Les PLLs sont une famille d’enzyme dont l’activité catalytique est double. L’activité lactonase permet entre autre de détruire les AHLs, molécules médiatrices de la communication chez les bactéries Gram négatives, empêchant ainsi la synchronisation à l’échelle de la population de la sécrétion de facteurs de virulence ou la formation de biofilm. Elles sont non seulement capables d’hydrolyser les molécules possédant un noyau lactone, mais aussi les phosphotriésters par promiscuité de substrat. L’activité phosphotriestérase permet de dégrader les composés organophosphorés (OPs) hautement toxiques, que ce soit les insecticides (Paraoxon) ou les agents neurotoxiques de guerre (Sarin, VX). Les travaux effectués ont consisté à évaluer l’efficacité de la PLL SsoPox, provenant de l’archée extrêmophile Sulfolobus solfataricus, pour empêcher la mise en place de la virulence et du biofilm chez Pseudomonas aeruginosa PAO1. Cette évaluation a été effectuée in vitro et in vivo via un modèle d’infection pulmonaire chez le rat. D’autre part, une étude in vitro a été réalisée sur 73 souches cliniques de P. aeruginosa isolés sur des patients atteints de pied diabétique, en évaluant la quantité de pyocyanine et l’activité protéolytique. Enfin, une phase prospective pour identifier de nouvelles PLLs a permis la caractérisation enzymatique et structurale de 2 nouvelles enzymes, SacPox et VmoLac, contribuant ainsi à affiner la connaissance sur cette famille et leur potentiel d’amélioration par ingénierie protéique. Au final, les PLLs offrent un intérêt biotechnologique majeur et peuvent mener à une valorisation concrète pour la santé humaine mais également pour la bioremédiation des OPs. / Phosphotriesterase-Like Lactonases (PLLs) are a family of enzyme displaying a dual catalytic activity. Lactonase activity allows for, among others, the destruction of Acyl Homoserine Lactones (AHLs). These molecules mediate the communication in Gram negative bacteria, allowing them to synchronize group behavior like virulence factor secretion or biofilm formation. Beside their ability to hydrolyze molecules with a lactones moiety, PLL also show substrate promiscuity for hydrolyzing highly toxic organophosphate compounds (OPs), such as pesticides (i.e. Paraoxon) or Chemical Warfare Nerve Agents (CWNAs) (e.g. Sarin & VX). The work described here consisted in evaluating the efficacy of the PLL SsoPox, originating from the extremophile Archaea Sulfolobus solfataricus, to prevent virulence and biofilm formation on the model strain Pseudomonas aeruginosa PAO1. This evaluation was performed both in vitro and in vivo, by using a rat pulmonary infection model. A study has been performed on a strain collection of 73 clinical strains of P. aeruginosa isolated from diabetic foot, to assess the enzyme effects on pyocyanin secretion and protease activity. Finally, a prospective phase to identify new PLLs allowed for the enzymatic and structural characterization of two new enzymes, SacPox and VmoLac, thus contributing to refine the knowledge about this enzyme family and their engineering potential. In conclusion, PLLs are of prime biotechnological interest and could lead to developments in human health, but also for OPs bioremediation with a non aggressive decontamination solution.

Les organophosphorés (OPs) sont des composés neurotoxiques qui sont largement utilisés comme pesticides. Cette utilisation intensive a conduit à une importante pollution des sols et des effluents agricoles et sont retrouvés jusque dans les aliments. Ces pesticides sont responsables de 300 000 morts à travers le monde. Les OPs ont également été développés comme agents neurotoxiques de guerre tel que le sarin. Actuellement, il n’existe pas de méthode de décontamination externe satisfaisante pour dégrader les OPs, c’est pourquoi l’utilisation d’enzymes est une stratégie attractive. Parmi les enzymes capables de dégrader les OPs, les phosphotriestérases (PTEs) sont les plus actives mais sont peu stables ce qui limite leurs applications. Les enzymes hyperthermostables ont donc été considérées. Ainsi l’enzyme SsoPox, isolée de l’archée Sulfolobus solfataricus ayant une activité lactonase et une activité de promiscuité phosphotriestérase, a été plus particulièrement étudiée. SsoPox est extrêmement robuste mais son activité phosphotriestérase est en revanche plus faible. Une stratégie d’ingénierie protéique a été réalisée afin d’obtenir un compromis entre l’activité d'une PTE et la stabilité de SsoPox. En utilisant les similarités structurales entre ces deux enzymes, une base de données mutationnelle a été réalisée pour transférer le site actif hautement performant d’une PTE dans la structure hyperstable de SsoPox. Cette stratégie a permis d’obtenir des variants de SsoPox améliorés jusqu’à 2000 fois. L'efficacité de ces variants a été démontrée in vivo chez un modèle animal, la planaire, permettant d'améliorer la survie ainsi que la mobilité et la capacité de régénération. / Organophosphates (OPs) are neurotoxic compounds widely used as pesticides. Over the years, utilization of OP led to a considerable environmental contamination of soils and agricultural wastewaters, this pollution is furthermore a major health issue as these insecticides can be found in food. OP are highly toxic and are responsible for 300,000 deaths in the world every year. OPs were also developed as chemical warfare nerve agents such as sarin. Currently, no satisfying method for external decontamination is available, therefore bioremediation with enzymes is highly appealing. Among OP degrading enzymes, phosphotriesterases (PTEs) are the most active biocatalysts but are poorly stable what hinders their potential for bioremediation. Hyperthermostable enzymes from extreme environments were thus considered to circumvent this limitation. In particular, SsoPox isolated from the archaeon Sulfolobus solfataricus, displaying a lactonase activity and a promiscuous phosphotriesterase activity was deeply investigated. SsoPox is extremely robust but its activity for OP degradation is from far lower. A protein engineering strategy was started in order to reach a compromise between PTE activity and SsoPox robustness. Using structural similarities between PTEs and SsoPox, a mutational database was designed in order to transfer the highly performant active site of PTE into the hyperstable scaffold of SsoPox. This strategy led to variants displaying up to 2,000-fold increase against OPs as compared to wild-type enzyme. The variants efficiency was demonstrated in vivo using an original animal model planarian, allowed to enhance survival rate as well as mobility and regeneration capacity.

Gram-negative bacteria use N-acyl homoserine lactones (AHLs) to sense population density and regulate gene expression, including virulent phenotypes. The quorum-quenching AHL lactonase from Bacillus thuringiensis cleaves the lactone ring of AHLs, disabling this mode of gene regulation. Despite the potential applications of this enzyme as an antibacterial weapon, little was known about it's lactone ring-opening mechanism. As a member of the metallo-beta-lactamase superfamily, AHL lactonase requires two divalent metal ions for catalysis. NMR experiments confirm that these metal ions are also involved in proper enzyme folding. The chemical mechanism of ring opening was explored using isotope incorporation studies, and hydrolysis was determined to proceed via a nucleophilic attack by a solvent-derived hydroxide at the carbonyl of the lactone ring. A transient, kinetically significant metal-leaving group interaction was detected in steady-state kinetic assays with AHL lactonase containing alternative divalent metal ions hydrolyzing a sulfur-containing substrate. High-resolution crystal structures implicated two residues in substrate binding and hydrolysis, Tyr194 and Asp108. Site-directed mutagenesis of these residues followed by steady-state kinetic studies with wild-type and mutant enzymes hydrolyzing a spectrum of AHL substrates revealed that mutations Y194F and D108N significantly affect catalysis. Combining these results allows the proposal of a detailed hydrolytic mechanism. The binding site for the N-acyl hydrophobic moiety was probed using steady-state kinetics with a variety of naturally occurring and non-natural AHL substrates, and these studies indicate that AHL lactonase will accept a broad range of homoserine lactone containing substrates. Crystal structures with AHL substrates and non-hydrolyzable analogs reveal two distinct binding sites for this N-acyl group. Based on the ability of this enzyme to accommodate a variety of substrates, AHL lactonase was shown to have the ability to quench quorum sensing regulated by a newly discovered class of homoserine lactone signal molecules possessing an N-aryl group using a bioassay. Steady-state kinetic studies confirm that this class of signal molecules are indeed substrates for AHL lactonase. / text

Issue de l'Archaea extrêmophile Sulfolobus solfataricus, SsoPox est une enzyme à fort potentiel biotechnologique du fait de son extrême stabilité. Nous avons caractérisé son activité lactonase naturelle ainsi que son activité de promiscuité phosphotriestérase. Elle est capable d'hydrolyser les organophosphorés (OPs), des agents neurotoxiques utilisés en tant qu'insecticide et arme chimique de guerre dont les méthodes actuelles de décontamination restent insatisfaisantes. Non optimale, l'activité phosphotriestérase de SsoPox a été améliorée en redessiné in silico son site actif de afin qu'il ressemble à celui des PTEs, hydrolysant très efficacement les OPs. L'enzyme ainsi développée offre des perspectives d'utilisation pour la décontamination des pollutions aux OPs. L'activité lactonase de l'enzyme a également été améliorée envers certaines N-Acyl Homosérine Lactones (AHLs), des molécules impliquées dans la communication inter-bactérienne (quorum sensing). Or, le quorum sensing régule notamment la virulence bactérienne (e.g. Pseudomonas aeruginosa). Ainsi, l'utilisation de lactonases telles que SsoPox constituerait une alternative aux antibiotiques par interférence au quorum sensing (i.e. quorum quenching). L'ensemble de ces travaux a conduit au dépôt d'un brevet protégeant les séquences des variants améliorés ainsi que leurs domaines d'applications. Ils permirent également d'étudier des phénomènes clés dans l'évolution des enzymes tels que l'épistasie, la promiscuité et la flexibilisation. Ce projet, mêlant Sciences fondamentales et appliquées, pourrait, in fine, mener à la valorisation d'un projet de recherche académique. / Issued from the extremophilic Archaea Sulfolobus solfataricus, SsoPox exhibits an important biotechnological potential because of its extreme stability. Belonging to the phosphotriesterase-like lactonase family, its natural lactonase and promiscuous phosphotriesterase activities were characterized. The enzyme is able to hydrolyze organophosphates (OPs), i.e. nerve agents used as insecticides and chemical warfare agents for which current methods of decontamination are unsatisfactory. The phosphotriesterase activity of SsoPox is suboptimal unlike some mesophilic enzymes (PTEs). To develop a robust bio-decontaminant of OPs, we redesigned, in silico, SsoPox active site in the aim to mimic that of PTEs. Using a mutation database in an in vitro evolution protocol, we screened, selected and characterized efficient enzymes for OPs insecticides hydrolysis, offering prospects in OPs decontamination. SsoPox lactonase activity was also improved for some N-Acyl Homoserine Lactones (AHLs), molecules involved in the inter-bacterial communication (quorum sensing). Quorum sensing regulates several functions such as virulence of some pathogens (e.g. Pseudomonas aeruginosa). The use of lactonases such as SsoPox could constitute an alternative to antibiotics by quorum sensing (and thus virulence) inhibition (i.e. quorum quenching). These works were patented, protecting the sequences of improved variants and their fields of application. They also allowed to study key phenomena in enzyme evolution such as epistasis, promiscuity and flexibility. This project, combining basic and applied Sciences, could lead, in fine, to the promotion of an academic research project.

L'émergence de bactéries résistantes à plusieurs classes d'antibiotiques rend difficile le traitement des pneumonies nosocomiales. Notre objectif était d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques et hypothèses physiopathologiques dans des modèles murins de pneumonie.Dans un premier modèle de pneumonie aigue létale à A. baumannii chez le rat, nous avons comparé la virulence de 2 souches nosocomiales, l'une sensible (ABCS) et l'autre résistante (ABCR) à la colistine. Nous avons montré une diminution de la mortalité, du compte bactérien pulmonaire, de l'incidence des bactériémies et des lésions histologiques pulmonaires chez les animaux infectés avec ABCR, ceci confirmant la baisse de virulence associée à l'acquisition de la résistance à la colistine. Dans un second travail, nous avons développé un modèle de pneumonie chronique à P. aeruginosa chez le rat et montré que des aérosols de squalamine permettaient une diminution de la charge bactérienne pulmonaire et du nombre de lésions histologiques de pneumonie. Au cours d'un troisième travail, nous avons évalué l'effet inhibiteur du quorum sensing d'une lactonase in vitro et dans un modèle de pneumonie aigue létale à P. aeruginosa chez le rat. Nous avons constaté une diminution de l'activation de gènes de virulence et de la synthèse de biofilm bactérien in vitro. Ceci était associé à une diminution de la mortalité de 75 à 20 % chez les animaux traités.ConclusionsCe travail de thèse nous a permis de montrer le potentiel thérapeutique de 2 molécules dans des pneumonies à P. aeruginosa et d'illustrer la perte de virulence associée à la résistance à la colistine dans une souche clinique d'A. baumannii. / The emergence multi-drug resistant bacteria hardens the treatment of nosocomial pneumonia. Our objective was to evaluate new therapeutic strategies and pathophysiological hypotheses in murine models of pneumonia.In a first model of acute lethal pneumonia with A. baumannii in rats, we compared the virulence of two hospital strains, one susceptible (ABCS) and the other resistant (ABCR) to colistin. We showed a reduction in mortality, pulmonary bacterial count, incidence of bacteremia and pulmonary histological lesions in animals infected with ABCR. This confirms the impaired virulence associated with the acquisition of resistance to colistin. In a second study, we developed a model of chronic pneumonia with P. aeruginosa in rats and showed thataerosols of squalamine permitted a reduction in pulmonary bacterial load and the number of histological lesions of pneumonia. In a third study, we evaluated the quorum quenching effects of a lactonase in vitro and in a model of acute lethal P. aeruginosa pneumonia in rats. We found a decrease in virulence gene activation and bacterial biofilm synthesis in vitro. This was associated with a decreased mortality from 75 to 20% in the treated animals.ConclusionsIn this work, we described the therapeutic potential of 2 molecules in P. aeruginosa pneumonia and illustratesd the loss of virulence associated with resistance to colistin in a clinical strain of A. baumannii.

Le but de ce travail était d'identifier les fonctions régulées par quorum-sensing (QS) chez la bactérie phytostimulatrice Azospirillum. Les effets phytobénéfiques in vitro des souches B518 et TVV3 (isolées du riz) ne sont pas altérées par l'inactivation des molécules signal impliquées dans le QS. La combinaison d'une approche ciblée et d'une approche globale par protéomique montre que le QS régule des fonctions liées à l'adaptation à la plante, notamment à la colonisation racinaire chez B518. Chez TVV3, aucune fonction régulée par QS n'a pu être identifiée mais les gènes impliqués dans le QS sont localisés dans un environnement atypique, constitué de gènes prophagiques. La mise en évidence d'un prophage chez TVV3 a conduit à la caractérisation de phages tempérés chez dix autres souches et au séquençage du premier génome d'un bactériophage isolé d'Azospirillum. Ce travail montre que la régulation de type QS est souche spécifique et révèle la prévalence des phages chez Azospirillum.

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This thesis describes the characterization of SsoPox, a lactonase with promiscuous phosphotriesterase activity from the hyperthermophilic archaeon, Sulfolobus solfataricus, and the potential of the phosphotriesterase from Brevundimonas diminuta (PTEBd) to function as an organophosphate sensor. Arg-223 and Tyr-99 of SsoPox are not essential for lactonase activity, however substitution of a phenylalanine in place of Tyr-97 abolished lactonase activity while reducing paraoxonase activity by 20-fold. Substrate specificity of SsoPox can be modulated through the partial blockage of the hydrophobic binding tunnel adjacent to the active site. The specificity constant for N-(3-oxo-decanoyl)-L-homoserine lactone decreased 37-fold when a phenylalanine was introduced in place of Leu-226. PTEBd was expressed and purified from Pseudomonas putida and, like SsoPox, can be immobilized to Disruptor paper. The immobilized enzyme can be used to detect five organophosphates at concentrations as low as 50 μM. Incubation of PTEBd-immobilized sensors at different temperatures proved that the enzyme is stable for at least 40 days at 23.5 degrees Celsius without any detectable change in activity.