Die Messung der Herzfrequenzvariabilität (HRV) stellt ein sensitives Verfahren dar, um die Aktivität des autonomen Nervensystems zu erfassen. Die HRV beschreibt die sich ständig wechselnden zeitlichen Unterschiede aufeinanderfolgender Herzschläge und unterliegt vor allem der Steuerung des sympathischen und des parasympathischen Nervensystems. Die Ermittlung der HRV erfolgt über Kurz- und Langzeit-EKG-Aufzeichnungen. Störungen in der autonomen Kontrolle wurden mit vielen Krankheiten, v.a. mit einem erhöhten Risiko für kardiovaskuläre Erkrankungen, in Verbindung gebracht. Die Imbalance des autonomen Nervensystems, welche durch eine Hyperaktivität des sympathischen Nervensystems und einer verminderten Aktivität des parasympathischen Nervensystems charakterisiert ist, könnte einer der entscheidenden Faktoren sein, welcher zu einer erhöhten Morbidität und Mortalität von kardiovaskulären Erkrankungen führt. Ob diese Störungen in der autonomen Kontrolle zudem auch eine wichtige Rolle für das gehäufte Auftreten kardiovaskulärer Erkrankungen bei kleinwüchsigen Menschen einnehmen, ist Gegenstand heutiger Forschung. Für ein besseres Verständnis der Verbindung zwischen Körpergröße und kardiovaskulärem Risiko wurden in dieser Arbeit HRV-Analysen aus 24h-Langzeit-EKG-Aufzeichungen ausgewertet. Die Herzfrequenzvariabilität von 30 kleinwüchsigen Kindern (MWAlter = 6,3 ± 3,6 Jahre), darunter 17 ehemalige hypothrophe Neugeborene (sog. „Small for gestational age“, SGA), 11 Kinder mit einer konstitutionellen Entwicklungsverzögerung (KEV) und 2 Kinder mit einem nachgewiesenen idiopathischen isolierten Wachstumshormonmangel (Growth hormone deficiency, GHD) wurden hierfür mit einer Kontrollgruppe von 121 normwüchsigen und herzgesunden Kindern verglichen. Zusätzlich wurde die HRV von 30 Kindern unter langjähriger Wachstumshormontherapie (MWAlter = 10,8 ± 3,7 Jahre), darunter 20 Kinder mit einer GHD und 10 SGA-Kinder, mit dieser Kontrollgruppe verglichen, um den Einfluss einer Substitutionstherapie auf das autonome Nervensystem zu ergründen. Es zeigte sich, dass kleinwüchsige Kindern ab einem Alter von 9 Jahren eine signifikant herabgesetzte Herzfrequenzvariabilität haben. Die SDNN (Standard deviation of normal RR-intervals) als Maß der Gesamtvariabilität und die vagal modulierten HRV-Parameter RMSSD (Root mean squared of successive difference) und pNN50 (Percent NN differences over 50 ms) waren signifikant erniedrigt. Zudem zeigte sich bei diesen Kindern eine signifikant erhöhte Herzfrequenz bei Tag und Nacht. Kleinwüchsige präpubertäre Kinder unter 9 Jahren zeigten dagegen keine Veränderungen der HRV und der Herzfrequenz im Vergleich zur Kontrollgruppe. Eine Therapie mit Wachstumshormonen bei Kindern mit einem idiopathischen isolierten Wachstumshormonmangel und SGA-Kindern ohne Aufholwachstum scheint dagegen keinen Einfluss auf die Herzfrequenzvariabilität zu haben. Diese blieb trotz Substitutionstherapie auch weiterhin erniedrigt. Durch die Aufzeichnung von 24h-Langzeit-EKGs und anschließender HRV-Analyse während eines Clonidin-Wachstumshormonstimulationstests bei kleinwüchsigen Kindern sollte zudem die Rolle des zentralen α2-Adrenorezeptors in der Pathogense des Kleinwuchses untersucht werden. Erstaunlicherweise kam es nur bei den Kindern mit einer konstitutionellen Entwicklungsverzögerung (KEV) zu einem erwarteten signifikanten Anstieg der vagal modulierten HRV-Parameter sowie zu einem Absinken des sympathisch modulierten HRV-Parameters LFn. Kinder mit einer GHD zeigten weder einen adäquaten Anstieg der Wachstumshormon-Ausschüttung noch eine Reaktion des sympathischen und des parasympathischen Nervensystems auf die Clonidingabe. Bei den SGA-Kindern konnte nur ein Anstieg der vagal modulierten Parameter, nicht jedoch ein Abfall der sympathisch modulierten Parameter, gemessen werden. Es muss daher davon ausgegangen werden, dass der zentrale α2-Adrenorezeptor eine wichtige Rolle bei der Entstehung des Kleinwuchses, zumindest bei Kindern mit einem idiopathischen Wachstumshormonmangel und evtl. auch bei SGA-Kindern, einnimmt. / The measurement of heart rate variability (HRV) poses a sensitive method to detect the activity of the autonomous nervous system. HRV describes the constantly changing chronological difference of successive heart beats and is especially subject to the regulation of the sympathetic and parasympathetic nervous system. The detection of HRV is done using short-term ecg and holter monitoring. Disorders of autonomous regulation are associated with many diseases, especially with those with an increased risk for cardiovascular illnesses. The imbalance of the autonomous nervous system which is characterized by a hyperactivity of the sympathetic nervous system and a decreased activity of the parasymypathetic system could be one of the critical factors which leads to an increased morbidity and mortality in cardiovascular illnesses. Whether these disorders in the autonomous control also have an important role in the heaped occurrence of cardiovascular illnesses in people of short stature is the subject of current research. To gain a better understanding of the connection between body size and cardiovascular risk this thesis evaluated HRV-analyzes in recorded 24h holter monitoring. The HRV of 30 children of short stature (MVage=6,3 ± 3,6 years), including 17 former hypotrophic newborns (so called „small for gestational age“, SGA), 11 children with constitutional growth delay (CGD) and 2 children with proven idiopathic isolated growth hormone deficiency (Growth hormone deficiency, GHD) was compared to a control group of 121 heart healthy children of moderate stature to discover the influence of a substitute therapy on the autonomous nervous system. It was found that children with short stature as of the age of 9 have a significantly reduced heart rate variability. The SDNN (Standard deviation of normal RR-intervals) as a measurement of total variability and the vagal modulated HRV-Parameter RMSSD (Root mean squared of successive difference) and pNN50 (percent NN differences over 50 ms) were significantly lowered. Additionally it was found that these children had significantly raised heart rates during the day and at night. Prepubertal children of short stature under the age of 9 showed no changes in HRV and heart rate compared to the control group. A therapy with growth hormones for children with idiopathic isolated growth hormone deficiency and SGA-children without catch-up growth doesn’t seem to have an influence on heart rate variability. Despite replacement therapy theses children had a lowered heart rate variability. The role of the central α2-adrenal receptor in the pathogenesis of short stature was examined through holter monitoring and subsequent HRV-analysis during a clonidin growth hormone stimulation test on children of short stature. Astonishingly only children with constitutional growth delay (CGD) showed the expected significant rise of vagal modulated HRV parameters as well as the fall of the sympathetic modulated HRV parameter LFn (normalized Low Frequency Power). Children with GHD showed neither a rise of growth hormone nor a reaction of the sympathetic or parasympathetic nervous system after the administration of clonidin. SGA-children only showed a rise of parameters of vagal modulation but not a fall of sympathetic modulated parameters. It is therefore to be assumed that the central α2-adrenal receptor plays an important role in the genesis of short stature, at least in children with idiopathic growth hormone deficiency and possibly in SGA-children.

Die menschliche Entwicklung ist charakterisiert durch ein rasches fetales Wachstum, ein langsames postnatales Wachstum, ein kontinuierliches Wachstum im Laufe der Kindheit sowie einen Wachstumsschub während der Pubertät. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Mutationen in den Genen des Pericentrins (PCNT) und des Insulin-like growth factor-1 Rezeptors (Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor Typ 1 Rezeptor, IGF1R) seltene Auslöser von prä- und postnataler Wachstumsrestriktion darstellen können. In dieser Arbeit wird eine stark wachstumsretardierte Patientin mit zusammengesetzter heterozygoter PCNT-Mutation und heterozygoter IGF1R-Mutation beschrieben. Ziel dieser Arbeit war zum einen die ausführliche klinische Charakterisierung der Patientin. Zum anderen sollte auf zellulärer Ebene überprüft werden, inwieweit die genannten Mutationen den Phänotyp der Patientin erklären. Um die funktionellen Zusammenhänge zu untersuchen, wurden in vitro Assays durchgeführt. Hierfür standen neben mit dem mutierten Rezeptor transfizierte IGF1R-defiziente Mausfibroblasten (R--Zellen) auch humane Fibroblasten zur Verfügung. Es wurden die totale und die extrazelluläre Rezeptorexpression, die IGF1 induzierte Stimulierung und die Signaltransduktion des mutierten IGF1R untersucht. Weiterhin wurde die proliferative Kapazität der Patientenfibroblasten analysiert. Die Ergebnisse dieser Analysen ergaben keine relevanten Funktionseinschränkungen des mutierten IGF1R. Demgegenüber steht eine reduzierte Zellproliferation der Patientenfibroblasten. Die zugrunde liegenden Mechanismen der verminderten Proliferationskapazität sind womöglich den PCNT-Mutationen zuzurechnen. In Versuchen zur IGF1 induzierten Proliferationssteigerung konnte die Proliferation der Patientenfibroblasten zwar kurzfristig stimuliert werden, bei längerer IGF1-Stimulation konnte jedoch das bestehende Proliferationsdefizit nicht ausgeglichen werden. Die genauen molekularbiologischen Auswirkungen der PCNT-Mutation in Bezug auf den ausgeprägten Phänotyp der Patientin müssen in zukünftigen Arbeiten noch weiter aufgeklärt werden.

Untersuchungen zeigen, dass Kinder mit einem Geburtsgewicht und/oder einer Geburtslänge unterhalb der 3. Perzentile der populationsspezifischen Norm (SGA) u. a. ein erhöhtes Risiko für kardiovaskuläre und metabolische Krankheitsbilder haben. Mausembryonen mit einer Funktionseinschränkung der PDPK1 sind überlebensfähig, haben aber ein um 40-50 Prozent vermindertes Längenwachstum als Wurfgeschwister. Im Rahmen dieser Arbeit wurden bei 111 SGA-Kindern mit nachgewiesenem proportioniertem Kleinwuchs ohne Aufholwachstum, dem Phänotyp einer IGF1 Resistenz und einem im Vorfeld ausgeschlossenem IGF1 Rezeptordefekt die Nukleotidabfolge der kodierenden Bereiche der PDPK1 untersucht. Dabei konnte für die Exons 1, 3 und 4, sowie 7 bis 14 eine PCR-Reaktion etabliert werden, wobei das PCR Produkt mittels dHPLC und/oder Sequenzierung untersucht wurde. Methodische Probleme ergaben sich aus der Existenz eines Pseudogen, sodass für die Exons 2-10 eine Vor-PCR etabliert werden musste. Aufgrund der Länge des homologen Bereichs und der damit verbundenen relativ weiten Entfernung zu spezifischen Primerbindungsstellen konnten nicht alle Exons mit ausreichender Spezifität amplifiziert werden. Es wurden insgesamt 6 verschiedene intronische Varianten bei 11 Patienten nachgewiesen, welche bisher in der Literatur noch nicht beschrieben worden sind. Ob oder in wie weit diese Sequenzvarianten eine Rolle bei der Entwicklung des SGA-Phänotyps der Kinder gespielt haben, ist aufgrund der Lokalisation außerhalb der Exons bzw. wegen ihres seltenen Auftretens auch in der Gesundpopulation unklar. Möglich wären z. B. Wechselwirkungen mit Promoterregionen und eine daraufhin eingeschränkte Funktion der Aktivität der PDPK1. Weiterführende methodische Optimierungen oder alternative Analysetechniken sowie die Untersuchung größerer Patientenkollektive mit geeigneten Kontrollgruppen werden helfen, die Relevanz der PDPK1 bei der Ausprägung eines isolierten Minderwuchses bei Patienten mit IGF1-Resistenz zu etablieren.

Der IGF1R gehört zur Familie der transmembranären Tyrosinkinaserezeptoren. Als Mediator der biologischen Effekte von IGF1 und IGF2 belegt er eine zentrale Rolle im Zellwachstum und der Zelldifferenzierung. Seit 2003 wurden bis heute über 20, vor allem heterozygote IGF1R Mutationen publiziert. Die erste der bisher zwei veröffentlichten homozygoten IGF1R Mutationen erschien im Jahr 2012. Bis zu diesem Zeitpunkt legten Untersuchungen transgener IGF1R knockout Mäuse eine Unvereinbarkeit solcher Mutationen mit dem Leben nahe. Versuche zeigten, dass die mutationstragenden Mäuse unmittelbar nach Geburt an respiratorischem Versagen starben. Hieraus wurde abgeleitet, dass humane homozygote Mutationsträger mit komplettem Funktionsverlust ebenfalls nicht lebensfähig wären. Ziel dieser Arbeit war die molekularbiologische Aufarbeitung des zum damaligen Zeitpunkt noch einzigartigem homozygoten Trägerstatus der Indexpatientin. Das Interesse lag vor allem auf der Genotyp-Phänotyp Korrelation, da es sich aller Wahrscheinlichkeit nach nicht um einen völligen Funktionsverlust der Allele handeln konnte. Bei dieser Patientin lag eine Missense Mutation – Aminosäureaustausch von Glutamat zu Aspartat an Position 56 des IGF1R – in der ligandenbindenden Domäne L1 vor. Phänotypisch zeigte die Patientin neben ihrem proportionierten Kleinwuchs, ein rundes Puppengesicht mit großen Augen, sehr dichten schwarzen Augenbrauen und einem dichten Kopfhaarwuchs mit einem tiefen nuchalen Haaransatz. Die molekularbiologische Untersuchung dieser Mutation erfolgte sowohl an Hautfibroblasten der Indexpatientin als auch rekombinant in Säugerzellen. Die in vitro Untersuchungen dieser homozygoten IGF1R(E56D) Mutation, legten im Wesentlichen folgende Ergebnisse dar: 1. Die Expression der IGF1R Untereinheiten wurde mittels Immunoblotting untersucht und zeigte im Falle des mutierten Rezeptors eine substantielle Erhöhung des Prorezeptors auf Kosten der reifen α- und β-Untereinheiten. Dies lässt auf eine gestörte Prozessierung in die Rezeptoruntereinheiten schließen. 2. Die IGF1 induzierte Autophosphorylierungskapazität des mutierten Rezeptors, ebenfalls mittels Immunoblot visualisiert, war substantiell verringert. Eine Quantifizierung der pIGF1R Signale auf das Gesamtprotein im Vergleich zur Normalisierung auf den unphosphorylierten IGF1R legte nahe, dass die Aktivierungskinetik des mutierten Rezeptors unverändert ist. Anzunehmen ist, dass aufgrund der fehlerhaften Prozessierung des Prorezeptors der funktionelle IGF1R quantitativ beeinträchtigt ist. 3. Eine Abnahme der Aktivierung der intrazellulären Signalkaskade, die anhand des Signalproteins B/AKT untersucht wurde, konnte nicht in allen untersuchten Zelllinien bestätigt werden. 4. Die Oberflächenexpression des mutationstragenden Rezeptors wurde im Durchflusszytometer untersucht. Einhergehend mit der verminderten Expression reifer IGF1R Untereinheiten war die Oberflächenexpression des Rezeptors signifikant verringert. Diese Ergebnisse zeigten, dass die Mutation quantitative Auswirkung auf die Prozessierung und Oberflächenexpression des IGF1R hat. Im Gegensatz zum völligen Funktionsverlust des Rezeptors im knock-out Mausmodell, bestand hier eine Restaktivität, weshalb man von einem hypomorphen Charakter dieser Mutation spricht. Diese Ergebnisse lassen auf einen kausalen Zusammenhang zwischen der Mutation und dem IGF1-resistenten Phänotyp der Schwestern schließen. Phänotypisch ähneln biallele Mutationsträger den bisher publizierten heterozygoten Individuen. Die biallelen Indexpatienten zeigen allerdings eine ausgeprägtere Hormonresistenz, einen markanteren Wachstumsrückstand und vermehrt Komorbiditäten (z.B. Störungen der Glukosehomöostase). Eine Korrelation dieser Merkmale mit der Lokalisation der Mutation und dem Trägerstatus lässt sich allerdings erst mit der Identifizierung weiterer Patienten endgültig klären.:Inhaltsverzeichnis 2 1.1 Wachstum als lebenslanger Prozess 3 1.2 IGF1 und IGF2 in der pränatalen Wachstumsphase 4 1.3 Die Ätiologie und Pathogenese des Kleinwuchses 5 1.5 Pathologien der somatotropen Achse 8 1.6 Der Insulin-like growth factor 1 Rezeptor 9 1.7 IGF1R Mutationen 13 2 Fragestellung 14 3 Material und Methoden 15 3.1 Patientin 15 3.2 Molekulargenetik 16 3.3 Molekularbiologie 17 3.3.1 Basismethoden 17 3.3.2 Plasmide, Klonierungen und ortsgerichtete Mutagenese 18 3.4 Zellkultur 19 3.4.1 Transiente Transfektion 21 3.4.2 Immunoblotting 21 3.4.3. Durchflusszytometrie 23 4. Ergebnisse 24 4.1 Klinisches Bild und Genotypisierung der Patientin 24 4.2 Expression der IGF1R Untereinheiten 31 4.3 IGF1R Autophosphorylierung und intrazelluläre Signaltransduktion 32 4.4 Oberflächenexpression des IGF1R 37 5. Diskussion 38 5.1 Der homozygote Charakter der Mutation 38 5.2 Die Genotyp-Phänotyp Korrelation 42 6. Zusammenfassung der Arbeit 46 Literaturverzeichnis 48 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit 57 Lebenslauf 58 Danksagung 60 7. Anhang 61 7.1 Abbildungsverzeichnis 61 7.2 Tabellenverzeichnis 61 7.3 Abkürzungsverzeichnis 62 7.4 Aminosäurecodes 65

Die menschliche Entwicklung ist charakterisiert durch ein rasches fetales Wachstum, ein langsames postnatales Wachstum, ein kontinuierliches Wachstum im Laufe der Kindheit sowie einen Wachstumsschub während der Pubertät. In den letzten Jahren wurde gezeigt, dass Mutationen in den Genen des Pericentrins (PCNT) und des Insulin-like growth factor-1 Rezeptors (Insulin ähnlicher Wachstumsfaktor Typ 1 Rezeptor, IGF1R) seltene Auslöser von prä- und postnataler Wachstumsrestriktion darstellen können. In dieser Arbeit wird eine stark wachstumsretardierte Patientin mit zusammengesetzter heterozygoter PCNT-Mutation und heterozygoter IGF1R-Mutation beschrieben. Ziel dieser Arbeit war zum einen die ausführliche klinische Charakterisierung der Patientin. Zum anderen sollte auf zellulärer Ebene überprüft werden, inwieweit die genannten Mutationen den Phänotyp der Patientin erklären. Um die funktionellen Zusammenhänge zu untersuchen, wurden in vitro Assays durchgeführt. Hierfür standen neben mit dem mutierten Rezeptor transfizierte IGF1R-defiziente Mausfibroblasten (R--Zellen) auch humane Fibroblasten zur Verfügung. Es wurden die totale und die extrazelluläre Rezeptorexpression, die IGF1 induzierte Stimulierung und die Signaltransduktion des mutierten IGF1R untersucht. Weiterhin wurde die proliferative Kapazität der Patientenfibroblasten analysiert. Die Ergebnisse dieser Analysen ergaben keine relevanten Funktionseinschränkungen des mutierten IGF1R. Demgegenüber steht eine reduzierte Zellproliferation der Patientenfibroblasten. Die zugrunde liegenden Mechanismen der verminderten Proliferationskapazität sind womöglich den PCNT-Mutationen zuzurechnen. In Versuchen zur IGF1 induzierten Proliferationssteigerung konnte die Proliferation der Patientenfibroblasten zwar kurzfristig stimuliert werden, bei längerer IGF1-Stimulation konnte jedoch das bestehende Proliferationsdefizit nicht ausgeglichen werden. Die genauen molekularbiologischen Auswirkungen der PCNT-Mutation in Bezug auf den ausgeprägten Phänotyp der Patientin müssen in zukünftigen Arbeiten noch weiter aufgeklärt werden.

Verschiedene Umstände können zu einem zu geringem Geburtsgewicht oder einer zu kleinen Geburtsgröße (SGA – small for gestational age) führen. Jedoch leiden nur wenige der betroffenen Kinder über das zweite Lebensjahr hinaus an einem Kleinwuchs. Bei einem Teil dieser speziellen Patientengruppe konnten Mutationen im Insulin-like-growth-factor-1 -Rezeptor (IGF1-Rezeptor) als ein möglicher Auslöser des SGA-Kleinwuchses identifiziert werden. Dieser Rezeptor spielt durch seine zentrale Lage in der Wachstumshormonkaskade eine wichtige Rolle in der Kontrolle des prä- und postnatalen Wachstums. Zwar sind IGF1-Rezeptormutationen selten, jedoch weisen betroffene Patienten eine ausgeprägte Wachstumsverzögerung auf. Obwohl Fallberichte von Arbeitsgruppen aus aller Welt über betroffene Patienten vorliegen gibt es heute, circa 17 Jahre nach der Erstbeschreibung der Mutationen beim Menschen, keine umfassende statistische Analyse, die das Wachstumsprofil betroffener Patienten untersucht. Auch wurde der Nutzen der angewandten Behandlung mit rekombinantem Wachstumshormon bei Patienten mit IGF1-Rezeptormutationen noch nicht systematisch untersucht. Die dieser Dissertation zugrundeliegenden Studienergebnisse wurde 2020 im Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism veröffentlicht. Ziel der Studie war es, das Wachstumsprofil, die Reaktion auf die Wachstumshormontherapie, mögliche metabolische Auswirkungen und den Gesundheitszustand von Patienten mit einer IGF1-Rezeptormutation im Vergleich zu anderen SGA-Patienten zu untersuchen. In der Studie wurden 23 Kinder als Träger von IGF1-Rezeptormutationen identifiziert. Von diesen Mutationsträgern wurden 17 Patienten bereits mindestens ein Jahr lang mit Wachstumshormon behandelt. Eine Kontrollkohorte (im Folgenden als SGA-Kontrolle bezeichnet) umfasste SGA-Kinder ohne Aufholwachstum, die in der Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin, Universitätsklinikum Leipzig für mindestens ein Jahr mit Wachstumshormon behandelt worden waren. Bei diesen 35 Patienten wurde eine Mutation im IGF1-Rezeptorgen ausgeschlossen und es lagen keine anderen syndromalen, genetischen oder endokrinologischen Erkrankungen vor. Daten von Geburtsparametern, die Körpergröße und andere auxologische Parameter im Verlauf der Wachstumshormontherapie, die Endgröße und Labordaten wurden retrospektiv gesammelt und statistisch ausgewertet. Um die mutationsbedingten Gesundheitsfolgen im Erwachsenenalter zu bewerten, wurden auch Daten von 11 erwachsenen IGF1-Rezeptormutationsträgern und 11 Kontrollprobanden gesammelt. Die Gesundheitsprofile der erwachsenen Probanden wurden mittels eines Fragebogens erhoben. Obwohl beide Kinderkohorten sehr ähnliche Geburtsgrößen hatten, waren Patienten mit IGF1 Rezeptormutationen im Vergleich zu SGA-Kontrollen bei Therapiestart signifikant kleiner und zeigten eine proportionale Mikrozephalie. Es kam also zu einer Verstärkung der Wachstumsverzögerung um 0,85 SDS (standard deviation score) bei IGF1-Rezeptormutationsträgern von Geburt bis Therapiestart. Dieses relative Größendefizit im Vergleich zu den SGA-Kontrollen blieb während des Beobachtungszeitraums von vier Jahren signifikant. Patienten mit IGF1 Rezeptormutationen zeigten innerhalb des ersten Jahres der Wachstumshormonbehandlung ein deutlich schlechteres Aufholwachstum als die SGA-Kontrollen (0,29 vs. 0,65 SDS, p < 0,01). In den folgenden drei Jahren war der jährliche Größenzuwachs bei IGF1-Rezeptormutationsträgern jedoch nahezu konstant, während er sich bei der SGA-Kontrolle leicht verlangsamte. Ähnliche Ergebnisse zeigten sich auch in der Wachstumsgeschwindigkeit. Während die SGA-Kontrollgruppe zunächst sehr schnell (ein Zuwachs in der Wachstumsgeschwindigkeit von 3,29 SDS) wuchs, war dieser Gipfel bei den IGF1-Rezeptormutationsträgern nicht nachweisbar (Veränderung um nur 0,87 SDS). Anhand einer Literaturrecherche wurde 'schlechtes Therapieansprechen' als Körpergrößenanstieg < 0,3 SDS innerhalb des ersten Behandlungsjahres definiert. Interessanterweise war die Zahl der schlecht ansprechenden Patienten unter Therapie bei IGF1-Rezeptormutationsträgern dreimal so hoch wie bei SGA-Patienten (53 % vs. 17 %). Die Unterschiede zwischen IGF1-Rezeptormutationsträgern mit gutem und schlechtem Ansprechen im ersten Behandlungsjahr wurden genauer differenziert. Obwohl im weiteren Verlauf keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Untergruppen festgestellt wurden, wichen die Wachstumskurven sichtlich voneinander ab. Die Patienten, welche im ersten Therapiejahr schlecht auf die Behandlung ansprachen, zeigten innerhalb der folgenden Jahre der Behandlung ein kaum erfassbares Aufholwachstum. Dagegen zeigten die guten Therapieansprecher eine Wachstumskurve ähnlich der der SGA-Kontrollen. Es waren keine Faktoren identifizierbar, die dafür ausschlaggebend sind, ob ein IGF1-Rezeptormutationsträger ein gutes oder schlechtes Therapieansprechen haben wird. Der genaue Grund hierfür ist trotz intensiver Analysen unklar. Es konnten keine statistischen Unterschiede oder Korrelationen in auxologischen oder endokrinologischen Parametern identifiziert werden. Des Weiteren gab es zwischen den beiden Untergruppen bei Therapiestart keinen statistisch signifikanten Unterschied bei Parametern wie Alter, BMI-SDS, mittlerer Größe der Eltern, IGF1- oder IGFBP3-Spiegel und keine Korrelation dieser Faktoren mit der Wachstumshormon-induzierten Wachstumsreaktion. Selbst die verabreichte Wachstumshormondosis hatte bei IGF1-Rezeptormutationsträgern keinen statistisch signifikanten Einfluss auf den Größenzuwachs. Darüber hinaus war weder eine statistische Assoziation des Therapieansprechens mit der Art noch der Lokalisation und/oder der Pathophysiologie der IGF1-Rezeptormutation sichtbar. Zur Beurteilung des langfristigen Outcomes der Therapie wurde die Differenz der Körpergrößen-SDS bei Geburt und nach Erreichen der Endgröße errechnet. Obwohl kein signifikanter Unterschied zwischen der Mutationsträger- und der Kontrollkohorte feststellbar war, schienen SGA-Kontrollen mehr von der Behandlung mit Wachstumshormon zu profitieren als IGF1-Rezeptormutationsträger. Interessant ist, dass die behandelten IGF1-Rezeptormutationsträger eine interindividuelle Variabilität im Langzeiterfolg aufwiesen. Auswertungen von endokrinologischen Laborparametern bei Therapiestart zeigten bei IGF1-Rezeptormutationsträgern signifikant erhöhte Serumkonzentrationen von IGF1 und seines Bindungsproteins IGF1BP3, ein Zeichen einer IGF1-Resistenz. Darüber hinaus waren keine Unterschiede in der Insulinsensitivität vor der Behandlung sichtbar. Während der Behandlung war die Insulinresistenz bei IGF1-Rezeptormutationsträgern im Vergleich zu SGA-Kindern signifikant erhöht. Analysen bei erwachsenen Mutationsträgern zeigten im Vergleich zu SGA-Kontrollen kein erhöhtes Auftreten von Komorbiditäten im späteren Leben. Die in Einzelfällen vorbeschriebenen Veränderungen im Glukosestoffwechsel bei Patienten mit IGF1-Rezeptormutationen konnten also statistisch nicht untermauert werden. Zusammenfassend untersucht diese Studie IGF1-Rezeptormutationsträgern als eine spezielle Untergruppe von kleinwüchsigen Kindern mit SGA-Geburtlichkeit. Fokus wurde auf den Wachstumsverlauf und die Reaktion auf eine Wachstumshormonbehandlung gesetzt. IGF1-Rezeptormutationsträger zeigten im Vergleich zu SGA-Patienten ohne Mutationen ausgeprägtere Wachstumsverzögerungen und ein schlechteres Ansprechen auf die Wachstumshormontherapie mit hoher interindividueller Variabilität. Ist das Ansprechen im ersten Therapiejahr gut (> 0,3 SDS Größenzuwachs) können IGF1-Rezeptormutationsträger jedoch von einem Aufholwachstum bis auf das Niveau der behandelten SGA-Kinder profitieren. Daher kommen wir zu dem Schluss, dass Patienten mit IGF1-Rezeptormutatioen nicht von der Wachstumshormonbehandlung ausgeschlossen werden sollten, sondern dass eine kritische Neubewertung des Erfolgs in regelmäßigen Zeitabständen durchgeführt werden sollte. Ärzte und Patienten beziehungsweise deren Eltern sollten realistische Erwartungen und mögliche Nebenwirkungen der Hormonbehandlung abwägen, um eine optimale Therapieentscheidung im Sinne der betroffenen Kinder zu treffen.:I Abkürzungsverzeichnis 1 Einführung 1.1 Die multifaktorielle Genese der Körpergröße 1.2 Die Beurteilung des Körperlängenwachstums 1.3 Die Diagnose „small for gestational age“ 1.4 Die somatotrope Achse und die Rolle des IGF1-Rezeptors 1.5 Das klinische Erscheinungsbild von Patienten mit IGF1-Rezeptormutationen 1.6 Fragestellungen 2 Publikationsmanuskript 3 Zusatzmaterialien zur Veröffentlichung 4 Zusammenfassung der Arbeit II Literaturverzeichnis III Abbildungsverzeichnis IV Darstellung des eigenen Beitrags V Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit VI Lebenslauf VII Danksagung

Untersuchungen haben gezeigt, dass unterdurchschnittlich leichte Neugeborene für zahlreiche Erkrankungen ein erhöhtes Risiko tragen. Beschrieben ist unter anderem das vermehrte Auftreten psychosozialer Probleme sowie metabolischer und kardiovaskulärer Spätfolgen. Inzwischen sind zahlreiche mögliche Ursachen einer intrauterinen und postnatalen Wachstumsretardierung beschrieben worden. Unter diesen Ursachen finden sich auch genetische Veränderungen von Proteinen der endokrinologischen Wachstumsregulierung. So wurden Mutationen im GH1 Gen, in Entwicklungsgenen von GH produzierenden Zellen, im IGF-I Gen und schließlich auch im IGF-I Rezeptor Gen identifiziert. Mutationen im letztgenannten Gen stellen den neuesten Forschungszweig dar und wurden bisher weltweit bei lediglich 19 Patienten festgestellt. Mit dieser Arbeit wird ein weiterer Patient mit einer heterozygoten IGF-I Rezeptormutation beschrieben. Neben einer ausführlichen klinischen Beschreibung war die Analyse der Kausalzusammenhänge von Mutation und klinischem Bild Hauptziel dieser Studie. Über eine ausgeprägte intrauterine und postnatale Wachstumsretardierung hinaus präsentierte die betroffene Patientin eine mentale Entwicklungsverzögerung. Durch verschiedene molekularbiologische Methoden konnte eine gestörte intrazelluläre Prozessierung des veränderten Rezeptorproteins nachgewiesen werden. Beobachtet wurde eine fehlende Zelloberflächenexpression aufgrund einer Retention von Rezeptorvorstufen im Endoplasmatischen Retikulum. Damit wurde ein neuer Mechanismus der IGF-I Resistenz beschrieben.

Etwa 3-5% der Neugeborenen werden kleinwüchsig geboren. Bei einem Teil dieser Kinder bleibt auch nach der Geburt ein Aufholwachstum aus. Eine prä- und postnatale Wachstumsverzögerung kann neben unmittelbaren Folgen wie zum Beispiel psychosozialen Problemen auch mit Langzeitrisiken im Erwachsenenalter, vor allem Diabetes mellitus und kardiovaskulären Erkrankungen einhergehen. In den letzten 10 Jahren konnten verschiedene Mutationen im Gen des IGF1 Rezeptors (IGF1R) bei Patienten mit Kleinwuchs, Mikrozephalie und erhöhten IGF1-Spiegeln identifiziert werden. Aufgrund eines gestörten IGF1 Signales kommt es hauptsächlich zu einem fehlenden Längenwachstum. Aber auch Funktionen des Glukosestoffwechsels sind bei manchen Patienten gestört. In dieser Arbeit wurde eine solche IGF1R Mutation in der Tyrosinkinasedomäne bei zwei Brüdern und deren Vater nachgewiesen. Auffällig waren neben einem Kleinwuchs und Mikrozephalie auch ein zunehmend gestörter Glukosemetabolismus unter Wachstumshormontherapie. Der IGF1R Gendefekt liegt in einer über Speziesgrenzen hinweg hochkonservierten Region und ließ sich mittels dHPLC und Genotypisierungsuntersuchungen bei über 1200 Kontrollen nicht nachweisen. Zusätzlich machen Vererbungsmodus und klinische Manifestationsform die IGF1R Mutation als Ursache der beobachteten prä- und postnatalen Wachstumsverzögerung sehr wahrscheinlich. Eine aufgezeichnete zunehmende Glukoseintoleranz der IGF1R Mutationsträger unter Wachstumshormontherapie spricht für eine komplexe Mitbeteiligung des IGF1R im Glukosestoffwechsel. Bei der Resequenzierung des AKT1 Gens, einem Haupteffektormolekül des IGF1R, wurden bei 70 kleinwüchsigen Kindern fünf neue Genpolymorphismen identifiziert. Eine die Proteinsequenz verändernde Mutation konnte jedoch ausgeschlossen werden. Insgesamt bestätigen diese Ergebnisse die wichtige Funktion des IGF1R im menschlichen Wachstumsprozess und geben Hinweise auf eine mögliche Mitbeteiligung des IGF1R Signalweges bei Störungen des Glukosestoffwechsels.:Inhaltsverzeichnis Bibliographische Beschreibung I. Abkürzungen 1. Einführung 1.1 Epidemiologie und Ätiologie prä- und postnatalen Kleinwuchses 1.2 Das IGF-System im Wachstumsprozess 1.3 Der IGF Typ 1 Rezeptor 1.4 Die Protein Kinase PKBα/AKT1 1.5 Die Rolle des IGF-Systems im Glukosestoffwechsel 2. Das Promotionsprojekt 2.1 Hintergrund und Fragestellung 2.2 Gen-Sequenzierung des AKT1 bei 70 SGA-Kindern 2.2.1 Methoden 2.2.2 Ergebnisse der AKT1 Resequenzierung 2.3 Geno- und phänotypische Charakterisierung der heterozygoten C1248Y IGF Typ 1 Rezeptor Mutation 2.3.1 Patienten und Methoden 2.3.2 Ergebnisse 2.4 Anmerkungen 3. Publikation 4. Zusammenfassung und Interpretation 5. Literaturverzeichnis II. Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit III. Lebenslauf IV. Danksagung

Hintergrund: Der Insulin-like growth factor receptor (IGF1R) spielt eine zentrale Rolle bei Wachstumsprozessen. Heterozygote IGF1R-Mutationen führen durch eine partielle IGF1-Resistenz zu Kleinwuchs. Methoden: Auxologische und endokrinologische Daten des Patienten wurden erhoben. Anhand von Fibroblasten wurde die IGF1R-Deletion charakterisiert und die Auswirkungen auf die mRNA- und Protein-Expression sowie die Signaltransduktion untersucht. Ergebnisse: Der Junge, der eine heterozygote Exon 6 Deletion im IGF1R – durch Alu-Rekombination verursacht – und eine heterozygote SHOX-Variante (p.Met240Ile) in seinem Genom vereint, kam ‚appropriate for gestational age‘ zur Welt, entwickelte aber postnatal eine Wachstumsretardierung. Die Endokrinologischen Daten waren unauffällig. Der Patient zeigt keine Stigmata, die bei anderen IGF1- oder SHOX-Mutationsträgern beschrieben wurden. Durch Nonsense-Mediated mRNA Decay kommt es zu einer Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren und einer entsprechenden verminderten Aktivierung der Rezeptoren, nicht aber des Signalwegs. Zusammenfassung: Der Patient trägt eine bisher unbeschrieben heterozygote IGF1R-Deletion, die zu Kleinwuchs führt. Ursächlich dafür ist eine durch die Mutation verursachte Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren.

Hintergrund: Der Insulin-like growth factor receptor (IGF1R) spielt eine zentrale Rolle bei Wachstumsprozessen. Heterozygote IGF1R-Mutationen führen durch eine partielle IGF1-Resistenz zu Kleinwuchs. Methoden: Auxologische und endokrinologische Daten des Patienten wurden erhoben. Anhand von Fibroblasten wurde die IGF1R-Deletion charakterisiert und die Auswirkungen auf die mRNA- und Protein-Expression sowie die Signaltransduktion untersucht. Ergebnisse: Der Junge, der eine heterozygote Exon 6 Deletion im IGF1R – durch Alu-Rekombination verursacht – und eine heterozygote SHOX-Variante (p.Met240Ile) in seinem Genom vereint, kam ‚appropriate for gestational age‘ zur Welt, entwickelte aber postnatal eine Wachstumsretardierung. Die Endokrinologischen Daten waren unauffällig. Der Patient zeigt keine Stigmata, die bei anderen IGF1- oder SHOX-Mutationsträgern beschrieben wurden. Durch Nonsense-Mediated mRNA Decay kommt es zu einer Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren und einer entsprechenden verminderten Aktivierung der Rezeptoren, nicht aber des Signalwegs. Zusammenfassung: Der Patient trägt eine bisher unbeschrieben heterozygote IGF1R-Deletion, die zu Kleinwuchs führt. Ursächlich dafür ist eine durch die Mutation verursachte Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren.:Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis - 4 - 1 Bibliographische Beschreibung - 7 - 1.1 Referat - 7 - 2 Einleitung und Hintergrund - 9 - 2.1 Das menschliche Wachstum - 9 - 2.2 Das IGF-System als Regulator von Wachstum u. Entwicklung - 10 - 2.3 Der IGF1-Rezeptor - 11 - 2.4 Formen des Kleinwuchses - 12 - 2.5 IGF1R-Mutationen - 13 - 2.6 SHOX-Defizienz - 14 - 2.7 Der Nonsense-Mediated mRNA Decay - 15 - 2.8 Alu-Elemente - 16 - 2.9 Überleitung - 17 - 4 Originalpublikation - 18 - 5 Zusammenfassung der Arbeit - 31 - 5.1 Patientenbeschreibung - 32 - 5.2 Experimentelle Untersuchungen - 33 - 5.3 Interpretation - 35 - 5.4 Ausblick - 37 - 6 Literaturverzeichnis - 39 - III Curriculum vitae - 50 - IV Danksagung - 52 -