Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología / Dada la necesidad de diversificar la matriz energética existe la necesidad de buscar nuevas fuentes de biomasa para las energías renovables no convencionales, entre las cuales las algas pardas son una fuente de carbono por su composición en carbohidratos fermentables, entre los que se destacan el polisacárido alginato. Para industrializar un proceso de sacarificación y fermentación de alginato es necesario contar con un organismo reconocido como seguro por la FDA (G.R.A.S.). El siguiente trabajo consiste en el establecimiento de una ruta degradativa de alginato en S. cerevisiae S288c, mediante la construcción de módulos de expresión de las enzimas del tipo alginato liasa, oligoalginato liasa, DEHU reductasa y KDG quinasa, KDGP aldolasa en el cromosoma XVII y el transportador GAT en vector episomal. Se obtuvo un transformante de S. cerevisiae S288c clon 47 resistente a higromicina B. La cepa recombinante posee un crecimiento de un 37,5% superior a la cepa nativa en condiciones de 5 y 10 g/L de glucosa y alginato, con una degradación de hasta 6 g/L de alginato a las 60 horas, correspondiente a un 63% del total de alginato. Los análisis enzimáticos revelan que no es posible encontrar la expresión de DEHU reductasa en el organismo. La expresión de las enzinas alginolíticas está presente en el medio intracelular, como también en la fracción extracelular mediante el uso de un péptido señal. Estudios de docking molecular muestran similitudes estructurales de los transportadores del tipo de la superfamilia del facilitador mayor de ácido D-galacturónico, ácido D-quínico con transportadores de xilosa y glucosa, y sugieren que pueden que ser utilizados para la asimilación de ácidos urónicos. Los resultados experimentales muestran que S. cerevisiae S288-47 posee mayor crecimiento utilizando el transportador heterólogo GAT-1, por sobre quTD. Se requieren estudios adicionales para incrementar la capacidad de degradación del alginato por parte de esta levadura, y la asimilación de los ácidos urónicos, además de ser complementado con otras rutas degradativas de azúcares provenientes de algas como manitol.

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Tesis entregada a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Doctor en Ciencias con mención en Microbiología. / Saccharomyces cerevisiae es la principal especie responsable de la producción de vino. Un problema importante durante el proceso de vinificación son las fermentaciones estancadas debido a la deficiencia de nitrógeno en el mosto de uva. Actualmente, el metabolismo del nitrógeno se encuentra bajo investigación activa, con énfasis en la vía de señalización TORC1, dado su papel central en conectar el crecimiento con la suficiencia de nutrientes. Sin embargo, el mecanismo por el cual las fuentes de nitrógeno activan TORC1 no se comprende completamente. En este trabajo, se desarrolló un nuevo método para monitorear la activación de TORC1 basado en el gen reportero de la luciferasa. Este método se usó para fenotipificar una población recombinante derivada de dos cepas que mostraron fenotipos opuestos para la activación de TORC1 por glutamina. Usando esta información fenotípica, se realizó un mapeo de QTLs, identificando varios QTLs para la activación de TORC1. Utilizando un análisis de hemicigosidad recíproca, se validaron los genes GUS1, KAE1, PIB2 y UTH1 como responsables de la variación natural en la activación de TORC1. Las cepas recíprocas hemicigotas para el gen KAE1 (ATPasa requerida para la modificación t6A de los tRNAs) mostraron las mayores diferencias fenotípicas para la activación de TORC1, como también diferencias fenotípicas en sus capacidades fermentativas en condiciones de bajo nitrógeno. En conjunto, estos resultados resaltan la importancia del procesamiento de tRNAs en la activación de TORC1 y conectan esta vía con la cinética de fermentación de levaduras en condiciones limitantes de nitrógeno. / Saccharomyces cerevisiae is the main species responsible for wine production. A major problem during the winemaking process are stuck fermentations due to nitrogen deficiency in the grape must. Currently, nitrogen metabolism is under active research, with emphasis on the TORC1 signalling pathway, given its central role connecting growth with nutrient sufficiency. However, the mechanism by which nitrogen sources activate TORC1 is not completely understood. In this work, a new method for monitoring TORC1 activation was developed based on the luciferase reporter gene. This method was used to phenotype a recombinant population derived from two strains that showed opposite phenotypes for TORC1 activation by glutamine. Using this phenotypic information, a QTL mapping was performed, identifying several QTLs for TORC1 activation. Using a reciprocal hemizygous analysis, the GUS1, KAE1, PIB2 and UTH1 genes were validated as responsible for the natural variation in the TORC1 activation. Reciprocal hemizygous strains for KAE1 gene (ATPase required for t6A tRNA modification) showed the greatest phenotypic differences for TORC1 activation, as well as phenotypic differences in their fermentative capacities under low nitrogen conditions. Altogether, these results highlight the importance of tRNA processing in TORC1 activation and connects this pathway with yeast fermentation kinetics under nitrogen-limited conditions.

Memoria para optar al título de Ingeniero en Alimentos / El uso de levaduras en la industria alimentaria es ampliamente conocido pues estos microorganismos poseen excelentes propiedades funcionales y nutricionales con una fuente inagotable de nutrientes. El objetivo de este trabajo fue utilizar levadura seca e inactiva en mezclas de paté con el fin de comprobar su efecto como emulsificante a fin de mantener propiedades texturales y sensoriales típicas de un paté. Utilizando fórmulas bases se definieron dos categorías de paté, no económica y económica, dividas en tres clases de muestras: control, 50% y 100% de levadura. En cada una se utilizó dos tipos de emulsificantes típicos (mono y diglicéridos de ácidos grasos y proteína aislada de soya), elaborándose 12 paté en total, los cuales fueron sometidos a análisis de índice de estabilidad y texturales para determinar la cantidad de levadura a utilizar en las fórmulas finales. Se determinaron características fisicoquímicas y nutricionales para cada muestra cuyos resultados arrojaron valores de pH y actividad de agua de 6,0 y 0,95, respectivamente. Nutricionalmente los paté con 100% de levadura como emulsionante presentaron un aporte calórico similar al teórico, bajos valores de sodio y un pequeño aporte de fibra dietética. Se realizó una evaluación sensorial con un panel entrenado de 11 jueces con experiencia en productos cárnicos donde el test de valoración de calidad indicó, entre todas las muestras, que el paté 100% levadura, no económico-proteína aislada de soya, resultó ser el de mayor calidad. Un segundo test, de diferencias contra control (sin levadura), indicó que, de los paté no económicos, el 100% levadura-proteína aislada de soya presentó una mayor cantidad de atributos con direccionalidad “mayor al control”, mientras que, de los económicos, con ambos emulsificantes, se obtuvo la mayor cantidad de atributos con direccionalidad “menor al control”. La comparación de costos entre las muestras estableció que las muestras no económicas poseen mayores valores que los paté económicos, donde las muestras 50 y 100% levadura poseen un aumento en los costos de 5 y 9%, respectivamente, en comparación a sus controles / The use of yeast in the food industry is widely known because these microorganisms have excellent functional and nutritional properties with an inexhaustible source of nutrients. The objective of this work was to use dry and inactive yeast in mixtures of pâté in order to check its effect as emulsifier in order to maintain textural and sensory properties typical of a pâté. Using base formulas, two categories of pâté, not economic and economic, were defined, divided into three classes of samples: control, 50% and 100% yeast. In each one, two types of typical emulsifiers (mono and diglycerides of fatty acids and soy protein isolate) were used, producing 12 pâté in total, which were subjected to stability index and textural analysis to determine the amount of yeast to be used in the final formulas. Physicochemical and nutritional characteristics were determined for each sample whose results showed pH and water activity values of 6.0 and 0.95, respectively. Nutritionally, the pâté with 100% yeast as emulsifier presented a caloric intake similar to theoretical, low sodium values and a small contribution of dietary fiber. A sensory evaluation was carried out with a trained panel of 11 assessors with experience in meat products where the quality assessment test indicated, among all the samples, that the 100% yeast pâté, not economic -isolated soy protein, was found to be of higher quality. A second test, of differences against control (without yeast), indicated that, of the noneconomic pâté, 100% yeast-soy protein isolated presented a greater number of attributes with directionality "greater than control", while, of the economic ones, with both emulsifiers, the highest number of attributes with "less than control" directionality was obtained. The cost comparison between the samples established that the non-economic samples have higher values than lower quality pâté, where samples 50 and 100% yeast have an increase in costs of 5 and 9%, respectively, compared to their controls

En este trabajo, se diseñó y probó a escala piloto un medio de cultivo a base de bagazo de manzana como sustrato para la producción industrial de biomasa de levaduras de vino nativas Patagónicas convencionales y no convencionales. El bagazo de manzana se caracterizó fisicoquímicamente y su potencial utilidad como componente de un medio de cultivo completo para la producción de biomasa de levadura se evaluó en primer lugar utilizando diseños experimentales factoriales. La influencia de la composición del medio sobre los parámetros de crecimiento de las levaduras vínicas autóctonas de la Patagonia, se analizó mediante diseños Plackett-Burman y compuesto central con metodología de superficie de respuesta, comparando en cada ensayo el bagazo de manzana con la melaza de caña, el sustrato comúnmente utilizado para la propagación de biomasa. Se formuló la composición del medio de cultivo y se validaron los modelos. Seguidamente, la composición del medio de cultivo se optimizó en cultivos por lote a escala piloto (20 L) ajustándose la fuente nitrogenada, el pH y la temperatura hasta obtener una conversión óptima del sustrato en producto, en función del tiempo de fermentación. La calidad microbiológica de la biomasa obtenida se evaluó mediante métodos convencionales y sus propiedades tecnológicas se analizaron a escala industrial mediante vinificaciones guiadas utilizando la biomasa húmeda obtenida y dos iniciadores comerciales como controles. La cinética de la fermentación, seguida por evolución de la densidad del mosto, fue óptima y capacidad de implantación de las cepas, evaluada mediante recuento de viables en un medio completo y discriminación de las cepas por ADNm RFLP utilizando la endonucleasa Hinf I, resultó del 100 %. Los vinos fueron analizados química y sensorialmente y sometidos a una prueba de preferencia del consumidor con resultados estadísticamente significativos y favorables. Finalmente, se realizó un estudio de factibilidad técnica y económica del proyecto de producción de levadura seca activa (LSA) teniendo en cuenta las necesidades regionales, obteniéndose resultados favorables. Los resultados permiten concluir que el bagazo de manzana constituye un sustrato ventajoso para la propagación de levaduras enológicas, en particular las Crabtree positivas como Saccharomyces cerevisiae, tanto desde un punto de vista nutricional, tecnológico como económico. Importancia e impacto del estudio: Este trabajo propone transformar un material alternativo rico en carbono, generosamente disponible en la región de la Patagonia y generado como desecho industrial, en un recursos energéticos sostenible, económicamente rentable y amigable con el medio ambiente destinado a la producción de insumos alimenticios que involucren levaduras. Adicionalmente el proyecto agregará valor a la producción vitivinícola local y permitirá la sustitución de insumos importados. / A culture medium based on apple bagasse was designed and tested as a substrate for biomass production of conventional and unconventional Patagonian native wine yeasts. The physicochemical characterization of the apple bagasse/waste was carried out and its potential utility as a constituent of a complete culture medium for the production of yeast biomass was firstly analysed using the experimental statistical designs. Growth parameters of conventional and non-conventional Patagonian wine yeasts were analysed with Plackett–Burman designs and response surface methodology, comparing in each assay the apple bagasse substrate with the commonly used substrate for biomass development, cane molasses. The composition of the culture medium was formulated and models were validated. After this, culture medium composition was optimized at pilot scale (20 L) in batch cultures where nitrogen source, pH and process temperature were adjusting in order to obtain optimal substrate conversion into product. The biomass microbiological quality was evaluated by conventional methods and its technological properties were assayed at industrial scale through guided vinifications using wet biomass and two commercial starters as controls. The kinetics of alcoholic fermentation were followed by density and implantation of the strains by counting viable cells on agar plate agar and molecular analysis using ADNm RFLP and Hinf I endonuclease. The wines were chemically analyzed and their oenological quality was evaluated using a consumer preference test with statistically favorable results for them. Finally, the technical and economic feasibility study of a project on active dry yeast production attending regional needs was performed. The results allow to conclude that apple bagasse constitutes an advantageous substrate for the propagation of enological yeasts from a nutritional, technological and economic point of view. Significance and Impact of the Study: This work propose to transform an alternate carbon-rich material, generously available in Patagonia region, originally generated as fruit industrial waste, into a source of sustainable, economically profitable, and environmentally friendly energy resource for the food supplies production that involving yeasts. The project allows also to improve the local wine industry as well as imported products substitution.

Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo Mención: Enología y Viticultura / La industria enológica, permanentemente desarrolla nuevos productos que buscan mejorar las características técnicas y organolépticas de los vinos elaborados. La decisión de uso debe equilibrar variables técnicas y económicas junto a la búsqueda de atributos de calidad reconocibles y valorables por el consumidor. En este trabajo se comparó el efecto de dos levaduras sobre las características físicas, químicas y sensoriales de un vino Chardonnay obtenido con diferentes formas de nutrición nitrogenada. Para ello, se utilizó un mosto deficiente en nitrógeno asimilable al que se adicionó nitrógeno inorgánico (sal de amonio) y un suplemento nutritivo complejo. Durante la fermentación alcohólica, mediante registros diarios de densidad, temperatura y conteos poblacionales de levaduras viables, se evaluó el comportamiento de las cepas utilizadas y se comprobó, que la velocidad y duración del proceso fermentativo, es diferente independiente del tipo de nutrición utilizada. Los vinos fueron analizados físico químicamente y se comprobó que las diferencias obtenidas por efecto de las cepas de levaduras o por el tipo de nutrición nitrogenada, no comprometen analíticamente al producto final. Sensorialmente, las cepas estudiadas presentaron diferencias cuantitativas y/o cualitativas respecto a atributos como intensidad aromática, aromas a frutos tropicales y aceptabilidad, mientras que el uso de un suplemento nutritivo complejo, generó diferencias en la percepción del panel de estos y otros atributos, como la persistencia, acidez y amargor. Se pudo comprobar que el perfil aromático específico presentó diferencias por acción de la cepa de levadura utilizada, pero una suplementación compleja, no generó diferencias en tipo, cantidad e intensidad de descriptores aromáticos identificables por el panel. / The wine industry, constantly develop new products to improve the technical and organoleptic characteristics of wines produced. The decision of use, must balance technical and economic variables beside obtaining appreciated quality attributes by the consumer. In this study, the analytical and sensory effect of wine obtained with two yeasts and different forms of nitrogen nutrition, using a Chardonnay grape juice, deficient in this element was compared Through daily records of density, temperature and counts of viable population it was demonstrated that the breeds of yeast respond differently on the rate fermentation and duration of the process regardless of the type of nitrogen nutrition. The analytical differences obtained, product of the effect of the yeast breeds or the type of nitrogen nutrition, does not compromise final parameters of wine. The studied breeds showed quantitative and/or qualitative sensorial differences especially on aromatic intensity, aromas of tropical fruits and acceptability. The use of a complex nutritional supplement made differences in the perception of the panel of these and other attributes, such as persistence, acidity and bitterness. The aromatics profiles due the actions of yeast breeds were different, however a complex supplementation were not generated differences on quantity and intensity of aromatics descriptors recognizable by the panel.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La otitis externa es una enfermedad de etiología multifactorial que afecta comúnmente a los caninos. Representa una patología compleja que se asocia a infecciones causadas por bacterias y levaduras y que muchas veces no responden a los tratamientos. El objetivo de este estudio fue evaluar la eficacia de un limpiador ótico en dos presentaciones (vehículo líquido y vehículo gel) como tratamiento único en pacientes con otitis externa bilateral. Esta solución contenía ácido acético 2%, ácido bórico 2%, ácido salicílico 1%, lidocaína 2% y azufre 0,5%. En esta investigación, 15 perros fueron incluídos con diagnóstico clínico y citológico de otitis externa generada por bacterias cocáceas y levaduras. Los oídos afectados fueron tratados con un limpiador ótico en presentación gel o líquido según correspondiera y cuya distribución fue al azar. La aplicación se realizó una vez al día por 14 días, considerando un control citológico y otoscópico el día 7 y 14 de tratamiento. El limpiador ótico, independiente de su presentación, fue eficaz en cuanto a la reducción de los recuentos para bacterias cocáceas y levaduras en el 100% de los pacientes. En cuanto a la efectividad entre soluciones, considerando un recuento de bacterias cocáceas menor a 25 bacterias por campo al término del tratamiento, la presentación líquida alcanzó un 40% de efectividad en comparación a un 20% de la presentación gel, sin encontrarse diferencias significativas entre ellas. Para los recuentos de levaduras considerando valores menores a 5 levaduras por campo al término del tratamiento, la presentación líquida alcanzó una efectividad de un 20% y la presentación gel un 60%, sin embargo, tampoco hubo diferencias significativas entre ambas presentaciones. En cuanto a los signos clínicos evaluados, es importante considerar que todos los perros en estudio, tuvieron una significativa regresión al término del tratamiento. Otitis externa, perros, limpiadores óticos, bacterias, levaduras.

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Memoria para optar al Título Profesional de Ingeniero Agrónomo / El objetivo del presente estudio consistió en evaluar el uso de cuatro fuentes nitrogenadas diferentes en un mismo mosto del cultivar Sauvignon Blanc proveniente del valle de Leyda de la temporada 2012. El mosto fue sometido a análisis de FAN, pH, acidez total, acidez volátil, densidad, sulfuroso libre, sulfuroso total para verificar que correspondiera a las condiciones buscadas y los vinos obtenidos en cada tratamiento fueron caracterizados a través de la medición de pH, acidez total, acidez volátil, densidad, sulfuroso libre, sulfuroso total, grado alcohólico y azúcar residual. Además se determinó la evolución de fermentación alcohólica midiendo diariamente la densidad y temperatura de todos los tratamientos. Cada una de las muestras obtenidas fue evaluada por un panel entrenado con previa experiencia en el análisis de la variedad Sauvignon Blanc, quienes tuvieron que analizar solo el aroma de las muestras midiendo los descriptores de intensidad aromática, aroma a cítrico, aroma a durazno, aroma a pimentón verde, aroma a frutos tropicales, aroma a pera y aroma a miel. En el comportamiento de la fermentación alcohólica se pudo observar que el tratamiento 3 es significativamente diferente respecto de los otros tratamientos. En la evaluación sensorial se encontró diferencias significativas solo en el aroma a pera y se evidenció una gran heterogeneidad en las respuestas de los evaluadores para cada una de las muestras. / The aim of this study was to evaluate the use of four different nitrogen sources in Sauvignon Blanc of Valley Leyda of the 2012 season. The must was subjected to analysis of FAN, pH, total acidity, volatile acidity, density, free sulfur, total sulfur to verify that correspond to the conditions sought and wines produced in each treatment were characterized by the measurement of pH, acidity total volatile acidity, density, free sulfur, total sulfur, high alcohol and residual sugar. Further evolution was determined by measuring daily fermentation the density and temperature of all treatments. Each of the samples obtained was evaluated by a trained panel with prior experience in the analysis of Sauvignon Blanc, they had to analyze only the aroma of the samples by measuring the descriptors of aromatic intensity, citrus aroma, aroma of peach, aroma of green pepper , tropical fruit aroma, aroma of pear and honey aroma. The behavior of the alcoholic fermentation, it was observed that treatment 3 is significantly different from other treatments. The sensory evaluation found significant differences only in the aroma of pear and showed a high heterogeneity in the responses of the evaluators for each of the samples.

Memoria para optar al título profesional De Ingeniero Agrónomo Mención: Enología y Vitivinicultura