A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento que utiliza um fotossensibilizador, luz e oxigênio para gerar espécies reativas de oxigênio capazes de induzir a morte de células indesejadas, como tumores e micro-organismos infecciosos. Nosso foco está na morte induzida por 1,9-dimetil azul de metileno fotoativado (TFD-DMMB). Este fotossensibilizador foi previamente estudado por nosso grupo. Foi mostrado que o DMMB se acumula em lisossomos e mitocôndrias, e danifica essas organelas após fotoativado. O DMMB em concentração nanomolar promove uma morte celular eficiente, que parece ser resultante do bloqueio da conclusão do processo autofágico, enquanto outros fotossensibilizadores geralmente são empregados na faixa de micromolar. Nosso objetivo neste trabalho foi investigar o mecanismo molecular da TFD-DMMB através do estudo do papel da proteína p53 nas respostas celulares à TFD-DMMB. Sendo uma proteína supressora tumoral, p53 participa de vários processos celulares em resposta a diferentes estresses. Para atingir nosso objetivo, utilizamos linhagens celulares HEK293T que expressam diferentes quantidades de p53, sendo uma linhagem knockdown para p53 (HEK293T-p53KD) e outra com expressão normal de p53 (HEK293T-SC, scramble). Após o tratamento com DMMB fotoativado, avaliamos a fototoxicidade, apoptose, dano no DNA, ciclo celular e autofagia. Nossos resultados mostram que, apesar de não observarmos a estabilização de p53, a TFDDMMB parece induzir a localização citoplasmática de p53, sugerindo que p53 citoplasmática participa da resposta celular à TFD-DMMB. A linhagem HEK293T-p53KD mostrou-se menos sensível à TFD-DMMB. Essa diferença foi explicada pelo acúmulo de células em sub- G1, indicativo de morte por apoptose, apenas na linhagem HEK293T-SC, que foi mais sensível ao tratamento. É possível que a atividade citoplasmática de p53 esteja relacionada com a indução de apoptose no nosso modelo. Em contraste aos efeitos de p53 na morte celular, encontramos respostas à TFD-DMMB independentes de p53 na parada do ciclo celular e autofagia. Observamos acúmulo de células na fase S do ciclo celular associado à fosforilação de CHK1 e H2AX, indicativo da ocorrência de estresse replicativo. A relação com a autofagia foi confirmada pelo acúmulo de vesículas ácidas e aumento dos níveis proteicos de LC3-II. Esses resultados indicam a indução ou o bloqueio da autofagia, entretanto não observamos um aumento simultâneo nos níveis de BECLIN-1, proteína importante para a iniciação da autofagia. Além disso, DMMB fotoativado resultou em dano seletivo no DNA mitocondrial (mtDNA), que não foi reparado em 24 horas. Desse modo, e baseado nos resultados preliminares do nosso grupo, propomos que a morte celular induzida por DMMB fotoativado é decorrente principalmente do bloqueio da resolução da via autofágica, comprometendo a eliminação de mitocôndrias danificadas e levando a alterações na dinâmica do ciclo celular. Nossos resultados sugerem que há respostas celulares à TFDDMMB dependentes e independentes de p53. Resultados similares foram obtidos para a linhagem HEK293, que é a linhagem parental de HEK293T. Do nosso conhecimento, a relocalização de p53 para o citoplasma, a habilidade em induzir dano seletivo no mtDNA e o bloqueio da progressão do ciclo celular na fase S são resultados inéditos decorrentes da TFDDMMB. O dano seletivo ao mtDNA torna o DMMB um modelo útil para estudos de mecanismos de resposta a dano no DNA específicos para a mitocôndria. / Photodynamic Therapy (PDT) is a treatment modality that uses a photosensitizer, light and oxygen to generate reactive oxygen species capable of inducing death of unwanted cells, such as cancer cells and infectious microorganisms. In this work, we are interested in studying death induced by 1,9-dimethylmethylene blue as a photosensitizer by PDT (DMMB-PDT). This photosensitizer has been previously studied by our group. It has been shown that DMMB accumulates within lysosomes and mitochondria, and damages these organelles after photoactivation. In this case, cell death is believed to be a result from the impairment of autophagy. DMMB at nanomolar concentration promotes efficient cell death, while other photosensitizers are usually employed in the micromolar range. The aim of this work is to investigate the molecular mechanism of DMMB-PDT action through the study of p53 protein role over the cell response to DMMB-PDT. Being a tumor suppressor protein, p53 participates in several cellular processes in response to different stresses. To achieve our goal, we used HEK293T cell lines that express different amounts of p53: a p53 knockout cell line (HEK293T-p53KD) and a normal cell line (HEK293T-SC, scramble). After treatment with photoactivated DMMB, we evaluated phototoxicity, apoptosis, DNA damage, cell cycle, and autophagy. Our results showed that, although we did not observe p53 stabilization, DMMBPDT seems to induce the cytoplasmic localization of p53, suggesting that cytoplasmic p53 participates in the cell response to DMMB-PDT. The HEK293T-p53KD cell line was less sensitive to DMMB-PDT. This difference could be explained by the level of sub-G1 accumulation suggestive of apoptosis that was only observed for HEK293T-SC cell line, which was more sensitive to the treatment. It is possible that the cytoplasmic activity of p53 was related to apoptosis induction according our model. In contrast to p53 effects on cell death, we found that there are p53-independent responses to DMMB-PDT on cell cycle arrest and autophagy. We observed a significant increase in the fraction of cells in the S phase of the cell cycle associated with phosphorylation of the CHK1 and H2AX proteins, indicating induction of replicative stress. The relationship of DMMB-PDT and autophagy was confirmed by the accumulation of acidic vesicles and the increased LC3 conversion (LC3-I to LC3-II). These results indicated that DMMB-PDT induces and/or impairs autophagy. However, we did not observe a simultaneous increase in BECLIN-1 levels, which is an important protein to autophagy initiation. Photoactivated DMMB resulted in selective damage in mitochondrial DNA (mtDNA) that was not repaired in 24 hours. According to these results, we propose that cell death induced by photoactivated DMMB is mainly related to blockade of a late stage of the autophagy pathway. It could compromise the elimination of damaged mitochondria and might lead to cell cycle dynamics alterations. Our results suggested that there are p53-dependent and p53-independent cell responses to DMMB-PDT. Similar results were obtained from HEK293 cell line, which is the parental cell line of HEK293T. To the best of our knowledge, the p53 relocalization to the cytoplasm, the ability to induce selective mtDNA damage, and the S arrest represent new insights in the DMMB-PDT field. The selective mtDNA damage makes DMMB a useful model for studies on mechanisms of DNA damage responses in mitochondria.

A comparação \"in silico\" das vias de reparo de DNA nos genomas de Caulobacter crescentus e E. coli mostra diferenças significativas entre estas duas bactérias, sugerindo diversidade biológica das respostas a danos no DNA entre as bactérias. Em busca de genes que possam proteger o genoma de C. crescentus contra mutações, foi feita uma varredura em uma biblioteca de cerca de 5.000 clones construída a partir de inserção aleatória do transposon TN5 no genoma dessa bactéria. A maioria destes genes não tinha sido, ainda, relacionada a fenótipo mutador, mas, como esperado, também identificamos genes já conhecidos como relacionados a fenótipos mutadores. Alguns clones candidatos foram investigados quanto ao tipo de mutação induzida, baseando-se na sequência do gene rpoB, com o objetivo de indicar o processo mutacional sob condições genéticas específicas. Análises baseadas na medida da atividade promotora em fusão de transcrição com lacZ, mostra que o sistema SOS está alterado em alguns clones, e pode justificar parte do fenótipo mutador em alguns deles. / The \"in silico\" comparison of the main DNA repair genes between C. crescentus and E. coli shows significant differences between these bacteria, suggesting biological diversity in bacterial responses to DNA damage. We further screened a C. crescentus library of 5,000 clones mutated by random insertion of the TN5 transposon in the genome, searching for clones with high levels of spontaneous rifampicin resistance mutations. Most of the genes identified have not been previously reported as related to mutator phenotype, but, as expected, we have also identified proteins already known as causing mutator phenotypes when mutated. As part of the functional characterization, some candidate clones were characterized based on rpoB gene sequences aiming at indicating the mutational process under specific genetic background conditions. Analysis of some candidate clones based on measurements of promoter activity with lacZ transcriptional fusions show that the system SOS is modified in some clones and this justify part of their mutator phenotype.

A comparação \"in silico\" das vias de reparo de DNA nos genomas de Caulobacter crescentus e E. coli mostra diferenças significativas entre estas duas bactérias, sugerindo diversidade biológica das respostas a danos no DNA entre as bactérias. Em busca de genes que possam proteger o genoma de C. crescentus contra mutações, foi feita uma varredura em uma biblioteca de cerca de 5.000 clones construída a partir de inserção aleatória do transposon TN5 no genoma dessa bactéria. A maioria destes genes não tinha sido, ainda, relacionada a fenótipo mutador, mas, como esperado, também identificamos genes já conhecidos como relacionados a fenótipos mutadores. Alguns clones candidatos foram investigados quanto ao tipo de mutação induzida, baseando-se na sequência do gene rpoB, com o objetivo de indicar o processo mutacional sob condições genéticas específicas. Análises baseadas na medida da atividade promotora em fusão de transcrição com lacZ, mostra que o sistema SOS está alterado em alguns clones, e pode justificar parte do fenótipo mutador em alguns deles. / The \"in silico\" comparison of the main DNA repair genes between C. crescentus and E. coli shows significant differences between these bacteria, suggesting biological diversity in bacterial responses to DNA damage. We further screened a C. crescentus library of 5,000 clones mutated by random insertion of the TN5 transposon in the genome, searching for clones with high levels of spontaneous rifampicin resistance mutations. Most of the genes identified have not been previously reported as related to mutator phenotype, but, as expected, we have also identified proteins already known as causing mutator phenotypes when mutated. As part of the functional characterization, some candidate clones were characterized based on rpoB gene sequences aiming at indicating the mutational process under specific genetic background conditions. Analysis of some candidate clones based on measurements of promoter activity with lacZ transcriptional fusions show that the system SOS is modified in some clones and this justify part of their mutator phenotype.

A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade de tratamento que utiliza um fotossensibilizador, luz e oxigênio para gerar espécies reativas de oxigênio capazes de induzir a morte de células indesejadas, como tumores e micro-organismos infecciosos. Nosso foco está na morte induzida por 1,9-dimetil azul de metileno fotoativado (TFD-DMMB). Este fotossensibilizador foi previamente estudado por nosso grupo. Foi mostrado que o DMMB se acumula em lisossomos e mitocôndrias, e danifica essas organelas após fotoativado. O DMMB em concentração nanomolar promove uma morte celular eficiente, que parece ser resultante do bloqueio da conclusão do processo autofágico, enquanto outros fotossensibilizadores geralmente são empregados na faixa de micromolar. Nosso objetivo neste trabalho foi investigar o mecanismo molecular da TFD-DMMB através do estudo do papel da proteína p53 nas respostas celulares à TFD-DMMB. Sendo uma proteína supressora tumoral, p53 participa de vários processos celulares em resposta a diferentes estresses. Para atingir nosso objetivo, utilizamos linhagens celulares HEK293T que expressam diferentes quantidades de p53, sendo uma linhagem knockdown para p53 (HEK293T-p53KD) e outra com expressão normal de p53 (HEK293T-SC, scramble). Após o tratamento com DMMB fotoativado, avaliamos a fototoxicidade, apoptose, dano no DNA, ciclo celular e autofagia. Nossos resultados mostram que, apesar de não observarmos a estabilização de p53, a TFDDMMB parece induzir a localização citoplasmática de p53, sugerindo que p53 citoplasmática participa da resposta celular à TFD-DMMB. A linhagem HEK293T-p53KD mostrou-se menos sensível à TFD-DMMB. Essa diferença foi explicada pelo acúmulo de células em sub- G1, indicativo de morte por apoptose, apenas na linhagem HEK293T-SC, que foi mais sensível ao tratamento. É possível que a atividade citoplasmática de p53 esteja relacionada com a indução de apoptose no nosso modelo. Em contraste aos efeitos de p53 na morte celular, encontramos respostas à TFD-DMMB independentes de p53 na parada do ciclo celular e autofagia. Observamos acúmulo de células na fase S do ciclo celular associado à fosforilação de CHK1 e H2AX, indicativo da ocorrência de estresse replicativo. A relação com a autofagia foi confirmada pelo acúmulo de vesículas ácidas e aumento dos níveis proteicos de LC3-II. Esses resultados indicam a indução ou o bloqueio da autofagia, entretanto não observamos um aumento simultâneo nos níveis de BECLIN-1, proteína importante para a iniciação da autofagia. Além disso, DMMB fotoativado resultou em dano seletivo no DNA mitocondrial (mtDNA), que não foi reparado em 24 horas. Desse modo, e baseado nos resultados preliminares do nosso grupo, propomos que a morte celular induzida por DMMB fotoativado é decorrente principalmente do bloqueio da resolução da via autofágica, comprometendo a eliminação de mitocôndrias danificadas e levando a alterações na dinâmica do ciclo celular. Nossos resultados sugerem que há respostas celulares à TFDDMMB dependentes e independentes de p53. Resultados similares foram obtidos para a linhagem HEK293, que é a linhagem parental de HEK293T. Do nosso conhecimento, a relocalização de p53 para o citoplasma, a habilidade em induzir dano seletivo no mtDNA e o bloqueio da progressão do ciclo celular na fase S são resultados inéditos decorrentes da TFDDMMB. O dano seletivo ao mtDNA torna o DMMB um modelo útil para estudos de mecanismos de resposta a dano no DNA específicos para a mitocôndria. / Photodynamic Therapy (PDT) is a treatment modality that uses a photosensitizer, light and oxygen to generate reactive oxygen species capable of inducing death of unwanted cells, such as cancer cells and infectious microorganisms. In this work, we are interested in studying death induced by 1,9-dimethylmethylene blue as a photosensitizer by PDT (DMMB-PDT). This photosensitizer has been previously studied by our group. It has been shown that DMMB accumulates within lysosomes and mitochondria, and damages these organelles after photoactivation. In this case, cell death is believed to be a result from the impairment of autophagy. DMMB at nanomolar concentration promotes efficient cell death, while other photosensitizers are usually employed in the micromolar range. The aim of this work is to investigate the molecular mechanism of DMMB-PDT action through the study of p53 protein role over the cell response to DMMB-PDT. Being a tumor suppressor protein, p53 participates in several cellular processes in response to different stresses. To achieve our goal, we used HEK293T cell lines that express different amounts of p53: a p53 knockout cell line (HEK293T-p53KD) and a normal cell line (HEK293T-SC, scramble). After treatment with photoactivated DMMB, we evaluated phototoxicity, apoptosis, DNA damage, cell cycle, and autophagy. Our results showed that, although we did not observe p53 stabilization, DMMBPDT seems to induce the cytoplasmic localization of p53, suggesting that cytoplasmic p53 participates in the cell response to DMMB-PDT. The HEK293T-p53KD cell line was less sensitive to DMMB-PDT. This difference could be explained by the level of sub-G1 accumulation suggestive of apoptosis that was only observed for HEK293T-SC cell line, which was more sensitive to the treatment. It is possible that the cytoplasmic activity of p53 was related to apoptosis induction according our model. In contrast to p53 effects on cell death, we found that there are p53-independent responses to DMMB-PDT on cell cycle arrest and autophagy. We observed a significant increase in the fraction of cells in the S phase of the cell cycle associated with phosphorylation of the CHK1 and H2AX proteins, indicating induction of replicative stress. The relationship of DMMB-PDT and autophagy was confirmed by the accumulation of acidic vesicles and the increased LC3 conversion (LC3-I to LC3-II). These results indicated that DMMB-PDT induces and/or impairs autophagy. However, we did not observe a simultaneous increase in BECLIN-1 levels, which is an important protein to autophagy initiation. Photoactivated DMMB resulted in selective damage in mitochondrial DNA (mtDNA) that was not repaired in 24 hours. According to these results, we propose that cell death induced by photoactivated DMMB is mainly related to blockade of a late stage of the autophagy pathway. It could compromise the elimination of damaged mitochondria and might lead to cell cycle dynamics alterations. Our results suggested that there are p53-dependent and p53-independent cell responses to DMMB-PDT. Similar results were obtained from HEK293 cell line, which is the parental cell line of HEK293T. To the best of our knowledge, the p53 relocalization to the cytoplasm, the ability to induce selective mtDNA damage, and the S arrest represent new insights in the DMMB-PDT field. The selective mtDNA damage makes DMMB a useful model for studies on mechanisms of DNA damage responses in mitochondria.

Em estudos de proteção ao genoma contendo lesões de C. crescentus, foi feita uma varredura em uma biblioteca clones mutados pelo transposon Tn5 e sensíveis à luz UV-B e MMS. Dos 249 clones selecionados conseguimos identificar mutações em 102 genes, distribuídos em dez categorias funcionais, incluindo metabolismo de DNA. Além de genes já descritos como atuantes na defesa de genoma a lesões, os dados ainda adicionam funções potenciais para outros genes. Investigação mais detalhada indica que vários dos genes identificados podem afetar o estresse e ciclo celular, podendo estar relacionados a respostas do tipo pontos de checagem. Além disso, verificamos que mutantes para genes envolvidos em reparo excisão de nucleotídeos são mais sensíveis à H2O2, indicando que nessa bactéria, este sistema de reparo atua também em lesões oxidativas no DNA. Os dados obtidos são pioneiros no estabelecimento de funções para vários genes de C. crescentus e de outras alfa-proteobactérias. / This work aimed to identify genes related to DNA damage protection in C. crescentus, by means of screening a Tn5 -mutated library for clones sensitive to UV-B light and MMS. Out of 249 selected clones, we were able to identify mutations in 102 genes, classified in ten different functional categories, including DNA metabolism. In addition to genes already described as playing a role in genome defense to lesions, the results provide new potential functions to several other genes. More detailed investigation indicates also that the mutations in some of these genes may also affect cell stress and cell cycle, being potentially involved in check-point responses. Moreover, mutants for nucleotide excision repair genes were also found to be sensitive to H2O2, indicating that this DNA repair system also acts in DNA oxidative damage. These data are the first establishing a role in genome protection for several genes in C. crescentus, as well as other alpha-proteobacteria.

Em estudos de proteção ao genoma contendo lesões de C. crescentus, foi feita uma varredura em uma biblioteca clones mutados pelo transposon Tn5 e sensíveis à luz UV-B e MMS. Dos 249 clones selecionados conseguimos identificar mutações em 102 genes, distribuídos em dez categorias funcionais, incluindo metabolismo de DNA. Além de genes já descritos como atuantes na defesa de genoma a lesões, os dados ainda adicionam funções potenciais para outros genes. Investigação mais detalhada indica que vários dos genes identificados podem afetar o estresse e ciclo celular, podendo estar relacionados a respostas do tipo pontos de checagem. Além disso, verificamos que mutantes para genes envolvidos em reparo excisão de nucleotídeos são mais sensíveis à H2O2, indicando que nessa bactéria, este sistema de reparo atua também em lesões oxidativas no DNA. Os dados obtidos são pioneiros no estabelecimento de funções para vários genes de C. crescentus e de outras alfa-proteobactérias. / This work aimed to identify genes related to DNA damage protection in C. crescentus, by means of screening a Tn5 -mutated library for clones sensitive to UV-B light and MMS. Out of 249 selected clones, we were able to identify mutations in 102 genes, classified in ten different functional categories, including DNA metabolism. In addition to genes already described as playing a role in genome defense to lesions, the results provide new potential functions to several other genes. More detailed investigation indicates also that the mutations in some of these genes may also affect cell stress and cell cycle, being potentially involved in check-point responses. Moreover, mutants for nucleotide excision repair genes were also found to be sensitive to H2O2, indicating that this DNA repair system also acts in DNA oxidative damage. These data are the first establishing a role in genome protection for several genes in C. crescentus, as well as other alpha-proteobacteria.

Orientador: José Roberto Fioretto / Resumo: A Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA) caracteriza-se por processo inflamatório que leva à quebra da barreira alvéolo-capilar com desenvolvimento de edema intersticial e alveolar, diminuição da complacência pulmonar, hipertensão pulmonar, desequilíbrio da relação ventilação/perfusão e hipoxemia refratária à administração de oxigênio. Apesar do progresso no entendimento de sua fisiopatologia e consequente avanço em estratégias terapêuticas de pacientes com SDRA, a mortalidade permanece elevada. Entre os mecanismos que levam a síndrome, várias evidências sugerem que pacientes portadores de SDRA estão expostos a elevado grau de estresse oxidativo (EO) induzido por ampla variedade de eventos. Por essa razão é fundamental a compreensão do papel do EO tanto na instalação como na perpetuação do processo infamatório que ocorre na doença. No entanto, apesar do uso de antioxidantes ter mostrado algum benefício na evolução da doença, ainda não há evidência clínica para sua utilização rotineira na prática. O licopeno é um carotenoide sem atividade provitamina A encontrado principalmente no tomate e nas frutas vermelhas. Em decorrência de seu grande número de duplas ligações conjugadas, o licopeno é considerado um dos melhores antioxidantes entre os carotenoides. Além disso, é um dos mais potentes antioxidantes encontrados no organismo humano, apresentando potência antioxidante 100 vezes maior do que a vitamina E e a vitamina C. A ventilação mecânica convencional protetora (V... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

Submitted by Susiane de Oliveira Klefens Barbosa (btsusi@yahoo.com.br) on 2018-04-10T12:20:42Z No. of bitstreams: 1 TESE _ Susiane de Oliveira Klefens Barbosa 2018.pdf: 1518184 bytes, checksum: 6d5b1e7635afb78dfefe1890eea01151 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Pizzani null (luciana@btu.unesp.br) on 2018-04-10T19:22:58Z (GMT) No. of bitstreams: 1 barbosa_so_dr_bot.pdf: 1518184 bytes, checksum: 6d5b1e7635afb78dfefe1890eea01151 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-10T19:22:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 barbosa_so_dr_bot.pdf: 1518184 bytes, checksum: 6d5b1e7635afb78dfefe1890eea01151 (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A Síndrome do Desconforto Respiratório Agudo (SDRA) caracteriza-se por processo inflamatório que leva à quebra da barreira alvéolo-capilar com desenvolvimento de edema intersticial e alveolar, diminuição da complacência pulmonar, hipertensão pulmonar, desequilíbrio da relação ventilação/perfusão e hipoxemia refratária à administração de oxigênio. Apesar do progresso no entendimento de sua fisiopatologia e consequente avanço em estratégias terapêuticas de pacientes com SDRA, a mortalidade permanece elevada. Entre os mecanismos que levam a síndrome, várias evidências sugerem que pacientes portadores de SDRA estão expostos a elevado grau de estresse oxidativo (EO) induzido por ampla variedade de eventos. Por essa razão é fundamental a compreensão do papel do EO tanto na instalação como na perpetuação do processo infamatório que ocorre na doença. No entanto, apesar do uso de antioxidantes ter mostrado algum benefício na evolução da doença, ainda não há evidência clínica para sua utilização rotineira na prática. O licopeno é um carotenoide sem atividade provitamina A encontrado principalmente no tomate e nas frutas vermelhas. Em decorrência de seu grande número de duplas ligações conjugadas, o licopeno é considerado um dos melhores antioxidantes entre os carotenoides. Além disso, é um dos mais potentes antioxidantes encontrados no organismo humano, apresentando potência antioxidante 100 vezes maior do que a vitamina E e a vitamina C. A ventilação mecânica convencional protetora (VMC) constitui um dos principais pilares do tratamento da SDRA, sendo capaz de modificar a evolução da doença e reduzir a mortalidade. Baseado nos efeitos protetores da ventilação oscilatória de alta frequência (VOAF) sobre a SDRA, anteriormente descritos pelo grupo, bem como o potencial papel antioxidante e antiinflamatório do licopeno, nossa hipótese é que esse carotenoide exerce efeito protetor adicional em modelo experimental de SDRA. O objetivo do estudo foi investigar os efeitos da suplementação com licopeno sobre o EO pulmonar, por meio da capacidade antioxidante total (TAP) e dano oxidativo do DNA (teste do Cometa), em modelo experimental de lesão pulmonar induzida em coelhos ventilados com VMC e VOAF, comparando-os com grupo controle. Também foram avaliadas a histologia pulmonar e a inflamação pela contagem de células de neutrófilos no lavado broncoalveolar. Cinquenta e cinco coelhos foram instrumentados com traqueostomia, acessos vasculares e ventilados mecanicamente. Os animais suplementados receberam 10mg/Kg de licopeno durante 21 dias antes do experimento. A lesão pulmonar foi induzida por infusão traqueal de salina aquecida (30mL/Kg, 38°C). Foram formados os seguintes grupos experimentais: animais sadios foram submetidos a eutanásia para compor o grupo baseline sem suplementação: GBL; n=5 e baseline suplementado com licopeno: GBLL; n=5, animais sadios submetidos à VM Protetora, sem suplementação denominado grupo controle GC; n=5, animais submetidos à indução da lesão pulmonar e tratamento com ventilação mecânica e suplementados com licopeno GVMCL; n=10 e sem suplementação GVMC; n=10, com LP submetidos à VOAF e suplementados com licopeno GVAFL; n=10 e sem suplementação GVAF; n=10. Após a confirmação da lesão pulmonar, as gasometrias foram realizadas a cada 30 minutos pelas 4 horas de duração do protocolo experimental. O nível de significância foi de 5%. Comparando os momentos, antes e depois da lesão pulmonar em cada grupo, houve piora significante da oxigenação e também diminuição da complacência pulmonar estática em todos os grupos. Após 4 horas, os grupos tratados com VOAF, com e sem licopeno, e o grupo sob VMC protetora com licopeno, apresentaram melhora significante em relação ao grupo VMC protetora sem suplementação, apresentando relação de PaO2/FiO2 semelhante aos momentos antes da indução da lesão pulmonar e em relação ao GC. A contagem de neutrófilos no lavado broncoalveolar mostrou que os grupos GVMCL e GVAFL, apresentaram valores significantemente menores em comparação com os animais sem suplementação. GC, GVAFL e GVMCL apresentaram escore de lesão histológica significantemente menor quando comparados com os grupos sem suplementação. Quanto ao TAP no tecido pulmonar, não houve diferença estatística entre os grupos. O dano do DNA nos linfócitos, comparando os animais sob VMC protetora, foi significantemente mais baixo nos animais suplementados com licopeno. Este estudo demonstra que independentemente do modo ventilatório, a suplementação prévia com licopeno melhora a oxigenação, reduz a lesão inflamatória bem como a lesão histopatológica nos animais, assemelhando-se aos benefícios propostos pela VOAF, e minimiza o dano no DNA nos animais sob VMC protetora com suplementação em relação aos animais sob mesma ventilação. / Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS) is characterized by inflammatory process that leads to the breakdown of the alveolar-capillary barrier with the development of interstitial and alveolar edema, decreased pulmonary compliance, pulmonary hypertension, impaired ventilation and perfusion, and hypoxemia refractory to administration of oxygen. Despite better understanding in pathophysiology and consequent advancement in therapeutic strategies for ARDS patients, mortality remains high. Although the exact mechanism leading to ARDS is unknown, several evidences suggest that patients with the syndrome are exposed to a high degree of oxidative stress. For this reason it is important to understand the role of oxidative stress in both, initiation and progress of inflammatory process that occurs in the disease. However, although the use of antioxidants has shown some benefit in ARDS evolution, there is still no clinical evidence for its use in practice routine. Lycopene is a carotenoid with no provitamin A activity found mainly in tomatoes and red fruits. Due to its large number of double conjugated bonds, lycopene is considered one of the best antioxidants among carotenoids. In addition, it is one of the most potent antioxidants found in the human body, with antioxidant potency 100 times higher than vitamin E and vitamin C. Conventional mechanical ventilation (CMV) is the main ARDS treatment, capable of modifying disease evolution and reducing mortality. Based on the protective effects of high frequency oscillatory ventilation (HFOV) on ARDS, previously described by our group, as well as the potential antioxidant and antiinflammatory role of lycopene, our hypothesis is that this carotenoid has additional protective effect in ARDS model. The aim of this study was to investigate the effects of lycopene supplementation on pulmonary oxidative damage, analyzing total antioxidant performance (TAP) and oxidative DNA damage (Comet Assay), in an experimental induced lung injury model in rabbits, ventilated by CMV and HFOV compared to control group. Pulmonary histology and neutrophil cell counts were also evaluated. Fifty-five rabbits were instrumented with tracheostomy, vascular accesses and mechanically ventilated. Supplemented animals received 10mg/ kg of lycopene for 21 days prior to the experiment. Lung injury was induced by tracheal infusion of warm saline (30mL/ kg, 38°C). The following experimental groups were: healthy animals submitted to euthanasia to compose the baseline group without supplementation: GBL; n = 5 and baseline supplemented with lycopene: GBLL; n = 5, healthy animals submitted to Protective CMV, without supplementation, denominated GC control group; n = 5, animals submitted to lung injury induction and mechanical ventilation treatment and supplemented with lycopene GVMCL; n = 10 and without supplementation GVMC; n = 10, animals with LP submitted to HFOV and supplemented with lycopene GVAFL; n = 10 and without supplementation GVAF; n = 10. After confirming lung injury induction, blood gases were performed every 30 minutes during the 4 hours of the experimental protocol. The level of significance was 5%. Comparing the moments before and after the pulmonary injury induction in each group, there was a significant worsening of oxygenation and decrease in static lung compliance in all groups after injury induction. After 4 hours, groups treated with HFOV, with and without lycopene supplementation, and group with lycopene supplementation and submitted protective CMV, showed a significant improvement compared to Protective CMV group without supplementation, showing PaO2/FiO2 ratio similar to the moments before the pulmonary induction and CG. Neutrophil count in bronchoalveolar lavage showed that GVMCL and GVAFL groups presented significantly lower comparing with animals without supplementation. GC, GVAFL and GVMCL had a significantly lower histological injury score compared to groups without supplementation. TAP in lung tissue showed no statistical difference among groups. DNA damage on lymphocytes comparing animals submitted to protective CMV was significantly lower in animals supplemented with lycopene. This study demonstrates that independent of the ventilatory mode, prior lycopene supplementation improves oxygenation, reduced inflammatory injury, as well as histopathological injury score in this lung injury animal model. Both HFOV groups, and animals submitted to protective CMV and supplemented with lycopene showed reduced DNA-free damage compared to animals under de same ventilation without supplementation. / FAPESP: 2014/15683-9