Das koinhibitorische Molekül B7-H1 beeinflusst adaptive Immunantworten und ist vermutlich an den Mechanismen zur Aufrechterhaltung peripherer Toleranz und der Limitierung inflammatorischen Schadens beteiligt. Zusätzlich kommt DZ eine entscheidende Bedeutung in der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Regulation ZNS-spezifischer Autoimmunität und Inflammationsprozessen zu. Um den B7-H1/PD-1-Signalweg eingehender zu untersuchen, wurden adaptive Immunantworten und die Zielorgan-spezifische Infiltration im Modell der MOG35-55-induzierten EAE analysiert, einem Tiermodell der MS, das durch neurologische Schädigungen und progressive Paralyse bedingt durch die inflammatorische Demyelinisierung im ZNS charakterisiert ist. Im Vergleich zu Wildtyptieren zeigten B7-H1-/- Mäuse einen beschleunigten Krankheitsbeginn und eine signifikante Steigerung des Schweregrads der EAE. Periphere MOG35-55-spezifische IFNg-/IL-17-Immunzellantworten traten in B7-H1-/- Mäusen verfrüht und verstärkt auf, klangen allerdings auch schneller ab. Im ZNS persistierte jedoch eine signifikant höhere Anzahl aktivierter, Neuroantigen-spezifischer T-Zellen während allen Phasen der EAE, wobei diese Zellen ebenfalls größere Mengen proinflammatorischer Zytokine sezernieren konnten. Experimente mit APZ-assoziiertem B7-H1, die einen direkten inhibitorischen Effekt auf die Aktivierung und Proliferation MOG35-55-spezifischer Effektorzellen zeigten, unterstützen die Hypothese, dass parenchymale Expression von B7-H1 ausschlaggebend für das Schicksal von T-Zellen im Zielorgan ist. B7-H1 stellt damit ein Schlüsselmolekül für die Kontrolle parenchymaler Immunreaktionen dar. Nachdem die Relevanz von B7-H1 auf APZ in vitro bewiesen werden konnte, wurde der Einfluss von B7-H1 auf systemisch oder intrazerebral injizierten DZ mit immunogenem oder tolerogenem Phänotyp untersucht. Intravenöse Applikation von tolerogenen B7-H1-/- DZ resultierte in einer besseren Protektion gegen EAE, und dieser Effekt war von einer gesteigerten Produktion Tr1-/Th2-typischer Zytokine sowie einer verstärkten Sekretion von IL-4 und IL-13 durch CD1d-restringierte T-Zellen in der Peripherie begleitet. Die Anzahl Neuroantigen-spezifischer T-Zellen, die proinflammatorische Zytokine sezernierten, war dementsprechend sowohl in der Peripherie als auch im ZNS reduziert. In diesem Zusammenhang konnte für B7-H1 eine wesentliche Beteiligung an der Inhibition der Aktivierung antigen-spezifischer, regulatorischer T-Zellen und CD1d-restringierter T-Zellen gefunden werden. Bei der Injektion intrazerebraler DZ bewirkten tolerogene DZ im Vergleich zu immunogenen DZ eine Reduktion der ZNS-Infiltration mit CD4+ T-Zellen in der frühen Phase der Erkrankung. Außerdem konnte eine Veränderung des intrazerebralen Zytokinmilieus von IFNg/IL-17 exprimierenden enzephalitogenen T-Zellen zu IL-10+ regulatorischen T-Zellen gezeigt werden. B7-H1-Defizienz auf APZ verstärkte diesen Effekt und führte dadurch in den Mäusen zur partiellen Protektion gegen klinische Symptome der EAE. Zusätzlich wurde die Beteiligung von B7-H1 an der Rekrutierung und ZNS-lokalisierten Induktion der Proliferation CD8+ regulatorischer T-Zellen durch DZ beschrieben. Unabhängig vom Phänotyp der DZ wurde eine bereits in der frühen Phase vorhandene und dauerhaft expandierende Population von CD8+ T-Zellen im ZNS DZ[B7-H1-/-]-injizierter Mäuse gefunden. Diese Zellen konnten in vitro die Proliferation MOG35-55-spezifischer CD4+ T-Zellen supprimieren und wirkten so mutmaßlich an der Abmilderung der EAE mit. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit die entscheidende Bedeutung von B7 H1 auf DZ als immuninhibitorisches Molekül, das sowohl enzephalitogene als auch regulatorische T-Zell-Antworten moduliert und damit zur Limitation von Immunantworten beiträgt. / The coinhibitory B7-H1 molecule influences adaptive immune responses and has been proposed to contribute to the mechanisms maintaining peripheral tolerance and limiting inflammatory damage in parenchymal organs. Additionally, DC emerge as crucial immune cell population during development, maintenance and regulation of CNS-specific autoimmunity and inflammation. To further explore the B7-H1/PD1 pathway in CNS autoimmune inflammation, adaptive immune responses and target organ infiltration were analysed in MOG35-55-induced EAE, an animal model of MS characterized by neurological impairment and progressive paralysis resulting from inflammatory demyelination in the CNS. In comparison to wildtype mice B7 H1-/- mice exhibited an accelerated disease onset and significantly exacerbated EAE severity. Peripheral MOG35-55-specific IFNg/IL-17 T cell responses occurred earlier and enhanced in B7-H1-/- mice, but ceased more rapidly. In the CNS, however, significantly higher numbers of activated neuroantigen-specific T cells persisted during all stages of EAE and were able to secrete higher amounts of proinflammatory cytokines. Experiments showing a direct inhibitory role of APC-derived B7-H1 on the activation and proliferation of MOG35-55-specific effector cells support the assumption that parenchymal B7 H1 is pivotal for delineating T cell fate in the target organ. Therefore, B7-H1 represents a key molecule in the control of parenchymal immune reactions. Having shown the critical relevance of B7-H1 on APC in vitro, the influence of B7-H1 expression on systemically or intracerebrally injected DC displaying an immunogenic or tolerogenic phenotype was investigated. Intravenous application of tolerogenic B7-H1-/- DC resulted in a more efficient protection from EAE, accompanied by an increased peripheral production of Tr1/Th2 cytokines and a pronounced secretion of IL-4 and IL-13 by CD1d-restricted T cells. In accordance, numbers of neuroantigen-specific T cells secreting proinflammatory cytokines were reduced both in the periphery and in the CNS. Here, a substantial contribution of B7-H1 to inhibition of activation of antigen-specific, regulatory T cells and CD1d-restricted T cells could be found. Using intracerebral DC injections, a reduction of early CNS CD4+ T cell infiltration was shown for tolerogenic DC compared to immunogenic DC. Furthermore, alteration of the intracerebral cytokine milieu containing IFNg+/IL-17+ encephalitogenic T cells to IL 10+ regulatory T cells was demonstrated. B7-H1 deficiency on DC enhanced this effect, thereby mediating partial protection of mice from clinical signs of EAE. Additionally, involvement of B7-H1 expression on the ability of DC to recruit and induce proliferation of CD8 regulatory T cells locally in the CNS was described. Regardless of DC phenotype, an early and consistently expanding population of CD8+ T cells was observed in the CNS of DC[B7-H1-/-]-injected mice, which was able to suppress proliferation of MOG35-55-specific CD4+ T cells in vitro and thus probably contributes to EAE amelioration in vivo. Taken together, the findings of this study demonstrate the critical importance of DC-derived B7-H1 as an immune-inhibitory molecule capable of modulating both encephalitogenic and regulatory T cell responses thus contributing to the confinement of immune responses.

Durch die im Labor der AG Topp standardisierte Verfahren konnten im Rahmen dieser Arbeit stabile T Zell Linien aus primär humanen CMV spezifischen T Zellen und CMV spezifischen T Zellen mit chimärischen Rezeptoren hergestellt werden. Die Anzahl der chimärischen Rezeptoren auf den unterschiedlichen T Zellinien ist nicht signifikant unterschiedlich und beträgt ca. 17000 Rezeptoren pro Zelle. Bei der Überprüfung des Lyseverhaltens CMV spezifischer T Zellen gegenüber CMV spezifischer T Zellen transduziert mit einem chimärischen Rezeptor zeigt sich das gleiche Lyseverhalten. Um die zeitliche Dynamik dieses Verhaltens besser darzustellen, wurde ein FACS basierter Lysierungsversuch selbstständig entwickelt und etabliert. Somit konnte herausgestellt werden, dass das Lyseverhalten der T Zelllinien sowohl der CMV spezifischen T Zellen als auch das der Erst- und Zweitgeneration- T Zelllinien CAR CD19z und CAR CD19/28z vergleichbar war. Alle genannten Zelllinien lysieren ihre Targetzellen sowohl in der Quantität als auch in der zeitlichen Dynamik vergleichbar. Dies ist die einzige Gemeinsamkeit der verglichenen T Zell Aktivierungssysteme. In allen anderen funktionellen Versuchen ist die Aktivierung der T Zellen über einen chimärischen Rezeptor dem der physiologischen Aktivierung über den T Zell Rezeptor unterlegen. Der Proliferationsversuch mit CFSE zeigt eindeutig, dass nur die T Zellen, die über den TCR aktiviert werden, das Potential haben, sich zu teilen. Die T Zellen, die über den CAR sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, teilen sich nicht. Der Defekt der CAR T Zellen zeigt sich auch in der Hochregulation von CD25, einem Aktivierungsmarker für T Zellen. Die T Zellen, die durch die chimärischen Rezeptoren sowohl der ersten als auch der zweiten Generation aktiviert werden, regulieren CD25 nicht so stark nach oben wie die T Zellen, die physiologisch durch den TCR aktiviert werden. Diese Minderaktivierung spiegelt sich auch in der Zytokinproduktion wieder. Auch hier zeigt sich die unvollständige Aktivierung der CAR T Zellen. In der intrazellulären Zytokinmessung sieht man, dass bei CAR T Zellen der ersten und zweiten Generation zum einen die Einzelzellen weniger IFNy produzieren, zum anderen die Gesamtzahl der Zellen, die Zytokine produzieren, weniger ist als im Vergleich zur TCR Aktivierung. Dieses Phänomen der defizienten Aktivierung und der funktionellen Defekte von CAR T Zellen ist bekannt. Dies konnte noch einmal unter standardisierten und kontrollierten Bedingungen bestätigt werden. Durch die relativ neue Methode der durchflusszytometrischen Bead Technologie konnte dies nun zum ersten Mal realisiert werden. Es zeigte sich, dass ein signifikanter Unterschied zwischen den verschiedenen Aktivierungsmodi der T Zellen besteht. Eine physiologische Aktivierung von T Zellen führt zu einer höheren Maximum-Phosphorylierung als eine Aktivierung über den Erstgeneration CAR. Der signifikante Unterschied zeigt sich bei den MAP Kinasen ERK, JNK und p38. Somit ist dies ein Hinweis, dass die Signaltransduktion auf breiter Ebene aufgrund des alleinigen Vorhandenseins der Zeta Kette bei den CAR CD19z T Zellen, defizient ist und nicht ausreicht für eine volle Aktivierung, die eine volle Funktionalität der T Zelle nach sich ziehen würde. Diese unzureichende Aktivierung soll durch die kostimulatorische Komponente CD28 beim Zweitgenerationrezeptor CAR CD19/28z aufgehoben werden. In der Proliferation, Zytokineproduktion und den Aktivierungsmarkern zeigt sich keine Verbesserung im Vergleich zum Erstgenerationrezeptor bei CMV spezifischen T Zellen. Dieses Ergebnis wird bestätigt und korreliert damit, dass es keinen Unterschied in der maximalen Phosphorylierung von ERK, JNK und p38 zwischen Erstgeneration CAR CD19z und Zweitgeneration CAR CD19/28z gibt. Somit ist dieses System geeignet, um aus dem Phosphorylierungsstatus von MAP Kinasen von CAR T Zellen auf die Funktionalität dieser T Zellen zu schließen. / Activation dependent phosphorylation of MAP kinases in t cells. These t cells were activated through a chimeric antigen recepptor system of the first and second generation. In CMV specific t cells are no differences in the strength of phosphorylation between first and second generation receptors.

Myelin-assoziierte Epitope können Ziel destruktiver T-Zell Antworten während autoimmuner Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose oder der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis werden. Dagegen reagieren selbstspezifische T-Zellen nach axonaler Degeneration nicht mit destruktiver Autoimmunität, obwohl die entsprechenden Epitope durch Myelin-phagozytierende Mikroglia präsentiert werden. Im Modell der entorhinalen Kortexläsion von Ratte und Mause zeigten wir, daß Autoimmunität nach solchen Läsionen durch die Expression des Todesliganden CD95L (FasL, Apo1L) auf Astrozyten verhindert wird, da hochaktivierte T-Zellen durch CD95L apoptotisch eliminiert werden. Myelin-phagozytierende Mikroglia reguliert MHC-II und B7-2 hoch, nicht aber das kostimulatorische B7-1 Moleküle, das mit Autoimmunität im Gehirn assoziiert ist. In Zonen retrograder Degeneration, wo Axone am Sproutingprozess beteiligt sind, zeigen Mikrogliazellen bis mindestens 90 Tage nach Läsion einen MHC-II und B7-2 positiven Immunphänotyp. Trotz Anwesenheit von CD4/B7-2 positiven a/b T-Zellen, behält Mikroglia ihre ramifizierte, ruhende Morphologie. Im Gegensatz zu autoimmunen Erkrankungen im Gehirn, erfolgt die Antigenpräsentation nach axonaler Läsion durch Mikroglia also nicht über das B7-1 Molekül. Dies kann der Grund für das Ausbleiben destruktiver Autoimmunität nach axonaler Schädigung sein. / Myelin-associated epitopes are targets of destructive T cell responses during autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). On the other hand, autoimmune T cells do not respond in a destructive way to mechanically-induced axonal degeneration despite myelin phagocytosis and presentation by local microglia. Using entorhinal cortex lesion, a model of axonal degeneration and reactive sprouting, we showed that autoimmunity in the brain is prevented by the expression of the death Ligand CD95L expressed on astrocytes lading to apoptosis of highly activated T cells. Moreover, myelin phagocytosing microglia upregulate MHC-II and B7-2, but lack expression of B7-1, a costimulatory molecule related to destructive immunity. In zones of retrograde axonal degeneration, where axons undergo secondary damage and later contribute to the sprouting response, MHC-II/B7-2 positive microglia are still found at 90 days post lesion. These cells exhibit the ramified morphology of resting microglia in the presence of CD4/B7-2 positive a/b T cells. Thus, in contrast to autoimmune brain disease, axonal degeneration is lacking a signal to induce B7-1 on microglial cells and the recruited T cells do not induce microglial activation. Differences in B7-phenotype of local antigen-presenting cells might provide an explanation for the important finding that autoimmune T cells elicit protective rather than destructive effects following axonal degeneration in the CNS.

Interaktionen zwischen Zellen sowie deren Aktivierung werden im Immunsystem durch verschiedene Zelloberflächenmoleküle reguliert. Inhalt dieser Arbeit war die Untersuchung des kürzlich identifizierten Rezeptor-Ligand-Paares BTLA und HVEM. Zunächst wurden diverse BTLA-spezifische monoklonale Antikörper generiert, mit deren Hilfe erstmals die Lokalisation BTLA-tragender Zellen im Gewebe gezeigt werden konnte. Bei umfassenden Expressionsanalysen fiel auf, dass BTLA auf nahezu allen Leukozytenpopulationen der lymphatischen Organe konstitutiv vorhanden ist, und mit seinem Liganden HVEM koexprimiert wird. Beide Moleküle werden auf verschiedenen Zellpopulationen differenziell exprimiert und aktivierungsabhängig reguliert. Funktionelle Analysen in vitro als auch in vivo ergaben, dass die BTLA-HVEM-Interaktion durch Suppression der T-Zellaktivierung und –proliferation wesentlich zur negativen Regulation der Immunantort beiträgt. Die negative Wirkung von BTLA zeigte sich sowohl bei der Initiation als auch bei bereits fortgeschrittener Aktivierung, unabhängig von der Beteiligung positiver kostimulatorischer Signalwege. Durch Stimulation von T Zellen mit unterschiedlicher BTLA-Oberflächenexpression (verschiedene Subpopulationen oder aus transgenen Mäusen) konnte die strikte Korrelation der negativen Funktion mit der BTLA-Menge auf den Zellen gezeigt werden. Es stellte sich heraus, dass BTLA essentiell für die HVEM-vermittelte Suppression ist und eine wesentliche Beteiligung weiterer HVEM-Interaktionspartner (z.B. CD160) nicht vorliegt. Die Beobachtung von veränderten Lymphozytenpopulationen in BTLA-transgenen Mäusen im Ruhezustand weist zudem auf einen zentralen Beitrag des negativen BTLA-Signals zur Aufrechterhaltung der Homöostase hin. Die ubiquitäre Expression von HVEM und BTLA in Kombination mit der gegenseitigen Modulation beider Interaktionspartner ermöglicht eine flexible Reaktion des Immunsystems auf äußere Einflüsse unter anderem über die negative Regulation durch BTLA / Activation of immune cells is regulated by various cell surface molecules during cell-cell interactions. The aim of this work was the characterization of the recently identified receptor-ligand-pair BTLA and HVEM. Initially, several BTLA-specific monoclonal antibodies were generated. With these antibodies, the localization of BTLA expressing cells in the tissues has been determined for the first time. Further detailed flow cytometric analysis revealed a strong constitutive expression of BTLA on nearly all leukocytes in lymphoid organs. Interestingly, all BTLA-expressing cells co-expressed its ligand HVEM. However, both molecules were differentially expressed on different cell populations in the steady state, but were also regulated in an activation-dependent way. Functional analyses in vitro and in vivo (in an antigen-specific adoptive transfer system) revealed a substantial contribution of the BTLA-HVEM interaction for negative regulation of immune responses by suppressing T cell activation and proliferation. Inhibitory signals of BTLA affect the initial and ongoing activation, irrespective of simultaneous positive signals from other co¬stimulatory pathways. Using wildtype and BTLA-transgenic primary T cells, a strictly linear relationship between the inhibitory function of BTLA and its cell surface levels was observed. The data clearly demonstrate that BTLA expression determined the strength of HVEM-mediated suppression, but also that BTLA is essential for this negative co-stimulation, whereas other HVEM-interaction partners were apparently not involved. Finally, the observed changes in lymphoid cell populations of the BTLA-transgenic mice even in the resting state indicate a prominent role for negative BTLA signals to maintain homeostasis. The ubiquitous expression of HVEM and BTLA together with the reciprocal modulation of both interaction partners supports flexible reaction and regulation of the immune system particularly via the inhibitory function of BTLA.

Bei der adaptiven Immunantwort wird ein breites Repertoire an Effektor-T-Zellen gebildet, das sich durch spezifische und vielfältige funktionelle Fähigkeiten auszeichnet. Neben der Aktivierung der Immunantwort werden Mechanismen benötigt, die Immunantworten regulieren und abschalten können, um unerwünschte Immunreaktion zu verhindern. Die Arbeit befasst sich mit der Rolle von CD152 (CTLA-4), einem Homolog zu CD28, bei der Begrenzung von T-Zellantworten. Die Inhibition der Proliferationsbegrenzung der T-Zellen durch CD152 war ursprünglich auf eine späte Abschaltung der T-Zellproliferation zurückgeführt worden. Wir konnten zeigen, dass CD152 bereits die T-Zellaktivierung abschalten kann und somit die Aktivierungsschwelle der T-Zelle heraufsetzt. Wir konnten auch zeigen, dass CD152 die frühe T-Zellproliferation auf zwei Ebenen inhibiert: Durch die Transkriptionsinitiierung des autologen, Proliferation-induzierenden Zytokins IL-2 und durch die Expression von G1-Kinasen, die für das voranschreiten des Zellzyklus unerläßlich sind. Bisher war es nicht möglich, individuelle, CD152-oberflächen-exprimierende T-Zellen zu detektieren. Um die Expression von CD152 auf der Oberfläche von T-Zellen zu analysieren, haben wir eine sensitive Färbemethode für Oberflächen-exprimiertes CD152 etabliert. Wir konnten damit zeigen, dass während einer antigen-spezifischen Stimulation Zellmembran-gebundenes CD152 lediglich auf einer Subpopulation von aktivierten Zellen (CD152+ T-Zellen) exprimiert wird. Isolierte, aktivierte CD152+ T-Zellen waren im Gegensatz zu aktivierten CD152- T-Zellen bei Restimulation in ihrer Proliferation inhibiert. Dies zeigt auch, dass CD152 in der Lage ist, bereits aktivierte T-Zellen zu inhibieren. Die heterogene Expression von CD152 auf der Oberfläche lässt vermuten, dass die CD152 exprimierenden Zellen, wenn sie ein CD152-Signal bekommen, eine andere Zelldifferenzierung einschlagen als Zellen ohne CD152. Wiederholte oder chronische Aktivierung von Th-Zellen führt zu einer Form von Apoptose, dem Aktivierungs-induzierter Zelltod, gegen den Th2-Zellen resistent sind. Aktivierte Th2-Zellen exprimieren, im Gegensatz zu Th1-Zellen, häufiger CD152 auf ihrer Oberfläche. Wir konnten zeigen, dass CD152-Kreuzvernetzung von aktivierten T-Zellen direkt Resistenz gegen Apoptose vermittelt. Dies geschieht, indem ein Signaltransduktionsmolekül, die PI3´Kinase, aktiviert wird. Dies führt zur Inaktivierung von Apoptose-unterstützenden Molekülen (Phosphorylierung von FKHRL1 und Herunterregulation von FasL) und zur Induktion des Apoptose-verhindernden Moleküls Bcl-2. Vermeidung von Apoptose ist eine zentrale Voraussetzung zur Induktion von Gedächtniszellen. CD152 exprimierende Zellen wären somit gute Kandidaten, um zu Gedächtniszellen zu differenzieren. Um die Rolle von CD152 bei der späten T-Zelldifferenzierung in vivo untersuchen zu können, wurde das CD152 Gen konditionell in der Maus mutagenisiert. / During adaptive immune responses a broad repertoire of effector T-cells is generated, characterized by diverse functional capabilities. Besides activation of the immune response other mechanisms are needed in order to regulate and terminate responses, thus preventing unwanted immune reactions. Here I focus on the role of CD152 (CTLA-4), a homologue of CD28, in the limitation of T-cell responses. Inhibition of T-cell-proliferation by CD152 was originally attributed to a late regulation of the T-cell proliferation. We now show that CD152 is already able to prevent the activation of T-cells and to set the threshold for their activation. We also show that CD152 inhibits T-cell activation in two ways: It inhibits the induction of the growth-factor IL-2 and it inhibits the expression of G1-kinases mandatory for the progression of the cell cycle. Until now, it has not been possible to detect individual T-cells expressing CD152 at their surface. To analyze the expression of CD152 at the surface of individual cells, we developed a sensitive staining method. Using this technique we could show that antigen-specific stimulation of T-cells leads to the expression of surface-bound CD152 only on a fraction of the activated T-cells. Isolated, activated CD152+ T-cells were inhibited in their proliferation whereas CD152- T cells were not. This also shows that CD152 is indeed able to inhibit already activated T-cells. The heterogenous expression of CD152 at the cell surface of already activated T-cells also suggests that CD152+ T-cells will differentiate differently compared to CD152-T-cells. Repeated or chronic activation of Th-cells leads to one form of apoptosis, activation-induced cell death (AICD), against which Th2-cells are resistant. Activated Th2-cells express surface CD152 at higher frequencies than Th1-cells. We show here, that CD152-crosslinking of activated T-cells directly induces resistance against AICD by a mechanism requiring PI3´kinase. This leads to the inactivation of pro-apoptotic molecules (phosphorylation of FKHRL1 and downregulation of FasL). It also leads to the induction of the survival molecule Bcl-2. Prevention of apoptosis is a central prerequisite for the generation of memory cells. Therefore, surface CD152+ T-cells might be good candidates to differentiate into memory cells. To investigate the role of CD152 during the differentiation of T-cells in vivo, the CD152 gene was conditional mutagenese of the CD152 gene was generated.

Die adaptive Immunantwort wird von T-und B-Lymphozyten realisiert. Nachdem der Antigenrezeptor auf T-Zellen durch die Interaktion mit einem MHC-Peptid Komplex auf APZ getriggert wurde, sind kostimulatorische Moleküle ein zweiter Kontrollpunkt für die Immunantworten interagierender Zellen. Für das Abschalten von ungewollten Immunantworten, z.B. Autoimmunantworten, sind Moleküle der kostimulatorischen Molekülfamilien auf den T- und B-Zellen von außerordentlicher Bedeutung. Ein zentrales kostimulatorisches Molekül ist das Molekül CTLA-4. Wir untersuchten den Einfluss von regulatorischen Zellen auf den Verlauf einer EAE, die durch einen Wechsel von Remission und Rezidiv gekennzeichnet ist. Neben den CD4+CD25+Foxp3+CTLA-4+ T-Zellen konnten wir ebenfalls CD4+CD25-Foxp3+CTLA-4+ T-Zellen in den das Gehirn infiltrierenden Lymphozyten sichtbar machen. Wir fanden gleiche Zahlen an CD4+CD25+ Zellen, die auch intrazellulär CTLA-4 exprimierten, während der akuten Phase und ersten Remission, wobei aber Oberflächen CTLA-4+CD4+ Zellen während der akuten Phase deutlich erhöht waren. Eine Depletion der natürlich vorkommenden CD4+CD25+ Treg Zellen vor dem Auslösen einer EAE führte zu einem schnelleren Krankheitsausbruch und schwererem sekundär progressivem Krankheitsverlauf. Obwohl die erste Remission von der CD4+CD25+ Treg Zelldepletion unbeeinflußt blieb, konnten bereits im ersten Krankheitsschub signifikant erhöhte Antigen spezifische proinflammatorische Zytokine der T-Zellen detektiert werden. Damit wird deutlich, dass der sekundär progressive Verlauf durch CD4+CD25+ Treg Zelldepletion bereits zeitig während des Krankheitsverlaufes eingeleitet wird. Wir konnten CTLA-4 ebenfalls in B-Zellen nachweisen. Die Expression von intrazellulärem und Oberflächen CTLA-4 in aktivierten B-Zellen ist strikt T-Zellen abhängig und hat ihr Maximum 48-72h nach Stimulation in vitro. Durch den Einsatz hochsensitiver Zellanreicherungsverfahren konnte der Nachweis der mRNA für CTLA-4 in den B-Zellen aus T-Zellabhängigen Zellkultursystemen erbracht werden. Die Induktion der mRNA für CTLA-4 kann unter bestimmten Umständen durch CD19 Kreuzvernetzung in B-Zellen erfolgen. Durch den Einsatz von Knochenmarkschimären, in denen CTLA-4 spezifisch nur in B-Zellen deletiert wird, konnte gezeigt werden, dass CTLA-4 in B-Zellen die primäre IgE und IgM und die sekundäre IgM Produktion in Thymus abhängigen Immunantworten steuert. Diese Daten implizieren für alle Thymus abhängigen Immunantworten eine noch komplexere Regulation, bei der CTLA4 in B-Zellen deren Effektorfunktion intrinsisch modulieren kann. / T and B lymphocytes carry out the adaptive immune response. After the antigen receptor on T cells is triggered through interaction with an MHC:peptide complex on APCs, costimulatory molecules are a second checkpoint for immune responses of interacting cells. To terminate unwanted immune responses, such as autoimmune responses, molecules of the costimulatory molecule family on T and B cells are of great importance. A central costimulatory molecule is CTLA-4 (CD152). We investigated the influence of regulatory cells on the course of an EAE, a disease marked through alterations of remission and relapses. Apart from the CD4+CD25+Foxp3+CTLA-4+ T cells we also detected CD4+CD25-Foxp3+CTLA-4+ T cells within the brain-infiltrating lymphocyte population. Furthermore we found similar numbers of CD4+CD25+ cells that also expressed intracellular CTLA-4, during the acute phase and first remission from EAE, whereas surface CTLA-4+CD4+ cells were clearly elevated during the acute phase. The depletion of the natural occurring CD4+CD25+ Treg cells before EAE induction leads to an accelerated disease onset and an increase in disease severity combined with a secondary progressive disease course. Even though the first remission was unaffected by the depletion of CD4+CD25+ Treg cells before disease induction, the antigen specific proinflammatory cytokine production of T cells during the acute phase was already significantly increased. The data show, that the secondary progressive disease course after CD4+CD25+ Treg cell depletion is already determined early during the course of EAE. On a second approach we found CTLA-4 expression as well on B lymphocytes. The expression of intracellular and surface CTLA-4 on activated B cells is strictly T cell dependent and the expression is maximal 48-72h after stimulation in vitro. Through the use of highly sensitive cell sorting strategies we were able to detect the mRNA for CTLA-4 in B cells cultured with activated T cells. CTLA-4 mRNA in B cells is inducible in isolated B cells via crosslinking of CD19 in vitro. We generated bone marrow chimeric mice, in which only B cells were CTLA-4 deficient. With these mice we could show, that CTLA-4 on B cells controls the primary IgE and IgM, as well as the secondary IgM production in thymus dependent immune responses. These data imply a more complex regulation of thymus dependent immune responses, in which CTLA-4 on B cells can modulate B cell effector functions.

Glukokortikoide (GK) zählen zu den effizientesten Medikamenten bei der Behandlung akuter und chronischer Entzündungskrankheiten. Ihr Einsatz ist häufig durch das Auftreten zahlreicher und teilweise irreversibler Nebenwirkungen beeinträchtigt. Aus diesem Grund wurden neue Glukokortikoid-Rezeptor-Liganden, wie die nicht-steroidalen selektiven Glukokortikoid-Rezeptor-Agonisten (SEGRAs), die eine potente anti-entzündliche Wirkung bei gleichzeitig vermindertem Nebenwirkungspotential aufweisen sollen, entwickelt. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die SEGRA-Substanz BAY1155975 hinsichtlich ihrer hemmenden Wirkung auf die CD28-kostimulierte Aktivierung primärer humaner T-Zellpopulationen mit der von klassischen GK, wie z.B. Prednisolon, verglichen. In humanen Gedächtnis/Effektor- CD4+ T-Zellen wies die höchste Konzentration von BAY1155975 im Vergleich zu Prednisolon eine statistisch signifikant größere Hemmung der CD28-kostimulierten Sekretion von Effektorzytokinen (IFN-gamma, TNF-alpha, IL17 und IL22) auf. Proliferation, Apoptose und die Expression verschiedener Aktivierungsmarker wurden dagegen durch BAY1155975 und Prednisolon gleichermaßen reguliert. Es wird eine stärkere Hemmung des Kalzium-Kalzineurin-NFAT Signalweges durch BAY1155975 in diesen Zellen vermutet. In vivo zeigten BAY1155975 und Prednisolon eine ähnlich starke Hemmung der T-Zell-vermittelten Hautentzündung im DNFB-induzierten Kontaktallergiemodell in Mäusen, wenn die Behandlung der Mäuse mit den Substanzen vor dem Challenge erfolgte. Bei einer Substanzbehandlung der Mäuse während der Sensibilisierung wurde die Hautentzündung dagegen deutlich stärker durch BAY1155975 als durch Prednisolon gehemmt. Zusammenfassend geben die Ergebnisse dieser Arbeit einen Hinweis auf eine stärkere Hemmung der T-Zellsensibilisierung und der Effektorzytokinsekretion durch die SEGRA Substanz BAY1155975 im Vergleich zum klassischen GK Prednisolon. / Glucocorticoids (GCs) are the most effective therapeutic agents for the treatment of acute and chronic inflammatory diseases. Their use is often accompanied with numerous and sometimes irreversible side-effects. Therefore, new glucocorticoid receptor (GR) ligands with should have potent anti inflammatory efficacy but a reduced side-effect profile have been developed. Non steroidal selective glucocorticoid receptor agonists (SEGRAs) represent a new class of GR ligands with an improved therapeutic index. In this study, we compared the SEGRA, BAY1155975, and the classical GC, prednisolone, regarding their suppressive effect on CD28-costimulated activation of human primary T cell subpopulations. In human memory/effector CD4+ T cells, BAY1155975 at the highest concentration exhibited a significantly stronger inhibition of CD28-costimulated effector cytokine secretion (IFN-gamma, TNF-alpha, IL17 and IL22) in comparison to prednisolone. Interestingly, proliferation, apoptosis and expression of activation markers were similarly regulated by BAY1155975 and prednisolone. Further studies on different signal transduction pathways suggested that BAY1155975 stronger inhibited the calcium-calcineurin-NFAT pathway than prednisolone in these cells. In vivo BAY1155975 and prednisolone showed comparable efficacy in inhibition of T cell dependent skin inflammation in DNFB-induced contact hypersensitivity models in mice, when mice were treated before hapten challenge. In contrast, when mice were treated around hapten sensitization markedly stronger inhibition of skin inflammation was observed for BAY1155975 than prednisolone. In summary, the data of this study give evidence for a stronger inhibition of T cell sensitization and effector cytokine secretion by the SEGRA, BAY1155975, in comparison to the classical GC, prednisolone.

Das Ergebnis einer T-Zellmediierten Immunantwort ist von der Signalvermittlung durch kostimulatorische Moleküle abhängig. Diese kostimulatorischen Moleküle sind - neben dem spezifischen Antigen - notwendig für eine vollständige T-Zellaktivierung, die es der T-Zelle erlaubt zu proliferieren, neue Oberflächenantigene zu exprimieren und Zytokine zu sezernieren. Ohne das kostimulatorische Signal wird die T-Zelle anerg oder sogar apoptotisch, eine effektive Immunantwort ist dann nicht möglich. Die vorliegende Dissertationsschrift enthält die initiale Beschreibung eines neuen kostimulatorischen Moleküls, eine umfangreiche Charakterisierung seiner Expression in vitro, sowie seiner Funktion. Das Molekül "ICOS" (ICOS steht für inducible costimulator) ist ein T-Zellspezifisches Molekül und weist eine große Homologie zu dem Prototyp eines kostimulatorischen Moleküls, dem CD28 Molekül auf. Die Experimente, die zur Charakterisierung der Induktionsbedingungen des ICOS Moleküls durchgeführt wurden, zeigen, daß die Expression des ICOS Moleküls sehr schnell nach T-Zellaktivierung induziert wird, die Expressionsstärke innerhalb von Stunden stark heraufreguliert wird und die Expression lange (mindestens 96h) auf der T-Zelloberfläche zu detektieren ist. Ein Vergleich mit anderen aktivierungsabhängigen T-Zelloberflächenmolekülen zeigt eine ICOS-spezifische Zeitkinetik der Expression, die durch verschiedene T-Zellstimuli zu induzieren ist. Eine optimale Expression des Moleküls ist zwei-signalabhängig und durch Cyclosporin A blockierbar. Bezüglich der Funktion von ICOS wurde die Wirkung der Kostimulation via ICOS auf eine Reihe von kritischen Parametern der T-Zellaktivierung analysiert. Durch die Kostimulation mit einem ICOS-spezifischen Antikörper wird konzentrationsabhängig die T-Zellproliferation induziert, unabhängig davon, ob das ersten Signal via CD3 oder via einen löslichen Stimulus, wie PHA erfolgte. Die ICOS Kostimulation bewirkt die Hochregulation von typischen T-Zellaktivierungsantigenen und sie induziert oder verstärkt die Sekretion zahlreicher Lymphokine. Die verstärkende Wirkung auf alle diese Parameter der T-Zellaktivierung führt schließlich dazu, daß die über ICOS kostimulierten Zellen in der Lage sind T-Zellhilfe für B-Zellen zu leisten, so daß diese Immunglobuline sezernieren. Wurde versucht, die direkte Interaktion des ICOS Moleküls mit seinem potentiellen Liganden bei der T-Zellinduzierten Immunglobulinsekretion durch den mAk F44 zu blockieren, so zeigte sich kein Effekt. Bei Langzeitkostimulation via ICOS zeigte sich allerdings, daß die Kostimulation durch das ICOS Molekül auch in der Lage ist, die T-Zellaktivierung negativ zu beeinflussen: Die Langzeitstimulation via ICOS erzeugt eine deutliche Proliferationsdepression und einen Viabilitätsverlust der T-Zellen. Insgesamt lassen diese Ergebnisse den vorsichtigen Schluß zu, daß das ICOS Molekül eine wichtige Rolle an der Schnittstelle zwischen Expansion und Effektorfunktion einerseits und Depression der T-Zellen andererseits spielt. / The outcome of T-cell resonses after T-cell encounter with specific antigens is modulated by co-stimulatory signals, which are required for both lymphocyte activation and development of adaptive immunity. Here I report the initial characterization of a novel co-stimulatory molecule which enhances all basic T-cell functions and displays a unique induction and expression pattern. ICOS (for inducible co-stimulator) is a T-cellspecific activation antigen with high homology to CD28, the prototype of a co-stimulatory molecule. Analysis of induction requirements for ICOS expression revealed a two-signal dependency and cyclosporine A sensitivity. ICOS' expression kinetics are unique when compared with other early T-cell activation antigens. ICOS is induced very quickly on the T-cell surface and is rapidly upregulated following T-cell activation. The surface expression of ICOS is surprisingly prolonged - lasting at least 96 hours - considering its rapid induction kinetics. Stimulation via an ICOS-specific monoclonal antibody enhances all basic T-cell functions such as proliferation, upregulation of molecules that medicate cell-cell interaction, secretion of lymphokines and effective help for antibody secreting B-cells. Costimulation via ICOS is effective regardless of the route of action of the first signal (immobilized or soluble). Blockade of the ICOS interaction with its presumed ligand on B-cells does not inhibit immunoglobulin production by these B-cells, though. Finally long-term stimulation experiments reveal a possible negative role for ICOS in regulating T-cell responses. These results indicate that ICOS is a major regulator of the adaptive immune system determining the healthy balance of negative and positive signaling during T-cell activation and differentiation.

Der Induzierbare Kostimulator (ICOS) ist ein wichtiger Regulator der T-Zell-Effektorfunktion. In vivo führt ein Defekt von ICOS zur Beeinträchtigung der T-Zellabhängigen humoralen Immunität. In gendefizienten Mäusen wurden stark gestörte B-Zellantworten beobachtet. Mehrere in vitro und in vivo Studien führen diese Phänomene auf eine beeinträchtigte Regulation von Kommunikationsmolekülen auf der Zelloberfläche und Expression von Zytokinen durch ICOS-defiziente T-Zellen zurück. In dieser Arbeit konnte jedoch anhand Antigen-spezifischer T-Zellen in einem murinen adoptiven Transfersystem gezeigt werden, dass das Signal über ICOS die frühe T-Zellaktivierung nicht signifikant beeinflusst. Stattdessen trägt ICOS wesentlich zum Überleben und zur Expansion von Effektor T-Zellen bei, die zuvor lokal durch Antigengabe mit Adjuvanz induziert wurden. Diese beobachtete biologische Funktion von ICOS lässt sich auch auf FoxP3+ Regulatorische T-Zellen übertragen, welche durch systemische Antigengabe ohne Adjuvanz generiert wurden. In Übereinstimmung mit diesem Befund führt die Abwesenheit von ICOS unter homöostatischen Bedingungen in nicht-immunisierten Mäusen zu reduzierten Zellzahlen von Effektor-Memory T-Zellen und FoxP3+ Regulatorischen T-Zellen. Der regulierende Effekt von ICOS auf die Größe einer spezifischen Effektor T-Zellpopulation gilt auch für Follikuläre T-Helferzellen, konnte jedoch für zytotoxische CD8+ T-Zellen nicht eindeutig nachgewiesen werden. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse kristallisiert sich eine globale biologische Rolle von ICOS für Effektorzellen heraus. Als kostimulatorisches, agonistisches Molekül reguliert ICOS generell die Pool-Größe aller Effektor T-Zellen mit unterschiedlichen, teilweise gegensätzlichen funktionellen Eigenschaften. Mit Hilfe dieses neuen Konzeptes können frühere in vivo Studien, deren Ergebnisse in Bezug auf die Funktion von ICOS scheinbar widersprüchlich waren, in Einklang gebracht werden. / The Inducible Co-Stimulator (ICOS) is an important regulator of T cell effector function. In vivo ICOS deficiency results in impaired T-cell dependent humoral immunity. Knock out mice show strongly defective B cell responses. Several in vitro and in vivo studies attributed this phenomenon to impaired upregulation of cell surface communication molecules and cytokine synthesis by ICOS-deficient T cells. However, in this work now could be shown with antigen-specific T cells in a murine adoptive transfer system that signaling via ICOS does not significantly affect early T cell activation. Instead, ICOS substantially contributes to the survival and expansion of effector T cells upon local challenge with antigen and adjuvant. Importantly, the observed biological function of ICOS also extends to FoxP3+ regulatory T cells, as can be observed after systemic antigen delivery without adjuvant. In line with these findings, absence of ICOS under homeostatic conditions of nonimmunized mice leads to a reduced number of both effector-memory and FoxP3+ regulatory T cells. The regulatory function of ICOS to control the poolsize of special T cell effector populations is also observed for follicular B helper T cells. The influence of ICOS on cytotoxic CD8+ T cells could not be clearly demonstrated. Based on these results, I propose a biological role for ICOS as a costimulatory, agonistic molecule for a variety of effector T cells with differing and partly opposing funtional roles. This concept may reconcile a number of past in vivo studies with seemingly cotradictory results on ICOS function.

Filarien persistieren bis zu 15 Jahren in ihren Wirten. Als eine Ursache dieser Persistenz diskutiert man die Fähigkeit der Filarien, die Immunantwort des Wirtes gezielt zu modulieren und eine zelluläre Hyporeaktivität zu induzieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob ein sezernierter Cysteinproteasen-Inhibitor (Onchocystatin) der humanpathogenen Filarie Onchocerca volvulus immunmodulierende Eigenschaften besitzt und an der Herausbildung eines hyporeaktiven Immunstatus des Wirtes beteiligt ist. Für die Untersuchungen wurde Onchocystatin als full length Molekül (rOv17) und als verkürztes Molekül (trOv17) rekombinant hergestellt. Das verkürzte trOv17 besitzt aufgrund des Fehlens des N-terminalen Bereiches eine verminderte proteaseinhibitorische Aktivität. Die in vitro Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen verdeutlichen, daß rOv17 und auch trOv17 potente Immunmodulatoren sind, die sowohl die antigenspezifische als auch die polyklonal-stimulierte Proliferation von humanen PBMC inhibieren. Die zelluläre Hyporeaktivität ist dabei auf die Modulation von Monozytenfunktionen zurückzuführen. rOv17 und trOv17 modulieren die Antigenpräsentation, die Zytokinproduktion und die Expression kostimulatorischer Signale von humanen Monozyten. So konnte gezeigt werden, daß rOv17 und trOv17 die Aktivität von humanem Cathepsin L und S inhibieren und die Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 vermindern. Die Modulation der Zytokinproduktion durch rOv17 und trOv17 ist durch eine verstärkte TNF-alpha und IL-10 Produktion und durch eine verminderte IL-12 Produktion charakterisiert. Desweiteren konnte in Neutralisationsstudien mit anti-IL-10 Ak gezeigt werden, daß die verminderte Expression von HLA-DR, CD40 und CD86 Folge der durch rOv17 und trOv17 induzierten verstärkten IL-10 Produktion ist. Im Gegensatz dazu bleibt die verminderte IL-12 Produktion und die verminderte polyklonal-stimulierte Proliferation humaner PBMC auch nach der Neutralisation von IL-10 bestehen. Die Studien mit den rekombinant hergestellten O. volvulus Cystatinen zeigen, daß rOv17 und trOv17 ihr immunologisches Umfeld auf vielfältige Art und Weise modulieren. Dabei spielt vermutlich die Inhibition der Aktivität einer Wirtscysteinprotease, aber auch ein von der Funktion als Cysteinproteasen-Inhibitor unabhängiger Mechanismus eine Rolle. Der Cysteinproteasen-Inhibitor der Filarie O. volvulus besitzt somit die Eigenschaft, die Immunantwort des Wirtes zu modifizieren, und ist vermutlich eine wesentliche Komponente, die dem Parasiten eine lange Persistenz im Wirt ermöglicht. / Immune responses of individuals infected with filarial nematodes are characterized by a marked cellular hyporesponsiveness. The establishment of this hyporesponsiveness is considered as an important mechanism to avoid host immune responses which could eliminate the parasites. The present study is investigating the immunomodulatory potential of a 17 kD secreted cysteine protease inhibitor (onchocystatin) of the human pathogenic filaria Onchocerca volvulus. In vitro studies using recombinant onchocystatin (rOv17) identified this inhibitor as a potent immunomodulator. rOv17 suppresses the antigen-driven and the polyclonally-stimulated proliferation of human PBMC. This cellular hyporeactivity is due to the modulation of monocytic function by rOv17, comprising the modulation of antigenpresentation, the expression of costimulatory molecules and the production of cytokines. Thus rOv17 strongly inhibits the activity of human cathepsin L and S and reduces the expression of MHC class II molecules as well as the expression of CD40 and CD86 on human monocytes. The modulation of cytokine production by rOv17 is characterized by an initial increase of TNF-alpha which is followed by an increase of IL-10 and a decrease of IL-12. By neutralization studies it was shown that the suppression of MHC class II molecules and of CD86 and CD40 is mediated by the rOv17 induced increase of IL-10. In contrast cellular hyporeactivity and the reduced IL-12 production remain unaffected by neutralization of IL-10. In comparison to rOv17 a truncated onchocystatin (trOv17) with lowered protease inhibitory activity was investigated. Surprisingly even trOv17 is immunomodulatory active suggesting that immunomodulation by onchocystatin is mediated by both an inhibitor-dependent and an inhibitor-independent mechanism. These data demonstrate that onchocystatin is a potent immunomodulator of host immune responses and in consequence is an essential component that enables the parasites a long persistence within their hosts.