Hintergrund: Der Insulin-like growth factor receptor (IGF1R) spielt eine zentrale Rolle bei Wachstumsprozessen. Heterozygote IGF1R-Mutationen führen durch eine partielle IGF1-Resistenz zu Kleinwuchs. Methoden: Auxologische und endokrinologische Daten des Patienten wurden erhoben. Anhand von Fibroblasten wurde die IGF1R-Deletion charakterisiert und die Auswirkungen auf die mRNA- und Protein-Expression sowie die Signaltransduktion untersucht. Ergebnisse: Der Junge, der eine heterozygote Exon 6 Deletion im IGF1R – durch Alu-Rekombination verursacht – und eine heterozygote SHOX-Variante (p.Met240Ile) in seinem Genom vereint, kam ‚appropriate for gestational age‘ zur Welt, entwickelte aber postnatal eine Wachstumsretardierung. Die Endokrinologischen Daten waren unauffällig. Der Patient zeigt keine Stigmata, die bei anderen IGF1- oder SHOX-Mutationsträgern beschrieben wurden. Durch Nonsense-Mediated mRNA Decay kommt es zu einer Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren und einer entsprechenden verminderten Aktivierung der Rezeptoren, nicht aber des Signalwegs. Zusammenfassung: Der Patient trägt eine bisher unbeschrieben heterozygote IGF1R-Deletion, die zu Kleinwuchs führt. Ursächlich dafür ist eine durch die Mutation verursachte Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren.

Hintergrund: Der Insulin-like growth factor receptor (IGF1R) spielt eine zentrale Rolle bei Wachstumsprozessen. Heterozygote IGF1R-Mutationen führen durch eine partielle IGF1-Resistenz zu Kleinwuchs. Methoden: Auxologische und endokrinologische Daten des Patienten wurden erhoben. Anhand von Fibroblasten wurde die IGF1R-Deletion charakterisiert und die Auswirkungen auf die mRNA- und Protein-Expression sowie die Signaltransduktion untersucht. Ergebnisse: Der Junge, der eine heterozygote Exon 6 Deletion im IGF1R – durch Alu-Rekombination verursacht – und eine heterozygote SHOX-Variante (p.Met240Ile) in seinem Genom vereint, kam ‚appropriate for gestational age‘ zur Welt, entwickelte aber postnatal eine Wachstumsretardierung. Die Endokrinologischen Daten waren unauffällig. Der Patient zeigt keine Stigmata, die bei anderen IGF1- oder SHOX-Mutationsträgern beschrieben wurden. Durch Nonsense-Mediated mRNA Decay kommt es zu einer Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren und einer entsprechenden verminderten Aktivierung der Rezeptoren, nicht aber des Signalwegs. Zusammenfassung: Der Patient trägt eine bisher unbeschrieben heterozygote IGF1R-Deletion, die zu Kleinwuchs führt. Ursächlich dafür ist eine durch die Mutation verursachte Dosisreduktion der IGF1-Rezeptoren.:Inhaltsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis - 4 - 1 Bibliographische Beschreibung - 7 - 1.1 Referat - 7 - 2 Einleitung und Hintergrund - 9 - 2.1 Das menschliche Wachstum - 9 - 2.2 Das IGF-System als Regulator von Wachstum u. Entwicklung - 10 - 2.3 Der IGF1-Rezeptor - 11 - 2.4 Formen des Kleinwuchses - 12 - 2.5 IGF1R-Mutationen - 13 - 2.6 SHOX-Defizienz - 14 - 2.7 Der Nonsense-Mediated mRNA Decay - 15 - 2.8 Alu-Elemente - 16 - 2.9 Überleitung - 17 - 4 Originalpublikation - 18 - 5 Zusammenfassung der Arbeit - 31 - 5.1 Patientenbeschreibung - 32 - 5.2 Experimentelle Untersuchungen - 33 - 5.3 Interpretation - 35 - 5.4 Ausblick - 37 - 6 Literaturverzeichnis - 39 - III Curriculum vitae - 50 - IV Danksagung - 52 -

Le NMD (nonsense-mediated mRNA decay) est un mécanisme qui reconnaît et dégrade les ARNm portant un codon stop prématuré afin d’empêcher la synthèse de protéines tronquées qui pourraient avoir des effets néfastes pour la cellule ou tout simplement être non fonctionnelles. Cependant, dans un certain nombre de cas, selon la position du codon stop prématuré, la protéine tronquée qui serait synthétisée si le NMD n’existait pas, pourrait remplir complètement ou partiellement la fonction de la protéine sauvage. Il faut noter qu’un codon stop prématuré est retrouvé dans le gène responsable d’une pathologie dans un tiers des maladies génétiques et de nombreuses formes de cancer. Dans la plus grande majorité des cas, la maladie se développe non pas parce qu’une protéine tronquée non fonctionnelle ou instable est synthétisée, mais plutôt parce que le gène muté n’est pas exprimé du fait de l’intervention du NMD sur l’ARNm qui en dérive. Une nouvelle approche thérapeutique de ces maladies serait d’inhiber le NMD afin de permettre la synthèse de protéines tronquées fonctionnelles et sauver le phénotype clinique. Nous avons donc décidé de rechercher des inhibiteurs du mécanisme du NMD parmi des petites molécules chimiques. Pour cela, nous avons mis au point un système de criblage en culture cellulaire reliant l’efficacité du NMD dans une cellule avec une activité luciférase mesurable directement sur les cultures cellulaires, au moyen d’un luminomètre. A partir d’un premier criblage d’environ 1500 composés chimiques, nous avons identifié une nouvelle molécule capable d’inhiber efficacement le NMD. De façon intéressante, cette nouvelle molécule est capable également d’induire la synthèse de protéines entières à partir d’un ARNm portant un codon stop prématuré. Nous avons utilisé cet inhibiteur dans des expériences pour déterminer son potentiel thérapeutique sur des modèles cellulaires de maladies génétiques tels que la dystrophie musculaire de Duchenne, la mucoviscidose et le cancer. Nos résultats démontrent que l’inhibition du NMD peut être en effet envisagée comme une nouvelle approche thérapeutique pour des maladies causées par l’apparition d’une mutation non sens. Nous avons aussi identifié une autre molécule chimique capable d’inhiber le NMD et permettant de faire un lien entre efficacité du NMD et intégrité du cytosquelette. / MRNAs harboring a premature termination codon are rapidly degraded by a mechanism called nonsense-mediated mRNA decay (NMD). NMD is a surveillance pathway that prevents the synthesis of truncated proteins that could be harmful for the cell or simply be non-functional. However in some cases, depending on the position of the premature stop codon, the truncated protein that would be synthesized if there were no NMD would be partially or fully as functional as the wild-type protein. It is noteworthy that premature termination codons are found in approximately one-third of inherited genetic disorders and several forms of cancer. In most of cases the disease arises not because a non-functional or unstable truncated protein is synthesized, but instead because the degradation of the transcript by NMD leads to complete loss of protein production. Therefore, NMD inhibition could be an interesting therapeutic approach in some cases of nonsense-related genetic diseases in which functional truncated proteins can restore the clinical phenotype. We decided to search for NMD inhibitors among thousands of small molecules. We developed a cell-based screening method which couples NMD efficiency into the cell to a luciferase activity that can be measured directly into cells by a luminometer. From a screening of approximately 1500 compounds, we have identified one molecule capable of efficiently inhibit NMD. Interestingly, this compound is also able to induce the synthesis of full-length proteins from an mRNA bearing a premature termination codon. We evaluated the therapeutic potential of this compound in different cellular models of genetic disorders such as Duchenne’s muscular dystrophy, cystic fibrosis and cancer. Our results demonstrate that NMD inhibition in general can be considered as an useful therapeutic approach to rescue PTC consequences in genetic diseases provoked by the apparition of a nonsense mutation. We have also identified another compound that inhibits NMD and uncovers a relationship between the NMD efficiency and the integrity of the cytoskeleton.

Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is an important protective mechanism to guard against erroneous transcripts particularly mRNA transcripts containing premature termination codons (PTC). In classical teaching, such erroneous transcripts (called nonsense-mediated decay targeted RNA, nt-RNA here) are considered as incidental non-specific side-products of the cellular transcription machinery and they are rapidly cleared by NMD and thus they exists in scanty quantity inside a cell (i.e. at a very low steady state abundance). As a side product of stochastic transcriptional error, they are also commonly considered to carry no biologic function. / By analysis of a large collection of RNA-seq data in TCGA (over 4000 samples and the hard disk storage was over 50 TB), it was found that nt-RNA were produced in large amount for some genes, sometimes, they were even more abundant than the normal transcripts of the corresponding genes. / Based on the hypothesis that some nt-RNA are specifically produced by a biological process (in contrast to a process happened by chance), the aims of this work are: 1) To quantify the expression of nt-RNA (survey of the spectrum); 2) To examine the relationship between nt-RNA and protein expression (biological roles); 3) To detect nt-RNAs that affect prognosis of cancer (biological roles); 4) To apply nt-RNA as diagnostic biomarkers for cancer (application); 5) To identify nt-RNAs to classify tumors for unknown primary (CUP, application). / Firstly, nt-RNA were defined from Gene databases and all PTC containing transcripts were compared to their corresponding normal transcripts to locate specific signature tags (both short segments of sequences and splice junctions) for each of the nt-RNA. And the presence and counts of these nt-RNA signature tag were searched in all RNA reads of RNA-seq datasets. Such search and counting produced the read counts of each nt-RNA signature tag and all RNA-read containing such tags are targets for NMD. RNA-seq datasets used in this study included TCGA normal samples, TCGA tumor samples and cancer cell lines for 13 cancer types. / In the example of KIRC, it was found that most differentially expressed nt-RNA (tumor vs control) were related to differential expression of the corresponding normal transcripts. However, nt-RNA were produced in 900 genes which were independent of higher production of the normal transcripts. In the example of KIRC, collection of 12 genes in the proteasome ubiquitination pathway standed out among the highly produced nt-RNA. This finding is very interesting as VHL-HIF1A is a key oncogenesis mechanism in KIRC and normal HIF1A degradation required proteasomal ubiquitination pathway. GO analysis was highly significant at p-value<4.11E-05. And the nt-RNA producing genes included PSMB4, PSMD14, PSMC6, PSMD13, PSMB1, VCP, ANAPC5, PSMA4, PSMD3, ANAPC7, OS9, GCLC. / Secondly, some nt-RNA retarded translation of the normal transcripts. By using proteome data, the relationship between quantity of nt-RNA unique tags and normal protein product were analyzed by ANOVA comparison of linear models. It was found that 422 nt-RNA unique tags influenced the expression of proteins, which suggested a potential biological action of these nt-RNA. PTEN also produced nt-RNA in KIRC and tumor cells with higher PTEN nt-RNA had a lower PTEN protein level (p-value of ANOVA comparison of linear models: 0.017). Survival analysis results showed that PTEN nt-RNA levels affected survival, which suggested that it can be used as biomarker for prognosis. Furthermore, survival analysis were done for other nt-RNA unique tags which affected protein expression using clinical data. / Thirdly, the application of nt-RNA as diagnostic markers and markers to define tumor origin in CUP were examined. nt-RNA were identified in different types of tumors. Here, only nt-RNA that were independent of the normal gene transcripts in term of differential expression were used as biomarkers. By comparing tumor samples with normal samples, nt-RNAs as diagnostic markers were detected. Unsupervised clustering was performed for these nt-RNAs and heat maps showed high degree of separation of tumor and normal samples. For studying tumor origin in CUP, in both cross-validation study in the training dataset (N=541) and independent sample set external validation (N=2462), a highly discriminating sets of nt-RNAs were defined for most cancers examined (400 nt-RNA seq. tags). Unsupervised clustering was performed for the 400 nt-RNA seq. tags and heat maps showed its power to define tumor origin in CUP. And then the significance of classifier formed by 400 nt-RNA seq. tags was measured by performing 100 resampling of the training set. The results for the 100 resampling showed that the correctly classified instance rate for training set had 96.4895% ± 0.75% (mean ± standard deviation); for validation set had 91.0239% ± 1.032611%. / In conclusion, this study showed nt-RNA can have important biological function and be used for various applications. It’s a potential biomarker for diagnosis and prognosis of diseases. And it can also be used to decide the origin site of tumors, which indicates that nt-RNA will provide great information for potential application in diagnosis of cancer and determining the origin in cancer of unknown primary site (CUP). [With diagram] / 無意介導的mRNA降解（NMD）是一種重要的保護機制，它可以防止錯誤的轉錄本，特別是含有提前終止密碼子的轉錄本。在經典的教學里，這種錯誤的轉錄本（這裡稱為無意介導的mRNA降解所靶向的轉錄本，記為nt-RNA）被認為是細胞轉錄過程中偶然產生的非特異性的副產物，它們很快被NMD清除，因此它們在細胞內的表達很少（即穩態時它們的表達量很少）。作為隨機的轉錄錯誤的一個副產物，它們通常被認為是沒有生物功能的。 / 通過分析大量的來自TCGA的RNA-seq的數據（超過4000個樣本，存儲空間超過50TB），我們發現一些基因的nt-RNA有很高的表達量，有的甚至超過同一個基因的正常轉錄本的表達量。 / 我們的假設是一些nt-RNA是由某個生物過程特定產生的，而不是偶然產生的。基於這一假設，本研究的目標有：（1）量化nt-RNA的表達（表達譜的調查）；（2）探索nt-RNA與蛋白質表達的關係（生物功能）；（3）尋找可以影響癌症預後的nt-RNA（生物功能）；（4）用nt-RNA作為癌症診斷的生物標記物（應用）；（5）識別可以用來區分原发灶不明的癌症的nt-RNA（應用）。 / 首先，通過基因的數據庫定義nt-RNA，并將這些nt-RNA與相應的正常的轉錄本進行比較，找到每個nt-RNA特有的標簽（包括系列的片段和剪接位点）。進而在RNA-seq數據所有的讀段中搜索這些nt-RNA特有的標簽并記數。通過這樣的搜索和記數，產生了每個nt-RNA特有標簽的讀段數目，而包含這些標簽的讀段就是NMD的靶標。本研究中使用的RNA-seq數據包含13種癌症的TCGA正常和癌症樣本，以及癌細胞系的樣本數據。 / 在腎癌的例子中，大多數差異表達（癌症與正常比較）的nt-RNA和它相應的正常的轉錄本的差異表達是有關聯的。然而，900个基因產生的nt-RNA與正常轉錄本的高表達是獨立的。我們發現與白酶體泛素化通路相關的12個基因高表達nt-RNA。這個發現是很有意思的，因為VHL-HIF1A是KIRC的一個重要的致癌機制，而正常的HIF1A的降解需要通過白酶體泛素化通路。白酶體泛素化通路在基因富集分析中是顯著的（p值<4.11E-05）。這12個基因分別是PSMB4，PSMD14，PSMC6，PSMD13，PSMB1，VCP，ANAPC5，PSMA4，PSMD3，ANAPC7，OS9，GCLC。 / 其次，一些nt-RNA可以降低正常轉錄本的翻譯。利用蛋白組數據，我們用ANOVA比較線性模型的方法研究了nt-RNA特有的標簽與正常的蛋白產物的關係。結果發現，422个nt-RNA特有的標簽影響蛋白質的表達，這說明nt-RNA具有潛在的生物作用。PTEN也在KIRC裡產生nt-RNA，PTEN的nt-RNA表達越高的樣本，含有越少的PTEN蛋白產物（ANOVA比較線性模型的p值=0.017）。生存分析的結果顯示PTEN的nt-RNA影響生存率，這說明PTEN的nt-RNA可以作為癌症預後的生物標記物。進一步，對其他的影響蛋白表達的nt-RNA特有的標簽也做了生存分析。 / 最後，我檢查了nt-RNA作為診斷標記物和用來定義原发灶不明的癌症（CUP）的起源的標記物的兩大應用。只有在差異表達方面獨立於正常轉錄本的那些nt-RNA會被用作生物標記物。通過比較癌症和正常的樣本，檢查了哪些nt-RNA可以作為診斷標記物。利用無監督的聚類分析和熱圖顯示了這些nt-RNA可以很明顯地將癌症和正常樣本分開。在研究原发灶不明的癌症（CUP）的起源中，通過對訓練集（N=541）和獨立的外部驗證集（N=2462）進行交叉驗證學習，定義了一個可以識別大多數癌症樣本的nt-RNA標簽集（400個nt-RNA特有的片段標簽）。無監督的聚類分析和熱圖顯示了用這些nt-RNA定義原发灶不明的癌症（CUP）的起源的能力。隨後，通過從訓練集的樣本隨機抽樣100次，檢查了由400個nt-RNA特有的片段標簽組成的分類器的顯著性。100次隨機抽樣的結果顯示：對訓練集，樣本準確分類率的均值和標準差分別是96.4895%和0.75%；對驗證集，樣本準確分類率的均值和標準差分別是91.0239%和1.032611%。 / 總之，本研究顯示了nt-RNA有重要的生物功能和多種應用。它是癌症診斷和預後的潛在的生物標記物。它也可以被用來決定癌症的原发灶，這意味著nt-RNA將會為癌症診斷和決定原发灶不明的癌症的原发灶的這些潛在應用提供很好的信息。[附圖] / Hu, Fuyan. / Thesis Ph.D. Chinese University of Hong Kong 2015. / Includes bibliographical references (leaves 173-211). / Abstracts also in Chinese. / Title from PDF title page (viewed on 12, October, 2016). / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only.

Environ un tiers des maladies humaines, héréditaires ou acquises, sont dues à la génération d’un codon stop prématuré (PTC). Le système de contrôle appelé dégradation des ARNm non-sens (NMD) permet de détecter puis de dégrader des ARNm contenant un PTC. Les facteurs principaux de la NMD : UPF1, UPF2 et UPF3 reconnaissent les PTCs en interagissant avec le complexe de terminaison de traduction contenant les ribosomes, les facteurs de terminaison eRF1, eRF3 et la protéine poly(A) binding (Pab1p en levure). Nous avons pu résoudre la structure d'un tel complexe en levure comprenant un ribosome en cours de traduction en présence d’un ARNt dans le site P et de facteurs de terminaisons dans le site A. Aucune densité n’a pu être observée pour Pab1p indiquant la flexibilité de l’interaction avec ce complexe. Nous avons aussi évalué l’impact des facteurs de la NMD sur la terminaison dans un système de traduction in vitro humain. UPF3B retarde la reconnaissance du codon stop et favorise la dissociation des sous-unités ribosomales. UPF2 abolit l’effet de UPF3B tandis que l’addition de UPF1 n’a pas d’influence dans la terminaison. Par in vivo et in vitro pulldowns, nous avons montré que UPF3B interagit avec eRF3a et UPF1 et pourrait constituer le lien manquant entre la terminaison et la NMD. Nos résultats illustrent la complexité des mécanismes de la terminaison et de la NMD. / Premature termination codons (PTCs) account for approximately one third of inherited and acquired diseases. A surveillance pathway called nonsense-mediated mRNA decay (NMD) detects and degrades PTC-containing transcripts. NMD core factors UPF1, UPF2 and UPF3 mediate the recognition of PTCs by associating with the terminating translation machinery composed of the ribosome, the release factors eRF1 and eRF3 and the poly(A) binding protein (Pab1p in yeast). Using electron cryo-microscopy, we solved such a complex in yeast and observed the translating ribosome, containing a P-site tRNA and an A-site density for the release factors but not for Pab1p indicating that Pab1p is flexibly bound. We also probed the function of NMD factors in mammalian termination using a reconstituted human in vitro translation system. Surprisingly, we found that UPF3B delayed stop codon recognition and promoted ribosomal dissociation. The addition of UPF2 could abolish UPF3B’s effect on translation termination. UPF1 had no influence in the termination process alone or in combination with UPF2. Using in vitro and in vivo pulldowns we found that UPF3B interacts with eRF3a and UPF1, indicating that UPF3B could be the missing link between termination and NMD. Our results point to a complex interplay between the NMD factors and the termination apparatus.

Le système de contrôle appelé dégradation des ARNm non-sens (NMD) permet de détecter puis de dégrader des ARNm contenant un codon de terminaison prématuré (PTC). Les facteurs principaux de la NMD : UPF1, UPF2 et UPF3 reconnaissent les PTCs en interagissant avec les facteurs de terminaison eRF1, eRF3 et la protéine Poly(A) binding (PABP). La reconstitution d’un système de traduction in vitro a permis d’étudier la terminaison de la traduction en présence des facteurs PABP et UPF1, à l’aide de méthodes de biochimie et de cryo-microscopie électronique. L’étude du rôle du facteur de NMD UPF3B dans la terminaison de la traduction a mis en évidence une double action de cette protéine ; tout d’abord, un retardement de la reconnaissance du codon stop et également la promotion de la dissociation du ribosome. Ce travail a également permis de mettre en évidence une nouvelle interaction entre UPF3B et la kinase SMG1-8-9 et de montrer comment cette interaction affecte l’état de phosphorylation de UPF1. Les résultats de cette étude montrent une interaction complexe entre les différents facteurs de NMD et la kinase SMG1. / Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) is an important eukaryotic quality control mechanism that recognizes and degrades mRNA containing a premature termination codon (PTC). Up-frameshift proteins constitute the conserved core NMD factors (UPF1, UPF2 and UPF3). They mediate the recognition of a NMD substrate, i.e. a ribosome stalled at a PTC. UPF proteins were shown to associate with eukaryotic release factors (eRF1 and eRF3) and were suggested to impede translation termination. We showed that, at a normal termination codon, Poly(A)-binding protein (PABP) stimulates translation termination by directly interacting with eRF3a. Using a reconstituted in vitro translation system, we studied translation termination in the presence of the factors PABP and UPF1 using biochemistry and single particle electron cryo-microscopy (Cryo-EM). Additionally, we analysed the role of the other NMD factors UPF2 and UPF3B in translation termination in vitro. We discovered a novel role for UPF3B in translation termination. Moreover, we observed a novel interaction between UPF3B and the SMG1-8-9 kinase complex. The presence of UPF3B affects the kinase activity of SMG1 and thus the phosphorylation state of UPF1. Our results highlight a much more complex interplay of the NMD factors with the translation termination machinery and SMG1 kinase than anticipated.

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Le processus aléatoire des recombinaisons V(D)J permet d’obtenir un répertoire d’anticorps (Ac) ou immunoglobulines (Ig) hautement diversifié. En revanche, le caractère imprécis des jonctions V(D)J conduit à l’apparition de décalages du cadre de lecture dans deux tiers des cas. Ainsi, la plupart des cellules B hébergent des allèles d’Ig avec des réarrangements V(D)J non-productifs au sein de leur génome. Plusieurs études incluant celles menées au laboratoire ont montré que ces allèles non-productifs sont transcrits mais subissent une régulation post-transcriptionnelle impliquant le mécanisme de dégradation des ARNm appelé NMD « Nonsense-Mediated mRNA Decay ». Cette surveillance ARN diminue ainsi le taux d’ARNm codant pour des chaînes d’Ig tronquées. En revanche, l’impact de l’épissage alternatif des transcrits d’Ig non-productifs sur la production d’Ig aberrantes reste jusqu’ici peu exploré. L’étude de ce processus appelé NAS (« Nonsense-associated Altered Splicing »), et en particulier du phénomène de saut d’exon, présente un grand intérêt car cet épissage alternatif peut permettre la synthèse d’Ig tronquées présentant des délétions internes. Les projets développés lors de cette thèse ont révélé la toxicité des chaînes d’Ig dépourvues de domaine variable (V) dans les plasmocytes, et mis en évidence l’existence d’un nouveau point de contrôle au cours de la différenciation plasmocytaire. Ce phénomène nommé TIE-checkpoint (Truncated-Ig Exclusion) conduisant à l’élimination des plasmocytes exprimant des Ig tronquées, est la conséquence d’un saut d’exon lors de l’épissage des transcrits Ig non-productifs. Pour étudier les évènements de NAS lors de l’épissage des transcrits d’Ig dans les plasmocytes, il faut par conséquent limiter l’activation du TIE-checkpoint. A l’aide d’un modèle murin présentant un exon non-sens additionnel au locus IgH, nous avons pu analyser in vivo l’épissage alternatif par « saut d’exon » des transcrits d’Ig non-productifs. En effet, l’élimination de cet exon addtionnel aboutit à la synthèse d’une chaîne d’Ig normale et non à la production de chaînes tronquées. Cette étude a été menée dans des cellules B primaires et des plasmocytes. Les résultats obtenus ont révélé que l’hypertranscription des gènes d’Ig, qui accompagne la différenciation plasmocytaire, favorise l’épissage alternatif des transcrits d’Ig non-productifs, par un phénomène de saut d’exon. Nous avons également étudié les éventuelles connexions entre le mécanisme de NMD, impliqué dans la surveillance des ARNm, et l’UPR (« Unfolded Protein Response ») permettant de réguler l’homéostasie protéique dans les plasmocytes. De façon originale, nous avons identifié une boucle de régulation positive entre les processus de surveillance ARN (NMD) et protéique (UPR, autophagie, protéasome). La mise en évidence de cette coopération dans les plasmocytes constitue un exemple unique au vue de la littérature et, aurait pour effet de limiter la synthèse d’Ig tronquées tout en autorisant la synthèse massive d’Ig. Enfin, nous avons étudié le rôle de l’épissage des transcrits d’Ig non-codants (appelés transcrits I « germinaux ») au cours du processus de CSR « Class Switch Recombination ». Cette étude a apporté des précisions sur le rôle des sites donneurs d’épissage des exons I et révélé que la reconnaissance de ces sites d’épissage module l’intensité de la transcription de la région « switch » S adjacente, et par conséquent, son accessibilité à AID « Activation-Inducedcytidine Deaminase » lors de la CSR. / The random V(D)J recombination process contributes to the generation of a vast immunoglobulin (Ig) repertoire. However, imprecise V(D)J junctions lead to the appearance of frameshift mutations in two-third of the cases. Hence, numerous B-lineage cells retain non-productively V(D)J rearranged Ig alleles in their genome. Several studies including ours have shown that these non-productive alleles are transcribed but rapidly degraded by NMD « Nonsense-Mediated mRNA Decay », thus decreasing the level of mRNA encoding truncated Ig. However, less is known about the impact of alternative splicing on non-productive Ig transcripts, and especially « exon skipping », with regard to the production of truncated Ig with internal deletions. During my thesis, we have shown that truncated Ig chains lacking variable (V) domain exhibted toxic effects in plasma cells revealing a new « Truncated-Ig Exclusion » (TIE-) checkpoint during plasma cell differentiation. The TIE-checkpoint eliminates plasma cell-expressing truncated Ig, as a consequence of exon skipping during splicing of non-productive Igκ transcripts. However, the TIE checkpoint activation limits the analysis of NAS (« Nonsense associated Altered Splicing ») of Ig transcripts in plasma cells. Using a mouse model harboring an additional frameshift-inducing V exon at the IgH chain locus, we could analyze NAS of non-productive Ig transcripts in primary B cells and plasma cells. This study revealed that hypertranscription of Ig genes accompanying plasma cell differentiation favors alternative splicing of non-productive Ig transcripts. We also investigated potential connections between the NMD mechanism, involved in mRNA surveillance, and the UPR (« Unfolded Protein Response ») pathway that regulates protein homeostasis in plasma cells. Interestingly, we identified a positive regulatory loop between RNA (NMD) and protein (UPR, autophagy, proteasome) surveillance processes. In view of the literature, the occurrence of such cooperation is unique to plasma cells, and this should help to limit the expression of truncated Ig while allowing massive Ig synthesis. Finally, we studied other aspects of Ig RNA splicing, and investigated the role of splice donor site on non-coding « germline » I transcripts during CSR (« Class Switch Recombination »). Using dedicated mouse models, we found that the deletion of Iƴ1 splice donor site drastically decreased CSR to IgG1. Overall, this study demonstrated that the recognition of I exon donor splice site enhances transcription of « switch » regions S, facilitating their opening and the subsequent recruitment of AID « Activation-Induced cytidine Deaminase » during CSR.

Le processus de recombinaison V(D)J des gènes d’immunoglobulines (Ig) est caractérisé par une grande imprécision des jonctions entre les segments variables (V), de diversité (D) et de jonction (J). Deux fois sur trois, un décalage du cadre de lecture apparaît, aboutissant à une jonction non productive dite « hors phase ». Plusieurs études ont démontré que les deux allèles productifs et non-productifs sont activement transcrits. Les transcrits matures issus des allèles non-productifs sont pris en charge par un mécanisme de surveillance des ARNm appelé NMD « Nonsense-Mediated mRNA Decay ». En dégradant efficacement les ARNm d’Ig contenant des codons non-sens, ce mécanisme prévient l’apparition des Ig tronquées au cours de l’ontogénie B. Néanmoins, aucune étude n’a jusqu’ici analysé l’impact de l’épissage alternatif des transcrits d’Ig non-productifs. Ce phénomène appelé NAS « Nonsense-associated Altered Splicing » peut conduire à une production d’Ig tronquées présentant des délétions internes du domaine variable (V).Les projets développés lors de cette thèse ont montré que la présence d’un codon non-sens, au niveau de l’exon variable (VJ) des transcrits Igκ, favorise le saut d’exon et la production de chaînes légères dépourvues de domaine variable (ΔV-κLCs). De façon intéressante, ces Ig tronquées provoquent un stress cellulaire et conduisent à l’apoptose des plasmocytes (Article 1). Ces observations ont permis d’identifier un nouveau point de contrôle agissant tardivement lors de la différenciation plasmocytaire : le TIE « Truncated-Ig Exclusion » checkpoint. Ce processus de contrôle provoque l’élimination des plasmocytes qui produisent des chaînes d’Ig tronquées. Nous avons également étudié l’épissage alternatif des transcrits d’Ig non-productifs en l’absence de TIE-checkpoint (Article 2). Cette étude a révélé que l’hypertranscription des gènes d’Ig dans les plasmocytes favorise l’épissage alternatif des transcrits d’Ig non-productifs. En utilisant un modèle d’expression forcée d’Ig tronquées, nous avons mis en évidence une coopération entre les mécanismes assurant la surveillance des ARNm (NMD) et la surveillance au niveau protéique (UPR : « Unfolded Protein Response », autophagie) (Article 3). Sur la base de ces résultats, nous avons mis au point une nouvelle approche thérapeutique qui consiste à forcer la production d’Ig tronquées en utilisant des oligonucléotides anti-sens (AON) capables de provoquer l’élimination de l’exon variable lors de l’épissage. Cette invention pourrait ouvrir des perspectives thérapeutiques pertinentes dans le traitement du Myélome Multiple et d’autres pathologies touchant les plasmocytes. / The recombination process V(D)J of immunoglobulin (Ig) genes is characterized by random junctions between the variable (V), diversity (D) and joining (J) segments. A frameshift mutation appears in two-third of cases, generating a non-productive or « out of frame » junction. Several studies have shown that both productive and non-productive alleles are actively transcribed. The mature transcripts from nonproductive alleles are usually considered sterile and innocuous as a result of an mRNA surveillance mechanism called NMD « Nonsense-Mediated mRNA Decay ». By degrading aberrant mRNA, this mechanism prevents the appearance of truncated Ig during B cell ontogeny. However, less is known about the impact of alternative splicing on non-productive Ig transcripts. This mechanism, called NAS « Nonsense-associated Altered Splicing » can lead to the production of truncated Ig with internal deletions of variable domain (V). During my thesis, we have shown that the presence of a stop codon, within the variable exon (VJ) of Igκ transcripts, promotes exon skipping and synthesis of V domain-less κ light chains (ΔV-κLCs). Interestingly, such truncated Ig causes cellular stress and leads to plasma cells apoptosis (Article 1). These findings have identified a new checkpoint acting late during plasma cell differentiation: TIE « Truncated-Ig Exclusion » checkpoint. This process ensures counter-selection of plasma cells producing truncated-Ig. We also studied the alternative splicing of non-productive Ig transcripts in the absence of TIE-checkpoint (Article 2). We found that hypertranscription of Ig genes in plasma cells promote alternative splicing of non-productive Ig transcripts. Using a model forcing the expression of truncated Ig, we identified a cooperative action between mRNA surveillance mechanisms (NMD) and those of protein surveillance (UPR « Unfolded Protein Response », autophagy) (Article 3). Based on these results, we have developed a new therapeutic approach by increasing the production of truncated Ig using antisense oligonucleotides (AON) that leads to the elimination of the variable exon during splicing. This invention could open new avenues for the treatment of Multiple Myeloma patients and other pathologies affecting plasma cells.

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