinase mittels Wortmannin die Infarktgrößenreduktion vollständig aufgehoben war und andererseits nach einer 1,5-minütigen Reperfusion eine vermehrte Phosphorylierung der Akt im Western-Blot auftrat. Des Weiteren konnte erstmals die Inaktivierung der GSK-3ß durch eine verstärkte Phosphorylierung über einen PI3-Kinase-vermittelten Signaltransduktionsweg nachgewiesen werden. Die Zugabe des spezifischen Inhibitors TDZD-8 der GSK-3ß verringert ebenfalls die Infarktgröße signifikant. Auch konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass das mammalian target of Rapamycin in der Postkonditionierung des in vivo Rattenherzens eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Außerdem konnte neben dem PI3-Kinase/Akt-Signaltransduktionsweg auch die Beteiligung des MEK1/2-ERK1/2–Wegs als Signaltransduktionsweg der Postkonditionierung im in vivo Rattenherzen nachgewiesen werden. Erstmals wurde die Apoptose in einem in vivo Herzen nach regionaler Ischämie untersucht. Die Ergebnisse des TUNEL-Tests und der Western-Blot-Analysen zeigen eine unterdrückte Apoptose durch die Postkonditionierung. Ein weiterer Teil der vorliegenden Arbeit widmete sich der Untersuchung der Postkonditionierung in pathologischen Rattenherzen. Im Gegensatz zu gesunden Herzen schlug die Postkonditionierung in hypertrophiertem Myokardium von spontan-hypertensiven Ratten mit einer signifikant arteriellen Hypertension fehl. Diese Blockierung der Kardioprotektion zeigte sich durch die fehlende Reduzierung der Infarktgröße trotz unterschiedlicher Postkonditionierungsprotokolle (3x30’’ und 6x10’’ R/I) und unterschiedlich langer Ischämiedauern (20 und 30 Minuten). Gleichfalls war auch die Phosphorylierung der GSK-3ß aufgehoben. Als Modell des metabolischen Syndroms wurde die WOKW-Ratte untersucht. Diese Ratten entwickeln in sehr jungem Alter klassische Symptome wie Dyslipidämie, Hyperinsulinämie und Fettsucht. Wie bei der Herzhypertrophie war auch beim Modell des metabolischen Syndroms die Postkonditionierung - mit 3 Reperfusions-/ Ischämiezyklen für jeweils 30 Sekunden - blockiert. Dabei konnte weder eine Infarktgrößenreduktion noch eine vermehrte Phosphorylierung der GSK-3ß nachgewiesen werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit erlauben die Schlußfolgerung, dass das Substrat der GSK-3ß, die mPTP des Mitochondriums, eine „Schlüsselrolle“ in der Apoptose innehat - die Postkonditionierung vermindert nicht nur die Nekrose, sondern reduziert auch die Apoptose. Bemerkenswert und potentiell von klinischer Bedeutung ist die Beobachtung, dass bei Vorliegen von Risikofaktoren, wie arterielle Hypertonie und metabolischem Syndrom, solche Schutzmechanismen des Herzens aufgehoben sind. Diese Erkenntnisse sind im Hinblick auf die Therapie am Menschen von großer Bedeutung. Ob langfristig einzelne Komponenten der Signaltransduktionswege, wie PI3-Kinase, Akt, mTOR, ERK1/2 oder GSK-3ß, Angriffspunkte einer pharmakologischen Therapie sein könnten, muß in weiteren Untersuchungen geklärt werden.

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Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Der ATP-getriggerte Ionenkanal P2X7 ist als purinerger Oberflächenrezeptor besonders auf Zellen des Immunsystems und auf Gliazellen im Nervensystem exprimiert. Seine Aktivierung führt zur Freisetzung proinflammatorischer Zytokine, zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies sowie zu einer Beeinflussung des Zellzyklus. Zwar konnte eine Beteiligung des Rezeptors an verschiedenen entzündlichen und degenerativen Erkrankungen nachgewiesen werden, allerdings bestehen nach wie vor viele Unstimmigkeiten darüber, ob P2X7 im Einzelfall protektiv oder schadend wirkt. Eine therapeutische Modulation des Rezeptors gestaltet sich daher bis heute schwierig. Weiterhin wurde trotz intensiver Bemühungen um selektive, potente P2X7-Modulatoren bisher kein Wirkstoff über Phase-II-Studien hinaus entwickelt. Der erste Teil der Arbeit beschreibt eine Studie zur Identifikation neuer P2X7-Modulatoren und deren Charakterisierung hinsichtlich Potenz, Bindeverhalten und Speziesspezifität. Ziel dieser Studie war es, die Basis für die Entwicklung möglicher neuer Therapeutika zu legen, für die ein hoher Bedarf besteht. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Beteiligung des P2X7-Rezeptors an den pathophysiologischen Vorgängen nach einem Hirninfarkt untersucht. Besondere Aufmerksamkeit lag dabei auf dem Einfluss, den der Rezeptor auf die Bildung eines begleitenden, oftmals fatalen Hirnödems ausübt. In einer Wirkstoffbibliothek enthaltene zugelassene Pharmaka und Naturstoffe wurden auf ihre Wirksamkeit am rekombinant exprimierten humanen P2X7-Rezeptor (hP2X7) getestet. Dazu wurde gemessen, inwiefern diese Wirkstoffe den P2X7-vermittelten Ca2+-Einstrom modulieren können. Für potenziell selektive Substanzen wurden Konzentrations-Wirkungs-Kurven erstellt. Für den potenten Inhibitor Tanshinon II A-Sulfonat (TIIAS) und den chemisch verwandten Wirkstoff Tanshinon II A (TIIA) erfolgte diese Untersuchung auch an den rekombinant exprimierten P2X7-Rezeptoren von Maus (mP2X7) und Ratte (rP2X7). Weiterhin erfolgte eine detaillierte, auf elektrophysiologischen Untersuchungen basierende Darstellung der pharmakodynamischen Eigenschaften von TIIAS. Die Selektivität der Wirkung gegenüber P2X2 und P2X4 wurde mithilfe entsprechender Zelllinien geprüft. Die Wirkung modulierender Pharmaka am nativen Rezeptor wurde in humanen, aus peripheren Blutmonozyten gereiften Makrophagen überprüft, wozu neben der Darstellung des Ca2+-Einstroms auch ein IL-1β-ELISA eingesetzt wurde. In allen Experimenten wurde die Beteiligung von P2X7 über bekannte Antagonisten verifiziert. Um zu klären, inwiefern P2X7 die pathophysiologischen Abläufe nach Hirninfarkt beeinflusst, wurde bei 20 P2X7-defizienten Mäusen (P2X7-/-) und bei 22 zugehörigen Wildtyp-Mäusen (WT) eine zerebrale Ischämie induziert, indem die mittlere Zerebralarterie mit einem dünnen Faden für 60 Minuten transient verschlossen wurde (middle cerebral artery occlusion, MCAO). In den folgenden 72 Stunden wurde über klinische Methoden und Magnetresonanzuntersuchungen die Entwicklung neurologischer Defizite, der Infarktgröße und des begleitenden Hirnödems evaluiert. Nach schmerzloser Tötung und Hirnentnahme wurden immunhistologisch die Aktivierung und Verteilung von Mikroglia und Astrozyten sowie der Zustand des Gefäßendothels untersucht. Sham-operierte Tiere dienten in allen Experimenten als Kontrollen. TIIAS hemmte hP2X7 mit einer IC50 von 4.3 μM, während die Potenz an mP2X7 geringer war und rP2X7 kaum geblockt wurde. TIIA modulierte P2X7 nicht. TIIAS hemmte als allosterischer Antagonist die Öffnung des Ionenkanals und band vermutlich an eine intrazelluläre Bindestelle. Die Wirkung von TIIAS wurde in humanen Makrophagen bestätigt, in denen der Wirkstoff den Ioneneinstrom und die IL-1β-Freisetzung hemmte. Obwohl die neurologische Untersuchung von P2X7-/-- und WT-Mäusen nach MCAO keine signifikanten Unterschiede ergab, zeigte sich in der bildgebenden Diagnostik, dass P2X7-/--Mäuse binnen 24 Stunden nach der OP ein signifikant stärkeres Hirnödem entwickelten, welches nicht durch Unterschiede in der Infarktgröße bedingt war. Der Infarkt führte in beiden Gruppen zu einer Gliaaktivierung, die im Fall der Mikroglia in Abwesenheit von P2X7 allerdings reduziert war. Differenzen hinsichtlich der Aktivierung von Astrozyten und der Expression von Laminin im Kapillarendothel wurden nicht festgestellt. Im Gegensatz zu TIIA, das häufig als gleichwertiger Wirkstoff eingesetzt wird, blockt TIIAS hP2X7 speziesspezifisch mit einer hohen Potenz. Maus und Ratte scheiden aufgrund der geringen Wirkung von TIIAS leider als Tiermodelle aus, um die Wirkung von TIIAS in vivo zu prüfen. Weitere Arbeiten sind notwendig, um die Potenz von TIIAS in anderen Spezies zu evaluieren oder Alternativen zum Tierversuch zu finden und eine mögliche therapeutische Anwendung bei Erkrankungen mit P2X7-Beteiligung zu testen. P2X7 beeinflusst die pathophysiologischen Vorgänge nach einem Hirninfarkt und begrenzt die Entwicklung eines zytotoxischen Hirnödems, nicht aber die des vasogenen Hirnödems, das sich zeitversetzt einstellt. Eine mögliche Erklärung für diesen Sachverhalt bieten die unterschiedlichen Funktionen, die Gliazellen zu verschiedenen Zeitpunkten nach zerebraler Ischämie übernehmen. Unsere Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass verschiedene Tiermodelle des zerebralen Infarkts nicht in allen Punkten vergleichbar sind.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung........................................................................................................... 1 1.1 Purinerge Signaltransduktion.......................................................................... 1 1.2 P2X-Rezeptoren.............................................................................................. 2 1.3 Pharmakologie des P2X7-Rezeptors............................................................... 3 1.4 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung des P2X7-Rezeptor...... 5 1.5 Gegenstand dieser Arbeit............................................................................... 7 2 Veröffentlichungen............................................................................................. 9 2.1 Erste Publikation............................................................................................. 9 2.1.1 Tanshinone II A sulfonate, but not tanshinone II A, acts as potent negative allosteric modulator of the human purinergic receptor P2X7................................. 9 2.1.2 Ergänzende Materialien zur ersten Publikation.......................................... 22 2.2 Zweite Publikation......................................................................................... 30 2.2.1 Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery................................................................................. 30 2.2.2 Ergänzende Materialien zur zweiten Publikation......................................... 42 2.2.3 Erratum to: Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery occlusion............................................ 46 3 Diskussion........................................................................................................ 49 4 Zusammenfassung........................................................................................... 55 5 Summary.......................................................................................................... 57 6 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 59 7 Danksagung..................................................................................................... 66 / ATP-gated ion channel P2X7 is a purinergic cell surface receptor which is mainly expressed on immune and glia cell. Upon activation of P2X7, proinflammatory cytokines are released, reactive oxygen species are generated and the cell cycle may be altered. In this regard, it has been shown that P2X7 plays a role in diseases such as rheumatoid arthritis, Alzheimer’s disease and multiple sclerosis. However, results regarding protective or detrimental effects mediated by P2X7 under particular conditions are often inconsistent. Thus, up to now, any therapeutic modulation of the receptor remains a challenge. Although intensive research has been conducted to find selective, potent P2X7-modulators, no active compound has been developed beyond phase II clinical trials. The first part of this work describes a study realized to identify new P2X7 modulators and to characterize them in terms of pharmacodynamic properties like potency and species specificity. This study was aimed at providing a basis for the development of new therapeutic agents, which are urgently needed. During the second part of this work, the involvement of P2X7 in pathophysiological processes after cerebral infarction was examined. Particular attention was paid to the influence of the receptor on the development of an accompanying and often fatal brain edema. A compound library containing approved drugs and natural compounds was screened for modulators of the recombinantly expressed human P2X7 receptor (hP2X7). Therefor, their effect on P2X7-mediated Ca2+ influx was evaluated. Concentration-response-curves were established for potentially selective compounds. Tanshinone II A sulfonate (TIIAS) turned out to be a potent inhibitor of P2X7. Both TIIAS and tanshinone II A (TIIA), the natural compound TIIAS has been derived from, were also tested on recombinantly expressed mouse and rat P2X7 (mP2X7 and rP2X7, respectively). Furthermore, electrophysiological assays were conducted for a detailed characterization of mechanisms of P2X7 inhibition. Antagonist selectivity was revised using cell lines expressing purinergic receptors P2X2 and P2X4. Human monocyte-derived macrophages were used in fluorometric calcium and dye-uptake assays as well as an IL-1ß ELISA to evaluate the effects of modulating compounds on native P2X7. In all experiments, involvement of P2X7 was verified using established P2X7 antagonists. In order to evaluate whether modulation of P2X7 may affect the outcome after cerebral infarction, cerebral ischemia was induced in 20 P2X7-deficient mice (P2X7-/-) and 22 mice of their corresponding wild type (WT) by transiently occluding their middle cerebral artery for 60 minutes with a thin filament (middle cerebral artery occlusion, MCAO). During 72 hours following surgery, neurological deficits, infarct size and edema development were monitored, applying clinical examinations and magnetic resonance measurements. After humane killing and brain removal, different antibodies were used in order to evaluate the distribution and activation state of microglia and astrocytes as well as the condition of the vascular endothelium. Sham-operated animals were used as negative controls in all experiments. TIIAS blocked hP2X7 with an IC50 of 4.3 μM, whereas it proved to be less potent at mP2X7 and poorly modulated rP2X7. TIIA did not modulate P2X7. TIIAS acted as an allosteric antagonist and reduced the opening of the ion channel; it presumably bound to an intracellular binding site. The effect of TIIAS could be confirmed in human macrophages. In these cells, TIIAS inhibited the ATP-induced Ca2+ entry, dye-uptake and release of IL-1β. Although neurological examinations did not reveal significant differences between P2X7-/- and WT mice that underwent MCAO, diagnostic imaging revealed that P2X7-/- mice developed significantly more severe brain edema within 24 hours after surgery, a development that was not due to differences in infarct sizes. Both groups displayed clear signs of activation of glia cells, but only microglia activation was attenuated in the absence of P2X7. Differences regarding the activation state of astrocytes or the expression of laminin by capillary endothelial cells could not be detected. TIIAS species specifically blocks hP2X7 with a high potency. TIIA does not convey this effect although both compounds are frequently used interchangeably. Due to the low potency TIIAS displays at mP2X7 and rP2X7, these species unfortunately cannot be used as animal models to evaluate the drug’s effect in vivo. Further research is necessary to evaluate the potency of TIIAS at other species’ P2X7 receptors or to find alternativespurinerge Signaltransduktion, P2X7, Tanshinon II A-Sulfonat, zerebrale Ischämie, Hirnödem to animal testing in order to study possible therapeutic applications of TIIAS in P2X7-related diseases. P2X7 does affect pathophysiological events following cerebral ischemia and restricts cytotoxic brain edema development, but does not limit vasogenic cerebral edema formation, which develops at a later stage of the disease. The different functions fulfilled by glia cells at distinct points in time after infarction may provide an explanation for this interesting fact. The results presented also imply that diverse animal models of cerebral ischemia may not be entirely comparable due to differences regarding the pathogenesis of brain edema.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung........................................................................................................... 1 1.1 Purinerge Signaltransduktion.......................................................................... 1 1.2 P2X-Rezeptoren.............................................................................................. 2 1.3 Pharmakologie des P2X7-Rezeptors............................................................... 3 1.4 Physiologische und pathophysiologische Bedeutung des P2X7-Rezeptor...... 5 1.5 Gegenstand dieser Arbeit............................................................................... 7 2 Veröffentlichungen............................................................................................. 9 2.1 Erste Publikation............................................................................................. 9 2.1.1 Tanshinone II A sulfonate, but not tanshinone II A, acts as potent negative allosteric modulator of the human purinergic receptor P2X7................................. 9 2.1.2 Ergänzende Materialien zur ersten Publikation.......................................... 22 2.2 Zweite Publikation......................................................................................... 30 2.2.1 Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery................................................................................. 30 2.2.2 Ergänzende Materialien zur zweiten Publikation......................................... 42 2.2.3 Erratum to: Lack of functional P2X7 receptor aggravates brain edema development after middle cerebral artery occlusion............................................ 46 3 Diskussion........................................................................................................ 49 4 Zusammenfassung........................................................................................... 55 5 Summary.......................................................................................................... 57 6 Literaturverzeichnis.......................................................................................... 59 7 Danksagung..................................................................................................... 66

Die extrakorporale Zirkulation unter Einsatz einer Herz-Lungen-Maschine kann postoperativ zu kontraktilen ventrikulären Funktionsstörungen führen, die Morbidität und Mortalität für betroffene Patienten erhöht. Diese kardiale Dysfunktion bezeichnet man als myokardiales Stunning, welche durch die globale Ischämie ausgelöst wird. Das Phänomen der reversiblen kontraktilen Dysfunktion weißt eine hohe klinische Relevanz auf und ist somit in den vergangenen Jahrzehnten sowohl klinisch als auch experimentell intensiv erforscht worden. Dabei kamen unterschiedlichste Spezies, Methoden und Modelle zum Einsatz. Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Etablierung eines neuartigen akut instrumentierten Tiermodells, anhand dessen Folgen des kardiopulmonalen Bypasses und Wirkung des endogenen Opioidsystems auf myokardiales Stunning untersucht werden können. Mit Hilfe des entwickelten Versuchsmodells können die Auswirkungen applizierter Opioidrezeptorantagonisten und die Effekte der kardiopulmonalen Zirkulation auf die kontraktile myokardiale Dysfunktion valide untersucht werden. Als Versuchstiere wurden 50 männlich kastrierte Schweine der Rassenkreuzung „Deutsche Landrasse“ und „Yorkshireschwein“ eingesetzt. In Allgemeinanästhesie wurden die Tiere über eine Thorakotomie instrumentiert und anschließend elektrisch Kammerflimmern induziert. Nach Erreichen einer stabilen extrakorporalen Zirkulation unter der Herz-Lungen-Maschine wurde nach Ablauf der ischämischen Phase eine standardisierte Reaninmation und Weaning durchgeführt. Alle 50 Tiere konnten den Versuch erfolgreich durchlaufen. Die Analyse und Auswertung sämtlicher archivierter Daten und Proben der Versuchstiere wurde zu einem späteren Zeitpunkt durchgeführt.

Assessment of lung edema by gravimetrical analysis is a standard method to evaluate the severity of experimentally induced ischemia/reperfusion (IR) injury. The aim of this study was to compare gravimetrical assessment of pulmonary edema with a stereological approach which allows for qualitative and quantitative distinction between intravascular and edematous fluids by light microscopy. Eight experimental groups which differed in mode of preservation, ischemic storage and pharmacological treatments were studied in an extracorporeal rat lung model. Analysis of the pooled data showed that the wet/dry ratio values mainly reflected the amount of intra-alveolar edema (rs = 0.442; p = 0.0057) but only stereological assessment of edema formation revealed differences depending on the treatment used. Only stereological data correlated significantly with oxygen tension measured at the end of reperfusion (rs = –0.530; p = 0.0009). We conclude that gravimetry is of minor functional importance compared to assessment by stereological methods which prove to be a reliable and efficient tool for the evaluation of IR injury in the different experimental settings. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.