Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-10-14T21:05:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseProteômicaComparativa.pdf: 1930862 bytes, checksum: 8b9ca5313718b5e5a2d966f239ed40c1 (MD5) / Approved for entry into archive by Gracilene Carvalho (gracilene@sisbin.ufop.br) on 2015-10-29T18:49:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseProteômicaComparativa.pdf: 1930862 bytes, checksum: 8b9ca5313718b5e5a2d966f239ed40c1 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-29T18:49:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 20592 bytes, checksum: 0c9b9c579af4cbbcf785ca803bd18d4b (MD5) DISSERTAÇÃO_AnáliseProteômicaComparativa.pdf: 1930862 bytes, checksum: 8b9ca5313718b5e5a2d966f239ed40c1 (MD5) Previous issue date: 2014 / A leishmaniose é uma doença endêmica em vários países, com incidência anual de 2 milhões de casos. A forma visceral da doença é a mais severa e a falta de tratamento pode levar o indivíduo à morte. Está bem estabelecido que a desnutrição (DPC) constitui fator de risco para a progressão clínica da leishmaniose visceral (LV), porém, pouco se conhece sobre os mecanismos bioquímicos envolvidos tanto na biologia do parasito quanto na resposta do hospedeiro na ocorrência simultânea de DPC e LV. Assim, o presente trabalho teve como foco a análise do perfil proteômico de Leishmania (Leishmania) infantum após a passagem pelo modelo murino de desnutrição proteica. Camundongos do grupo teste receberam dieta contendo 3% de proteína, enquanto os do grupo controle receberam dieta normal, contendo 14%. Após 8 semanas do início da dieta, confirmou-se a desnutrição dos animais do grupo teste a partir dos parâmetros peso corporal e dosagem sérica de proteína total e albumina. Os camundongos de cada grupo foram infectados com promastigotas de L. infantum, na mesma dose, e, posteriormente, os parasitos foram recuperados do fígado e baço na 2a semana (fase aguda) e na 15a semana (fase crônica) pós-infecção. Após a 15ª semana de infecção crônica, parasitos recuperados de animais de ambos os grupos exibiram curva de crescimento diferencial in vitro, sugerindo maior atividade proliferativa de promastigotas isolados de camundongos desnutridos. O estado nutricional também influenciou significativamente no aumento da carga parasitária total do fígado em animais desnutridos. A técnica 2D-PAGE comparativa, para os extratos de L. infantum recuperados dos dois grupos, revelou perfis eletroforéticos similares com poucos spots únicos de cada extrato. No entanto, promastigotas recuperados de animais em fase crônica da LV e submetidos à desnutrição apresentaram aumento de expressão para proteínas envolvidas com biossíntese proteica. A resposta imune humoral dos animais, frente a antígenos solúveis do parasito, também foi avaliada pela técnica de Western blotting. Essa abordagem imunoproteômica revelou padrões de reatividade distintos para os soros de animais de ambos os grupos. De particular importância, o soro de camundongos desnutridos quando empregado na mesma diluição do soro de camundongos normonutridos, não reconhece proteínas da família das HSP’s e chaperoninas, as quais têm sido descritas como altamente imunogênicas em diversos estudos. Coletivamente, os resultados obtidos demonstraram que a DPC altera o perfil proteômico de L. infantum, compromete o estabelecimento de uma resposta humoral eficaz contra proteínas do parasito e está associada ao aumento de carga parasitária no hospedeiro vertebrado. ____________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: Leishmaniasis is an endemic disease in many countries with approximately 2 million cases reported annually. The visceral form of the disease is the most severe, and the lack of treatment can lead to death. It has been established that undernutrition constitutes a risk factor for the progression of visceral leishmaniasis (VL). However, little is known about the biochemical mechanisms involved in parasite´s biology as well as in the host response when undernutrition and VL occur simultaneously. In this context, the present investigation intended to evaluate the proteomic profile of Leishmania (Leishmania) infantum promastigotes after passage in mice previously maintained under protein restriction. Mice belonging to the test group received a diet containing 3% protein whilst those from the control were fed a 14% protein diet. After 8 weeks, protein undernutrition was confirmed for test-group animals by monitoring body weight and serum levels of total protein and albumin. Mice from both groups were then inoculated with L. infantum promastigotes, at the same dose, and parasites recovered from liver and spleen on the 2nd (acute phase) and 15th (chronic phase) weeks post-infection. Promastigotes from mice under chronic phase VL exhibited a differential growth curve in vitro, suggesting an increased proliferative activity for parasites isolated from animals of the test group. The nutritional status also significantly increased parasite burden in the liver of test-group animals. A comparative 2D-PAGE technique, using protein extracts of L. infantum promastigotes isolated from both groups, revealed similar electrophoretic profiles with few unique spots assigned to each extract. Nevertheless, promastigotes recovered from animals under chronic phase VL and submitted to protein restriction displayed increased expression of molecules involved with protein biosynthesis. The reactivity of whole serum IgG against parasite soluble antigens was also evaluated using the Western blotting technique. This immunoproteomic approach revealed distinct reactivity patterns associated with the sera of animals belonging to the two groups. Of particular importance, sera from test-group animals, when used in the same dilution as sera from control-group animals, did not recognize HSP´s and chaperones which have been described as highly immunogenic in various studies. Collectively, our results demonstrated that protein undernutrition alters the proteomic profile of L. infantum, compromises the establishment of an efficient humoral response against promastigote antigens and is associated to increased parasite burden in the vertebrate host.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:35:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseARPA.pdf: 8348697 bytes, checksum: 2d133cc93364ad78e1934fb8f60c7968 (MD5) Previous issue date: 2004-02-27 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work involved the bioassay-guided study of Almeidea coerulea, A. rubra, Conchocarpus heterophyllus, Galipea carinata (Rutaceae), and Trichilia ramalhoi (Meliaceae). The bioassays were carried out with T. cruzi GAPDH and L. tarentolae APRT enzymes, and trypomastigote forms of T. cruzi as model assays. The results obtained with extracts and fractions showed that selected plants are promising source for the search of antiprotozoal compounds. Chemical investigation of active fractions (or extracts) allowed the isolation of 30 substances. Among them, 6 are described for the first time: an eudesmane sesquiterpene, pyranoflavones, a tetrahydrofuroquinoline alkaloid, an indolopyridoquinazoline alkaloid, an anthranilic acid derivative, and 1,5-diphenyl-1-pentanone; and 24 substances have already been described in the literature: β-sitosterol and stigmasterol, sitostenone, β-sitosteryl benzoate, lupeol, lupenone, flavone, 7-methoxyflavone, 5-hydroxyflavone, dictamine, kokusagine, skimmianine, δ-fagarine, isokokusagine, isoskimmianine, isodutaduprine, haplotusine, 1-methyl-2-phenyl-4-quinolone, arborinine, scoparone, scopoletin, marmesine, paprazine, N-transferuloyltyramine, and siringic acid. Among these substances, furoquinolone alkaloids isokokusagine and isoskimmianine were actives on the inhibition of APRT enzyme; marmesine was active on GAPDH enzyme; and haplotusine and the 1-methyl-2-phenyl-4-quinolone alkaloid showed significant trypanocidal activities. The biological results showed that a systematic investigation of active chemical classes is needed for determination of structure-activity relationship and obtaining more active substances, that could be used as targets for the development of new antichagasic and antileishmaniasis drugs. / Esse trabalho envolveu o estudo fitoquímico de Almeidea coerulea, A. rubra, Conchocarpus heterophyllus, Galipea carinata (Rutaceae) e Trichilia ramalhoi (Meliaceae), biomonitorado através de três modelos biológicos: enzimas GAPDH de T. cruzi e APRT de L. tarentolae; e ensaios in vitro nas formas tripomastigotas de T. cruzi. Os testes biológicos de extratos e frações mostraram que as plantas selecionadas são promissoras na procura de compostos antiparasitários. O estudo químico das frações (ou extratos) ativas permitiu o isolamento de 30 substâncias, sendo 6 inéditas: sesquiterpeno eudesmano, piranoflavonas, alcalóide tetraidrofuroquinolínico, alcalóide indolopiridoquinazolínico, derivado do ácido antranílico e 1,5-difenil-1-pentanona; e 24 já descritas na literatura: β- sitosterol e estigmasterol, sitostenona, benzoato de β-sitosterila, lupeol, lupenona, flavona, 7-etoxiflavona, 5-hidroxiflavona, dictamina, kokusagina, esquimianina, δ-fagarina, isokokusagina, isoesquimianina, isodutaduprina, haplotusina, alcalóide 2-fenil-1-metil-4-quinolona, arborinina, escoparona, escopoletina, marmesina, paprazina, N-trans-feruloitiramina e ácido siríngico. Dentre essas substâncias, os alcalóides furoquinolônicos isokokusagina e isoesquimianina mostraram ser inibidores potentes da enzima APRT; a cumarina marmesina ocasionou uma inibição considerável da atividade da enzima GAPDH; e os alcalóides haplotusina e 2-fenil-1-metil-4-quinolona, e o triterpeno lupeol apresentaram atividades tripanocidas significativas. Os resultados biológicos indicaram a necessidade de um estudo sistemático posterior das classes dos compostos ativos, para a determinação da relação estrutura-atividade e, desta forma, de substâncias mais ativas, que possam ser utilizadas como protótipos no desenvolvimento de novos quimioprofiláticos e/ou quimioterápicos para a doença de Chagas e leishmanioses.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VirginiaPMS.pdf: 3411673 bytes, checksum: dfe2ec0cb317ad239d62da9c99560ecf (MD5) Previous issue date: 2008-09-04 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Leishmaniasis are endemic diseases wild spread in the New and Old World, caused by the flagelated protozoan Leishmania. In the New World, the distribution of different forms of leishmaniasis is mostly in tropical regions. In the State of Rio Grande do Norte, Northeast Brazil, 85% of the captured sand flies fauna is Lutzomyia longipalpis. The distribution of the sand fly vector in the state overlaps with the disease distribution, where the presence of sand flies is associated with presence of animals shelters. The aim of this study was to analyse the blood meal preference of sand flies vector from the genus Lutzomyia spp. in laboratory conditions, to verify the vector life cicle at different temperatures sets and to identify the main blood meal source in endemic areas for visceral leishmaniasis (VL) at peri-urban regions of Natal. Sand flies samples were collected from the municipalities of S?o Gon?alo do Amarante and N?sia Floresta where female sand flies were grouped for the colony maintenance in the laboratory and for the analysis of the preferred source of sand fly blood meal in natural environment. The prevalence of blood meal preference and oviposition for the females sand flies was 97% for Cavia porcellus with oviposition of 19 eggs/female; 97% for Eqqus caballus with 19 eggs/female; 98% for human blood with 14 eggs/female; 71.3% for Didelphis albiventris with 8.4 eggs/female; 73% for Gallus gallus with 14 eggs/female; 86% for Canis familiaris with 10.3 eggs/female; 81.4% for Galea spixii with 26 eggs/female; 36% for Callithrix jachus with 15 eggs/female; 42.8% for Monodelphis domestica with 0% of oviposition. Female sand flies did not take a blood meal from Felis catus. Sand flies life cycle ranged from 32-40 days, with 21-50 oviposition rates approximately. This study also showed that at 32?C the life cycle had 31 days, at 28? C it had 50 days and at 22?C it increased to 79 days. Adjusting the temperature to 35?C the eggs did not hatch, thus blocking the life cycle. A total of 1540 sand flies were captured, among them, 1.310 were male and 230 were female. Whereas 86% of the sand flies captured were Lu. longipalpis as compared to 10.5% for Lu. evandroi and, 3.2% for L. lenti and 0.3% for Lu whitmani. The ratio between female and male sandfly was approximately 6 males to 1 female. In N?sia Floresta, 50.7% of the collected females took their blood meal from armadillo, 12.8% from human. Among the female sand flies captured in S?o Gon?alo do Amarante, 80 of them were tested for the Leishmania KDNA infectivity where 5% of them were infected with Leishmania chagasi. Female Lutzomyia spp. showed to have an opportunistic blood meal characteristic. The behavioral parameters seem to have a higher influence in the oviposition when compared to the level of total proteins detected in the host s bloodstream. A higher Lu. longipalpis life cycle viability was observed at 28?C. The increase of temperature dropped the life cycle time, which means that the life cycle is modified by temperature range, source of blood meal and humidity. Lu longipalpis was the most specie found in the inner and peridomiciliar environment. In N?sia Floresta, armadillos were the main source of blood meal for Lutzomyia spp. At S?o Gon?alo do Amarante, humans were the main source of blood meal due to CDC nets placed inside their houses / As leishmanioses s?o doen?as end?micas em regi?es do Velho e Novo Mundo causadas por protozo?rios flagelados do g?nero Leishmania. No Novo Mundo, a distribui??o das diversas formas de leishmaniose ? quase que inteiramente intertropical. No Rio Grande do Norte, nordeste do Brasil, 85% da fauna flebotom?nica capturada no Estado, corresponde a Lutzomyia longipalpis e sua distribui??o se sobrep?e ? distribui??o da doen?a estando associada ? presen?a de abrigos de animais dom?sticos. A exposi??o de pessoas a esses ambientes aumenta a probabilidade de infec??o por diversas esp?cies de Leishmania. O estudo teve como objetivo avaliar a prefer?ncia alimentar de f?meas do g?nero Lutzomyia em condi??es laboratoriais, observar o ciclo biol?gico a diferentes temperaturas e identificar as principais fontes de repasto sangu?neo em ?reas end?micas de leishmaniose visceral na Grande Natal. Foram realizadas coletas nos munic?pios de S?o Gon?alo do Amarante e N?sia Floresta dos quais foram separados grupos de f?meas para manuten??o de col?nia em laborat?rio e para avalia??o da prefer?ncia alimentar em ambiente natural. As f?meas apresentaram um percentual de prefer?ncia alimentar e taxa de oviposi??o de 97,0% para Cavia porcellus com oviposi??o de 19 ovos/f?mea; 97,0% para Equus caballus, com 19 ovos/f?mea; 98,0% para sangue humano, com 14 ovos/f?mea; 71,3% em Didelphis albiventris, com 8,4 ovos/f?mea; 73,0% em Gallus gallus, com 14 ovos/f?mea; 86,0% em Canis familiaris, com 10,3 ovos/f?mea; 81,4% em Galea spixii, com 26 ovos/f?mea; 36,0% em Callithrix jachus, com 15 ovos/f?mea; 42,8% para Monodelphis domestica com 0,0% de oviposi??o. As f?meas n?o realizaram repasto sangu?neo em Felis catus. O ciclo de vida de flebotom?neos em laborat?rio ? de 32-40 dias, com taxa de oviposi??o de aproximadamente 21-50 ovos/f?mea. Foi observado que a 32?C o ciclo biol?gico ? de 31 dias, enquanto que a 28?C este aumenta para 50 dias e a 22?C para 79 dias. Com o aumento da temperatura para 35?C, os ovos n?o eclodiram, inviabilizando o curso do ciclo biol?gico. Foi coletado um total de 1.540 flebotom?neos, sendo 1310 machos e 230 f?meas. A esp?cie mais encontrada foi Lutzomyia longipalpis com 86,0%, Lutzomyia evandroi 10,5%, Lu. lenti com 3,2% e Lu. whitmani com 0,3%. A rela??o entre macho e f?mea foi de aproximadamente 6 machos para 1 f?mea. 50,7% das f?meas coletadas em N?sia Floresta realizaram repasto apenas em peba, 12,8% das f?meas coletadas em S?o Gon?alo do Amarante realizaram repasto sangu?neo somente em humanos. Dentre as f?meas coletadas em S?o Gon?alo do Amarante, 80 foram analisadas para a infectividade para o kDNA de Leishmania e 5% apresentaram amplifica??o para o kDNA de Leishmania. F?meas de Lutzomyia spp. apresentaram perfil alimentar oportunista. Os par?metros comportamentais parecem ter uma maior influ?ncia na oviposi??o do que os n?veis de prote?nas totais encontrados no sangue dos hospedeiros. Uma maior viabilidade do ciclo de Lu. longipalpis foi observada a temperatura de 28?C. A eleva??o da temperatura reduziu a dura??o do ciclo biol?gico, sendo este possivelmente influenciado pela temperatura, fonte de repasto e umidade relativa do ar. Lu. longipalpis foi a esp?cie mais encontrada em ambiente intra e peridomiciliar. Em N?sia Floresta, os pebas foram a principal fonte de repasto sangu?neo de f?meas Lutzomyia spp. No munic?pio de S?o Gon?alo do Amarante, os humanos foram a principal fonte de repasto em conseq??ncia das coletas terem sido realizadas no intradomic?lio