Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:21Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo5215_1.pdf: 1381913 bytes, checksum: 3a78f7ed849513c01bc3e4ced1760801 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / O ácido úsnico é um metabólito de líquen que apresenta uma grande variedade de atividades biológicas, dentre as quais, citotoxidade frente a células oriundas de tumores malignos humanos. Apesar da existência de revisões recentes sobre a atividade citotóxica do ácido úsnico, o mecanismo de ação desta droga ainda não foi completamente elucidado. Não existe na literatura referência ao envolvimento do gene supressor de tumor p53 com os efeitos do ácido úsnico. Na sua forma normal, a proteína p53 atua em resposta a diferentes estresses celulares levando à transcrição de genes que induzem a retenção do ciclo celular ou apoptose. Entre as formas de atuação do p53 está a repressão de genes que codificam proteínas associadas à polimerização e estabilização de microtúbulos. Estas funções são perdidas quando ocorrem mutações em sua via metabólica, o que acontece em mais de 50% dos tumores cancerosos humanos. O objetivo deste trabalho foi investigar se o mecanismo da ação anticancerígena do ácido úsnico envolve a ativação da via metabólica p53. Para estudos da sensibilidade de linhagens cancerígenas ao ácido úsnico, foram realizados ensaios pelo método colorimétrico do MTT [3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyl-tetrazolium bromide], utilizando-se várias concentrações do fármaco (1 a 60 μM) por 72h, frente às seguintes linhagens de células malignas humanas: MCF7(câncer de mama, positiva para receptores de estrogênio, p53 normal), MDA-MB-231(câncer de mama, negativa para receptores de estrogênio, p53 inativo), H1299 (câncer de pulmão, nula para p53). Para determinar o envolvimento do p53 na ação citotóxica do ácido úsnico, os níveis das proteínas p53 e p21 (um inibidor de quinases dependentes de ciclinas cuja expressão é controlada pelo p53) em células MCF7 tratadas com 29 μM de ácido úsnico por 24h foram determinados utilizando-se ensaios western blot com o anticorpo monoclonal DO-12 (específico para p53) e WAF1 (específico para p21). Para verificar se a ação anticancerígena do ácido úsnico resulta em dano ao DNA celular, a fosforilação da SER15 do p53 (um marcador para danos em DNA) foi investigada, após tratamento de células MCF7 com 29 μM de ácido úsnico por 24h. Nestes estudos, ensaios western blot foram realizados com o anticorpo policlonal FOSFO-SER15, específico para serina fosforilada. Para verificar se o aumento nos níveis da proteína p53 detectados após o tratamento com ácido úsnico eram acompanhados por um aumento em sua atividade transcricional, foram executados ensaios com ß-Gal. Nesta metodologia utilizaram-se fibroblastos T22 de camundongos, portadores do plasmídeo RGDFos-LacZ (contendo o resíduo de 36 pb do sítio de ligação para o p53), tratados com diferentes concentrações de ácido úsnico. Para a investigação dos efeitos do ácido úsnico na formação e estabilização de microtúbulos, células MCF7 foram tratadas com 29 μM de ácido úsnico por 24h, fixadas em metanol e tratadas com anticorpo monoclonal anti-ß-tubulina. O ácido úsnico mostrou atividade citotóxica frente às várias linhagens celulares oriundas de tumores malignos humanos, promovendo elevação nos níveis das proteínas p53 e p21. Entretanto, este aumento não foi acompanhado de incremento na atividade transcricional nem da fosforilação da SER15 do p53. Também não foram detectadas modificações na formação dos microtúbulos. As propriedades anticancerígenas do ácido úsnico como agente não genotóxico que atua de uma forma independente do p53 fazem dele um candidato em potencial para novas terapias de câncer

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_natalia_camacho.pdf: 752258 bytes, checksum: 4db6bde27e4ad1a1adedd5d44779d4aa (MD5) Previous issue date: 2007-06-01 / Lectins are proteins or glicoproteins of non-immune origin with binding specificities for carbohidrates, that interact with glicocomponents present in plant and animal cells, bacteria and viruses. This property makes lectins remarkable markers used in histochemical and biochemical studies, and for characterization and differentiation of cells. Leguminous plants are the major source of lectins, proteins that possess important biological activities, like insecticidal and antiproliferative against cancer cell lines. Thus, the aim of this work was to develop a heterologous expression system for a recombinant lectin from Bauhinia forficata, a leguminous plant popularly known as pata-de-vaca , in E. coli, to study its characteristics and biological activities. The lectin gene bfl was amplified by PCR from genomic DNA, and cloned to expression vectors pQE30 e pET32a(+). Recombinant BFL was expressed in E. coli in insoluble form by using the vector pET32a(+)/bfl. The lectin was purified by Ni +2 -Sepharose affinity chromatography, with a yield of 40 mg.L -1 . The sequence and carbohidrate specificity of rBFL is similar to other related lectins. The rBFL lectin presents in monomer and dimer forms, with aparent molecular mass of 44 and 94 kDa, respectively, shows biological activity in hemagglutination assay in the presence of divalent metal cations (Ca +2 and Mn +2 ) and antiproliferative effect on human cancer cell lines MCF-7 (breast cancer), HT-29 (colon cancer) and HL-60 (leukemia) according as the concentration used. The rBFL lectin showed dose-dependent inhibition in HT-29 cells, stimulatory effect on proliferation of MCF-7 cells in higher concentrations, and no induction of cell death was observed in any cancer cell line. The results obtained in this work, about rBFL lectin, never before isolated or produced in heterologous system, motivates the performance of new characterization assays to elucidate possible applications. / Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não imune com propriedade de ligação especifíca a carboidratos, capazes de interagir com glicocomponentes presentes em células de plantas, animais, bactérias e vírus. Essa propriedade faz das lectinas notáveis marcadores utilizados em estudos histoquímicos, bioquímicos e na caracterização e diferenciação de células. Plantas leguminosas constituem-se na maior fonte de lectinas, que possuem atividades biológicas importantes, como atividade inseticida e antiproliferativa sobre células tumorais. Diante disto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um sistema de expressão heteróloga para uma lectina de Bauhinia forficata (rBFL), popularmente conhecida como pata-de-vaca , em E. coli, com o intuito de elucidar suas características e atividades biológicas. O gene bfl da lectina foi amplificado por PCR a partir do DNA genômico, e clonado nos vetores de expressão pQE30 e pET32a(+). A lectina rBFL foi expressa em larga escala pelo vetor pET32a(+)/bfl em E. coli, na forma insolúvel. A purificação foi realizada por cromatografia de afinidade em coluna de Ni +2 -Sepharose, com rendimento de 40 mg.L -1 . A seqüência da lectina rBFL e sua especificidade por carboidrato é similar a de lectinas relacionadas. A lectina rBFL apresenta-se na forma de monômeros e dímeros, com massa molecular aparente de 44 e 94 kDa, respectivamente, possui atividade biológica em ensaio de hemaglutinação na presença de cátions divalentes (Ca +2 and Mn +2 ) e demonstra efeito antiproliferativo sobre as linhagens tumorais humanas MCF-7 (câncer de mama), HT-29 (câncer de cólon) e HL-60 (leucêmica), dependendo da concentração utilizada. A rBFL demonstrou efeito inibitório dose-dependente sobre HT-29, e efeito estimulatório sobre a proliferação da linhagem MCF-7 em altas concentrações, não induzindo morte celular em nenhuma das linhagens. Os resultados obtidos neste trabalho acerca da rBFL, nunca antes isolada ou produzida em sistema heterólogo, motivam a realização de novos ensaios de caracterização visando possíveis aplicações.