Submitted by Andre Moraes Queiroz (andre.moraesqueiroz@ufpe.br) on 2015-04-14T14:58:22Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO LUANA SANTOS.pdf: 2620467 bytes, checksum: dda9bba3a16c2408ffcfa5d487b9a85b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-14T14:58:23Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO LUANA SANTOS.pdf: 2620467 bytes, checksum: dda9bba3a16c2408ffcfa5d487b9a85b (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2013 / CNPq; FACEPE / A baixa estatura é uma das maiores causas de encaminhamento de pacientes à uma unidade pediátrica, sendo uma indicação comum para avaliação genética. Um dos mais importantes genes analisados em pacientes com déficit estatural é o SHOX (Short stature HOmeobox-cotainig gene), relacionado com a baixa estatura e deformidades esqueléticas. Este estudo teve como objetivo definir o cariótipo das pacientes com suspeita clínica da síndrome de Turner (ST) e investigar a haploinsuficiência do gene SHOX em pacientes com cariótipo normal (46,XX) que apresentaram sinais clínicos de baixa estatura associada ou não a malformações esqueléticas. As pacientes foram atendidas no Serviço de Genética Médica do IMIP e no Serviço de Endocrinologia Pediátrica do HC. A análise citogenética foi realizada em linfócitos de sangue periférico e a investigação de deleções foi realizada através de marcadores de microssatélites. A análise citogenética realizada em 168 pacientes revelou alterações cromossômicas compatíveis com a ST em 68 pacientes (40,48%), 20 pacientes (11,90%) apresentaram outras constituições cariotípicas e 80 pacientes (47,62%) apresentaram cariótipo 46,XX, sendo 28 destas inseridas no estudo molecular. A análise citogenética nas pacientes com suspeita clínica da ST permitiu definir seus cariótipos e a investigação do gene SHOX permitiu descartar a haploinsuficiência do gene em 46,43% da amostra de pacientes citogeneticamente normais. Assim, a baixa estatura nestas pacientes não possui etiologia genética para os marcadores moleculares utilizados no presente estudo.

Orientadores: Andréa Trevas Maciel Guerra, Maricilda Palandi de Mello / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T03:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_Renatade_D.pdf: 4015661 bytes, checksum: e48a1ea1afcdb807a4d9186f4bb5777c (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A Discondrosteose de Leri-Weill (DLW), caracterizada por baixa estatura, encurtamento mesomélico dos membros e deformidade de Madelung, deve-se a alterações no gene SHOX, localizado na região pseudoautossômica dos cromossomos sexuais e que atua como fator de transcrição. Alterações em um dos alelos são encontradas em casos de baixa estatura com ou sem DLW, e em ambos os alelos na Displasia Mesomélica de Langer (DML), na qual há alterações esqueléticas mais graves. Há variação fenotípica na DLW, atribuída ao envolvimento de outros genes ou a alterações nas regiões reguladoras à jusante ao gene. No presente estudo, realizou-se a investigação do gene SHOX de 10 pacientes com DLW e um com DML por meio de análises de microssatélites, PCR em tempo real, análise de MLPA e sequenciamento direto. Essas análises permitiram confirmar a etiologia genética do quadro apresentado por sete pacientes, dos quais três apresentavam deleção total ou parcial de um dos alelos. Em um destes pacientes a clinica foi associada a mutação de ponto (IVS3+21G>A no íntron 3), outro paciente (DML) a deleção dos dois alelos, outros pacientes (DLW) a deleção na região downstream do gene, outros dois mutações de ponto (c.439C>A no éxon 3 e c.523delC no éxon 4), outro a deleção (c.523delC) associada a mutação na região 5'UTR. Quatro outros pacientes apresentaram alterações de patogenicidade ainda indefinida: mutações não descritas na região 5'UTR, que poderia interferir no processo de tradução do gene (dois casos), e deleção das regiões referentes às sondas 8, 10 e 12 na análise de MLPA (um caso) e outro caso com relação à deleção da sonda SHOX reg. Os resultados mostram a grande heterogeneidade alélica associada à DLW e indicam a necessidade de que a investigação molecular nesses casos seja ampla, permitindo um diagnóstico molecular mais preciso. / Abstract: Leri-Weill Dyschondrosteosis (LWD) is characterized by short stature, mesomelic shortening of members and Madelung deformity. It results from changes in the SHOX gene, located in the pseudoautosomal region of the sex chromosomes. The protein it codes acts as a transcription factor. Changes in one SHOX allele are found in cases of short stature with or without LWD, whereas Langer Mesomelic Dysplasia (LMD), in which more serious skeletal disorders occur, results from alterations in both alleles. There is phenotypic heterogeneity in LWD, attributed to the possible involvement of other genes, or to changes in regulatory regions downstream of the gene. In the present study, the SHOX gene and the chromosomal SHOX gene region were evaluated in 11 patients with LWD and LMD by using microsatellite PCR, real time PCR analysis, MLPA analysis, and direct sequencing. Those tests confirmed the genetic etiology of the clinical characteristics in seven patients. Three of them carried alleles bearing a partial or total deletion of the SHOX gene, one of which bearing a mutation located in intron 3 (IVS3+21G>A) that has not been described previously; the patient with LMD carried SHOX gene deletion in both alleles; and another had a deletion in the dpwnstream region of the gene. Two patients bore mutations that have not been described previously in exons 3 (C.4390A, Arg147Ser) and 4 (c.523delC, Gln175Lisfs44x219). The later was also associated with a mutation in 5'UTR. Four other patients showed nucleotide changes and deletions of undefined pathogenicity: novel mutations in the 5'UTR, which might interfere with the translation process of the gene (two cases), and deletion of regions related to the probes 8, 10 and 12 in the MLPA analysis (one case) and deletion oh probe SHOX reg. Results showed great molecular heterogeneity associated with LWD, and pointed out the need of a more detailed research to allow more accurate molecular diagnosis. / Doutorado / Ciencias Biomedicas / Doutor em Ciências Médicas

O gene SHOX (short stature homeobox containing gene), expresso em altos níveis nas células osteogênicas, é fundamental para o desenvolvimento ósseo e para a determinação da altura. Haploinsuficiência do SHOX é responsável por vários fenótipos que envolvem a baixa estatura, como a síndrome de Turner, a discondrosteose de Léri-Weill e a baixa estatura idiopática. Cerca de dois terços das haploinsuficiências são causados por deleções. Neste trabalho, foi realizada uma comparação entre três técnicas para detecção de deleções do SHOX: a hibridação in situ com fluorescência (FISH), o estudo de microssatélites e o multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA). Nos pacientes sem deleção do SHOX, foi realizado um rastreamento para identificação de mutações de ponto no gene que levassem à sua haploinsuficiência. Foram analisados seis pacientes com discondrosteose de Léri-Weill (DLW) e 20 com baixa estatura desproporcionada (BED). Na técnica de FISH, os cromossomos metafásicos obtidos a partir de cultura de linfócitos foram hibridados com o cosmídio LLNOYCO3M34F5. DNA genômico extraído a partir de leucócitos de sangue periférico foi submetido à análise de microssatélites e MLPA. Foram amplificados seis marcadores de microssatélites (repetições CA, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 e DXYS234) e o MLPA foi realizado de acordo com as instruções dos kits SALSA MLPA P018-C1 e P018-D1 SHOX. Estes kits contêm oito sondas específicas para o gene SHOX e 13 para a área do SHOX, localizada a jusante do gene. O seqüenciamento direto da região codificadora do gene foi realizado nos pacientes sem deleção. Todos os pacientes com DLW apresentaram deleções envolvendo todo o gene. Entre os pacientes com BED, apenas um (5,0%) apresentou uma deleção intragênica envolvendo os exons 4, 5 e 6a. Os resultados das três metodologias foram concordantes na maioria dos casos, exceto em dois casos. No primeiro caso, inicialmente o FISH não identificou uma deleção envolvendo todos os éxons em um paciente com DLW. No segundo, uma deleção envolvendo os exons 4, 5 e 6a, identificada em uma paciente com BED, foi detectada apenas pelo MLPA. Ainda entre os pacientes com BED, três (15%) apresentaram deleção da região do marcador DXYS10096, a 3 do gene. Outros três (15%) pacientes apresentaram mutações de ponto identificadas pelo seqüenciamento direto: a mutação p.Tyr35X, que resulta na substituição de uma tirosina por um códon de parada prematuro; a p.Arg147His localizada na região do homeodomínio e a NM_000451:c.1236 -10T>C que se encontra a 10 nucleotídeos antes do início do éxon 5. Em uma comparação das três metodologias, o FISH foi considerado a técnica mais trabalhosa e com menor sensibilidade, levando até oito dias para sua realização. A análise por microssatélites requer o estudo dos progenitores, além de um grande número de marcadores para a análise de regiões extensas. O MLPA detectou todas as deleções, sendo considerada a metodologia mais sensível. Ele apresentou também menor custo e tempo de execução, além de possibilitar a estimativa do tamanho da deleção. Desta forma, o MLPA foi considerado a melhor metodologia para investigação inicial dos pacientes com DLW e BED. / The SHOX gene (short stature homeobox containing gene), expressed at high levels in osteogenic cells, is essential for bone development and growth process. SHOX haploinsufficiency is responsible for several phenotypes involving short stature, such as Turner syndrome, Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and idiopathic short stature. Deletions are responsible for 2/3 of SHOX haploinsufficiency. In this study, a comparison among three techniques for detection of SHOX deletions: fluorescence in situ hybridization (FISH), microsatellites analysis and multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA) was performed. A screening for point mutations that could lead to haploinsufficiency was performed in patients without SHOX deletion. Six patients with Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and 20 with disproportionate short stature (DSS) were analyzed. FISH analysis was performed using the cosmid LLNOYCO3\"M\"34F5 and metaphase spreads obtained from lymphocytes culture. Genomic DNA extracted from peripheral blood leukocytes was used to microsatellite and MLPA analysis. Six microsatellite markers (CA repeats, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 and DXYS234) were amplified by PCR and MLPA was performed according to the manufacturers instructions for SALSA MLPA P018 and P018-C1-D1 SHOX kits. These kits contain 8 specific probes for SHOX gene and 13 for \"SHOX area, which is located downstream of the gene. The direct sequencing of entire encoding region was performed in patients with no SHOX deletions. All patients with LWD presented deletions involving the entire gene. One (5.0%) patient with DSS, presented an intragenic deletion involving exons 4, 5 and 6a. The results of the three methods were concordant in most cases, except in two cases. In the first case, a patient with DLW, the FISH did not identify a deletion involving all SHOX exons. In the second case, a deletion of exons 4, 5 and 6a in a patient with BED was identified only by MLPA. Other 3 (15%) DSS patients had deletion in SHOX area, in the DXYS10096 marker. Other three (15%) patients presented a point mutation identified by direct sequencing: p.Tyr35X, which replaces a tyrosine for a premature stop codon, p.Arg147His located in the homeodomain region and NM_000451: c.1236-10T> C which is 10 nucleotides before the exon 5. In a comparison of three methods, the FISH technique was considered the more laborious and less sensitive, taking until eight days to obtain the results. The microsatellite analysis requires the parents DNA study. In addition, several markers are essential for the analysis of extensive regions. The MLPA was considered the most sensitive methodology since it detected all deletions. It also presented lower cost and execution time, and allowed the estimation of the size of the deletion. Thus, the MLPA was considered the best approach for initial investigation of LWD and DSS patients.

Hintergrund: Der Insulin-like growth factor receptor (IGF1R) spielt eine zentrale Rolle bei Wachstumsprozessen. Heterozygote IGF1R-Mutationen führen durch eine partielle IGF1-Resistenz zu Kleinwuchs. Methoden: Auxologische und endokrinologische Daten des Patienten wurden erhoben. Anhand von Fibroblasten wurde die IGF1R-Deletion charakterisiert und die Auswirkungen auf die mRNA- und Protein-Expression sowie die Signaltransduktion untersucht. Ergebnisse: Der Junge, der eine heterozygote Exon 6 Deletion im IGF1R – durch Alu-Rekombination verursacht – und eine heterozygote SHOX-Variante (p.Met240Ile) in seinem Genom vereint, kam ‚appropriate for gestational age‘ zur Welt, entwickelte aber postnatal eine Wachstumsretardierung. Die Endokrinologischen Daten waren unauffällig. Der Patient zeigt keine Stigmata, die bei anderen IGF1- oder SHOX-Mutationsträgern beschrieben wurden. Durch Nonsense-Mediated mRNA Decay kommt es zu einer Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren und einer entsprechenden verminderten Aktivierung der Rezeptoren, nicht aber des Signalwegs. Zusammenfassung: Der Patient trägt eine bisher unbeschrieben heterozygote IGF1R-Deletion, die zu Kleinwuchs führt. Ursächlich dafür ist eine durch die Mutation verursachte Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren.

O gene SHOX (short stature homeobox containing gene), expresso em altos níveis nas células osteogênicas, é fundamental para o desenvolvimento ósseo e para a determinação da altura. Haploinsuficiência do SHOX é responsável por vários fenótipos que envolvem a baixa estatura, como a síndrome de Turner, a discondrosteose de Léri-Weill e a baixa estatura idiopática. Cerca de dois terços das haploinsuficiências são causados por deleções. Neste trabalho, foi realizada uma comparação entre três técnicas para detecção de deleções do SHOX: a hibridação in situ com fluorescência (FISH), o estudo de microssatélites e o multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA). Nos pacientes sem deleção do SHOX, foi realizado um rastreamento para identificação de mutações de ponto no gene que levassem à sua haploinsuficiência. Foram analisados seis pacientes com discondrosteose de Léri-Weill (DLW) e 20 com baixa estatura desproporcionada (BED). Na técnica de FISH, os cromossomos metafásicos obtidos a partir de cultura de linfócitos foram hibridados com o cosmídio LLNOYCO3M34F5. DNA genômico extraído a partir de leucócitos de sangue periférico foi submetido à análise de microssatélites e MLPA. Foram amplificados seis marcadores de microssatélites (repetições CA, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 e DXYS234) e o MLPA foi realizado de acordo com as instruções dos kits SALSA MLPA P018-C1 e P018-D1 SHOX. Estes kits contêm oito sondas específicas para o gene SHOX e 13 para a área do SHOX, localizada a jusante do gene. O seqüenciamento direto da região codificadora do gene foi realizado nos pacientes sem deleção. Todos os pacientes com DLW apresentaram deleções envolvendo todo o gene. Entre os pacientes com BED, apenas um (5,0%) apresentou uma deleção intragênica envolvendo os exons 4, 5 e 6a. Os resultados das três metodologias foram concordantes na maioria dos casos, exceto em dois casos. No primeiro caso, inicialmente o FISH não identificou uma deleção envolvendo todos os éxons em um paciente com DLW. No segundo, uma deleção envolvendo os exons 4, 5 e 6a, identificada em uma paciente com BED, foi detectada apenas pelo MLPA. Ainda entre os pacientes com BED, três (15%) apresentaram deleção da região do marcador DXYS10096, a 3 do gene. Outros três (15%) pacientes apresentaram mutações de ponto identificadas pelo seqüenciamento direto: a mutação p.Tyr35X, que resulta na substituição de uma tirosina por um códon de parada prematuro; a p.Arg147His localizada na região do homeodomínio e a NM_000451:c.1236 -10T>C que se encontra a 10 nucleotídeos antes do início do éxon 5. Em uma comparação das três metodologias, o FISH foi considerado a técnica mais trabalhosa e com menor sensibilidade, levando até oito dias para sua realização. A análise por microssatélites requer o estudo dos progenitores, além de um grande número de marcadores para a análise de regiões extensas. O MLPA detectou todas as deleções, sendo considerada a metodologia mais sensível. Ele apresentou também menor custo e tempo de execução, além de possibilitar a estimativa do tamanho da deleção. Desta forma, o MLPA foi considerado a melhor metodologia para investigação inicial dos pacientes com DLW e BED. / The SHOX gene (short stature homeobox containing gene), expressed at high levels in osteogenic cells, is essential for bone development and growth process. SHOX haploinsufficiency is responsible for several phenotypes involving short stature, such as Turner syndrome, Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and idiopathic short stature. Deletions are responsible for 2/3 of SHOX haploinsufficiency. In this study, a comparison among three techniques for detection of SHOX deletions: fluorescence in situ hybridization (FISH), microsatellites analysis and multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA) was performed. A screening for point mutations that could lead to haploinsufficiency was performed in patients without SHOX deletion. Six patients with Léri-Weill dyschondrosteosis (LWD) and 20 with disproportionate short stature (DSS) were analyzed. FISH analysis was performed using the cosmid LLNOYCO3\"M\"34F5 and metaphase spreads obtained from lymphocytes culture. Genomic DNA extracted from peripheral blood leukocytes was used to microsatellite and MLPA analysis. Six microsatellite markers (CA repeats, DYS290, DXYS10093, DXYS10096, DXYS233 and DXYS234) were amplified by PCR and MLPA was performed according to the manufacturers instructions for SALSA MLPA P018 and P018-C1-D1 SHOX kits. These kits contain 8 specific probes for SHOX gene and 13 for \"SHOX area, which is located downstream of the gene. The direct sequencing of entire encoding region was performed in patients with no SHOX deletions. All patients with LWD presented deletions involving the entire gene. One (5.0%) patient with DSS, presented an intragenic deletion involving exons 4, 5 and 6a. The results of the three methods were concordant in most cases, except in two cases. In the first case, a patient with DLW, the FISH did not identify a deletion involving all SHOX exons. In the second case, a deletion of exons 4, 5 and 6a in a patient with BED was identified only by MLPA. Other 3 (15%) DSS patients had deletion in SHOX area, in the DXYS10096 marker. Other three (15%) patients presented a point mutation identified by direct sequencing: p.Tyr35X, which replaces a tyrosine for a premature stop codon, p.Arg147His located in the homeodomain region and NM_000451: c.1236-10T> C which is 10 nucleotides before the exon 5. In a comparison of three methods, the FISH technique was considered the more laborious and less sensitive, taking until eight days to obtain the results. The microsatellite analysis requires the parents DNA study. In addition, several markers are essential for the analysis of extensive regions. The MLPA was considered the most sensitive methodology since it detected all deletions. It also presented lower cost and execution time, and allowed the estimation of the size of the deletion. Thus, the MLPA was considered the best approach for initial investigation of LWD and DSS patients.

Hintergrund: Der Insulin-like growth factor receptor (IGF1R) spielt eine zentrale Rolle bei Wachstumsprozessen. Heterozygote IGF1R-Mutationen führen durch eine partielle IGF1-Resistenz zu Kleinwuchs. Methoden: Auxologische und endokrinologische Daten des Patienten wurden erhoben. Anhand von Fibroblasten wurde die IGF1R-Deletion charakterisiert und die Auswirkungen auf die mRNA- und Protein-Expression sowie die Signaltransduktion untersucht. Ergebnisse: Der Junge, der eine heterozygote Exon 6 Deletion im IGF1R – durch Alu-Rekombination verursacht – und eine heterozygote SHOX-Variante (p.Met240Ile) in seinem Genom vereint, kam ‚appropriate for gestational age‘ zur Welt, entwickelte aber postnatal eine Wachstumsretardierung. Die Endokrinologischen Daten waren unauffällig. Der Patient zeigt keine Stigmata, die bei anderen IGF1- oder SHOX-Mutationsträgern beschrieben wurden. Durch Nonsense-Mediated mRNA Decay kommt es zu einer Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren und einer entsprechenden verminderten Aktivierung der Rezeptoren, nicht aber des Signalwegs. Zusammenfassung: Der Patient trägt eine bisher unbeschrieben heterozygote IGF1R-Deletion, die zu Kleinwuchs führt. Ursächlich dafür ist eine durch die Mutation verursachte Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren.:Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis - 4 - 1 Bibliographische Beschreibung - 7 - 1.1 Referat - 7 - 2 Einleitung und Hintergrund - 9 - 2.1 Das menschliche Wachstum - 9 - 2.2 Das IGF-System als Regulator von Wachstum u. Entwicklung - 10 - 2.3 Der IGF1-Rezeptor - 11 - 2.4 Formen des Kleinwuchses - 12 - 2.5 IGF1R-Mutationen - 13 - 2.6 SHOX-Defizienz - 14 - 2.7 Der Nonsense-Mediated mRNA Decay - 15 - 2.8 Alu-Elemente - 16 - 2.9 Überleitung - 17 - 4 Originalpublikation - 18 - 5 Zusammenfassung der Arbeit - 31 - 5.1 Patientenbeschreibung - 32 - 5.2 Experimentelle Untersuchungen - 33 - 5.3 Interpretation - 35 - 5.4 Ausblick - 37 - 6 Literaturverzeichnis - 39 - III Curriculum vitae - 50 - IV Danksagung - 52 -

Such chromosomal rearrangements, which cannot be detected by using of cytogenetic banding of metaphase chromosomes, i.e. chromosomes smaller than 3 - 5 Mb, and therefore modern molecular genetic methods are used to detect them, are called "cryptic rearrangements". Their important role in human pathology is more and more significant. By using of the multiplex ligation-probe dependent amplification method (MLPA) we examined a group of 50 probands with idiopathic mental retardation. A cryptic rearrangement was found at 8 probands (16 %), at 6 of them it was demonstrably causal. Then we examined a group of 40 probands suspected of gene SHOX pathology. A cryptic rearrangement was found at 17 probands (42.5 %) and at 8 of them it was demonstrably causal. Presence of small deletion founded isolated at 7 probands was verified in a population set, but without a positive result. An analysis of mutations was made too.

Studying genetic diversity in natural and domestic populations is of major importance in evolutionary biology. The recent advent of next generation sequencing (NGS) technologies has dramatically changed the scope of these studies, enabling researchers to study genetic diversity in a whole-genome context. This thesis details examples of studies using NGS data to: (i) characterize evolutionary forces shaping the genome of the Atlantic herring, (ii) detect the genetic basis of speciation and domestication in the rabbit, and, (iii) identify mutations associated with skeletal atavism in Shetland ponies. The Atlantic herring (Clupea harengus) is the most abundant teleost species inhabiting the North Atlantic. Herring has seasonal reproduction and is adapted to a wide range of salinity (3-35‰) throughout the Baltic Sea and Atlantic Ocean. By using NGS data and whole-genome screening of 20 populations, we revealed the underlying genetic architecture for both adaptive features. Our results demonstrated that differentiated genomic regions have evolved by natural selection and genetic drift has played a subordinate role. The European rabbit (Oryctolagus cuniculus) is native to the Iberian Peninsula, where two rabbit subspecies with partial reproductive isolation have evolved. We performed whole genome sequencing to characterize regions of reduced introgression. Our results suggest key role of gene regulation in triggering genetic incompatibilities in the early stages of reproductive isolation. Moreover, we studied gene expression in testis and found misregulation of many genes in backcross progenies that often show impaired male fertility. We also scanned whole genome of wild and domestic populations and identified differentiated regions that were enriched for non-coding conserved elements. Our results indicated that selection has acted on standing genetic variation, particularly targeting genes expressed in the central nervous system. This finding is consistent with the tame behavior present in domestic rabbits, which allows them to survive and reproduce under the stressful non-natural rearing conditions provided by humans. In Shetland ponies, abnormally developed ulnae and fibulae characterize a skeletal deformity known as skeletal atavism. To explore the genetic basis of this disease, we scanned the genome using whole genome resequencing data. We identified two partially overlapping large deletions in the pseudoautosomal region (PAR) of the sex chromosomes that remove the entire coding sequence of the SHOX gene and part of CRLF2 gene. Based on this finding, we developed a diagnostic test that can be used as a tool to eradicate this inherited disease in horses.