Le [18F]Fluoro-éthoxybenzovesamicol ([18F]FEOBV) a été identifié comme étant un des agents radioactifs les plus prometteurs pour l'imagerie du transporteur vésiculaire de l'acétylcholine en utilisant la tomographie par émission de positrons (TEP). Nous rapportons ici que cette approche est en mesure de détecter de subtiles pertes de terminaux cholinergiques, comme celles associés avec le vieillissement ou suivant la lésion partielle du noyau basal de Meynert (NBM). Vingt-et-un rats adultes ont été distribués également en trois groupes : 1) Rats âgés (18 mois); 2) Jeunes rats (3 mois); et 3) Rats avec une lésion unilatérale du NBM induite par une infusion locale de saporine-IgG 192. Pour les rats normaux et ceux avec lésion, la plus haute valeur de liaison du [18F]FEOBV a été observée dans le striatum, suivi de valeurs similaires dans le cortex frontal et le thalamus, puis de valeurs plus faibles pour les hippocampes et le cortex temporo-pariétal. Les rats avec lésion du NBM ont démontré une liaison de [18F]FEOBV diminuée principalement dans la partie ventrale du cortex frontal. Cette perte est plus importante du côté de la lésion, mais également présente dans la région homologue de l'hémisphère controlatéral. Le vieillissement a entraîné une diminution de liaison de [18F]FEOBV localisée dans les hippocampes. Le [18F]FEOBV semble être une marqueur très prometteur pour la quantification in vivo du transporteur vésiculaire de l'acétylcholine dans le cerveau; l'imagerie TEP avec cet agent permet la détection de réductions physiologique et pathologique de la densité des terminaisons cholinergiques. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Tomographie par émission de positrons, transporteur vésiculaire de l'acétylcholine, neurodégénérescence, vieillissement, saporine-IgG 192, [18F]Fluoro-éthoxybenzovesamicol

Au niveau de la jonction neuromusculaire (JNM) squelettique de Vertébrés, deux enzymes d'une remarquable efficacité peuvent hydrolyser l'acétylcholine (ACh) : l'acétylcholinestérase (AChE) et la butyrylcholinestérase (BChE). L'hydrolyse de l'ACh dépend non seulement de l'activité enzymatique de l'AChE et de la BChE mais également de leur localisation. Ces deux enzymes semblent posséder des capacités fonctionnelles différentes dont l'importance relative n'a pas encore été établie.<br />Nous avons choisi une approche génétique pour analyser le rôle des cholinestérases dans la transmission neuromusculaire. Nous disposons de plusieurs lignées de souris qui présentent un déficit dans l'hydrolyse de l'ACh à la jonction neuromusculaire. Certaines de ces souris génétiquement modifiées n'ont plus d'activité enzymatique AChE (souris AChE KO) dans tous les tissus, d'autres ne possèdent que la forme moléculaire soluble de l'AChE (souris AChE Del E5,6), d'autres sont dépourvues de la forme ancrée à la membrane par un glycophospholipide (souris AChE Del E5/neo) ou des formes ancrées à la membrane par PRiMA (souris PRiMA KO) ou totalement de BChE (souris BChE KO). La caractérisation des JNM de ces souris par des approches électrophysiologiques et de microscopie confocale nous a permis d'appréhender les rôles des différentes formes moléculaires des cholinestérases dans la transmission neuromusculaire ainsi que les éventuelles adaptations pré- et postsynaptiques qui conditionnent l'efficacité synaptique.<br />Malgré l'absence totale ou partielle d'AChE, les souris développent des contractions tétaniques dans une gamme de fréquences physiologiques (10 à 100 Hz) mais ne peuvent pas les maintenir constantes à des fréquences supérieures à 30 Hz. Chez ces souris, l'inhibition de la BChE entraîne une accentuation de la dépression de ces réponses, ce qui suggère que la BChE joue un rôle de modulateur dans la transmission synaptique. De plus, les cours temporels des réponses synaptiques enregistrées au niveau des JNM sont augmentés de par l'activation répétitive des récepteurs nicotiniques de l'ACh (RnACh) par l'ACh. Enfin, des remodelages pré- et postsynaptiques post-nataux ont été mis en évidence au niveau des JNM. Ces remodelages synaptiques sont probablement dus à l'adaptation des RnACh et des terminaisons nerveuses motrices face à l'absence d'activité enzymatique de l'AChE.<br />Nous proposons que, chez ces souris génétiquement modifiées, la petite taille des aires de distribution des RnACh ainsi que la discontinuité des amas de ces récepteurs et de celle des terminaisons nerveuses permettent à l'ACh de diffuser facilement et rapidement hors de la fente synaptique.

L'utilisation des produits phytosanitaires est indispensable pour augmenter la qualité des productions agricoles. Cependant les directives européennes et nationales préconisent une réduction de 50 % de leur utilisation pour préserver l'environnement et limiter les effets secondaires sur les organismes non-cibles. Dans cette optique, et pour optimiser l'efficacité de ces produits tout en diminuant leur dose d'utilisation, il est nécessaire de caractériser les facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans la modulation de l'effet insecticide de ces composés sur leurs cibles membranaires. Parmi les insecticides les plus utilisés en agriculture, les néonicotinoïdes occupent une place importante sur le marché. Ils ont pour cible les récepteurs à l'acétylcholine de type nicotinique (nAChRs) du système nerveux central des insectes. Chez la blatte Periplaneta americana, des cellules neurosecrétrices identifiées, les neurones DUM, expriment deux sous-types de nAChRs, (nAChR1 et nAChR2). Alors que nAChR1 est sensible à l'imidaclopride (IMI), néonicotinoïde de première génération, cet insecticide ne présente aucun effet sur nAChR2. Afin d'obtenir une meilleure compréhension du mode d'action de ces insecticides sur des nAChRs insensibles, l'objectif de ce travail de recherche a été de caractériser du point de vue électro-pharmacologique les facteurs cellulaires et moléculaires qui influencent l'efficacité d'un insecticide néonicotinoïde de seconde génération, l'acétamipride (ACT) qui présente des caractéristiques chimiques différentes de l'IMI. Grâce à la technique électrophysiologique du patch-clamp, dans des conditions de potentiel imposé, il a été possible de démontrer que l'effet de l'ACT sur nAChR2 dépend du potentiel de membrane. Une dépolarisation de la membrane augmente légèrement la sensibilité de nAChR2 pour l'ACT alors qu'une hyperpolarisation produit un effet inverse significatif. Dans les deux cas, l'implication du calcium intracellulaire a été démontrée. Pour des potentiels plus positifs que le potentiel de membrane (i.e., -50 mV), l'inhibition de l'influx calcique via l'activation des canaux calciques à haut seuil d'activation (High Voltage- Activated) par le chlorure de cadmium et l'ω-conotoxine GVIA augmente la sensibilité de nAChR2 pour l'ACT. Des effets similaires sont obtenus pour des potentiels de membrane plus hyperpolarisés lorsque la perméabilité calcique est inhibée par le LOE 908, un inhibiteur des canaux TRPγ. Dans ce dernier cas, l'utilisation d'outils pharmacologiques spécifiques (e.g., forskoline, W7) a permis de révéler que la voie de signalisation intracellulaire AMPcyclique/adenylate cyclase est impliquée dans la modulation de l'efficacité de l'ACT sur nAChR2. Enfin, des mesures de la résistance membranaire, réalisées en parallèle dans des conditions de courant imposé, indiquent que l'état conformationnel des nAChR2 joue également un rôle important dans la modulation de l'efficacité de l'ACT. L'ensemble de ces résultats qui ont permis d'identifier de nouveaux facteurs cellulaires et moléculaires impliqués dans la modulation de l'efficacité d'un néonicotinoide, l'ACT ouvrent des perspectives très intéressantes pour optimiser l'efficacité d'un traitement insecticide.

ColQ est un collagène spécifique ancrant l'acétylcholinestérase (AChE) dans la fente synaptique de la jonction neuromusculaire (JNM). L'importance du complexe AChE-ColQ dans le fonctionnement de cette synapse a été révélée par l'identification de mutations dans le gène humain codant pour ColQ qui sont à l'origine du syndrome myasthénique congénital avec déficience en AChE (SMC-1c). Les défauts présents chez les patients et le phénotype des souris ColQ-/- modèles pour le SMC-1c sont complexes, la déficience en AChE ne rendant probablement pas compte de tous les symptômes. Nous avons donc fait l'hypothèse que ColQ pourrait réguler la formation de la JNM afin d'expliquer certains des défauts observés. J'ai montré que ColQ régule l'expression des sous-unités du récepteur de l'acétylcholine (RACh) via le récepteur tyrosine kinase MuSK, molécule clé dans la formation de la synapse et cela indépendamment de l'AChE. La conséquence de cette régulation est que ColQ contrôle la formation des agrégats de RACh impliqués dans la transmission synaptique. Par ailleurs, mes résultats ont révélé que l'absence de ColQ entraîne une réduction de l'expression de MuSK à la membrane. Cette observation prend tout son intérêt dans un contexte clinique montrant que certains symptômes sont communs aux patients atteints du SMC-1c et du SMC lié à des mutations de MuSK. De plus, des signes d'atrophie musculaire ont été découverts chez la souris ColQ-/- pouvant laisser penser à une dénervation au moins partielle du muscle en absence de ColQ. Mes recherches ont ainsi permis de mettre en évidence des modifications pouvant être à l'origine des défauts fonctionnels observés lorsque ColQ est muté ou absent.

Introduction. Plusieurs maladies neurodégénératives bénéficieraient de meilleures ap-proches diagnostiques, dont la maladie d’Alzheimer. Celle-ci affecte en particulier les systèmes cholinergiques du SNC, et de nombreuses études d’imagerie ont tenté d’évaluer la dégénérescence de ce système à des fins diagnostiques, à l’aide de ligands radioactifs de diverses composantes du système ACh. En définitive, la plupart de ces études ne se sont pas montrées satisfaisantes. À la recherche de meilleures approches dans ce domaine, nous avons décidé d’évaluer les possibilités offertes par le (-)-[18F]Fluoroethoxy-benzovesamicol ((-)-[18F]FEOBV), un agent émetteur de positons se liant au VAChT de façon spécifique et réversible. Avant d’en arriver à une utilisation humaine cependant, une validation animale en plusieurs étapes s’avère nécessaire, mais celle-ci nous est apparue justifiée à la lumière de résultats d’études préliminaires en TEP chez le rat, qui se sont montrées très prometteuses. Nous nous sommes donc attaqués à la caractérisation du métabolisme de cet agent. Ceci a exigé, dans un premier temps, la mise au point d’une méthode chromatographique d’analyse des métabolites sanguins et, dans un deuxième temps, l’évaluation de ces métabolites et de leur cinétique chez le rat. Ces données permettront ultérieurement, chez l’humain, de procéder à des études quantitatives en TEP. Étude #1: Une fois les paramètres chromatographiques optimisés, le TR du (–)-FEOBV fut établi à 7.92 ± 0.18 minutes. Étude #2 : Le métabolisme in vivo s’est montré très rapide et temporellement variable, mais un seul métabolite hydrophile a été identifié. La fonction d’apport au cerveau du (–)-[18F]FEOBV a pu être établie après correction pour la présence du métabolite détecté. Conclusion. Dans l’ensemble, le (–)-[18F]FEOBV semble très prometteur en tant que marqueur biologique du système cholinergique pré-synaptique. / Background. Several neurodegenerative diseases would benefit from better diagnostic tools, and Alzheimer’s disease is an obvious point in case. Of interest, that disease par-ticularly affects CNS cholinergic systems. Many studies have evaluated neurodegenera-tion in that system during the course of Alzheimer’s disease, some using imaging tech-niques with radioactive ligands targeting the cholinergic system. However, most of those studies have shown rather unsatisfying results. Therefore, our team has decided to evaluate a so far never used in primates positron emitting ligand of the VAChT which reversibly binds to its target, (-)-[18F]Fluoroethoxy-benzovesamicol ((-)-[18F]FEOBV). Of course, before being able to use this ligand in a clinical setting, a multi-step animal validation needs to be performed. As initial experiments with PET imaging yielded encouraging results, assessing the metabolism of (-)-[18F]FEOBV was the next logical step. First, an HPLC methodology had to be developed to analyse blood metabolites. Then, we were able to use that methodology to analyse metabolites and their kinetics in the rat. That data will allow quantitative studies in humans with PET. Study #1: After the chromatographic parameters had been optimised, the TR of (–)-FEOBV was established at 7.92 ± 0.18 minutes. Study#2 In vivo metabolism was found to be fairly rapid and somewhat temporally variable, but a lone hydrophilic metabolite was identified. The plasmatic input function was obtained and corrected for metabolism. Conclusion. Overall, (–)-[18F]FEOBV holds promise as a potential ACh system pre-synaptic marker.

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Afin de subvenir aux besoins et au bon développement du fœtus, la femme enceinte subit de nombreux changements cardiovasculaires. Notamment, la grossesse cause une accélération significative de la fréquence cardiaque au repos, créant ainsi un environnement arythmogène. Les arythmies supraventriculaires sont les arythmies cardiaques les plus fréquentes pendant la grossesse. Les femmes peuvent développer des arythmies de novo, tandis que d’autres peuvent voir leurs arythmies préexistantes exacerbées pendant leur grossesse. Bien que les arythmies supraventriculaires puissent compromettre la santé de la mère et du fœtus, les mécanismes qui en sont responsables restent à être explorés. Puisque les arythmies supraventriculaires peuvent être d’origine sinusale et auriculaire, l’objectif principal de cette thèse était de déterminer la contribution du remodelage du nœud sinusal et des oreillettes dans la survenue de ces arythmies. Depuis près de 20 ans, le laboratoire s’est intéressé aux mécanismes sous-jacents à l’accélération de la fréquence cardiaque associée à la grossesse. Plus précisément, le rôle des courants ioniques responsables de la dépolarisation diastolique et de la dépolarisation principale du potentiel d’action spontané du nœud sinusal ont été étudiés. Toutefois, bien que les courants ioniques responsables de la phase de repolarisation sont tout aussi importants dans l’automaticité cardiaque, le remodelage des courants K+ par la grossesse n’a pas encore été étudié. Ainsi, la première étude de cette thèse avait pour but d’examiner la contribution du courant potassique activé par l’acétylcholine (IKACh) dans l’accélération de l’automaticité cardiaque pendant la grossesse. Sachant que le remodelage des oreillettes peut également contribuer au développement d’arythmies supraventriculaires, le but de la deuxième étude était d’explorer le remodelage électrique, structurel et contractile des oreillettes pendant la grossesse. Afin de répondre aux objectifs de cette thèse, une analyse détaillée a été réalisée in vivo, sur les tissus et/ou les cellules isolées du nœud sinusal et des oreillettes de souris femelles non-gestantes et gestantes. Dans la première étude, nous avons montré que la fonction de IKACh, l’expression d’une des sous-unités formant le canal ionique (Kir3.1/Kcnj3) et l’expression du récepteur muscarinique de type 2 (M2R) sont diminuées dans le nœud sinusal de souris gestantes. En accord avec ces changements, des études cellulaires et in vivo ont montré que la réponse du nœud sinusal aux agents muscariniques est réduite pendant la grossesse. Les résultats de cette étude suggèrent que la réduction de IKACh contribue à l’accélération de la fréquence cardiaque pendant la grossesse. Dans la seconde étude, nous avons démontré que les oreillettes de souris gestantes subissent une hypertrophie physiologique, en plus d’une augmentation de leur fonction contractile. Cette augmentation de contraction est expliquée par 1) un remodelage des unités contractiles cellulaires, soit les sarcomères, et 2) un prolongement de la durée du potentiel d’action auriculaire expliqué par la réduction du courant potassique transitoire sortant indépendant du Ca2+ (Ito) et de l’expression de son canal potassique KV4.3 (Kcnd3). Par ailleurs, des contractions spontanées et des relâches spontanées de Ca2+ diastoliques sont plus fréquemment observés dans les oreillettes de souris gestantes. Ce remodelage structurel, contractile et électrique des oreillettes crée un environnement favorable au développement d’arythmies supraventriculaires pendant la grossesse. Ces études permettent une meilleure compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables du remodelage du nœud sinusal et des oreillettes causés par la grossesse. Les nouvelles connaissances acquises dans ces études sont d’une grande importance pour la santé des femmes et, à terme, pourraient permettre d’améliorer la gestion des arythmies induites par la grossesse. De nos jours, ce sujet de recherche est encore plus essentiel, considérant l’âge maternel avancé et la présence de comorbidités chez les femmes enceintes, des facteurs de risque supplémentaires d’arythmies cardiaques. / Pregnant women undergo several cardiovascular changes to support the needs and the healthy development of their fetus. Notably, pregnancy causes a significant acceleration in resting heart rate, creating an arrhythmogenic environment. Supraventricular arrhythmias are the most frequent type of cardiac arrhythmias during pregnancy. Some women may develop arrhythmias de novo, while others may have their pre-existing arrhythmias exacerbated during pregnancy. Although supraventricular arrhythmias can compromise the health of both the mother and fetus, their underlying mechanisms remain to be explored. Considering that supraventricular arrhythmias can be of both nodal and atrial origin, the main objective of this thesis was to determine the contribution of sinoatrial node and atrial remodeling to the occurrence of these arrhythmias. For almost 20 years, the laboratory has been investigating the mechanisms underlying the accelerated heart rate associated with pregnancy. More specifically, the role of ionic currents responsible for the diastolic depolarization and the main depolarization of the spontaneous action potential of the sinoatrial node has been studied. However, although the ionic currents responsible for the repolarization are equally important in cardiac automaticity, the remodeling of K+ currents by pregnancy has yet to be investigated. Therefore, the aim of the first study presented in this thesis was to examine the acetylcholine-activated K+ current IKACh during pregnancy and its contribution to the increased cardiac automaticity. Since atrial remodeling may also contribute to the development of supraventricular arrhythmias, the aim of the second study was to explore the electrical, structural, and contractile remodeling of the atria during pregnancy. To meet the objectives of this thesis, a detailed analysis was carried out in vivo, on tissue and/or isolated cells from the sinoatrial node and atria of non-pregnant and pregnant female mice. In the first study, we showed that the function of IKACh as well as the expression of one of its ion channel-forming isoforms (Kir3.1/Kcnj3) and the type 2 muscarinic receptor (M2R) is decreased in the sinoatrial node of pregnant mice. In line with these changes, the responsiveness to muscarinic agents of sinoatrial node is reduced during pregnancy, at cellular level and in vivo. These results strongly suggest that reduced IKACh may contributes to pregnancy-induced increased heart rate. In the second study, we demonstrated that the atria of pregnant mice undergo physiological hypertrophy, in addition to an increase in their contractile function. This increase in contraction is explained by 1) the remodeling of cellular contractile units, i.e. the sarcomeres, and 2) a prolongation of atrial action potential duration explained by a reduction in the Ca2+-independent transient outward K+ current (Ito) and expression of its underlying K+ channel KV4.3 (Kcnd3). Moreover, spontaneous contractions and spontaneous diastolic Ca2+ releases are more frequently observed in atrial myocytes of pregnant mice. Collectively, this structural, contractile, and electrical remodeling of the atria may contribute to the development of supraventricular arrhythmias during pregnancy. These studies provide a better understanding of the cellular and molecular mechanisms responsible for the pregnancy-induced remodeling of the sinoatrial node and atria. The new knowledge gained from these studies is of great importance to women's health and may ultimately help to improve the management of pregnancy-induced arrhythmias. Nowadays, this area of research is even more essential considering the advanced maternal age and the presence of comorbidities in pregnant women, additional risk factors for cardiac arrhythmias.