Sperm Adhesion Molecule 1 (SPAM1) est une protéine spermatique possédant une activité hyaluronidase dans son domaine N-terminal, contribuant à la dispersion des cellules du cumulus entourant l’ovocyte. Elle possède aussi une capacité de liaison à la zone pellucide (ZP) dans son domaine C-terminal. Nos études précédentes chez le taureau ont démontré la présence de deux isoformes potentielles de SPAM1 de ~70 et 80 kDa. Ces mêmes études ont permis d’émettre l’hypothèse que ces deux isoformes de SPAM1 ont des domaines C-terminaux différents, des origines différentes (testicule ou épididyme) et sont localisées dans la région acrosomale ou post-acrosomale du spermatozoïde. Puisque le domaine C-terminal est impliqué dans les interactions spermatozoïdes-ZP, nous voulions caractériser les deux domaines C-terminaux afin de mieux connaître le rôle de SPAM1 dans les interactions entre les gamètes. Deux transcrits de Spam1 ont été trouvés dans les tissus testiculaires et épididymaires. Ces transcrits possèdent une identité dans leur séquence nucléotidique en 3’ de la région codante, mais diffèrent par la présence ou l’absence de 90 nucléotides (exon 3 du gène Spam1). Nous avons identifié PH-20, une homologue potentielle de SPAM1 chez l’espèce bovine. Puisque SPAM1 et PH-20 sont similaires en N-terminal, notre anticorps dirigé contre la portion N-terminale de SPAM1 pourrait, théoriquement, reconnaître PH-20. Pour confirmer ceci, nous avons tenté de produire une protéine recombinante PH-20, mais sans succès. Nous voulions déterminer si SPAM1 fait partie d’un complexe multiprotéique impliqué dans les interactions spermatozoïdes-ZP, tel que rapporté chez l’humain. Nos résultats suggèrent que SPAM1 est associée aux protéines d’ancrage AKAPs, retrouvées majoritairement au niveau de la gaine fibreuse du flagelle des spermatozoïdes. La caractérisation des isoformes de SPAM1, de son homologue PH-20, ainsi que des complexes multiprotéiques dont fait partie SPAM1 sont importantes afin d’approfondir nos connaissances sur le rôle de SPAM1 dans les interactions entre les gamètes. / Sperm Adhesion Molecule 1 (SPAM1) is a sperm protein that has a hyaluronidase activity in its N-terminus, aiding in the dispersal of the cumulus cells surrounding the egg. It also has a zona pellucida (ZP) binding activity in its C-terminus. Our previous studies showed that there are two potential SPAM1 isoforms that have a molecular weight of ~70 and 80 kDa in the bovine species. From these studies, we hypothesized that these two SPAM1 isoforms had different C-terminal domains, different origins (testis or epididymis) and were localised in the acrosomal or post-acrosomal regions of spermatozoa. Seeing as it is the C-terminal domain that is involved in ZP binding, we aimed to characterize the two C-terminal domains in order to better understand SPAM1’s role in gamete interactions. Although the 3’ nucleotide sequences were identical, two Spam1 transcripts varying by the presence or absence of 90 nucleotides (exon 3 of the Spam1 gene) were found in both testicular and epididymal tissues. During our studies, we also identified PH-20, a potential SPAM1 homolog. In order to determine if PH-20 is one of the two potential SPAM1 isoforms that is recognized by our antibody directed against the N-terminal domain, we attempted the production of a PH-20 recombinant protein, without success. We also sought to determine if SPAM1 is part of a multimeric protein complex involved in spermatozoa-ZP interactions, as reported in humans. Our results suggest that SPAM1 is associated with AKAPs, which are anchoring proteins abundantly found in the fibrous sheath of sperm flagella. Characterizing the SPAM1 isoforms, its homolog PH-20, as well as the multimeric protein complexes SPAM1 is part of, are important in order to better understand SPAM1’s role in gamete interactions.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / L'une des principales voies du métabolisme des médicaments est prise en charge par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases (UGT). Nos récentes découvertes ont mis à jour l'existence de nouvelles protéines nommées isoformes 2 (i2) produites par épissage alternatif du gène UGT1A humain. Ces produits d'épissage ne possèdent pas d'activité enzymatique mais démontrent une distribution tissulaire similaire à celles des isoformes 1 actives. Les enzymes i 1 et les nouvelles formes i2 sont présentes notamment au foie, dans le tractus digestif et le rein et leur localisation subcellulaire est similaire. Par immunohistochimie, nous avons également pu observer leur présence dans les tissus tumoraux. Basé sur les profils d'expression tissulaire, nous avons démontré un impact significatif de l'expression hétérologue stable d'i2 sur la conjugaison de divers médicaments, en présence d'il. Nous avons établi diverses lignées cellulaires surexprimant différentes combinaisons d'il et i2. Une réduction significative de 20 à 82% de la production de metabolites glucuronides est observée en essais enzymatiques pour plusieurs substrats dont l'agent anticancéreux SN-38 et de l'immunosuppresseur MPA. Les expériences de co-immunoprécipitation supportent que cette répression survient via l'interaction directe des protéines il et i2 dans la membrane du reticulum endoplasmique, formant ainsi des complexes inactifs. La fonction répressive d'i2 sur l'activité UGT a en parallèle été validée par des expérimentations en cellules intactes visant la répression des isoformes i2 endogènes par interférence à l'ARN qui entraînaient pour leur part une augmentation significative de l'activité de glucuronidation. Ce phénomène pourrait donc avoir une importance physiologique et pharmacologique significative, alors que l'abondance relative des formes il et i2 interagissant sous la forme de complexes actifs (il-il) et inactifs il-i2) serait déterminante de l'activité de glucuronidation cellulaire. Nous avons également identifié la présence de sept nouvelles isoformes d'UGT2B4 qui sont inactives. Toutefois, la co-expression de trois d'entre elles avec la forme active classique d'UGT2B4 (il) provoque une diminution de l'activité de conjugaison. En conclusion, nos résultats démontrent que des événements d'épissage alternatif des gènes UGT humains influencent la voie de glucuronidation suggérant un mécanisme d'auto-régulation, et par conséquent pourraient modifier la susceptibilité et la réponse au traitement de plusieurs pathologies telles que le cancer.

Des altérations de la voie PI3-K/Akt sont retrouvées dans une grande proportion de cancers. De plus en plus, on s'intéresse aux isoformes de la PI3-K et leurs rôles respectifs, mais leurs implications au sein des mécanismes entourant la régulation de la survie/anoïkose entérocytaire humaine restent à être pleinement approfondies. Considérant que 1) la PI3-K est un complexe étant susceptible d'être formé de différents isoformes, 2) ces différents complexes isoformes peuvent effectuer des rôles distincts dans les divers processus cellulaires, 3) la voie PI3-K/Akt-1 exerce des rôles distincts dans la survie entérocytaire selon l'état de différenciation et que 4) dans la signalisation intégrines [béta]1/Fak, la voie PI3-K/Akt-1 est engagée de façon Src-dépendante chez les entérocytes indifférenciés mais se trouve à être Src-indépendante chez les cellules différenciées ; l'hypothèse de travail du projet de recherche était que des complexes isoformes de la PI3-K sont impliqués de façon distincte dans la survie entérocytaire humaine, selon l'état de différenciation. Les objectifs de recherche spécifiques à ce projet étaient les suivants : 1) déterminer les profils d'expression des différents isoformes (p85 et p110) selon l'état de différenciation ; 2) déterminer les complexes isoformes (p85/p110) prédominants selon l'état de différenciation ; 3) déterminer les complexes isoformes prédominants dans la signalisation PI3-K/Fak selon l'état de différenciation ; et 4) déterminer les rôles des isoformes dans la survie entérocytaire. Nous avons déterminé les profils d'expression des isoformes PI3-K de la classe 1A selon l'état de différenciation chez les cellules épithéliales intestinales. Aussi, il existe un profil d'expression distinct et les complexes isoformes sont également distincts selon l'état de différenciation. Nous avons ensuite déterminé qu'il existait des complexes isoformes de la PI3-K distincts dans la signalisation PI3-K/Fak selon l'état de différenciation, et que l'engagement de la voie PI3-K/Akt-1 implique des complexes isoformes distincts selon l'état de différenciation. Nous avons aussi démontré que les isoformes p110 sont impliqués de façon distincte dans la survie entérocytaire humaine ainsi que dans l'activation d'Akt-1, selon l'état de différenciation. En résumé, notre étude a permis de démontrer que les isoformes PI3-K jouaient des rôles distincts dans la survie entérocytaire humaine et que ces rôles étaient également distincts selon l'état de différenciation.

La phosphatidylinositol-3 kinase (PI3-K) est un complexe comportant une sous-unité catalytique (C) et régulatrice (R). Trois isoformes R (p85?, p85? et p55?) et quatre isoformes C (p110?, p110?, p110? et p110?) sont connues. Nous avons démontré préalablement chez les entérocytes humains que la PI3-K performe des rôles différenciation-spécifiques dans la suppression d'anolkose médiée par la signalisation intégrines ? 1 /Fak/Src. Cependant, comme dans la plupart des études concernant la PI3-K, les considérations pour les distinctions entre les isoformes sont négligées. L'hypothèse de la présente étude est donc que les isoformes PI3-K performent des rôles distincts au niveau de la régulation de la survie et de la suppression d'anoïkose médiées par la signalisation intégrines ?1/Fak/Src et ce, selon l'état de différenciation entérocytaire. Les objectifs de l'étude étaient les suivants : 1) Confirmer, valider et compléter la détermination des profils d'expression des isoformes et de complexes isoformes PI3-K chez les entérocytes indifférenciés et différenciés; 2) Analyser l'engagement de chacun des complexes isoformes PI3-K par la signalisation intégrines ? 1 /Fak/Src selon l'état de différenciation entérocytaire; 3) Analyser les contributions de chacune des isoformes au niveau de l'activation d' Akt-1 et de la promotion de la survie selon l'état de différenciation entérocytaire; et 4) Analyser l'impact d'une surexpression des isoformes R chez les entérocytes indifférenciés au niveau de l'activation d'Akt-1 et de la résistance à l'anoikose. Nos résultats indiquent que: 1) les profils d'expression d'isoformes régulatrices et catalytiques PI3-K sont distincts selon l'état de différenciation; 2) des profils distincts de complexes isoformes PI3-K prédominants sont également retrouvés selon l'état de différenciation; 3) des complexes isoformes PI3-K également distincts sont recrutés/engagés par la signalisation Fak/Src; .4) l'inhibition spécifique (pharmacologique ou via siARN) de complexes isoformes PI3-K influence distinctement sur l'activation d'Akt-1, l'effecteur principal de la PI3-K et ce, selon l'état de différenciation; 5) l'inhibition spécifique (pharmacologique ou via siARN) de complexes isoformes PI3-K induit 1'apoptose/anoikose de manière isoforme-distincte et différenciation-spécifique; et 6) la surexpression de certaines isoformes régulatrices confère une certaine mesure de résistance à l'apoptose, et peut même, dans certains cas conférer une mesure additionnelle de résistance à l'anoikose. Mises ensembles, les données de cette étude supportent fortement le principe d'une participation de la PI3-K qui varie selon l' isoforme et en fonction de l'état de différenciation dans la signalisation intégrines ? 1 /Fak/Src de promotion de survie et de suppression d' andikose, chez les entérocytes humains.

L'adénocarcinome pancréatique est un des cancers les plus létaux, avec une survie à 5 ans après diagnostic de seulement 5%. L'absence de traitement curatif et les nombreux échecs des thérapies ciblées mettent en avant l'urgence d'identifier une stratégie thérapeutique efficace. L'atteinte de cet objectif doit passer par l'identification de biomarqueurs diagnostic et pronostic, l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques et la connaissance des mécanismes de résistance induits par les thérapies ciblées. La voie PI3K/Akt/mTOR, une des voies les plus altérées dans les cancers, est suractivée dans les cancers du pancréas et corrélée à un mauvais pronostic. Chez les Vertébrés, la famille des phosphoinositide-3-kinases (PI3K) de classe I est constituée des isoformes p110a, p110ß, p110d et p110?. Bien qu'elles réalisent toutes la même réaction biochimique (phosphorylation du PIP2 en PIP3, second messager lipidique), chaque isoforme de PI3K possède des rôles physiologiques spécifiques. Les inhibiteurs globaux de PI3Ks actuellement testés en phase I/II dans les cancers solides avancés présentent un bénéfice thérapeutique limité à des doses maximales tolérées. Les inhibiteurs des isoformes de PI3K sont actuellement les agents les plus prometteurs car ils offrent les avantages d'être, à de faibles doses, plus efficaces, plus puissants dans l'inhibition d'une PI3K et donc moins toxiques que les inhibiteurs pan-PI3K. Les objectifs de cette thèse sont de déterminer les rôles isoforme-spécifiques des PI3K et l'intérêt thérapeutique de cibler une ou plusieurs isoformes dans la pancréatite et l'adénocarcinome pancréatique, par l'identification de voies isoforme-spécifiques et l'étude des réponses adaptatives induites par le ciblage d'une ou de toutes les isoformes de PI3K. Dans un premier temps, mon travail a permis de mettre en évidence, valider et compléter des résultats obtenus dans l'équipe, visant à démontrer l'importance de la signalisation PI3K/Akt dans ces deux processus physiopathologiques : la pancréatite chronique et l'initiation de la carcinogenèse pancréatique. Plus précisément, l'hyperactivation de la voie PI3K/Akt observée dans des échantillons humains et murins atteints de pancréatique chronique est corrélée avec l'enrichissement d'une signature transcriptomique d'activation de l'isoforme p110a. Par ailleurs, l'inactivation génétique et pharmacologique de p110a lors d'une inflammation chronique pancréatique ou en présence de Kras oncogénique empêche l'apparition de métaplasies acino-canalaires, structures associées à l'initiation de la carcinogenèse pancréatique. L'élaboration d'un protocole de transdifférenciation acino-canalaire in vitro m'a permis de valider que seule l'isoforme p110a est nécessaire à cette étape d'initiation de la carcinogenèse pancréatique en régulant les petites GTPases Rho, essentielles au remodelage du cytosquelette d'actine. Dans un deuxième temps, grâce à une analyse quantitative du phosphoprotéome d'une lignée cancéreuse pancréatique traitée ou non à différents temps par un inhibiteur pan- ou isoforme-sélectif, j'ai démontré pour la première fois l'existence de cibles, de réseaux de signalisation et de réponses adaptatives régulés par chaque isoforme de PI3K. Pour conclure, l'ensemble des résultats démontrent le rationnel de l'utilisation combinatoire d'inhibiteurs isoforme-spécifiques de PI3K chez les patients atteints de cancer du pancréas pour une meilleure réponse clinique. / Pancreatic ductal adenocarcinoma is one of the most lethal cancers, with a 5 year-survival rate below 5%. Lack of curative treatment and failure of targeted therapies urge the need to identify novel efficient therapeutic strategy. Achievement of this goal will be obtained through the identification of diagnosis and prognosis biomarkers, identification of novel therapeutic targets and the knowledge of resistance mechanisms induced by these targeted therapies. PI3K/Akt/mTOR signalling, one of the most altered in cancers, is overactivated in pancreatic cancer and correlated with poor prognosis. In the Vertebrates, the family of class I phosphoinoitide-3-kinase (PI3K) includes four isoforms: p110a, p110ß, p110d and p110?. Although they all perform the same biochemical reaction (phosphorylation of PIP2 in PIP3, a membrane lipid messenger), each isoform were demonstrated to have specific physiological roles. Global PI3K inhibitors are currently being tested in phase I/II clinical trials in advanced solid cancers, but show at maximal doses tolerated a limited therapeutic benefit. Isoform-selective PI3K inhibitors are currently the most promising agents because, at low doses, they are more efficient to inhibit one PI3K isoform, and thus, less toxic than pan-PI3K inhibitors. The objectives of this thesis are to determine isoform-specific PI3K roles and the therapeutic interest to target one or more isoforms in pancreatitis and PDAC, by the identification of isoform-specific pathways and the study of adaptive responses induced by targeting of one or all isoforms of PI3K. In a first part, my work has highlighted, validated and completed results obtained in the team, to demonstrate the significance of PI3K/Akt signalling in two physiological processes: chronic pancreatitis and initiation of pancreatic carcinogenesis. Precisely, the overactivation of PI3K/Akt pathway measured on human and murine chronic pancreatitis samples is correlated with a specific p110a activation gene expression signature. Moreover, genetic and pharmacologic inactivation of p110a during pancreatic chronic inflammation or cancerogenesis (by oncogenic Kras) prevents the formation of acino-ductal metaplasia, structures at the origin of pancreatic carcinogenesis initiation. Development of in vitro acino-ductal transdifferentiation protocol allowed me to demonstrate that only p110a is necessary at this initial step of pancreatic carcinogenesis by the regulation of Rho small GTPases, further regulating actin remodelling. In the second part, by a phosphoproteomic-based approach, I quantified PI3K downstream phosphorylation-regulated targets in a pancreatic cancer cell line treated or not by a pan- or selective PI3K inhibitor at different times. I demonstrated for the first time existence of targets, signalling pathways and adaptive responses regulated by each PI3K isoform. To conclude, all these results demonstrate the rational of combinatorial use of isoform-specific PI3K inhibitors in patients with pancreatic cancer for better clinical response.

La maladie de Paget est caractérisée par un remodelage osseux anarchique débutant par une phase de résorption excessive suivie d’une phase de formation désordonnée. Comme les ostéoclastes sont recrutés en plus grand nombre et sont hyperactifs aux sites affectés par la maladie, cette cellule a été incriminée dans ce désordre osseux. Le phénotype de l’ostéoclaste pagétique comporte de plus un défaut du processus autophagique, de même qu'une résistance à l'apoptose, dont les mécanismes restent mal connus. Certains facteurs génétiques et environnementaux contribuent en partie au phénotype, mais d'autres facteurs pourraient y être associés. Des travaux du laboratoire ont mis en évidence six événements de l’épissage alternatif associés à la maladie de Paget. Parmi les gènes identifiés, le gène TBC1D25 et ses deux isoformes connus n’ont jamais été étudiés dans l’ostéoclaste. Le gène TBC1D25 possède un domaine hautement conservé TBC régulant l’activité des petites GTPases Rabs dans le transport vésiculaire et un domaine LIR liant la protéine LC3 durant le processus de l’autophagie. Ces domaines fonctionnels se retrouvent seulement dans l’isoforme long. L’hypothèse de recherche est que l’altération de l’épissage alternatif du gène TBC1D25 dans les ostéoclastes pagétiques explique en partie le phénotype de la cellule. Le changement dans le ratio de l’expression des isoformes affecterait le processus de l’autophagie, en plus d’affecter la principale fonction de l’ostéoclaste, la résorption osseuse. L’objectif principal de l’étude est de caractériser l’expression et la fonction de TBC1D25 dans les ostéoclastes humains. Des ostéoclastes humains différenciés à partir de monocytes fœtaux ont été utilisés pour l’étude de la fonction de TBC1D25 dans l’autophagie, l’apoptose et la résorption osseuse. Les travaux ont permis de localiser les protéines dans l’ostéoclaste dans des conditions maintenant un niveau basal de l’autophagie et dans des conditions induisant l’autophagie. L’interaction entre TBC1D25 et Rab34 a été confirmée pour la première fois dans les ostéoclastes. De plus, une variation de cette interaction a été observée dans les différentes conditions modulant le niveau d’induction de l'autophagie. Les résultats préliminaires montrent une augmentation du ratio LC3II/LC3I lors de la diminution de l’expression de TBC1D25 dans des conditions augmentant l’induction de l'autophagie. Par contre, aucun effet a été observé sur la résorption osseuse ou sur l'apoptose lors de la diminution de l’expression de TBC1D25. En conclusion, les résultats préliminaires montrent que TBC1D25 préviendrait l’augmentation du ratio LC3II/LC3I dans l’ostéoclaste soit en inhibant l’induction de l’autophagie ou en favorisant la dégradation des autophagosomes par l’entremise de son action sur Rab34. / Abstract : Paget’s disease of bone (PDB) is characterized by increases in bone turnover starting with excessive resorption followed by disorganized bone formation. Because the initial phase of PDB involves excessive bone resorption, osteoclasts have been identified as the cells primarily affected in PDB. Pagetic osteoclasts are overactive, resistant to apoptosis and exhibit defects in autophagy, but the mechanisms involved are still unclear. While genetic and environmental factors associated with PDB may partially account for the osteoclast phenotype, other genetic contributors have been identified. Recent work from our laboratory has identified six alternative splicing events associated with PDB. Among those genes, TBC1D25 and its two known isoforms have never been studied in osteoclasts. The two functional domains of TBC1D25 (TBC and LIR) are only present in the long isoform. The highly conserved TBC domain regulates small Rab GTPases in vesicular transport and the LIR domain interacts with LC3 during autophagy. Our research hypothesis is that altered alternative splicing of TBC1D25 in pagetic osteoclasts could contribute to phenotype. Differential isoform expression could affect osteoclast autophagy and bone resorption. The aim of the study is to characterize the expression and function of TBC1D25 proteins in human osteoclasts. Osteoclasts differentiated from cord blood monocytes were used to investigate the function of TBC1D25 in autophagy, apoptosis and bone resorption. First, the localization of the protein has been characterized in conditions maintaining basal autophagy and in rapamycin-induced autophagy. Interactions between TBC1D25 and Rab34 have been observed for the first time in osteoclasts. Moreover, changes in the interaction were observed with autophagy induction. Preliminary results suggest increases in LC3II/LC3I ratio with decreasing TBC1D25 expression when autophagy induction is stimulated. On the other hand, preliminary results showed that decreased expression of TBC1D25 did not affect bone resorption, nor apoptosis. In conclusion, preliminary results show that in osteoclasts, TBC1D25 could prevent the increase of LC3II/LC3I ratio by inhibiting autophagy induction or by promoting the clearance of autophagosomes through its action on Rab34.

FMRP est une protéine de liaison à l'ARN dont l'absence induit chez l'humain l'apparition du syndrome du X fragile, la forme la plus courante de déficience cognitive héréditaire. FMRP est codée par un gène présent sur le chromosome X, FMR1. L'épissage alternatif de l'ARN pré-messager de ce gène permet la synthèse de plusieurs isoformes. Les isoformes cytoplasmiques (cFMRP) sont impliquées dans la régulation de la traduction alors que le rôle des isoformes nucléaires (nFMRP) est encore inconnu. Outre ses rôles cytoplasmiques, FMRP a aussi des fonctions nucléaires. Ces dernières ont été attribuées aux cFMRP, qui feraient la navette entre le cytoplasme et le noyau. Pourtant, l'association des nFMRP avec les corps de Cajal, des organites nucléaires impliqués dans des processus liés au métabolisme de l'ARN, suggèrent que ces isoformes puissent remplir les fonctions nucléaires de FMRP. Afin de déterminer les rôles des nFMRP, notre équipe a décidé de mieux caractériser leur localisation. Mes travaux ont montré une association de ces isoformes avec les ponts d'anaphase, une structure connue pour être liée à l'instabilité génomique. Cette association permet de prévenir l'accumulation des ponts, dévoilant ainsi une fonction importante des isoformes nucléaire de FMRP. Les nFMRP s'opposent aussi à l'accumulation des dommages à l'ADN et la déplétion de ces isoformes induit une diminution de la viabilité cellulaire, ce qui renforce la possibilité d'un rôle de ces isoformes dans la protection et la stabilité du génome. Ces résultats indiquent aussi que les nFMRP remplissent des fonctions indépendantes des cFMRP, suggérant des interactomes spécifiques pour chaque type d'isoforme. Tandis que les interacteurs des isoformes cytoplasmiques ont déjà été déterminés, ceux des nFMRP demeurent inconnus. Nous avons donc décidé d'établir l'interactome de l'isoforme nucléaire 6 de FMRP (iso6). En le comparant avec les protéines interagissant avec l'isoforme cytoplasmique 1 de FMRP, nous avons déterminé des protéines qui interagissent spécifiquement avec iso6. Parmi ces protéines, certaines sont impliquées dans des processus liés au maintien de l'intégrité du génome, corroborant un rôle des nFMRP dans la stabilité génomique. Parmi les interacteurs spécifiques à iso6, la présence de plusieurs protéines protéasomales, suggère un lien avec le protéasome. Ce lien est confirmé par nos résultats montrant une régulation de iso6 par le protéasome. La caractérisation que nous avons faite des nFMRP pourrait ouvrir de nouvelles perspectives dans l'étude de la physiopathologie du syndrome du X fragile. / FMRP is an RNA-binding protein whose absence in humans is the reason of Fragile X syndrome, the most common form of inherited cognitive disorder. FMRP is encoded by an X chromosome gene, FMR1. Alternative splicing of the pre- messenger RNA of this gene results in the synthesis of different isoforms. The cytoplasmic isoforms (cFMRP) are involved in the regulation of translation, while the role of the nuclear isoforms (nFMRP) remains unknown. In addition to its cytoplasmic roles, the protein has nuclear functions. These nuclear functions are thought to be perfomed by the cFMRP, which shuttle between the cytoplasm and the nucleus. However, the association of nFMRP with Cajal bodies, nuclear organelles involved in RNA metabolism processes, suggests that nFMRP may have nuclear functions. In order to study the roles of nFMRP, we decided to characterize their localization. My work has shown an association of these isoforms with anaphase bridges, a structure linked with genomic instability. This association prevents bridge accumulation, unveiling an important function of nFMRP. Moreover, nFMRP prevent the accumulation of DNA damage, and depletion of these isoforms induces a decrease in cell viability, indicating a role of these isoforms in genome protection. These results show that nFMRP have functions independent of cFMRP, suggesting specific interactions for each isoform. While the interactome of cytoplasmic isoforms has already been identified, that of nFMRP remains unknown. We therefore determined the interactome of nuclear isoform 6 of FMRP (iso6). By comparing the interactome of cytoplasmic isoform 1 of FMRP with that of iso6, we identified certain proteins that interact specifically with iso6. Among these proteins, some are involved in processes linked to the maintenance of genome integrity, corroborating a role for nFMRP in genomic stability. The iso6-specific interactors include proteasomal proteins, which is consistent with our results showing a regulation of iso6 by the proteasome. Our characterization of nFMRPs could pave the way for new insights into the pathophysiology of Fragile X syndrome.

Le gène du métabolisme des médicaments UDP-glucuronosyltransférase UGT1A est épissé alternativement entraînant la production d’enzymes actives nommées isoformes 1 ainsi que de protéines régulatrices (i2) plus courtes. Mon objectif principal était de développer un modèle cellulaire permettant de mieux caractériser l’impact des isoformes 2 sur l’activité de conjugaison des médicaments et sur la réponse cellulaire à un traitement pharmacologique, plus particulièrement à l’agent anticancéreux SN-38, un substrat des UGT1A utilisé dans le traitement du cancer colorectal. Par une approche d ’interférence à l’ARN (shRNA), nous avons réprimé significativement les formes endogènes i2 dans la lignée humaine dérivée d’une tumeur de côlon, HT115. La répression des isoformes i2 entraîne une augmentation significative de la formation de SN-38-glucuronide. De plus, la répression des i2 entraîne une augmentation significative de la viabilité cellulaire ainsi qu’une modification significative de l’expression génique de processus cellulaires tels que la prolifération et certains microARN, à la suite d ’une exposition au SN-38. Les résultats obtenus supportent que les isoformes i2 ont le potentiel de moduler la réponse pharmacologique à un médicament dont le métabolisme de phase II est effectué principalement par les enzymes UGT1A.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La sénescence réplicative (SR) dans les fibroblastes humains primaires est causée par l’érosion des télomères et est contrôlée par p53. La régulation dynamique de l’activation de p53 est essentielle pour l’induction de la sénescence ; cependant, les mécanismes moléculaires sous-jacents ne sont pas clairement établis. Nous montrons, dans les cellules surexprimant les isoformes Δ133/Δ160p53, que ces isoformes s’oligomérisent avec p53, conduisant ainsi à la stabilisation d’une forme inactive de p53. A l’inverse, l’inactivation des isoformes endogènes Δ133/Δ160p53 induit l’accumulation de la protéine p53 et l’activation de son activité transcriptionnelle. La surexpression de Δ133/Δ160p53 inhibe les fonctions de p53, en particulier son activité transcriptionnelle et son rôle dans l’arrêt du cycle après un dommage à l’ADN. Nous avons remarqué que les protéines Δ133/Δ160p53 et p53 sauvage possédaient des conformations différentes. Les protéines Δ133/Δ160p53 sont reconnues pas l’anticorps Pab40 : elles adopteraient une conformation similaire à un mutant de conformation de p53. Enfin, nous observons qu’une faible expression de l’ARNm Δ133/Δ160TP53 coïnciderait avec la durée de l’activation transcriptionnelle de p53 lors de la SR, indiquée par l’accumulation de l’ARNm d’un effecteur majeur de p53, p21. L’augmentation de l’expression de Δ133/Δ160TP53 à un temps tardif au cours de la SR est corrélée à l’accumulation du marqueur de sénescence p16INK4a et à celle de la cytokine pro-inflammatoire IL-6. En conséquence, les isoformes Δ133/Δ160p53 contrôleraient l’activité de p53 dans l’arrêt du cycle et sur le phénotype sécrétoire des cellules sénescentes. / Telomere attrition in primary human fibroblasts induces replicative senescence by activation of the tumour suppressor p53. Fine-tuned activation of p53 is essential for senescence induction; however, the mechanisms underlying the regulation of p53 activity during senescence have not been clearly established yet. We report here that in cells that express the Δ133/Δ160p53 isoforms, these p53 isoforms oligomerize with p53, leading to the stabilization of the transcriptionally inactive form of p53. Conversely, endogenous Δ133/Δ160p53 silencing increases the level of p53 and p53-dependent transcriptional activity to promote cell cycle arrest. Overexpressed Δ133/Δ160p53 repress p53 functions, including gene transcription activation and growth inhibition, upon DNA damage. We also found that Δ133/Δ160p53 and wild-type p53 have different structural conformations. Δ133/Δ160p53 adopt a more unfolded conformation recognized by the Pab240 antibody, indicating that these p53 isoforms have a p53 mutant-like conformation. Finally, we observed that low level of Δ133/Δ160TP53 mRNA coincided with the duration of p53 transcriptional activation in replicatively senescent fibroblasts, as indicated by the upregulation of CDKN1A (p21) mRNA expression, a downstream effector of p53. Δ133/Δ160p53TP53 was upregulated at a later stage when the senescence marker p16INK4a and the pro-inflammatory interleukin-6 (IL-6) were also induced. Therefore, p53 activity on growth suppression and senescence-associated secretory phenotype may be differentially regulated by its Δ133/Δ160p53 isoforms.