Limitierend für pharmakologische Therapien ist oft die Unfähigkeit des Wirkstoffes, biologische Membranen zu überwinden, weswegen häufig Transportmoleküle wie z.B. zellpenetrierende Peptide (CPPs, cell penetrating peptides) benutzt werden. Von den über 100 beschriebenen CPPs wurde bisher nur eine kleine Anzahl systematisch verglichen, was die Auswahl des „richtigen“ CPPs für eine Anwendung erschwert. Ziel dieser vorliegenden Arbeit war es, das pro-apoptotische Peptid KLA mittels CPPs spezifisch in Krebszellen zu transportieren. Untersucht wurden: (I) Verschiedene CPPs in unterschiedlichen Zelltypen zur Selektion der „besten“ CPPs; (II) Der Einflusses des CPP C-Terminus auf die Internalisierung und zelluläre Verteilung; (III) Der zelluläre KLA-Transport mittels CPPs via einer nicht-kovalenten Administration. 22 verschiedene CPPs wurden in sieben Zelltypen untersucht, wobei Toxizität, Zellaufnahme und zelluläre Lokalisation mittels Fluorescein markierten CPPs in Fluoreszenzspektroskopie und konfokaler Mikroskopie betrachtet wurden. Abhängig von der Zellaufnahme wurden die CPPs in drei Gruppen klassifiziert. Die Untersuchung carboxylierter und carboxyamidierter CPP C-Termini ergab, dass in den meisten Fällen ein Carboxyamid die zelluläre Aufnahme begünstigte. Drei CPPs (MPG, Penetratin und Integrin) wurden ausgewählt, um das pro-apoptotische KLA Peptid in zwei Krebszelllinien (MCF-7 Brustkrebszellen und leukämische RAW264.7 Makrophagen) im Vergleich zu Fibroblasten (Cos-7) nicht-kovalent zu transportieren. Der erfolgreiche KLA-Transport hing vom CPP, dessen C-Terminus und der Zelllinie ab. Die Analyse der Viabilität nach CPP:KLA Administration ergab, dass MPG-CONH2:KLA (1:2) toxisch für Makrophagen und Brustkrebszellen, aber nicht für Fibroblasten war. Die Toxizität konnte der Apoptose zugeordnet werden. Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Informationen über die Auswahl des passenden CPPs für den nicht-kovalenten Transport des pro-apoptotischen KLA-Peptids. / Limitations in a pharmacological therapy are often due to the inability of drugs to overcome the cell membrane and therefore transporting molecules are being used, e.g. cell penetrating peptides (CPPs). Only a few of the over 100 described CPPs have been compared systematically making the choice of “the” CPP for a given application difficult. The goal of the presented work is the CPP mediated delivery of the pro-apoptotic peptide KLA in breast cancer cells as proof of principle for a therapeutical application. Analysed were (I) Different CPPs in various cell types to select the “best” one, (II) The influence of the CPP C-termini on uptake and localisation, (III) The cellular KLA delivery via a non-covalent CPP administration. 22 CPPs were compared in seven cell types thereby looking at toxicity, cellular uptake and subcellular localisation using fluorescein labelled CPPs for fluorescence spectroscopy and confocal microscopy. The resulting uptake information allowed the classification of the CPPs in three main groups. The evaluation of carboxylated and carboxyamidated CPP C-termini revealed that a carboxyamide mostly enhanced the cellular CPP uptake. Three CPPs were selected (MPG, penetratin and integrin) to deliver the pro-apoptotic KLA peptide in two cancer cell lines (breast cancer MCF-7 cells and RAW264.7 macrophages) compared to fibroblasts (Cos-7) via the non-covalent strategy. A successful KLA delivery depended on the applied CPP, its C-terminus and the used cell line. The biological activity of the pro-apoptotic KLA peptide was determined via the cell viability (MTT assay). The co-incubation of MPG-CONH2:KLA (1:2) was able to induce toxicity in breast cancer cells and leukaemic macrophages, but not in fibroblasts. The viability reductions were then assigned to apoptosis. This work provides important information for the choice of an adequate CPP for the pro-apoptotic KLA peptide delivery and presents the advantage of the non-covalent delivery strategy.

Für medizinische Anwendungen sind Stammzellen aufgrund ihrer Eigenschaften (Selbsterneuerung, hohe Proliferationsrate und Differenzierungsmöglichkeit in verschiedene Zelltypen) beispielsweise in den Bereichen des regenerativen Gewebeersatzes und der Zelltherapie sehr interessant. In vivo umgibt die Stammzellen eine definierte Mikroumgebung, die sie unterstützt sich zu teilen, ihren undifferenzierten Status aufrecht zu erhalten und Tochterzellen für das Wachstum, die routinemäßige Erneuerung oder den Ersatz von Gewebe zu produzieren. Diese Mikroumgebungen werden als Stammzellnischen bezeichnet. Für die Kultivierung von Stammzellen in vitro muss die in vivo-Situation möglichst getreu nachgestaltet werden. Ziel der Forschung ist die Schaffung einer künstlichen Umgebung, die sowohl die funktionellen Eigenschaften einer Nische besitzt als auch frei von Risiken xenogener Pathogene oder Gewebeunverträglichkeiten für die Anwendung am humanen Organismus eingesetzt werden kann. Einen Ansatz dafür bietet beispielsweise die Kopplung von Faktoren, die für den Erhalt der Stammzelleigenschaften notwendig sind, an synthetische Oberflächen. Ausgehend vom Bedarf an Kultur- oder Modellsystemen für die Expansion von (embryonalen) Stammzellen sollte in dieser Arbeit analysiert werden, ob alternierende Maleinsäureanhydrid (MA)-Copolymere ein geeignetes Trägersystem für die biofunktionelle kovalente Immobilisierung spezifischer Zytokine sind und dadurch unter anderem als künstliche Stammzellnische Anwendung finden können. MA-Copolymere eignen sich aufgrund ihrer spontanen Reaktion mit Aminogruppen für die Immobilisierung von Proteinen. Das Zytokin LIF (Leukemia inhibitory factor) existiert in vivo auch in immobilisierter Form und ist in embryonalen Mausstammzellen (mESC) allein in der Lage, das Stammzellpotential dieser Zellen zu erhalten. Aus diesem Grund ist LIF für die Analyse der Aufgabenstellung geeignet. Nach der Charakterisierung LIF-modifizierter Oberflächen wurde die biologische Verfügbarkeit des kovalent immobilisierten Zytokins mit Hilfe von LIF-sensitiven Fibroblasten und mESC der Linie R1 überprüft. Anschließend wurde im Mausmodell in vivo der Erhalt der Pluripotenz der mESC durch immobilisiertes LIF analysiert. Dafür standen die Oberflächen Poly(ethylen-alt-maleinsäureanhydrid) (PEMA) und Poly(octadecen-alt-maleinsäureanhydrid) (POMA) jeweils ohne und mit Polyethylenglykol (PEG7)-Modifizierung zur Verfügung, an die LIF kovalent gekoppelt wurde. Zusätzlich wurde LIF physisorptiv an einer Kollagen-Fibronektin-Matrix über hydrolysiertem POMA immobilisiert. Mit Hilfe von radioaktiv markiertem LIF konnte gezeigt werden, dass die Gesamtbeladungsmenge mit Zytokin von den Eigenschaften der MA-modifizierten Träger abhing. Auf PEMA konnten mit steigenden Immobilisierungskonzentrationen höhere Belegungsdichten an der Oberfläche erreicht werden, die im analysierten Bereich eine lineare Abhängigkeit zeigten. Aufgrund der starken Quellung in wässrigen Lösungen war eine Einlagerung von LIF-Molekülen in die Polymerschicht möglich und führte bei hohen Immobilisierungskonzentrationen auch nach 3 Tagen Inkubation mit proteinhaltigem Medium noch zur Verdrängung nicht kovalent gebundener Zytokinmoleküle aus PEMA-Oberflächen. Obwohl ein Teil des LIF in die Polymerschicht eindrang, war der Großteil der Moleküle für einen spezifischen Antikörper zugänglich. Hydrophobe Oberflächen mit POMA konnten bei hohen Immobilisierungskonzentrationen weniger LIF binden und zeigten Sättigungsverhalten der Oberflächen bei einer Belegungsdichte von 178 ng/cm^2 LIF. Eine Freisetzung von LIF nach mehr als 3 Tagen konnte nicht beobachtet werden. Gleichzeitig war hier aufgrund der hydrophoben Polymerseitenketten die Antikörperzugänglichkeit deutlich reduziert. Wegen des geringen Quellungsverhaltens von POMA in wässrigen Lösungen konnte eine Einlagerung des immobilisierten Zytokins in die Polymerschicht aber ausgeschlossen werden. Die kovalente LIF-Immobilisierung über PEG7-Spacer führte im Vergleich zu den nicht PEG-modifizierten Oberflächen PEMA und POMA zu jeweils geringeren Belegungsdichten, ohne dabei den Charakter der Abhängigkeit von der Immobilisierungskonzentration zu verändern (linear für PEMA+PEG7, Sättigung für POMA+PEG7). Die schlechte Antikörperzugänglichkeit von immobilisiertem LIF auf POMA konnte durch die Einführung des PEG7-Spacers deutlich verbessert werden und erreichte einen Wert ähnlich dem der hydrophilen PEMA-Oberflächen. Kovalent immobilisiertes LIF zeigte auf den vier MA-Oberflächen homogene und definiert einstellbare Belegungsdichten auf den einzelnen Proben. Die physisorptive Immobilisierung von LIF an extrazelluläre Matrixkomponenten auf hydrolysiertem POMA führte zu inhomogenen und bereits bei geringen Immobilisierungskonzentrationen instabilen Belegungsdichten. Die Einstellung definierter Belegungsdichten und die homogene Verfügbarkeit des Zytokins sind für die spätere Anwendung bei der Kultivierung wichtig, da so allen Zellen die gleiche definierte Zytokindosis unabhängig von der Oberflächencharakteristik präsentiert wird und Populationsunterschiede vermieden werden. LIF-sensitive Mausfibroblasten der Linie NIH3T3 reagierten auf immobilisiertes LIF mit der Aktivierung des Signalwegproteins STAT3. Durch den direkten Vergleich von STAT3-Aktivierungsprofilen nach Stimulation mit gelöstem oder immobilisiertem LIF konnte gezeigt werden, dass durch beide Präsentationsformen innerhalb der ersten 15 Minuten nach Stimulationsbeginn eine starke Aktivierung von STAT3 erfolgt, die anschließend wieder abklingt. Die Profile beider Präsentationsformen unterschieden sich in ihren Intensitäten nur bei der starken STAT3-Aktivierung. Dabei ergaben sich bei gelöstem LIF aufgrund der größeren Kontaktfläche mit Zytokin (gesamte Zelloberfläche) etwas stärkere Aktivierungen. Durch die sehr ähnlichen Aktivierungsprofile konnte nachgewiesen werden, dass das Zytokin LIF für Zellen zugänglich an MA-Copolymere mit und ohne Spacer-Modifizierung immobilisiert werden kann. Dabei lag ein Teil der Moleküle in einer Konformation und Orientierung gebunden vor, die die Funktionalität des Zytokins erhalten konnten. Zwischen den Oberflächen mit kovalenter LIF-Immobilisierung konnten keine wesentlichen Unterschiede in der STAT3-Aktivierung festgestellt werden. LIF war an all diesen Oberflächen für die LIF-sensitiven NIH3T3 Mausfibroblasten biologisch verfügbar. LIF-abhängige embryonale Mausstammzellen (mESC) reagierten nach 72 Stunden LIF-Stimulation mit der Aktivierung von STAT3. Bei Belegungsdichten ab 8 ng/cm^2 kovalent immobilisiertem LIF auf POMA mit und ohne PEG7-Spacer konnten ähnliche Aktivierungen wie durch die Stimulation mit gelöstem LIF festgestellt werden. Dies bestätigte die biofunktionelle LIF-Immobilisierung. Zwischen den POMA-Oberflächen mit und ohne PEG7 war dabei kein deutlicher Unterschied erkennbar. Eine reduzierte Zugänglichkeit des Antikörpers auf POMA beeinflusste demnach die biologische Verfügbarkeit des Zytokins für die mESC nicht. Der Erhalt des Stammzellpotentials durch kovalent an POMA gebundenes LIF konnte in vitro durch die Präsenz von Oct4 im Zellkern der mESC nachgewiesen werden. Durch die instabile Immobilisierung bei physisorptiver Assoziation des Zytokins an Matrixkomponenten über hydrolysiertem POMA reduzierte sich der Erhalt des Stammzellpotentials auf diesen Oberflächen stark. Kovalent immobilisiertes LIF dagegen konnte auch während der Kultur über mehrere Passagen hinweg die Pluripotenz der murinen ESC erhalten. Nach der Fusion mit Blastozysten beteiligten sich diese kultivierten Zellen in vivo erfolgreich an der Bildung von Chimären. Dabei konnten keine Unterschiede der Chimärenhäufigkeit zwischen der Kultivierung der mESC mit gelöstem oder kovalent an POMA immobilisiertem LIF festgestellt werden. Kovalent an MA-Copolymere immobilisiertes LIF ist demnach in der Lage, gelöstes LIF vollständig zu ersetzen und über mehrere Passagen hinweg allein das Stammzellpotential von mESC zu erhalten. Die Experimente zeigten, dass sich MA-Copolymere für die funktionelle kovalente Immobilisierung von Signalmolekülen eignen. Dabei konnten keine starken Unterschiede bei der Reaktion der Zellen auf die Oberflächen PEMA oder POMA festgestellt werden. Auch die Einführung eines zusätzlichen Spacers war für die Signaltransduktion nach Stimulation mit kovalent immobilisiertem LIF nicht notwendig. Für künftige Arbeiten zur kovalenten Immobilisierung von LIF an MA-Copolymeren ist deshalb aus Stabilitäts- und Effizienzgründen die Oberfläche POMA zu bevorzugen. Diese Favorisierung kann jedoch aufgrund der unterschiedlichen Tertiärstruktur anderer Proteine und ihrer verschiedenen Steifigkeiten sowie bei der Verwendung anderer Zelltypen nicht automatisch für ein anderes Modellsystem übernommen werden. Die Verwendung hydrophiler Oberflächen oder die Kopplung über Spacer sollte demnach in Abhängigkeit vom zu immobilisierenden Protein und den auszusiedelnden Zellen geprüft werden. Die vorgestellte Kopplungsmethode umgeht die Modifikation des Proteins sowie Behandlungen zur Vernetzung des Zytokins. Die Immobilisierungsreaktion ist bei Raumtemperatur und Umgebungsdruck sowie unter sterilen Bedingungen durchführbar. Immobilisierte Zytokine werden homogen kovalent an der Oberfläche gebunden und sind dort für die Zellen zugänglich. Außerdem ermöglicht die Einstellung definierter Belegungsdichten die gezielte Applikation von Zytokindosen. MA-Copolymere sind somit nicht nur für die Kultivierung von Stammzellen unter Erhaltung des Stammzellstatus einsetzbar, sondern eignen sich auch für Differenzierungsstudien. Teilergebnisse dieser Arbeit wurden publiziert unter K. Alberti, R.E. Davey, K. Onishi, S. George, K. Salchert, F.P. Seib, M. Bornhäuser, T. Pompe, A. Nagy, C.Werner, and P.W. Zandstra. Functional immobilization of signaling proteins enables control of stem cell fate. Nat Methods, 5(7):645–650, Jul 2008 und T. Pompe, K. Salchert, K. Alberti, P.W. Zandstra, and C. Werner. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protocols, 5(6):1042–1050, Jun 2010. / In vitro cultivation of (embryonic) stem cells requires a defined environment. Together different properties as cytokine supplement, extracellular matrix composition or topographic design can mimic this stem cell niche in an artificial system. For mouse embryonic stem cells the cytokine leukemia inhibitory factor (LIF) is able to keep those cells in undifferentiated state and to enhance self renewal without the supplement of other factors. In vivo LIF exists in both diffusible and extracellular matrix immobilized form. This work investigates whether LIF can be immobilized covalently to alternating maleic anhydride (MA)-copolymers in a functional manner. When bioavailable, covalently immobilized LIF should be able to interact with specific cytokine receptor subunits and provide information to keep murine embryonic stem cells in a pluripotent state. In aqueous solution with neutral pH (such as phosphate buffered saline, PBS) and ambient temperature and pressure MA-copolymers react spontaneously with aminogroups and therefore represent a useful support for covalent protein immobilization. Depending on the choice of co-monomer, properties of copolymer vary: ethylene results in hydrophilic poly-(ethylene-alt-maleic anhydride) (PEMA), octadecene in more hydrophobic poly-(octadecene-alt-maleic anhydride) (POMA). LIF can be covalently immobilized onto the MA-copolymers as shown by radiolabeling experiments. The amount of cytokine coupled to PEMA increased linear whereas on POMA saturation could be observed for higher concentrations. A subsequent coupling of a polyethylene glycol spacer (PEG7) further modified the properties and led to more hydrophilic surfaces. The amount of LIF per area decreased in comparison to MA-copolymers without the spacer but the graph characteristics remained unaltered (linear for PEMA+PEG7, saturation for POMA+PEG7). During the first three days in buffer solution supplemented with bovine serum albumin, unbound LIF was displaced and the amount of immobilized cytokine remained stable. This Stability after preincubation allowed to immobilize required amounts of LIF per area. Although hydrophilic surfaces with PEMA showed swelling behavior resulting in increased layer thickness after incubation in PBS, accessibility to LIF for an antibody was not impaired. The amounts per area detected by radiolabeling method and using the antibody were similar and indicated that LIF was not covered by copolymers. For cell culture addition of diffusible as well as immobilized growth factors or cytokines requires dosage control. Frequently it is necessary to provide homogeneous distribution of the factor of interest. In the present study analysis by fluorescence microscopy confirmed homogeneity for surfaces with covalently immobilized LIF (iLIF) but not for LIF physisorbed to extracellular matrix components collagen type I and fibronectin. LIF transduces signals via the JAK/STAT pathway. Preliminary experiments with LIF-sensitive fibroblasts showed similar activation of STAT3 after stimulation with immobilized or diffusible LIF. The results of STAT3 activation revealed an activation profile with high intensities within the first 15 minutes for both immobilized and diffusible LIF followed by decrease. STAT3 activation profiles were similar on different surfaces and independent of LIF presentation mode. These results revealed that fibroblasts could recognize covalently immobilized LIF onto MA-copolymers and were able to activate STAT3. In the absence of LIF mESC start to differentiate within 24 to 36 hours and loose their pluripotency. To confirm the functional immobilization of LIF mouse embryonic stem cells (mESC) were cultivated on iLIF-modified POMA or POMA+PEG7 surfaces for 72 hours and stained for activated STAT3. Results showed a dose-dependent activation increasing with the iLIF amount per area. Higher amounts (8 and 75 ng/cm^2) of iLIF activated STAT3 similar to 10 ng/ml diffusible LIF. Introduction of PEG7 spacer did not further increased STAT3 activation. Both, the amount of ESC marker Oct4 and the percentage of Oct4-positive cells increased with higher amounts of iLIF and showed similar results as obtained with 10 ng/ml diffusible LIF. Murine ESC cultivated on LIF physisorbed to matrix components expressed similar amounts of transcription factor Oct4 compared to unstimulated cells. STAT3 activation and Oct4 expression in the absence of diffusible cytokine indicated a functional covalent immobilization of LIF. To confirm the pluripotency, mESC were stimulated for 6 to 8 subcultures only with iLIF, cell aggregates were fused with mouse embryos and implanted in pseudopregnant surrogate mothers. Three weeks after birth the contribution of mESC aggregates to chimera was evaluated. ESC stimulated with iLIF only contributed to chimera formation with around the same frequency as mESC cultivated with 10 ng/ml diffusible LIF. Thus, iLIF maintained pluripotency of mESC during in vitro expansion and could replace diffusible LIF. As shown by the experiments, MA-copolymers provide a support to covalently immobilize cell signaling molecules in a functional manner. This method of coupling does not need any protein modification or cross-linking treatment after protein incubation. Reaction can be carried out under sterile conditions at ambient temperature and pressure. The immobilized ligand is distributed equally on the supporting copolymer and the adjustment of required ligand amounts is possible. These properties characterize MA-copolymers as a suitable support to immobilize cell signaling molecules not only for keeping the stem cell fate but also for differentiation studies. Parts of this work were published: K. Alberti, R.E. Davey, K. Onishi, S. George, K. Salchert, F.P. Seib, M. Bornhäuser, T. Pompe, A. Nagy, C.Werner, and P.W. Zandstra. Functional immobilization of signaling proteins enables control of stem cell fate. Nat Methods, 5(7):645–650, Jul 2008. T. Pompe, K. Salchert, K. Alberti, P.W. Zandstra, and C. Werner. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protocols, 5(6):1042–1050, Jun 2010.

Für medizinische Anwendungen sind Stammzellen aufgrund ihrer Eigenschaften (Selbsterneuerung, hohe Proliferationsrate und Differenzierungsmöglichkeit in verschiedene Zelltypen) beispielsweise in den Bereichen des regenerativen Gewebeersatzes und der Zelltherapie sehr interessant. In vivo umgibt die Stammzellen eine definierte Mikroumgebung, die sie unterstützt sich zu teilen, ihren undifferenzierten Status aufrecht zu erhalten und Tochterzellen für das Wachstum, die routinemäßige Erneuerung oder den Ersatz von Gewebe zu produzieren. Diese Mikroumgebungen werden als Stammzellnischen bezeichnet. Für die Kultivierung von Stammzellen in vitro muss die in vivo-Situation möglichst getreu nachgestaltet werden. Ziel der Forschung ist die Schaffung einer künstlichen Umgebung, die sowohl die funktionellen Eigenschaften einer Nische besitzt als auch frei von Risiken xenogener Pathogene oder Gewebeunverträglichkeiten für die Anwendung am humanen Organismus eingesetzt werden kann. Einen Ansatz dafür bietet beispielsweise die Kopplung von Faktoren, die für den Erhalt der Stammzelleigenschaften notwendig sind, an synthetische Oberflächen. Ausgehend vom Bedarf an Kultur- oder Modellsystemen für die Expansion von (embryonalen) Stammzellen sollte in dieser Arbeit analysiert werden, ob alternierende Maleinsäureanhydrid (MA)-Copolymere ein geeignetes Trägersystem für die biofunktionelle kovalente Immobilisierung spezifischer Zytokine sind und dadurch unter anderem als künstliche Stammzellnische Anwendung finden können. MA-Copolymere eignen sich aufgrund ihrer spontanen Reaktion mit Aminogruppen für die Immobilisierung von Proteinen. Das Zytokin LIF (Leukemia inhibitory factor) existiert in vivo auch in immobilisierter Form und ist in embryonalen Mausstammzellen (mESC) allein in der Lage, das Stammzellpotential dieser Zellen zu erhalten. Aus diesem Grund ist LIF für die Analyse der Aufgabenstellung geeignet. Nach der Charakterisierung LIF-modifizierter Oberflächen wurde die biologische Verfügbarkeit des kovalent immobilisierten Zytokins mit Hilfe von LIF-sensitiven Fibroblasten und mESC der Linie R1 überprüft. Anschließend wurde im Mausmodell in vivo der Erhalt der Pluripotenz der mESC durch immobilisiertes LIF analysiert. Dafür standen die Oberflächen Poly(ethylen-alt-maleinsäureanhydrid) (PEMA) und Poly(octadecen-alt-maleinsäureanhydrid) (POMA) jeweils ohne und mit Polyethylenglykol (PEG7)-Modifizierung zur Verfügung, an die LIF kovalent gekoppelt wurde. Zusätzlich wurde LIF physisorptiv an einer Kollagen-Fibronektin-Matrix über hydrolysiertem POMA immobilisiert. Mit Hilfe von radioaktiv markiertem LIF konnte gezeigt werden, dass die Gesamtbeladungsmenge mit Zytokin von den Eigenschaften der MA-modifizierten Träger abhing. Auf PEMA konnten mit steigenden Immobilisierungskonzentrationen höhere Belegungsdichten an der Oberfläche erreicht werden, die im analysierten Bereich eine lineare Abhängigkeit zeigten. Aufgrund der starken Quellung in wässrigen Lösungen war eine Einlagerung von LIF-Molekülen in die Polymerschicht möglich und führte bei hohen Immobilisierungskonzentrationen auch nach 3 Tagen Inkubation mit proteinhaltigem Medium noch zur Verdrängung nicht kovalent gebundener Zytokinmoleküle aus PEMA-Oberflächen. Obwohl ein Teil des LIF in die Polymerschicht eindrang, war der Großteil der Moleküle für einen spezifischen Antikörper zugänglich. Hydrophobe Oberflächen mit POMA konnten bei hohen Immobilisierungskonzentrationen weniger LIF binden und zeigten Sättigungsverhalten der Oberflächen bei einer Belegungsdichte von 178 ng/cm^2 LIF. Eine Freisetzung von LIF nach mehr als 3 Tagen konnte nicht beobachtet werden. Gleichzeitig war hier aufgrund der hydrophoben Polymerseitenketten die Antikörperzugänglichkeit deutlich reduziert. Wegen des geringen Quellungsverhaltens von POMA in wässrigen Lösungen konnte eine Einlagerung des immobilisierten Zytokins in die Polymerschicht aber ausgeschlossen werden. Die kovalente LIF-Immobilisierung über PEG7-Spacer führte im Vergleich zu den nicht PEG-modifizierten Oberflächen PEMA und POMA zu jeweils geringeren Belegungsdichten, ohne dabei den Charakter der Abhängigkeit von der Immobilisierungskonzentration zu verändern (linear für PEMA+PEG7, Sättigung für POMA+PEG7). Die schlechte Antikörperzugänglichkeit von immobilisiertem LIF auf POMA konnte durch die Einführung des PEG7-Spacers deutlich verbessert werden und erreichte einen Wert ähnlich dem der hydrophilen PEMA-Oberflächen. Kovalent immobilisiertes LIF zeigte auf den vier MA-Oberflächen homogene und definiert einstellbare Belegungsdichten auf den einzelnen Proben. Die physisorptive Immobilisierung von LIF an extrazelluläre Matrixkomponenten auf hydrolysiertem POMA führte zu inhomogenen und bereits bei geringen Immobilisierungskonzentrationen instabilen Belegungsdichten. Die Einstellung definierter Belegungsdichten und die homogene Verfügbarkeit des Zytokins sind für die spätere Anwendung bei der Kultivierung wichtig, da so allen Zellen die gleiche definierte Zytokindosis unabhängig von der Oberflächencharakteristik präsentiert wird und Populationsunterschiede vermieden werden. LIF-sensitive Mausfibroblasten der Linie NIH3T3 reagierten auf immobilisiertes LIF mit der Aktivierung des Signalwegproteins STAT3. Durch den direkten Vergleich von STAT3-Aktivierungsprofilen nach Stimulation mit gelöstem oder immobilisiertem LIF konnte gezeigt werden, dass durch beide Präsentationsformen innerhalb der ersten 15 Minuten nach Stimulationsbeginn eine starke Aktivierung von STAT3 erfolgt, die anschließend wieder abklingt. Die Profile beider Präsentationsformen unterschieden sich in ihren Intensitäten nur bei der starken STAT3-Aktivierung. Dabei ergaben sich bei gelöstem LIF aufgrund der größeren Kontaktfläche mit Zytokin (gesamte Zelloberfläche) etwas stärkere Aktivierungen. Durch die sehr ähnlichen Aktivierungsprofile konnte nachgewiesen werden, dass das Zytokin LIF für Zellen zugänglich an MA-Copolymere mit und ohne Spacer-Modifizierung immobilisiert werden kann. Dabei lag ein Teil der Moleküle in einer Konformation und Orientierung gebunden vor, die die Funktionalität des Zytokins erhalten konnten. Zwischen den Oberflächen mit kovalenter LIF-Immobilisierung konnten keine wesentlichen Unterschiede in der STAT3-Aktivierung festgestellt werden. LIF war an all diesen Oberflächen für die LIF-sensitiven NIH3T3 Mausfibroblasten biologisch verfügbar. LIF-abhängige embryonale Mausstammzellen (mESC) reagierten nach 72 Stunden LIF-Stimulation mit der Aktivierung von STAT3. Bei Belegungsdichten ab 8 ng/cm^2 kovalent immobilisiertem LIF auf POMA mit und ohne PEG7-Spacer konnten ähnliche Aktivierungen wie durch die Stimulation mit gelöstem LIF festgestellt werden. Dies bestätigte die biofunktionelle LIF-Immobilisierung. Zwischen den POMA-Oberflächen mit und ohne PEG7 war dabei kein deutlicher Unterschied erkennbar. Eine reduzierte Zugänglichkeit des Antikörpers auf POMA beeinflusste demnach die biologische Verfügbarkeit des Zytokins für die mESC nicht. Der Erhalt des Stammzellpotentials durch kovalent an POMA gebundenes LIF konnte in vitro durch die Präsenz von Oct4 im Zellkern der mESC nachgewiesen werden. Durch die instabile Immobilisierung bei physisorptiver Assoziation des Zytokins an Matrixkomponenten über hydrolysiertem POMA reduzierte sich der Erhalt des Stammzellpotentials auf diesen Oberflächen stark. Kovalent immobilisiertes LIF dagegen konnte auch während der Kultur über mehrere Passagen hinweg die Pluripotenz der murinen ESC erhalten. Nach der Fusion mit Blastozysten beteiligten sich diese kultivierten Zellen in vivo erfolgreich an der Bildung von Chimären. Dabei konnten keine Unterschiede der Chimärenhäufigkeit zwischen der Kultivierung der mESC mit gelöstem oder kovalent an POMA immobilisiertem LIF festgestellt werden. Kovalent an MA-Copolymere immobilisiertes LIF ist demnach in der Lage, gelöstes LIF vollständig zu ersetzen und über mehrere Passagen hinweg allein das Stammzellpotential von mESC zu erhalten. Die Experimente zeigten, dass sich MA-Copolymere für die funktionelle kovalente Immobilisierung von Signalmolekülen eignen. Dabei konnten keine starken Unterschiede bei der Reaktion der Zellen auf die Oberflächen PEMA oder POMA festgestellt werden. Auch die Einführung eines zusätzlichen Spacers war für die Signaltransduktion nach Stimulation mit kovalent immobilisiertem LIF nicht notwendig. Für künftige Arbeiten zur kovalenten Immobilisierung von LIF an MA-Copolymeren ist deshalb aus Stabilitäts- und Effizienzgründen die Oberfläche POMA zu bevorzugen. Diese Favorisierung kann jedoch aufgrund der unterschiedlichen Tertiärstruktur anderer Proteine und ihrer verschiedenen Steifigkeiten sowie bei der Verwendung anderer Zelltypen nicht automatisch für ein anderes Modellsystem übernommen werden. Die Verwendung hydrophiler Oberflächen oder die Kopplung über Spacer sollte demnach in Abhängigkeit vom zu immobilisierenden Protein und den auszusiedelnden Zellen geprüft werden. Die vorgestellte Kopplungsmethode umgeht die Modifikation des Proteins sowie Behandlungen zur Vernetzung des Zytokins. Die Immobilisierungsreaktion ist bei Raumtemperatur und Umgebungsdruck sowie unter sterilen Bedingungen durchführbar. Immobilisierte Zytokine werden homogen kovalent an der Oberfläche gebunden und sind dort für die Zellen zugänglich. Außerdem ermöglicht die Einstellung definierter Belegungsdichten die gezielte Applikation von Zytokindosen. MA-Copolymere sind somit nicht nur für die Kultivierung von Stammzellen unter Erhaltung des Stammzellstatus einsetzbar, sondern eignen sich auch für Differenzierungsstudien. Teilergebnisse dieser Arbeit wurden publiziert unter K. Alberti, R.E. Davey, K. Onishi, S. George, K. Salchert, F.P. Seib, M. Bornhäuser, T. Pompe, A. Nagy, C.Werner, and P.W. Zandstra. Functional immobilization of signaling proteins enables control of stem cell fate. Nat Methods, 5(7):645–650, Jul 2008 und T. Pompe, K. Salchert, K. Alberti, P.W. Zandstra, and C. Werner. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protocols, 5(6):1042–1050, Jun 2010. / In vitro cultivation of (embryonic) stem cells requires a defined environment. Together different properties as cytokine supplement, extracellular matrix composition or topographic design can mimic this stem cell niche in an artificial system. For mouse embryonic stem cells the cytokine leukemia inhibitory factor (LIF) is able to keep those cells in undifferentiated state and to enhance self renewal without the supplement of other factors. In vivo LIF exists in both diffusible and extracellular matrix immobilized form. This work investigates whether LIF can be immobilized covalently to alternating maleic anhydride (MA)-copolymers in a functional manner. When bioavailable, covalently immobilized LIF should be able to interact with specific cytokine receptor subunits and provide information to keep murine embryonic stem cells in a pluripotent state. In aqueous solution with neutral pH (such as phosphate buffered saline, PBS) and ambient temperature and pressure MA-copolymers react spontaneously with aminogroups and therefore represent a useful support for covalent protein immobilization. Depending on the choice of co-monomer, properties of copolymer vary: ethylene results in hydrophilic poly-(ethylene-alt-maleic anhydride) (PEMA), octadecene in more hydrophobic poly-(octadecene-alt-maleic anhydride) (POMA). LIF can be covalently immobilized onto the MA-copolymers as shown by radiolabeling experiments. The amount of cytokine coupled to PEMA increased linear whereas on POMA saturation could be observed for higher concentrations. A subsequent coupling of a polyethylene glycol spacer (PEG7) further modified the properties and led to more hydrophilic surfaces. The amount of LIF per area decreased in comparison to MA-copolymers without the spacer but the graph characteristics remained unaltered (linear for PEMA+PEG7, saturation for POMA+PEG7). During the first three days in buffer solution supplemented with bovine serum albumin, unbound LIF was displaced and the amount of immobilized cytokine remained stable. This Stability after preincubation allowed to immobilize required amounts of LIF per area. Although hydrophilic surfaces with PEMA showed swelling behavior resulting in increased layer thickness after incubation in PBS, accessibility to LIF for an antibody was not impaired. The amounts per area detected by radiolabeling method and using the antibody were similar and indicated that LIF was not covered by copolymers. For cell culture addition of diffusible as well as immobilized growth factors or cytokines requires dosage control. Frequently it is necessary to provide homogeneous distribution of the factor of interest. In the present study analysis by fluorescence microscopy confirmed homogeneity for surfaces with covalently immobilized LIF (iLIF) but not for LIF physisorbed to extracellular matrix components collagen type I and fibronectin. LIF transduces signals via the JAK/STAT pathway. Preliminary experiments with LIF-sensitive fibroblasts showed similar activation of STAT3 after stimulation with immobilized or diffusible LIF. The results of STAT3 activation revealed an activation profile with high intensities within the first 15 minutes for both immobilized and diffusible LIF followed by decrease. STAT3 activation profiles were similar on different surfaces and independent of LIF presentation mode. These results revealed that fibroblasts could recognize covalently immobilized LIF onto MA-copolymers and were able to activate STAT3. In the absence of LIF mESC start to differentiate within 24 to 36 hours and loose their pluripotency. To confirm the functional immobilization of LIF mouse embryonic stem cells (mESC) were cultivated on iLIF-modified POMA or POMA+PEG7 surfaces for 72 hours and stained for activated STAT3. Results showed a dose-dependent activation increasing with the iLIF amount per area. Higher amounts (8 and 75 ng/cm^2) of iLIF activated STAT3 similar to 10 ng/ml diffusible LIF. Introduction of PEG7 spacer did not further increased STAT3 activation. Both, the amount of ESC marker Oct4 and the percentage of Oct4-positive cells increased with higher amounts of iLIF and showed similar results as obtained with 10 ng/ml diffusible LIF. Murine ESC cultivated on LIF physisorbed to matrix components expressed similar amounts of transcription factor Oct4 compared to unstimulated cells. STAT3 activation and Oct4 expression in the absence of diffusible cytokine indicated a functional covalent immobilization of LIF. To confirm the pluripotency, mESC were stimulated for 6 to 8 subcultures only with iLIF, cell aggregates were fused with mouse embryos and implanted in pseudopregnant surrogate mothers. Three weeks after birth the contribution of mESC aggregates to chimera was evaluated. ESC stimulated with iLIF only contributed to chimera formation with around the same frequency as mESC cultivated with 10 ng/ml diffusible LIF. Thus, iLIF maintained pluripotency of mESC during in vitro expansion and could replace diffusible LIF. As shown by the experiments, MA-copolymers provide a support to covalently immobilize cell signaling molecules in a functional manner. This method of coupling does not need any protein modification or cross-linking treatment after protein incubation. Reaction can be carried out under sterile conditions at ambient temperature and pressure. The immobilized ligand is distributed equally on the supporting copolymer and the adjustment of required ligand amounts is possible. These properties characterize MA-copolymers as a suitable support to immobilize cell signaling molecules not only for keeping the stem cell fate but also for differentiation studies. Parts of this work were published: K. Alberti, R.E. Davey, K. Onishi, S. George, K. Salchert, F.P. Seib, M. Bornhäuser, T. Pompe, A. Nagy, C.Werner, and P.W. Zandstra. Functional immobilization of signaling proteins enables control of stem cell fate. Nat Methods, 5(7):645–650, Jul 2008. T. Pompe, K. Salchert, K. Alberti, P.W. Zandstra, and C. Werner. Immobilization of growth factors on solid supports for the modulation of stem cell fate. Nat Protocols, 5(6):1042–1050, Jun 2010.

Graphitische Karbonitride sind organische, kovalent gebundene, geschichtete und kristalline Halbleiter mit einer hohen thermischen und chemischen Stabilität. Diese Eigenschaften machen 2D Schichten der graphitischen Kristalle potentiell nützlich für das Ziel, Limitationen von organischen 0D Molekularen und 1D polymerischen Halbleitern zu überwinden. Trotz dieser interessanten Eigenschaften haben nur wenige Publikationen erfolgreich graphitische Karbonitride in optoelektronischen Bauteilen eingesetzt. Um die Vorteile dieser Materialien nutzbar zu machen, wurden bessere Synthesebedingungen gesucht. Die Verwendung von einem Iod-Eutektikum zeigt, dass Anionen mit einem größeren Radius als Bromid nicht für die Stabilisation von graphitischen Karbonitriden geeignet sind. Das Optimieren der Synthesebedingungen von Poly(triazin-imid)-LiBr resultiert in der Reduzierung von einem kohlenstoffreichen Zersetzungsprodukt bei vollständiger Kondensation. Das Untersuchen der elektronischen Struktur mit ab initio Berechnungen ergibt, dass der elektronische VB-CB-Übergang verboten ist. Dies resultiert daraus, dass die Zustände des obersten Valenzbandes nichtbindender Natur sind. Ein Band aus nichtbindenden Elektronen als oberstes Valenzband ist vor allem aus „lone-pair semiconductors“ aus der sechsten Hauptgruppe bekannt. In der Welt organischer Halbleiter wurde dieses Phänomen bisher nicht beobachtet. Die geringe makroskopische elektrische Leitfähigkeit der PTI-Filme wurde mit der Leitfähigkeit auf Nanoebene verglichen, woraus gefolgert werden kann, dass der Ladungsträgertransport durch den nanokristallinen Charakter an den Kristall-Kristall Übergängen gestört wird. Die elektronische Leitfähigkeit, Mobilität der Ladungsträger sowie die Ladungsträgerdichte wurden untersucht. Die Energie Niveaus legen nahe das Elektronentransport in der Präsenz von Sauerstoff möglich ist. Die erste Applikation eines kovalenten organischen Netzwerks in einer organischen lichtemittierenden Diode ist gezeigt worden. / Graphitic carbon nitrides are organic covalently-bonded, layered, and crystalline semiconductors with high thermal and oxidative stability. These properties make 2D layers of graphitic carbon nitrides potentially useful in overcoming the limitations of 0D molecular and 1D polymer semiconductors. Only few reports have shown them being employed in optoelectronic applications. With the goal to find better reaction conditions that enable higher product quality from the ionothermal synthesis the size effect of anions is studied by using an iodide eutectic instead of bromide or chloride eutectic. The highest crystalline condensation product obtained is melem, revealing that the large iodide anion is not capable of stabilizing a graphitic structure. Studying the synthesis conditions of poly(triazine imide) (PTI), the best characterized graphitic carbon nitride in literature, it is revealed that the brown discoloration of the product is due to a carbon rich side product. Reduction of reaction temperature and increase of reaction time allows omittance of carbonisation. Analyzing the electronic structure with ab initio calculations one finds that the lowest energy electronic transition in PTI is forbidden due to a non-bonding uppermost valence band. A uppermost non-bonding valence band is most reminiscent of lone-pair semiconductors and unknown in the world of organic semiconductors making PTI the first organic lone-pair semiconductor. The low electrical conductivity of PTI derivatives is compared to nanoscale conductivity values. The results indicate that macroscopic conductivity is hampered by the nano-crystalline character due to charge carrier trapping at crystal interfaces. The effective mobility is in the range of amorphous organic semiconductors with an unexpectedly high carrier density. The energy levels in PTI-LiBr potentially enable environmentally stable n-transport. The first successful Application of a covalent organic framework in a organic light emitting diode is presented.

<p>Degradable polymers have gained an increased attention in the field of biomedical applications over the past decades, for example in tissue engineering. One way of improving the biocompatibility of these polymers is by chemical surface modification, however the risk of degradation during the modification procedure is a limiting factor. In some biomedical applications, for example in nerve guides, a patterned surface is desired to improve the cell attachment and proliferation.</p><p>In this thesis a new non-destructive, single-step, and solvent free method for surface modification of degradable polymers is described. Poly(L-lactide) (PLLA) substrates have been functionalized with one of the following vinyl monomers; N-vinylpyrrolidone (VP), acrylamide (AAm), or maleic anhydride (MAH) grafts. The substrates were subjected to a vapor phase atmosphere constituted of a mixture of a vinyl monomer and a photoinitiator (benzophenone) in a closed chamber at very low pressure and under UV irradiation. Poly(ε-caprolactone) (PCL), poly(lactide-co-glycolide) (PLGA), and poly(trimethylene carbonate) (PTMC) have been surface modified with VP using the same procedure to show the versatility of the method. The wettability of all of the four substrates increased after grafting. The surface compositions were confirmed by ATR-FTIR and XPS. The VP grafted PLLA, PTMC and PLGA substrates have been shown to be good substrates for the normal human cells i.e. keratinocytes and fibroblasts, to adhere and proliferate on. The topography of substrates with well defined nano patterns was preserved during grafting, since the grafted layer is very thin. We have also shown that the method is useful for a simultaneous chemical and topographical modification of substrates by masked vapor phase grafting. The surface topography was determined with SEM and AFM.</p> / <p>Intresset för användningen av nedbrytbara polymerer till biomedicinska applikationer som till exempel vävnads rekonstruktion har ökat avsevärt de senaste decennierna. Ett sätt att öka biokompatibiliteten hos dessa polymerer är genom kemisk ytmodifiering, men risken för nedbrytning under själva modifieringen är en begränsande faktor. I vissa biomedicinska applikationer, till exempel nervguider, är det önskvärt att ha en väldefinierad ytstruktur för att öka vidhäftningen och tillväxten av celler.</p><p>I den här avhandlingen presenteras en ny ickeförstörande, lösningsmedelsfri enstegsprocess för ytmodifiering av nedbrytbara polymerer. Substrat av poly(L-laktid) (PLLA) har ytfunktionaliserats med var och en av följande vinylmonomerer, N-vinylpyrrolidon (VP), akrylamid (AAm) eller maleinsyraanhydrid (MAH). Substraten har exponerats för en gasfasatmosfär av en blandning av en vinylmonomer och en fotoinitiator (bensofenon) i en tillsluten reaktor vid mycket lågt tryck och under UV-strålning. Metodens mångsidighet har även påvisats genom att ytmodifiera substrat av poly(ε-kaprolakton) (PCL), poly(laktid-co-glykolid) (PLGA) och poly(trimetylen karbonat) (PTMC) med VP. Vätbarheten ökade för alla fyra materialen efter ympning med en vinylmonomer. Ytsammansättningen fastställdes med ATR-FTIR och XPS. De VP ympade filmerna av PLLA, PLGA och PTMC visade sig vara bra substrat för mänskliga celler, i detta fall keratinocyter och fibroblaster, att vidhäfta och växa på. Yttopografin hos filmer med väldefinierade nanomönstrade ytor kunde bevaras efter ympning, tack vare att det ympade lagret är så tunt. Gasfas metoden har också visat sig användbar för att simultant ytmodifiera både kemiskt och topografiskt genom maskad gasfasympning. Yttopografin bestämdes med SEM och AFM.</p>

Degradable polymers have gained an increased attention in the field of biomedical applications over the past decades, for example in tissue engineering. One way of improving the biocompatibility of these polymers is by chemical surface modification, however the risk of degradation during the modification procedure is a limiting factor. In some biomedical applications, for example in nerve guides, a patterned surface is desired to improve the cell attachment and proliferation. In this thesis a new non-destructive, single-step, and solvent free method for surface modification of degradable polymers is described. Poly(L-lactide) (PLLA) substrates have been functionalized with one of the following vinyl monomers; N-vinylpyrrolidone (VP), acrylamide (AAm), or maleic anhydride (MAH) grafts. The substrates were subjected to a vapor phase atmosphere constituted of a mixture of a vinyl monomer and a photoinitiator (benzophenone) in a closed chamber at very low pressure and under UV irradiation. Poly(ε-caprolactone) (PCL), poly(lactide-co-glycolide) (PLGA), and poly(trimethylene carbonate) (PTMC) have been surface modified with VP using the same procedure to show the versatility of the method. The wettability of all of the four substrates increased after grafting. The surface compositions were confirmed by ATR-FTIR and XPS. The VP grafted PLLA, PTMC and PLGA substrates have been shown to be good substrates for the normal human cells i.e. keratinocytes and fibroblasts, to adhere and proliferate on. The topography of substrates with well defined nano patterns was preserved during grafting, since the grafted layer is very thin. We have also shown that the method is useful for a simultaneous chemical and topographical modification of substrates by masked vapor phase grafting. The surface topography was determined with SEM and AFM. / Intresset för användningen av nedbrytbara polymerer till biomedicinska applikationer som till exempel vävnads rekonstruktion har ökat avsevärt de senaste decennierna. Ett sätt att öka biokompatibiliteten hos dessa polymerer är genom kemisk ytmodifiering, men risken för nedbrytning under själva modifieringen är en begränsande faktor. I vissa biomedicinska applikationer, till exempel nervguider, är det önskvärt att ha en väldefinierad ytstruktur för att öka vidhäftningen och tillväxten av celler. I den här avhandlingen presenteras en ny ickeförstörande, lösningsmedelsfri enstegsprocess för ytmodifiering av nedbrytbara polymerer. Substrat av poly(L-laktid) (PLLA) har ytfunktionaliserats med var och en av följande vinylmonomerer, N-vinylpyrrolidon (VP), akrylamid (AAm) eller maleinsyraanhydrid (MAH). Substraten har exponerats för en gasfasatmosfär av en blandning av en vinylmonomer och en fotoinitiator (bensofenon) i en tillsluten reaktor vid mycket lågt tryck och under UV-strålning. Metodens mångsidighet har även påvisats genom att ytmodifiera substrat av poly(ε-kaprolakton) (PCL), poly(laktid-co-glykolid) (PLGA) och poly(trimetylen karbonat) (PTMC) med VP. Vätbarheten ökade för alla fyra materialen efter ympning med en vinylmonomer. Ytsammansättningen fastställdes med ATR-FTIR och XPS. De VP ympade filmerna av PLLA, PLGA och PTMC visade sig vara bra substrat för mänskliga celler, i detta fall keratinocyter och fibroblaster, att vidhäfta och växa på. Yttopografin hos filmer med väldefinierade nanomönstrade ytor kunde bevaras efter ympning, tack vare att det ympade lagret är så tunt. Gasfas metoden har också visat sig användbar för att simultant ytmodifiera både kemiskt och topografiskt genom maskad gasfasympning. Yttopografin bestämdes med SEM och AFM. / QC 20101014