In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression unterschiedlicher Marker für die Vaskularisation in verschiedenen Modifikationen zur Unterkieferaugmentation mit autologem kortikospongiösen Beckenkammtransplantaten in-vivo am Schafmodell untersucht. Wie schon aus Voruntersuchungen bekannt, zeigte vor allem die Modifikation des Transplantatlagers in der Kombination einer resorbierbaren Bio-Gide® Membran mit dem Knochenersatzmaterial (KEM) Bio-Oss® und einem kortikospongiösen Transplantat die geringsten Resorptionsraten. Dieser Konditionierung wurden verschiedene andere Modikifationen des Transplantatlagers gegenübergestellt und jeweils die Expression der Vaskularisationsmarker untersucht und verglichen. Sowohl die Untersuchungen zur Expression von Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) und seinen Rezeptor-Isoformen VEGF-Rezeptor 1 und VEGF-Rezeptor 2, sowie den NOS-Isoformen eNOS und iNOS zeigen alle eine signifikant vermehrte Expression in der Konditionierung mit Bio-Oss® als KEM und einer resorbierbaren Bio-Gide® Membran. Lediglich die Expression des von-Willebrand-Faktors (vWF) als Marker des Endothels zeigte keine signifikant vermehrte Expression in der mit Bio-Oss® und Bio-Gide® modifizierten Gruppe. Hier wäre die Tatsache, dass der vWF auch als Marker der endothelialen Dysfunktion beschrieben wird und in den klinisch stärker atrophierten Modifikation vermehrt exprimiert wird, eine Erklärungsmöglichkeit. Die Untersuchungen zur Expression der Vaskularisationsmarker hinsichtlich der Regionen im Augmentat zeigen sowohl bei BMP-2 wie auch bei VEGF und seinen Rezeptorisoformen VEGF-R1 und VEGF-R2 eine signifikant vermehrte Expression im Bereich des Transplantates in der Bio-Oss® Modifikation. Diese Ergebnisse stützen den klinischen Aspekt der guten Vaskularisierung des Transplantates und unterstreichen die Bedeutung der Wachstumsfaktoren für die Vaskularisierung im Transplantat. Bei den Färbungen auf NOS findet sich eine signifikant vermehrte Expression im Transplantatlager. Diese Ergebnisse stellen die Bedeutung von NOS für die Regulation der Osteogenese und die direkten Wirkungen auf Osteoblasten und Osteoklasten. Die Tatsache, dass gerade in der Bio-Oss® Modifikation, in der klinisch die geringste Resorption zu beobachten war, signifikant mehr Vaskularisationsmarker exprimiert wurden, ist Nachweis der besseren Vaskularisation dieser Konditionierung und unterstreicht sowohl den Nutzen von KEM wie Bio-Oss® bei Transplantationen autologen Knochens, wie auch die Möglichkeiten der therapeutischen Verwendung einzelner Wachstumsfaktoren wie z. B. BMP-2. / In this study the expression of various markers for vascularization in different modifications of alveolar ridge augmentation procedures on the mandible with autogenous bone grafts from the iliac crest was analyzed with the help of an in-vivo sheep model. As preliminary investigations suggested, especially the modification of the host side as a combination of a resorbable Bio-Gide® membrane according to the concept of Guided Bone Regeneration (GBR) with Bio-Oss® as a bovine bone substitute, showed the least resorption in clinical findings. This modification of the host side was compared with a control group, in which other modifications of the host side were being used and which showed a way higher rate of resorption during the surveillance period and until the euthanasia of the sheep after 16 weeks. The expression of different vascularization markers was compared between these two groups. The data concerning the expression of Bone Morphogenetic Protein-2 (BMP-2), Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) and its receptor-isoforms VEGF-Receptor 1 and VEGF-Receptor 2, as well as the Nitric Oxide Synthase (NOS) isoforms, the endothelial NOS (eNOS) and the inducible NOS (iNOS) all showed a significantly higher expression within the modification of the host side using GBR and Bio-Oss®. Only the expression of the von-Willebrand-Factor (vWF) as a marker of the endothelium showed no significantly higher expression within this modification but a higher expression within the control group. Hypothetically, the fact that vWF is also a marker of endothelial dysfunction could explain the higher expression within the control group. Taking the different regions of the graft in consideration, BMP-2, VEGF, VEGFR-1 and VEGFR-2 all showed a significantly higher expression within the bone graft of the modification using GBR and Bio-Oss®. These results underline the clinical aspect of the good vascularization of the graft within this modification. NOS showed a significantly higher expression in the region of the host side and could explain the importance of NOS for osteogenesis and its effect on osteoblasts and osteoclasts. In summary, the significantly higher expression of vascularization markers and clincally the lowest rate of atrophy and resorption within the modification of the host side using GBR and Bio-Oss®, underlines the better vascularization of this modification and emphasizes the use of GBR and bone substitues during the transplantation of autogenous bone grafts and suggests the therapeutical use of certain growth factors such as BMP-2 within this modification.

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Natural composites, in particular nacre, often combine high strength and toughness thanks to highly ordered architectures and controlled geometries of the reinforcement components. However, combining strength, toughness and resorbability in synthetic materials remains a challenge in particular in the field of bone graft substitutes. In the present study, calcium phosphate-(CaP-)based materials with designed architectures inspired from natural composite materials were achieved. CaP platelets obtained by precipitation in organic medium were first aligned in chitosan matrices by solvent casting in ambient conditions. Efficient strengthening was obtained with 15 vol-% ceramic, reaching cortical bone strength (150 MPa) and preserving good ductility (5 % deformation). In a weak magnetic field, high spatial arrangement without percolation was maintained up to 20 vol-%. With directional freezing, good alignment of the platelets could be pushed up to 50 vol-%. In parallel, in situ recrystallization of CaP blocks in hydrothermal conditions led to hierarchical structures. The strength and the work-of-fracture were enhanced (300%) thanks to a change of failure mode.

Für die Behandlung von Knochendefekten überkritischer Größe stehen seit einigen Jahren zahlreiche resorbierbare Materialien zur Verfügung, die eine Defektheilung bis hin zur vollständigen knöchernen Regeneration erlauben. Im Fall systemischer Knochenerkrankungen, insbesondere im osteoporotischen Knochen, ist jedoch die Selbstheilungskapazität des Gewebes stark eingeschränkt, was neben der Defektbehandlung eine knochenanabole sowie resorptionshemmende Therapie erfordert. Diese kann beispielsweise durch die Gabe von Strontium-haltigen Präparaten erreicht werden, da der duale Wirkmechanismus der Strontium-Ionen zu vermehrter Knochenneubildung bei gleichzeitig verminderter Knochenresorption führt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Strontium-haltigen Knochenzements, welcher eine Freisetzung von Strontium-Ionen spezifisch im jeweiligen Knochendefekt und somit eine lokale Stimulation der Knochenneubildung ermöglicht. Basierend auf einem etablierten Calciumphosphat-Knochenzement wurden Strontium-haltige Zementvarianten hergestellt und ausgiebig charakterisiert. Im Gegensatz zu den meisten bislang verfolgten Methoden konnten Zemente mit deutlich verbesserten mechanischen Eigenschaften hergestellt werden, welche weiterhin Strontium-Ionen in physiologisch relevanten Konzentrationen freisetzen. Durch Zellkulturuntersuchungen an humanen Zellen sowohl der osteoblastären- als auch osteoklastären Linie konnte eine Stimulation der für den Knochenaufbau verantwortlichen Zellen sowie eine Hemmung der den Knochen resorbierenden Zellen durch die entwickelten Zemente nachgewiesen werden.

Für die Behandlung von Knochendefekten überkritischer Größe stehen seit einigen Jahren zahlreiche resorbierbare Materialien zur Verfügung, die eine Defektheilung bis hin zur vollständigen knöchernen Regeneration erlauben. Im Fall systemischer Knochenerkrankungen, insbesondere im osteoporotischen Knochen, ist jedoch die Selbstheilungskapazität des Gewebes stark eingeschränkt, was neben der Defektbehandlung eine knochenanabole sowie resorptionshemmende Therapie erfordert. Diese kann beispielsweise durch die Gabe von Strontium-haltigen Präparaten erreicht werden, da der duale Wirkmechanismus der Strontium-Ionen zu vermehrter Knochenneubildung bei gleichzeitig verminderter Knochenresorption führt. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Strontium-haltigen Knochenzements, welcher eine Freisetzung von Strontium-Ionen spezifisch im jeweiligen Knochendefekt und somit eine lokale Stimulation der Knochenneubildung ermöglicht. Basierend auf einem etablierten Calciumphosphat-Knochenzement wurden Strontium-haltige Zementvarianten hergestellt und ausgiebig charakterisiert. Im Gegensatz zu den meisten bislang verfolgten Methoden konnten Zemente mit deutlich verbesserten mechanischen Eigenschaften hergestellt werden, welche weiterhin Strontium-Ionen in physiologisch relevanten Konzentrationen freisetzen. Durch Zellkulturuntersuchungen an humanen Zellen sowohl der osteoblastären- als auch osteoklastären Linie konnte eine Stimulation der für den Knochenaufbau verantwortlichen Zellen sowie eine Hemmung der den Knochen resorbierenden Zellen durch die entwickelten Zemente nachgewiesen werden.

Natural composites, in particular nacre, often combine high strength and toughness thanks to highly ordered architectures and controlled geometries of the reinforcement components. However, combining strength, toughness and resorbability in synthetic materials remains a challenge in particular in the field of bone graft substitutes. In the present study, calcium phosphate-(CaP-)based materials with designed architectures inspired from natural composite materials were achieved. CaP platelets obtained by precipitation in organic medium were first aligned in chitosan matrices by solvent casting in ambient conditions. Efficient strengthening was obtained with 15 vol-% ceramic, reaching cortical bone strength (150 MPa) and preserving good ductility (5 % deformation). In a weak magnetic field, high spatial arrangement without percolation was maintained up to 20 vol-%. With directional freezing, good alignment of the platelets could be pushed up to 50 vol-%. In parallel, in situ recrystallization of CaP blocks in hydrothermal conditions led to hierarchical structures. The strength and the work-of-fracture were enhanced (300%) thanks to a change of failure mode.:Acknowledgements v Summary vii Background vii Thesis outline viii Part I: “Brick-and-mortar” structures with discrete reinforcement components ix Part II: “Textured” structures with continuous reinforcement components x Zusammenfassung xi Hintergrund xi Doktorarbeit Gliederung xii Teil I: “Ziegelmauer-Architektur” mit diskreten Verstärkungskomponenten xiii Teil II: “ Texturierte” Strukturen mit kontinuierlichen Verstärkungskomponenten xiv Chapter 1: General introduction 1 Bone grafting 1 CaP ceramics 1 How to improve toughness of CaP ceramics? 2 Importance of structure design: bio-inspiration 2 What mechanical properties should be reached? 5 Specific aims 5 Two general approaches to reach the goal 6 Nacre-inspired “brick-and mortar” structures (Part I) 6 Textured ceramic monoliths (Part II) 6 References 7 Chapter 2: Theoretical calculations 11 Introduction 12 Theoretical tensile strength of β-TCP platelets and critical size for flaw tolerance 13 Optimal aspect ratio 15 Composite strength and stiffness 17 Limitations 19 References 19 PART I: NACRE-INSPIRED “BRICK-AND-MORTAR” STRUCTURES Chapter 3: Synthesis of sub-micrometer calcium phosphate platelets 23 Introduction 24 ii Materials and Methods 25 Precipitation method 25 Reaction parameters 25 Characterization 26 Statistical analysis of results 28 Results 28 Reproducibility of standard experiments 28 Increase of the reagent volume to increase the productivity 30 Increase of the precursors concentration to increase the productivity and modify the particles 30 Increase of titration rate to simplify the process 32 Influence of temperature on the particles 35 Effect of the pH value on the particles 37 Effect of a longer reaction time on the particle stability 40 Study of the influence of variations of the Ca/P molar ratio 42 Discussion 43 Reproducibility 43 Productivity 44 CaP crystal shape 45 Crystal purity 47 Aspect ratio 48 Critical thickness 49 Uniformity of primary particles 50 Non agglomerated 51 General points 52 Conclusions 52 References 53 Chapter 4: Kinetics study of the calcium phosphate platelets growth 57 Introduction 58 Theory 58 Materials and methods 60 Materials and sample preparation 60 Characterization methods 61 Results 62 Visual observations during manipulations 62 SEM observations 62 XRD results 66 Size measurements 68 Kinetics calculations 70 Discussion 74 Nucleation and assembly mechanism 74 Reaction kinetics 76 Control of size and aspect ratio 76 Conclusions 77 References 78 Chapter 5: Structural design of bio-inspired composites by solvent casting 81 Foreword 82 Introduction 82 Experimental section 84 iii Synthesis of resorbable ceramic platelets 84 Solvent casting to prove the reinforcement efficiency of DCP platelets 84 Magnetization of the platelets 85 Maintaining the orientation during drying of an hydrogel matrix 86 Results 87 Synthesis of resorbable ceramic platelets 87 Solvent casting to prove the reinforcement efficiency of CaP platelets 87 Magnetization of the platelets 91 Maintaining the orientation during drying of an hydrogel matrix 93 Discussion 95 Detrimental effect of β-TCP platelets in chitosan 95 Efficient reinforcement with DCP platelets up to a given volume fraction 96 Threshold value for strength improvement 97 Fitting the experimental results with theoretical equations 98 Conclusions 101 References 101 Chapter 6: Biodegradable, strong and tough nacre-inspired structures obtained by freezecasting 105 Introduction 106 Experimental section 108 Synthesis of resorbable ceramic platelets 108 Preliminary freeze-casting tests with β-TCP-based slurries 108 Determination of adequate freeze-casting parameters for hydrogels-CaP slurries 108 Integration of CaP platelets and local planar alignment 109 Attempts to globally align porosity in two directions 109 Densification and consolidation 110 Tensile testing 110 Results 111 Preliminary freeze-casting tests with β-TCP-based slurries 111 Determination of adequate freeze-casting parameters for hydrogels-CaP slurries 112 Integration of CaP platelets and local planar alignment 113 Attempts to globally align porosity in two directions 119 Densification and consolidation 121 Tensile testing 121 Discussion 122 Conclusions 124 References 125 PART II: TEXTURED CERAMIC MONOLITHS Chapter 7: Micro-texturing by recrystallization of calcium phosphate blocks in hydrothermal conditions 127 Introduction 128 Materials and Methods 130 Samples characterization 132 Results 133 Macroscopic observations 133 Microstructural changes (SEM) 133 Crystalline phase conversion (XRD) 139 iv Mechanical properties 142 Fractured surfaces 142 Discussion 145 Conclusions 150 References 150 Chapter 8: Toughening of textured calcium phosphate blocks by polymer impregnation 155 Foreword 156 Introduction 156 Materials and Methods 157 Samples preparation 157 Characterization 158 Results 158 Porosity and microstructure 158 Composition 161 Mechanical properties 161 Discussion 162 Conclusions 164 References 164 Chapter 9: Synthesis and outlook 167 Curriculum Vitae 171

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Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der kontinuumsmechanischen Formulierung des Aushärteverhaltens polymerer Werkstoffe sowie der Implementierung und Simulation von Aushärtestoffgesetzen im Rahmen der Finite-Elemente-Methode. Auf Basis eines allgemeinen Modellierungsrahmens wird ein konkretisiertes Stoffgesetz für die Nachbildung von Aushärteprozessen eines acrylischen Knochenzements entwickelt. Darüber hinaus werden verschiedene Finite-Elemente-Simulationen zum klinischen Verfahren der Vertebroplastie präsentiert. / This work deals with the continuum mechanical formulation of curing phenomena in polymers as well as the implementation and simulation of curing models within the finite element method. Based on a general modelling framework, a specified material model for the simulation of curing processes in an acrylic bone cement is developed. Moreover, different finite element simulations regarding the clinical procedure of vertebroplasty are presented.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der kontinuumsmechanischen Formulierung des Aushärteverhaltens polymerer Werkstoffe sowie der Implementierung und Simulation von Aushärtestoffgesetzen im Rahmen der Finite-Elemente-Methode. Auf Basis eines allgemeinen Modellierungsrahmens wird ein konkretisiertes Stoffgesetz für die Nachbildung von Aushärteprozessen eines acrylischen Knochenzements entwickelt. Darüber hinaus werden verschiedene Finite-Elemente-Simulationen zum klinischen Verfahren der Vertebroplastie präsentiert. / This work deals with the continuum mechanical formulation of curing phenomena in polymers as well as the implementation and simulation of curing models within the finite element method. Based on a general modelling framework, a specified material model for the simulation of curing processes in an acrylic bone cement is developed. Moreover, different finite element simulations regarding the clinical procedure of vertebroplasty are presented.