Made available in DSpace on 2014-10-09T12:28:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:56:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:06/58510-0

Algumas enzimas são encontradas facilmente em diferentes microrganismos do ambiente e requerem um destaque especial devido a seu grande valor econômico. As proteases apresentam grande diversidade bioquímica, sendo facilmente manipuláveis, favorecendo dessa maneira suas aplicações biotecnológicas. Três linhagens bacterianas de Bacillus sp. foram isoladas com o objetivo de produzir protease e determinar as condições ótimas de temperatura, pH, e efeito de substratos e substâncias químicas sobre a atividade da enzima, assim como verificar a atividade depilatória e a utilização como agentes de modificação de proteína. As linhagens de Bacillus sp. apresentaram halos de atividade proteolítica em placas de Ágar Leite em diferentes pHs. O padrão proteolítico das enzimas em extrato bruto utilizando inibidores de protease indica que são serina-proteases, com alta especificidade pelo substrato azocaseína, pH e temperatura ótimos de 9,0 e 37ºC, respectivamente. As enzimas mantiveram-se estáveis à 37ºC por 30 minutos, entretanto quando submetidas a uma temperatura de 55ºC, perderam 50% da atividade inicial nos primeiros 20 minutos. A atividade enzimática foi parcialmente inibida por PMSF e benzamidina e totalmente por HgCl2. A adição de detergentes como o SDS ou o Triton X100 ocasionou um leve aumento na atividade das enzimas. Os sobrenadantes das linhagens de Bacillus sp. apresentaram enzimas com a capacidade de promover depilação de peles bovinas. Exames histológicos demonstraram que o tratamento com as enzimas não acarretou danos ao colágeno. Esses resultados indicam que as proteases produzidas pelos isolados apresentaram potencial para aplicação em processos envolvendo hidrólise de queratina, além da utilização como agente de modificação de proteínas. / Some enzymes are easily found in different microorganisms of the environment and they require a special prominence due its great economic value. Proteases present great biochemistry diversity, being easily manipulated allowing in this way, their biotechnological applications. Three Bacillus sp. strains were isolated intending to produce protease and determine optimal conditions of temperature, pH, and effect of chemical substances on the activity of the enzyme, as well as to verify the depilatory activity and utilization as agents protein modification. Bacillus sp. strains showed proteoyitic activity in milk plates in different pH.The proteolytic characteristic of enzymes in crude extract using protease inhibitors indicates that they are serine-proteases, with high specificity to azocasein, with optimal pH and temperature at 9,0 and 37oC, respectively. The enzymes have been kept stable at 37oC for 30 minutes. Nevertheless, when they were subjected to 55oC they lost 50% of their initial activity in the first 20 minutes. The enzymatic activity was partially inhibited by PMSF and benzamidine and totally by HgCl2. The addition of detergents, as SDS and Triton X100, caused a light increase on enzymes activity. The supernatants of Bacillus sp. strains showed enzymes with capacity to depilate bovine skin. Histological evaluation showed that the treatment with enzymes do not promote damage to collagen. These results indicate that proteases produced by isolated present a powerful application in processes involving keratin hydrolysis, as well as the use as an agent that modifies proteins.

Algumas enzimas são encontradas facilmente em diferentes microrganismos do ambiente e requerem um destaque especial devido a seu grande valor econômico. As proteases apresentam grande diversidade bioquímica, sendo facilmente manipuláveis, favorecendo dessa maneira suas aplicações biotecnológicas. Três linhagens bacterianas de Bacillus sp. foram isoladas com o objetivo de produzir protease e determinar as condições ótimas de temperatura, pH, e efeito de substratos e substâncias químicas sobre a atividade da enzima, assim como verificar a atividade depilatória e a utilização como agentes de modificação de proteína. As linhagens de Bacillus sp. apresentaram halos de atividade proteolítica em placas de Ágar Leite em diferentes pHs. O padrão proteolítico das enzimas em extrato bruto utilizando inibidores de protease indica que são serina-proteases, com alta especificidade pelo substrato azocaseína, pH e temperatura ótimos de 9,0 e 37ºC, respectivamente. As enzimas mantiveram-se estáveis à 37ºC por 30 minutos, entretanto quando submetidas a uma temperatura de 55ºC, perderam 50% da atividade inicial nos primeiros 20 minutos. A atividade enzimática foi parcialmente inibida por PMSF e benzamidina e totalmente por HgCl2. A adição de detergentes como o SDS ou o Triton X100 ocasionou um leve aumento na atividade das enzimas. Os sobrenadantes das linhagens de Bacillus sp. apresentaram enzimas com a capacidade de promover depilação de peles bovinas. Exames histológicos demonstraram que o tratamento com as enzimas não acarretou danos ao colágeno. Esses resultados indicam que as proteases produzidas pelos isolados apresentaram potencial para aplicação em processos envolvendo hidrólise de queratina, além da utilização como agente de modificação de proteínas. / Some enzymes are easily found in different microorganisms of the environment and they require a special prominence due its great economic value. Proteases present great biochemistry diversity, being easily manipulated allowing in this way, their biotechnological applications. Three Bacillus sp. strains were isolated intending to produce protease and determine optimal conditions of temperature, pH, and effect of chemical substances on the activity of the enzyme, as well as to verify the depilatory activity and utilization as agents protein modification. Bacillus sp. strains showed proteoyitic activity in milk plates in different pH.The proteolytic characteristic of enzymes in crude extract using protease inhibitors indicates that they are serine-proteases, with high specificity to azocasein, with optimal pH and temperature at 9,0 and 37oC, respectively. The enzymes have been kept stable at 37oC for 30 minutes. Nevertheless, when they were subjected to 55oC they lost 50% of their initial activity in the first 20 minutes. The enzymatic activity was partially inhibited by PMSF and benzamidine and totally by HgCl2. The addition of detergents, as SDS and Triton X100, caused a light increase on enzymes activity. The supernatants of Bacillus sp. strains showed enzymes with capacity to depilate bovine skin. Histological evaluation showed that the treatment with enzymes do not promote damage to collagen. These results indicate that proteases produced by isolated present a powerful application in processes involving keratin hydrolysis, as well as the use as an agent that modifies proteins.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 17898.pdf: 1328862 bytes, checksum: c348bf7d018b290edc62f87767ab2d14 (MD5) / Dissertacao (Mestrado Profissionalizante em Lasers em Odontologia) / IPEN/D-MPLO / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP; Faculdade de Odontologia, Universidade de São Paulo, São Paulo

Algumas enzimas são encontradas facilmente em diferentes microrganismos do ambiente e requerem um destaque especial devido a seu grande valor econômico. As proteases apresentam grande diversidade bioquímica, sendo facilmente manipuláveis, favorecendo dessa maneira suas aplicações biotecnológicas. Três linhagens bacterianas de Bacillus sp. foram isoladas com o objetivo de produzir protease e determinar as condições ótimas de temperatura, pH, e efeito de substratos e substâncias químicas sobre a atividade da enzima, assim como verificar a atividade depilatória e a utilização como agentes de modificação de proteína. As linhagens de Bacillus sp. apresentaram halos de atividade proteolítica em placas de Ágar Leite em diferentes pHs. O padrão proteolítico das enzimas em extrato bruto utilizando inibidores de protease indica que são serina-proteases, com alta especificidade pelo substrato azocaseína, pH e temperatura ótimos de 9,0 e 37ºC, respectivamente. As enzimas mantiveram-se estáveis à 37ºC por 30 minutos, entretanto quando submetidas a uma temperatura de 55ºC, perderam 50% da atividade inicial nos primeiros 20 minutos. A atividade enzimática foi parcialmente inibida por PMSF e benzamidina e totalmente por HgCl2. A adição de detergentes como o SDS ou o Triton X100 ocasionou um leve aumento na atividade das enzimas. Os sobrenadantes das linhagens de Bacillus sp. apresentaram enzimas com a capacidade de promover depilação de peles bovinas. Exames histológicos demonstraram que o tratamento com as enzimas não acarretou danos ao colágeno. Esses resultados indicam que as proteases produzidas pelos isolados apresentaram potencial para aplicação em processos envolvendo hidrólise de queratina, além da utilização como agente de modificação de proteínas. / Some enzymes are easily found in different microorganisms of the environment and they require a special prominence due its great economic value. Proteases present great biochemistry diversity, being easily manipulated allowing in this way, their biotechnological applications. Three Bacillus sp. strains were isolated intending to produce protease and determine optimal conditions of temperature, pH, and effect of chemical substances on the activity of the enzyme, as well as to verify the depilatory activity and utilization as agents protein modification. Bacillus sp. strains showed proteoyitic activity in milk plates in different pH.The proteolytic characteristic of enzymes in crude extract using protease inhibitors indicates that they are serine-proteases, with high specificity to azocasein, with optimal pH and temperature at 9,0 and 37oC, respectively. The enzymes have been kept stable at 37oC for 30 minutes. Nevertheless, when they were subjected to 55oC they lost 50% of their initial activity in the first 20 minutes. The enzymatic activity was partially inhibited by PMSF and benzamidine and totally by HgCl2. The addition of detergents, as SDS and Triton X100, caused a light increase on enzymes activity. The supernatants of Bacillus sp. strains showed enzymes with capacity to depilate bovine skin. Histological evaluation showed that the treatment with enzymes do not promote damage to collagen. These results indicate that proteases produced by isolated present a powerful application in processes involving keratin hydrolysis, as well as the use as an agent that modifies proteins.

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:28:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T13:56:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Queratinócitos são células bastante atrativas para a transferência gênica ex vivo e liberação sistêmica, uma vez que as proteínas secretadas por estas células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural. No presente trabalho, queratinócitos transduzidos mediante um vetor retroviral com o gene do hormônio de crescimento de camundongo (mGH) foram submetidos a um tratamento de aderência ao colágeno e à análise clonal, com o intuito de enriquecer esta população de queratinócitos em células-tronco. O principal resultado foi um aumento da viabilidade celular in vitro dos queratinócitos tratados, que poderá se refletir num aumento da durabilidade da secreção do hormônio in vivo, quando realizado o implante de culturas organotípicas em camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Foi também utilizado um modelo de terapia gênica in vivo, baseado na eletrotransferência de DNA plasmidial (naked DNA), contendo o gene do hormônio de crescimento humano (hGH), no músculo quadríceps de camundongos anões (lit/lit) e anões imunodeficientes (lit/scid). Foram padronizadas as condições de eletroporação em 8 pulsos de 50 V e 20 ms com 0,5 s de intervalo, utilizando um plasmídeo com o promotor da ubiquitina C e a sequência genômica do hGH. A administração de uma dose única de 50 g do plasmídeo pUC-UBI-hGH em camundongos lit/scid, seguida de eletroporação, propiciou pela primeira vez na literatura obtenção de níveis sustentáveis na circulação de 1,5-3,0 ng hGH/ml, durante 60 dias. Esses animais tratados com DNA apresentaram um aumento de peso altamente significativo (P<0,001) de 33,1%, comparado a uma perda de peso, não significativa, no grupo controle (camundongos injetados com salina + eletroporação). Os músculos quadríceps dos animais tratados apresentaram um aumento de 48%, quando comparados aos dos animais do grupo controle (P<0,001). Outro estudo de eletrotransferência foi realizado comparando a utilização da sequência genômica do hGH (gDNA) com a complementar (cDNA), em plasmídeos sob o controle do promotor de citomegalovírus (CMV). Foi observado que o cDNA do hGH foi expresso de maneira mais eficiente na circulação de camundongos lit/scid, por um período de 21 dias. Foram também construídos vetores lentivirais com os genes do hGH (cDNA e gDNA) e do mGH (cDNA), que serão utilizados num próximo estudo, tanto para a transdução de queratinócitos, como para a eletrotransferência in vivo. Vetores lentivirais serão de fato necessários para futuros estudos devido a sua reduzida toxicidade em comparação com os retrovirais. Os resultados deste trabalho, assim como as perspectivas de estudo abertas, têm como meta estabelecer condições para que a terapia gênica seja num futuro próximo uma alternativa viável e segura para o tratamento da deficiência de GH e de outras doenças sistêmicas. / Tese (Doutoramento) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP / FAPESP:06/58510-0

Made available in DSpace on 2014-10-09T12:34:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2014-10-09T14:01:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 17898.pdf: 1328862 bytes, checksum: c348bf7d018b290edc62f87767ab2d14 (MD5) / Dissertacao (Mestrado Profissionalizante em Lasers em Odontologia) / IPEN/D-MPLO / Instituto de Pesquisas Energeticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP; Faculdade de Odontologia, Universidade de São Paulo, São Paulo

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