Made available in DSpace on 2014-06-12T18:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6277_1.pdf: 1258637 bytes, checksum: 3bd6fe754154b1007ead8a3fb3326544 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / desvio no uso dos códons podem ocorrer devido a vários fatores. Entre provariotos, o uso de códons sinônimos é atribuido ao equilíbrio existente mutação e seleção natural. Um determinado subconjunto de códons pode frequentemente ser observado nas regiões do genoma onde uma alta eficiência traducional é requerida. O uso de códons de uma beta-proteobactéria, Chromobacterium violaceum, é deswcrito aqui pela primeira vez. O presente estudo teve como objetivo a identificação das principais causas da variação do uso de códons no genoma da C. violaceum ATCC 12472. Uma análise de correspondência (CoA) da utilização relativa de códons sinônimos (RSCU) foi empregada para investigar a variação do uso de códons sinônimos entre os genes. Os resultados mostraram que um dos maiores determinantes desta variação é o conteúdo de GC que mostrou correlação direta com o primeiro eixo principal da CoA. Observou-se também uma forte correlação inversa entre o número relativo de códons (ENc) e o conteúdo Guanina/Citosina na terceira posição (GC3), mostrando que o uso de códons também sofre influência da composição em nucleotídeos. Ao contrário do que observado em alfa-proteobactérias, a assimetria das fitas não pareceu influenciar a composição de aminoácidos ou o número de genes, por outro lado o uso de códosn teve alguma influência. A distribuição semelhante dos genes nas fitas contínua e descontínua apontou para aus~encia de conflito entre transcrição e replicação, provavelmente devido a uma tradução otimizada e a uma replicação muito lenta. A generealidade destas observações entre beta-proteobactérias dependerá de novos estudos com este grupo de microrganismos

A leptospirose é uma zoonose disseminada mundialmente, causada por bactérias do gênero Leptospira. A melhor maneira de contornar o problema é por de medidas preventivas, já que a contenção da proliferação de roedores é inviável e não há vacina eficaz disponível. Estratégias de genômica funcional têm identificado um grande número de proteínas a serem estudadas. Esse fato aliado a dados da literatura, que identificaram proteínas envolvidas na patogenicidade e que são expressas somente em condição de virulência, levou à proposição da utilização da proteômica para canalizar os estudos. A metodologia envolveu obtenção de extratos protéicos de leptospiras retiradas de animais infectados, sua separação por gel bidimensional, e identificação dos spots por espectrometria de massas. O objetivo central foi a identificação de proteínas expressas em bactérias virulentas e ausentes nas não-virulentas. A identificação dessas proteínas pode facilitar a busca de proteínas envolvidas na virulência e infecção da leptospirose. Adicionalmente, é um avanço no esclarecimento da biologia e patogenicidade das leptospiras, bem como para o reconhecimento de candidatos potenciais para a composição de vacinas e/ou métodos diagnósticos mais eficientes. / Leptospirosis, one of the most spread zoonosis worldwide, is caused by bacteria of the genus Leptospira. Preventive measures are the best way to control the disease due to the difficulty to impair the proliferation of rodents and because no efficient vaccine is currently available. Functional genomics strategies have pointed a large number of proteins that could be important immunogens. This fact allied to published data reporting the identification of proteins involved in pathogenesis that are expressed only in virulent strains, led us to propose the use of proteomics as a tool to narrow down these studies. The methodology involved the preparation of protein extracts from tissuederived leptospires, separation by two-dimensional gel and identification of the spots by mass spectrometry. The central objective was to identify proteins expressed only in virulent bacteria. The identification of these proteins could help the search for proteins involved in virulence with a role during infection. Additionally, the data presented here represent a large step to clarify the biology and pathogenicity of leptospires, as well as the identification of potentially important vaccine candidates and/or proteins to compose more efficient diagnostic methods.

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Juan Lucas Argueso Gomes de Almeida / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T04:49:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sampaio_NadiaMariaVieira_M.pdf: 5240623 bytes, checksum: 83a8fd832d725a15f52ace4fb49f9106 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Nos últimos anos, a busca por fontes renováveis de energia tem sido intensificada em todo o mundo e, atualmente, o processo fermentativo de produção de bioetanol destaca-se como uma alternativa energética economicamente viável e menos poluente do que os combustíveis fósseis. Diferentes etapas do processo de produção desse biocombustível vêm sendo aprimoradas e, recentemente, o melhoramento genético de linhagens da levedura Saccharomyces cerevisiae é apontado como um ponto chave para tornar a produção do bioetanol ainda mais rentável. No Brasil, a linhagem JAY270/PE-2 é amplamente utilizada pelo setor industrial devido a sua elevada produtividade e robustez, consideravelmente superiores em relação à linhagem padrão de laboratório S288c. Em busca da compreensão das características genéticas associadas ao fenótipo da linhagem JAY270/PE-2, nosso grupo de pesquisa realizou o sequenciamento de um isolado haploide dessa linhagem, denominado JAY291, o qual revelou um total de 21 genes preditos não identificados no genoma da linhagem S288c. As significativas diferenças fenotípicas observadas entre essas linhagens motivou a investigação do envolvimento destes genes nas características de interesse industrial da linhagem JAY270/PE-2. Para isso, foi realizada uma investigação funcional de 4 desses genes, por meio da avaliação fenotípica de linhagens knockout, testadas quanto às suas principais características de interesse industrial. A partir dos testes realizados, não foi possível correlacionar estes genes a uma função específica. Apesar disso, a anotação dessas sequências, a conservação desses genes em outras linhagens industriais e, adicionalmente, a observação de que alguns deles apresentam-se diferencialmente expressos ao longo de uma fermentação industrial forneceram fortes indícios de que os mesmos apresentam um papel importante para a fisiologia da linhagem em condições industriais. Dessa forma, os dados gerados por este trabalho deverão servir como base para futuros estudos focados na elucidação do papel desses genes, a qual é de fundamental importância, tanto para a geração de conhecimento básico acerca da biologia dessa espécie, como para a identificação de potenciais alvos para o melhoramento genético da linhagem JAY270/PE-2 / Abstract: In the past years, the search for renewable energy sources has increased worldwide and, recently, the bioethanol fermentation process rises as an economically viable and less pollutant alternative supply. Several steps of the production process have been enhanced and the genetic improvement of Saccharomyces cerevisiae strains plays a key role on that effort. In Brazil, the yeast strain JAY270/PE-2 is widely used in the industrial sector due to its high productivity and robustness, being remarkably superior to the reference laboratory strain S288c. In order to shed light to the genetic characteristics underlying these traits, our group sequenced the genome of the derivative haploid JAY291, which unveiled a total of 21 predicted genes absent in the S288c reference genome. The substantial differences observed between these strains motivated us to investigate the relationship between these predicted genes and the industrially relevant phenotype of JAY270/PE-2 strain. Thus, we accomplished the functional investigation of 4 putative genes through phenotypic evaluation of knockout strains. It was not possible to correlate those genes to a specific function. Although, considering their functional annotation, their conservation between industrial strains and also their differential expression during an industrial fermentation strengthens their potential to be related to these industrially valuable traits. Therefore, this study might work as a backbone for the future functional characterization of these genes. This knowledge is of cardinal importance for a comprehensive understanding of the biology of this specie and could possibly provide new targets for the genetic manipulation of the industrial strain JAY270/PE-2 / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestra em Genética e Biologia Molecular

A leptospirose é uma zoonose disseminada mundialmente, causada por bactérias do gênero Leptospira. A melhor maneira de contornar o problema é por de medidas preventivas, já que a contenção da proliferação de roedores é inviável e não há vacina eficaz disponível. Estratégias de genômica funcional têm identificado um grande número de proteínas a serem estudadas. Esse fato aliado a dados da literatura, que identificaram proteínas envolvidas na patogenicidade e que são expressas somente em condição de virulência, levou à proposição da utilização da proteômica para canalizar os estudos. A metodologia envolveu obtenção de extratos protéicos de leptospiras retiradas de animais infectados, sua separação por gel bidimensional, e identificação dos spots por espectrometria de massas. O objetivo central foi a identificação de proteínas expressas em bactérias virulentas e ausentes nas não-virulentas. A identificação dessas proteínas pode facilitar a busca de proteínas envolvidas na virulência e infecção da leptospirose. Adicionalmente, é um avanço no esclarecimento da biologia e patogenicidade das leptospiras, bem como para o reconhecimento de candidatos potenciais para a composição de vacinas e/ou métodos diagnósticos mais eficientes. / Leptospirosis, one of the most spread zoonosis worldwide, is caused by bacteria of the genus Leptospira. Preventive measures are the best way to control the disease due to the difficulty to impair the proliferation of rodents and because no efficient vaccine is currently available. Functional genomics strategies have pointed a large number of proteins that could be important immunogens. This fact allied to published data reporting the identification of proteins involved in pathogenesis that are expressed only in virulent strains, led us to propose the use of proteomics as a tool to narrow down these studies. The methodology involved the preparation of protein extracts from tissuederived leptospires, separation by two-dimensional gel and identification of the spots by mass spectrometry. The central objective was to identify proteins expressed only in virulent bacteria. The identification of these proteins could help the search for proteins involved in virulence with a role during infection. Additionally, the data presented here represent a large step to clarify the biology and pathogenicity of leptospires, as well as the identification of potentially important vaccine candidates and/or proteins to compose more efficient diagnostic methods.

Muitos problemas de classificação descritos na literatura de aprendizado de máquina e mineração de dados dizem respeito à classificação em que cada exemplo pertence a um único rótulo. Porém, vários problemas de classificação, principalmente no campo de Bioinformática são associados a mais de um rótulo; esses problemas são conhecidos como problemas de classificação multirrótulo. O princípio básico da classificação multirrótulo é similar ao da classificação tradicional (que possui um único rótulo), sendo diferenciada no número de rótulos a serem preditos, na qual há dois ou mais rótulos. Na área da Bioinformática muitos problemas são compostos por uma grande quantidade de rótulos em que cada exemplo pode estar associado. Porém, algoritmos de classificação tradicionais são incapazes de lidar com um conjunto de exemplos mutirrótulo, uma vez que esses algoritmos foram projetados para predizer um único rótulo. Uma solução mais simples é utilizar o método conhecido como método Binary Relevance. Porém, estudos mostraram que tal abordagem não constitui uma boa solução para o problema da classificação multirrótulo, pois cada classe é tratada individualmente, ignorando as possíveis relações entre elas. Dessa maneira, o objetivo dessa pesquisa foi propor uma nova adaptação do método Binary Relevance que leva em consideração relações entre os rótulos para tentar minimizar sua desvantagem, além de também considerar a capacidade de interpretabilidade do modelo gerado, não só o desempenho. Os resultados experimentais mostraram que esse novo método é capaz de gerar árvores que relacionam os rótulos correlacionados e também possui um desempenho comparável ao de outros métodos, obtendo bons resultados usando a medida-F. / Many classification problems described in the literature on Machine Learning and Data Mining relate to the classification in which each example belongs to a single class. However, many classification problems, especially in the field of Bioinformatics, are associated with more than one class; these problems are known as multi-label classification problems. The basic principle of multi-label classification is similar to the traditional classification (single label), and distinguished by the number of classes to be predicted, in this case, in which there are two or more labels. In Bioinformatics many problems are composed of a large number of labels that can be associated with each example. However, traditional classification algorithms are unable to cope with a set of multi-label examples, since these algorithms are designed to predict a single label. A simpler solution is to use the method known as Binary Relevance. However, studies have shown that this approach is not a good solution to the problem of multi-label classification because each class is treated individually, ignoring possible relations between them. Thus, the objective of this research was to propose a new adaptation of Binary Relevance method that took into account relations between labels trying to minimize its disadvantage, and also consider the ability of interpretability of the model generated, not just its performance. The experimental results show that this new method is capable of generating trees that relate labels and also has a performance comparable to other methods, obtaining good results using F-measure.

Muitos problemas de classificação descritos na literatura de aprendizado de máquina e mineração de dados dizem respeito à classificação em que cada exemplo pertence a um único rótulo. Porém, vários problemas de classificação, principalmente no campo de Bioinformática são associados a mais de um rótulo; esses problemas são conhecidos como problemas de classificação multirrótulo. O princípio básico da classificação multirrótulo é similar ao da classificação tradicional (que possui um único rótulo), sendo diferenciada no número de rótulos a serem preditos, na qual há dois ou mais rótulos. Na área da Bioinformática muitos problemas são compostos por uma grande quantidade de rótulos em que cada exemplo pode estar associado. Porém, algoritmos de classificação tradicionais são incapazes de lidar com um conjunto de exemplos mutirrótulo, uma vez que esses algoritmos foram projetados para predizer um único rótulo. Uma solução mais simples é utilizar o método conhecido como método Binary Relevance. Porém, estudos mostraram que tal abordagem não constitui uma boa solução para o problema da classificação multirrótulo, pois cada classe é tratada individualmente, ignorando as possíveis relações entre elas. Dessa maneira, o objetivo dessa pesquisa foi propor uma nova adaptação do método Binary Relevance que leva em consideração relações entre os rótulos para tentar minimizar sua desvantagem, além de também considerar a capacidade de interpretabilidade do modelo gerado, não só o desempenho. Os resultados experimentais mostraram que esse novo método é capaz de gerar árvores que relacionam os rótulos correlacionados e também possui um desempenho comparável ao de outros métodos, obtendo bons resultados usando a medida-F. / Many classification problems described in the literature on Machine Learning and Data Mining relate to the classification in which each example belongs to a single class. However, many classification problems, especially in the field of Bioinformatics, are associated with more than one class; these problems are known as multi-label classification problems. The basic principle of multi-label classification is similar to the traditional classification (single label), and distinguished by the number of classes to be predicted, in this case, in which there are two or more labels. In Bioinformatics many problems are composed of a large number of labels that can be associated with each example. However, traditional classification algorithms are unable to cope with a set of multi-label examples, since these algorithms are designed to predict a single label. A simpler solution is to use the method known as Binary Relevance. However, studies have shown that this approach is not a good solution to the problem of multi-label classification because each class is treated individually, ignoring possible relations between them. Thus, the objective of this research was to propose a new adaptation of Binary Relevance method that took into account relations between labels trying to minimize its disadvantage, and also consider the ability of interpretability of the model generated, not just its performance. The experimental results show that this new method is capable of generating trees that relate labels and also has a performance comparable to other methods, obtaining good results using F-measure.

Plantas de Citrus regeneradas de tecidos juvenis demandam um longo período para a análise do fenótipo resultante em flores ou frutos. Este trabalho apresenta o mutante espontâneo de florescimento precoce de laranja doce, denominado \'x11\', como modelo para estudos de genômica funcional de Citrus. As frutas cítricas são ricas em carotenoides, pigmentos que possuem grande valor nutricional, como pró-vitamina A (?- ou ?-caroteno). Estudos de genômica funcional envolvendo genes da via biossintética dos carotenoides terão resultados rapidamente obtidos utilizando-se variedades com florescimento e frutificação precoce, como a laranjeira doce mutante \'x11\'. A laranjeira doce \'Sanguínea-de-Mombuca\' (SM) é uma variedade de polpa vermelha que acumula licopeno na polpa dos frutos, podendo ser considerada uma importante ferramenta no estudo da acumulação de carotenoides nos frutos de laranjeiras. Desta maneira, o objetivo deste estudo foi estabelecer a laranjeira \'x11\' como planta-modelo em experimentos de transformação genética visando estudos de genômica funcional dos genes PSY (fitoeno sintase), PDS (fitoeno desaturase), CRTISO (carotenoide isomerase), LCY-b (licpeno ?-ciclase) e ?-caroteno hidroxilase (HYb), envolvidos na biossíntese de carotenoides e utilizar a laranjeira SM como ferramenta no entendimento da acumulação dos carotenoides nos frutos de Citrus. Plantas de laranjeira \'x11\' foram transformadas com promotor de expressão preferencial para órgãos reprodutivos de Citrus controlando a expressão de gene repórter (gusA) para a análise da tecido especificidade. Foi realizada a otimização do protocolo de transformação genética de segmentos de epicótilo de laranjeira \'x11\' via Agrobacterium. A eficiência de transformação média foi de 18,6%, mas atingiu 29,6% no protocolo otimizado. Das 270 brotações positivas, cinco foram microenxertadas e aclimatizadas. Quatro dessas plantas exibiram as primeiras flores em três meses após o estabelecimento ex vitro, e a outra, dois meses mais tarde, independentemente da época do ano. A coloração histoquímica da atividade do gene gusA foi realizada em segmentos de caule, flores e frutos de plantas transgênicas aclimatizadas, com 5-7 meses de idade, confirmando a expressão constitutiva do gene gusA nesses órgãos. As plantas transformadas com a construção para o teste do promotor de expressão preferencial para órgãos reprodutivos de Citrus continuam em fase de desenvolvimento. Em seguida foi realizada a transformação genética de laranjeira \'x11\' para a superexpressão dos genes PDS e LCY-b1 e para a superexpressão do gene LCY-b1 e HYb em laranjeira SM. Também foi realizada a transformação genética de \'x11\' para o silenciamento do gene CRTISO e HYb e também para o silenciamento do gene CRTISO, em SM. A quantificação da expressão do gene-alvo em tecido foliar foi correlacionada ao número de cópias do cisgene inseridos em cada planta, revelando que o nível de expressão gênica não foi diretamente ligado ao número de cópias inseridas no genoma. Uma planta de laranjeira \'x11\' superexpressando o gene LCY-b1 frutificou e foi realizada a análise do perfil de carotenoides totais em relação ao fruto de uma planta não transformada. Neste evento houve aumento no teor de carotenoides totais e xantofilas, indicando o potencial da manipulação dos genes codificadores de enzimas da via biossíntese de carotenoides para alterações quantitativas e qualitativas destes pigmentos / Considering the perennial developmental phase of Citrus, plants regenerated from juvenile tissues require long period for analysis of the resulting phenotype in flowers or fruits. Herein, we present the spontaneous sweet orange mutant named \'x11\', as a model plant for functional genomics studies in Citrus due to the remarkable feature of early-flowering. Citrus fleshy fruits are rich in carotenoids which are pigments that have great nutritional value, such as pro-vitamin A (?- or ?-carotene). Functional genomics studies involving genes related to carotenoids biosynthesis pathway can be rapid generated by using the early flowering mutant, \'x11\' in sweet orange background. The fleshy fruit from the sweet orange \'Sanguínea-de-Mombuca\' (SM) has a red pulp due to accumulation lycopene that may be considered an important tool to investigate the accumulation of carotenoids in sweet orange fruits. Therefore, the aim of this study was to establish the orange mutant \'x11\'as model plants for genetic transformation and functional genomics analysis of key regulatory genes PSY (phytoene synthase), PDS (phytoene desaturase), CRTISO (carotenoid isomerase), LCY-b1 (licopene ?-cyclase) and ?-carotene hydroxylase (HYb) involved in the biosynthesis of carotenoids and to use the sweet orange SM as a tool in understanding the accumulation of carotenoids in sweet orange fruits. The mutant plants \'x11\' were transformed with gene reporter (gusA) under control of specific promoter for reproductive organs in Citrus for the tissue specificity analysis. We report a procedure for efficient regeneration and transformation using epicotyl segment explants of \'x11\' and Agrobacterium tumefaciens as a proof-of-concept. The average transformation efficiency was 18.6%, but reached 29.6% in the best protocol tested. Among 270 positive shoots, five were micrografted and acclimatized. Four of these plants exhibited the first flowers within three months after ex vitro establishment, and the other, two months later, regardless the period of the year. Transgenic plants harboring specific promoter for reproductive organs in Citrus are still under development. We transformed \'x11\' for overexpression of PDS or LCY-b1 genes, and to overexpress LCY-b1 or HYb in SM sweet orange. \'x11\' was transformed to silence CRTISO or HYb , and CRTISO gene in SM sweet orange. Then, quantification of target gene expression in leaf tissue was performed by correlating this information with the number of copies of cisgene inserted into each plant. According to the results, it is suggested that the level of gene expression is not directly linked to the number of copies inserted into the genome.One transgenic plant of \'x11\' overexpressing LCY-b1 produced flowers and fruits and the carotenoid profile analysis indicated an increased in content of total carotenoids and, especially, xanthophylls, clearly indicating the potential to manipulate expression of genes encoding enzymes of the carotenoid biosynthetic pathway to obtain qualitatively and quantitatively changes of these pigments

Em estudos de proteção ao genoma contendo lesões de C. crescentus, foi feita uma varredura em uma biblioteca clones mutados pelo transposon Tn5 e sensíveis à luz UV-B e MMS. Dos 249 clones selecionados conseguimos identificar mutações em 102 genes, distribuídos em dez categorias funcionais, incluindo metabolismo de DNA. Além de genes já descritos como atuantes na defesa de genoma a lesões, os dados ainda adicionam funções potenciais para outros genes. Investigação mais detalhada indica que vários dos genes identificados podem afetar o estresse e ciclo celular, podendo estar relacionados a respostas do tipo pontos de checagem. Além disso, verificamos que mutantes para genes envolvidos em reparo excisão de nucleotídeos são mais sensíveis à H2O2, indicando que nessa bactéria, este sistema de reparo atua também em lesões oxidativas no DNA. Os dados obtidos são pioneiros no estabelecimento de funções para vários genes de C. crescentus e de outras alfa-proteobactérias. / This work aimed to identify genes related to DNA damage protection in C. crescentus, by means of screening a Tn5 -mutated library for clones sensitive to UV-B light and MMS. Out of 249 selected clones, we were able to identify mutations in 102 genes, classified in ten different functional categories, including DNA metabolism. In addition to genes already described as playing a role in genome defense to lesions, the results provide new potential functions to several other genes. More detailed investigation indicates also that the mutations in some of these genes may also affect cell stress and cell cycle, being potentially involved in check-point responses. Moreover, mutants for nucleotide excision repair genes were also found to be sensitive to H2O2, indicating that this DNA repair system also acts in DNA oxidative damage. These data are the first establishing a role in genome protection for several genes in C. crescentus, as well as other alpha-proteobacteria.

A compensação da dosagem gênica entre fêmeas XX e machos XY em mamíferos é adquirida através de um complexo mecanismo epigenético que resulta na inativação de grande parte de um dos cromossomos X nas células femininas. O processo de inativação do cromossomo X (XCI) se inicia cedo durante a embriogênese, concomitantemente à diferenciação celular, e envolve a aquisição de modificações epigenéticas características do cromossomo X inativo (Xi). Uma estabelecido, o padrão de inativação é estavelmente mantido através de todas as mitoses celulares subsequentes e por toda a vida do organismo (exceto para células germinativas que sofrem reativação do Xi). Os mecanismos envolvidos na iniciação e estabelecimento da XCI foram extensivamente estudados, especialmente em camundongos. Embora algumas características epigenéticas associadas à manutenção da XCI tenham sido descritas, a identidade e modo específico de ação de fatores envolvidos durante essa fase da XCI são aspectos ainda não bem compreendidos. Além disso, o processo de XCI apresenta diferenças importantes entre humanos e camundongos e estudos direcionados para a identificação de novos componentes envolvidos na manutenção da XCI em humanos tornam-se de fundamental importância. Triagens funcionais genômicas por bibliotecas de shRNAs constituem uma ferramenta poderosa para a identificação de genes envolvidos em diferentes mecanismos celulares e vias bioquímicas. Sendo assim, utilizamos essa ferramenta para triar genes envolvidos na manutenção da XCI em humanos. Células somáticas femininas primárias HPRT+/-/HPRT- foram transduzidas com uma biblioteca lentiviral de shRNAs e posteriormente tratadas em meio de cultura contendo a droga HAT para seleção de células HPRT+ nas quais esperava-se que o cromossomo Xi presente tivesse sofrido reativação em decorrência do knockdown de genes envolvidos na manutenção da XCI. Essa estratégia nos permitiu identificar 20 novos genes candidatos a estarem envolvidos na manutenção da XCI. Esses candidatos deverão ser avaliados individualmente para confirmar seu papel no processo de controle epigenético do cromossomo X / Transcriptional dosage compensation between mammalian XX females and XY males is acquired through a complex epigenetic mechanism that leads to the inactivation of most part of one of the X chromosomes in the female cells. The X chromosome inactivation (XCI) process takes place early during embryogenesis and involves the acquisition of epigenetic modifications that are characteristic of the inactive X chromosome (Xi). Once silencing is established, the inactivation pattern is maintained in through all the subsequent mitosis and the same X chromosome remains stably silenced in all the descendant cells and throughout the life of the organism (except for the germ line cells that undergo X chromosome reactivation). The initiation of XCI has been studied extensively, especially in mice. Although some epigenetic features associated with the maintenance of XCI have already been described, the identity and specific mode of action of the factors involved in this phase of XCI are largely unknown. Moreover, the XCI process presents important differences between mice and humans, and studies directed to the identification of new players involved in the maintenance of human XCI are fundamentally important. Functional genome-wide screens using multiplex shRNA libraries are a powerful tool for the identification of genes involved in different cellular mechanisms and biochemical pathways. In order to screen for genes involved in the maintenance of XCI in humans, a population of HPRT+/-/HPRT- primary somatic female cells were transduced with a multiplex lentiviral shRNA library and subsequently treated in HAT medium to select for HPRT+ cells in which we expected that the Xi would undergo reactivation as a result of the knockdown of genes involved in the maintenance of XCI. As a result, we identified 20 new candidate genes that could potentially be involved in the maintenance of XCI. These candidates should be individually evaluated in order to confirm their role in the epigenetic control of the X chromosome

O fungo filamentoso Trichoderma reesei é um dos principais fungos utilizados para a produção em larga escala de enzimas devido a sua grande capacidade de produção e secreção de holocelulases para aplicação em processos de sacarificação da biomassa vegetal lignocelulósica. Embora o T. reesei seja utilizado como um dos principais produtores de celulases a nível industrial, diversos processos e estudos são realizados com o objetivo de aprimorar o entendimento de todo o mecanismo de degradação de biomassa vegetal além de prover o aumento da eficiência tanto da produção quanto da atividade das celulases. No presente trabalho foi realizado a construção de uma linhagem mutante para o gene cel74a (codificando para uma xiloglucanase) e a caracterização funcional de CEL74A na regulação gênica de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. Os nossos resultados mostraram que deleção de cel74a possivelmente pode estar envolvida no sinergismo da regulação da expressão de holocelulases durante o cultivo em bagaço de cana-de-açúcar. A partir da análise do perfil de expressão gênica, foi possível observar a redução na expressão de todos os genes de celulases testados (cel7a, cel7b e cel6a) embora não tenha afetado a atividade enzimática, ao passo que as hemicelulases (xyn1 e xyn2) apresentaram aumento tanto na expressão quanto na atividade enzimática. Na linhagem ?cel74a, foi observado redução na liberação de glicose, xilose e galactose após a hidrólise de xiloglucano. Além disso, a atividade de CEL74A foi modulada na presença de cálcio e pode ser necessária para a atuação mais eficiente de outras enzimas envolvidas na degradação de xiloglucano. Desta forma, em T. reesei, CEL74A apresenta um papel importante tanto na regulação de genes holocelulolíticos quanto para a degradação eficiente de bagaço de cana-de-açúcar, contribuindo para a elucidação de mecanismos pelos quais este fungo utiliza para a utilização do bagaço de cana-de-açúcar como fonte de carbono / The filamentous fungus Trichoderma reesei is one of the main fungi used for the large-scale production of enzymes due to their great capacity of production and secretion of holocellulases for application in saccharification processes of lignocellulosic plant biomass. Although T. reesei is used as one of the main producers of cellulases at industrial level, several processes and studies are carried out with the aim of improving the understanding of the whole plant biomass degradation mechanism, as well as increasing the efficiency of both the production and cellulase activity. In the present work the construction of a mutant lineage for the cel74a gene (coding for a xyloglucanase) and the functional characterization of CEL74A in the gene regulation of holocellulases during the cultivation of sugarcane bagasse were carried out. Our results showed that deletion of cel74a may be involved in the regulation of holocellulase expression during sugarcane bagasse cultivation. From the analysis of the gene expression profile, it was possible to observe the reduction in the expression of all tested cellulase genes (cel7a, cel7b and cel6a), although it did not affect the enzymatic activity, whereas the hemicellulases (xyn1 and xyn2) presented increase in both expression and enzymatic activity. In the ?cel74a strain, a reduction in glucose, xylose and galactose release was observed after xyloglucan hydrolysis. In addition, the activity of CEL74A was modulated in the presence of calcium and may be required for the more efficient performance of other enzymes involved in the degradation of xyloglucan. Thus, in T. reesei, CEL74A plays an important role both in the regulation of holocellulolytic genes and in the efficient degradation of sugarcane bagasse, contributing to the elucidation of mechanisms by which this fungus uses for the use of sugarcane bagasse as source of carbon