The study of natural genetic variations affecting organogenic capacity in tomato (Solanum lycopersicum) is attractive due to the existence of several tomato wild relatives with enhanced organogenic capacity. The characterization of such variations is relevant not only in order to manipulate plant development, but also to understand its ecological and evolutionary significance. The objective of this work was to characterize three tomato loci whose alleles from the wild relative S. pennellii enhance in vitro shoot and root regeneration, and analyze their involvement in the acquisition of competence phase. In the first manuscript, we report the genetic and physiological characterization of the loci Rg3C, Rg7H and Rg8F. The S. pennellii alleles were introgressed into the tomato genetic model cv. Micro-Tom (MT), creating the near isogenic lines (NILs) MT-Rg3C, MT-Rg7H and MT-Rg8F. In the second manuscript we present a comparative analysis between the Near-Isogenic Lines (NILs) MT-Rg3C and MT-Rg1. Since Rg1 was proposed to be a key gene in the acquisition of competence, and was mapped in the chromosome three, it is believed that Rg3C is probably equivalent to the Rg1 allele from S. peruvianum. After the introgression of the loci into the MT background, the NILs presented enhanced regeneration of both roots and shoots, confirming that the loci were successfully introgressed. The analysis of the time for acquisition of competence and induction, together with the molecular characterization of the NILs, indicate that the genes present in the loci Rg3C, Rg7H and Rg8F affect in vitro regeneration by distinct pathways. While Rg3C decreased the time required for both acquisition of competence and induction, the other loci seem to influence only the time of acquisition of competence, in the case of Rg8F, or the time of induction, in the case of Rg7H. Additionally, although MT-Rg3C has an enhanced shoot branching phenotype, MT-Rg7H and MT-Rg8F did not differ from MT in this trait. This indicates that enhanced in vitro shoot formation in tomato is not necessarily related to a deleterious high branching phenotype. Comparative analyses of MT-Rg1 and MT-Rg3C strongly indicate that Rg1 and Rg3C are alleles of a same gene controlling regeneration capacity. Integrating Rg1 and Rg3C mapping information, we were able to narrow the number of candidate genes for Rg1/Rg3C to only 27, which were also analyzed and discussed. / O estudo de variações genéticas naturais afetando a capacidade de organogênese in vitro em tomateiro (Solanum lycopersicum) é promissor devido a existência de uma série de espécies selvagens relacionadas ao tomateiro, que apresentam alta capacidade organogênica in vitro. A caracterização de tais variações é relevante não apenas com o objetivo de manipulação do desenvolvimento vegetal, mas também com o intuito de entender o significado ecológico e evolutivo de tal característica. O objetivo desse trabalho foi caracterizar três loci de tomateiro, cujos alelos vindos de seu parente selvagem S. pennellii aumentam a capacidade de regeneração de gemas caulinares e radiculares in vitro, e analisar o envolvimento de tais loci na fase de aquisição de competência para regeneração. Nós apresentamos no primeiro capítulo a caracterização genética e fisiológica dos loci Rg3C, Rg7H e Rg8F. Os alelos de S. pennellii foram introgredidos na cultivar modelo Micro-Tom (MT), criando as linhagens quase isogênicas (Near Isogenic Lines - NILs) MT-Rg3C, MT-Rg7H e MT-Rg8F. No segundo capítulo nós analisamos comparativamente as NILs MT-Rg3C e MT-Rg1. Uma vez que Rg1 foi proposto como gene chave na aquisição de competência, e assim como Rg3C está localizado no cromossomo 3, acredita-se que Rg3C seja provavelmente ortólogo ao gene Rg1 de S. peruvianum. Após a introgressão dos loci na cultivar MT, as NILs, assim como esperado, apresentaram alta taxa de regeneração tanto de gemas caulinares, quanto de radiculares in vitro, confirmando que os loci foram devidamente introgredidos. A análise do tempo de aquisição de competência e indução, juntamente com a caracterização molecular das NILs, indicam que os genes localizados nos loci Rg3C, Rg7H e Rg8F afetam a regeneração in vitro através de rotas distintas. Enquanto Rg3C diminui o tempo necessário tanto para a aquisição de competência quanto para indução de gemas caulinares, os outros dois loci parecem influenciar apenas a aquisição de competência, no caso de Rg8F, ou a indução de gemas caulinares, no caso de Rg7H. Além disso, apesar de MT-Rg3C apresentar alta ramificação, MT-Rg7H e MT-Rg8F não diferiram de MT nesse aspecto, o que evidencia que a formação de gemas caulinares in vitro não está necessariamente relacionada ao aumento da ramificação. As análises comparativas entre MT-Rg3C e MT-Rg1 indicam fortemente que Rg1 e Rg3C sejam dois alelos de um mesmo gene controlando a alta capacidade de regeneração. Através do cruzamento dos dados de mapeamento disponíveis para esses dois alelos foi possível diminuir o número de genes candidatos à Rg1/Rg3C para apenas 27 genes, que são apresentados nesse trabalho.

A pesquisa de linhagens com duplicação cromossômica, como a linhagem A de Aspergillus nidulans, teve oseu início no final da década de 1970. Durante este período foram isolados da linhagem A, diversos variantes deteriorados, que foram caracterizados genética e citologicamente. Neste trabalho de pesquisa, as analises genéticas demonstraram que os determinantes de deterioração ou segmentos de inserção de V5, V101, V102, V103 e V104 estão localizados nos grupos de ligação VIII, III, IV, VII e I respectivamente. As análises citogenéticas revelaram diversas alterações no ciclo celular e migração nucleares nas fases iniciais de desenvolvimento. A duplicação cromossômica da linhagem A e os variantes deteriorados foram investigados a nível molecular, por técnica de PCR. Os resultados mostraram que o segmento de inserção consiste de um provável Elemento de Transposição, denominado de MATE, o qual é característico do fungo Aspergillus nidulans. Os segmentos de inserção analisados apresentam características típicas de MATE, como o motivo "Spe" que é encontrado por toda seqüência dos Elementos MATE. / The research with chromosome duplication strains, as strain A of Aspergillus nidulans, began during the 70's, with isolation of several deteriorates variants of strain A and characterization by genetic and cytological analysis. In this work the genetic analysis has demonstrated that the deterioration determinant or insertion sequence in V5, V101, V102, V103 and V104 deteriorates variants are located in the linkages groups VIII, III, IV, VII and I, respectively. The cytological analyses have demonstrated changes in cellular cycle and nuclear migration in initial phases of development. The chromosome duplication of strain A and the deteriorated variants were investigated by PCR with designed primers to mobile elements, what have resulted in the identification of the transposable element MATE, mainly by great similarity with "Spe" motif sequence that is described as essential in activity of these elements.

O objetivo desta pesquisa foi avaliar a magnitude da interação genótipos x ambientes (G x E) e a sua conseqüência na adaptabilidade e na estabilidade fenotípica de 100 linhagens experimentais de soja pertencentes a quatro ciclos de maturação (28 precoces, 38 semiprecoces, 27 intermediárias e sete semitardias), através de três metodologias que quantificam a adaptabilidade e/ou estabilidade fenotípica (ecovalência, regressão linear de Eberhart & Russel e AMMI ou "Additive Main effects and Multiplicative Interaction"), com ênfase nas produtividades de grãos e óleo. Os experimentos foram conduzidos em três localidades (Anhembi, Areão e ESALQ) do município de Piracicaba, Estado de São Paulo, Brasil (540 m de altitude, 22 o 42' de latitude sul e 47 o 39' de longitude oeste), em cultivo de verão (semeadura em novembro), nos anos agrícolas de 1996/97, 1997/98, 1998/99 e 1999/00. Em cada local foram avaliados quatro experimentos, correspondentes a quatro ciclos de maturação (CM). O delineamento utilizado foi o de blocos ao acaso com duas repetições estratificadas em conjuntos experimentais e quatro testemunhas comuns por conjunto. A parcela experimental foi representada por quatro fileiras de 5 metros de comprimento, espaçadas de 0,5 metro, sendo utilizadas para a tomada de dados apenas os 4 metros centrais das duas fileiras intermediárias da parcela. Os ambientes corresponderam à combinação de ano e local, totalizando 12 ambientes por CM. Os caracteres avaliados foram: número de dias para a maturidade (NDM), altura de planta na maturidade (APM), acamamento (Ac), valor agronômico (VA), produtividade de grãos (PG), porcentagem de óleo nas sementes (%OL) e produtividade de óleo (PO). Para a análise de adaptabilidade e estabilidade fenotípica utilizou-se apenas os caracteres PG, %OL e PO. Os resultados mostraram que o efeito de ambientes foi mais importante do que o efeito da interação genótipos (G) x ambientes (E), e este, mais importante do que o efeito de genótipos (linhagens). A magnitude da interação G x E, para a PG e PO, foi maior do que para a %OL, indicando que este último caráter foi mais estável. As linhagens precoces (LP) e semiprecoces LSP) foram mais adaptadas, mas exibiram interações G x E mais complexas e foram mais instáveis do que as intermediárias (LI) e semitardias (LST). As LI associaram alta adaptabilidade com estabilidade média para PG e PO, ao contrário¶ das LP, LSP e LST, nas quais a alta adaptabilidade esteve sempre associada com baixa estabilidade. Os anos agrícolas associados com os locais Anhembi e ESALQ foram mais favoráveis que os ambientes relacionados com o local Areão, mas estes apresentaram maior previsibilidade. A seleção de linhagens com média e previsibilidade altas foi mais difícil para a %OL do que para PG e PO, em decorrência das correlações negativas entre as médias e os parâmetros de estabilidade; a utilização desses parâmetros em conjunto mostrou-se mais eficiente na seleção simultânea para adaptabilidade e estabilidade. As metodologias foram similares quanto ao ordenamento das linhagens; no entanto, diferiram quanto à precisão, explicação, informação sobre a interação G x E e adaptabilidade das linhagens. O método da ecovalência pode ser utilizado para selecionar para estabilidade e, quando associado com a média, também para adaptabilidade, sempre que o melhorista não esteja interessado em obter informações adicionais sobre recomendações de linhagens para ambientes específicos. A regressão linear de Eberhart & Russel foi mais influenciada pelos efeitos ambientais do que pelos efeitos da interação G x E, não explicando satisfatoriamente o comportamento das linhagens. O padrão adjacente à interação G x E foi baixo e a presença de ruídos (efeitos aleatórios causados por fatores micro-ambientais) foi alta, evidenciando que apenas parte da variação total observada para a interação G x E foi importante para explicar o comportamento das linhagens. A interpretação gráfica da análise AMMI pelos biplots AMMI1 e AMMI2, para modelos que incluem mais de dois eixos, foi eficiente em explicar a estabilidade das linhagens e ambientes, mas a adaptabilidade foi melhor compreendida com o auxílio das médias preditas para linhagens e ambientes pelo modelo selecionado. O método AMMI foi mais eficiente do que os métodos da ecovalência e da regressão linear de Eberhart & Russel, pois permitiu analisar com mais detalhes os efeitos da interação G x E, ganhando precisão e melhorando o processo de seleção. As linhagens que reuniram maior adaptabilidade com estabilidade para PG e PO dentro de cada CM foram: USP 94-1086 (precoce), USP 93-2316 (semiprecoce), USP 93-5243 (intermediária) e USP 93-5684 (semitardia). / The objective of this research was to evaluate the magnitude of the genotype-environment interaction (G x E) and its consequence on the phenotypic adaptability and stability of one hundred soybean experimental lines belonging to four maturity cycles (28 early, 38 semi-early, 27 intermediate, and seven semi-late), through three methodologies that quantify the phenotypic adaptability and/or stability (ecovalence, linear regression of Eberhart & Russel and AMMI or "Additive Main effects and Multiplicative Interaction"), with emphasis in the seed and oil yield. The experiments were carried out at three localities (Anhembi, Areão and ESALQ) of the Piracicaba county, State of São Paulo, Brazil (540 m of altitude, 22 o 42' South latitude, and 47 o 38' West longitude), during the summer crop season (sowing in november) in the agricultural years of 1996/97, 1997/98, 1998/99, and 1999/00. For each locality and maturity cycle, a randomized complete block experiment was designed, with two replications stratified in experimental sets and four common checks in each set. The experimental plot corresponded to four rows 5.0 m x 0.5 m, where the four central meters of the two intermediate rows were evaluated. Each environment corresponded to a combination of locality and year, totalizing 12 environments by maturity cycle. The traits number of days to maturity (NDM), plant height at maturity (APM), lodging (Ac), agronomic value (VA), seed yield (PG), oil percentage in the seeds (%OL), and oil yield (PO) were evaluated. For the phenotypic adaptability and stability analysis it was only used the characters PG, %OL, and PO. The results showed that the effect of environment was more important than the effect of G x E interaction, and this one more important than the genotype effect (lines). The magnitude of the G x E interaction for PG and PO showed larger than for %OL, indicating that this was more stable. The early and semi-early lines were more adapted, but exhibited G x E interactions more complex and were more ustable than the intermediate and semi-late lines. The intermediate lines associated high adaptability with medium stability for PG and PO, unlike the early, semi-early, and semil-ate lines, for which the high adaptability was always associated with low stability. The agricultural year associated with the Anhembi and ESALQ localities were more favorable than the environments related with Areão locality, but those showed larger predictability. The selection of lines with high means and predictability went more difficult for %OL than for PG and PO, due to the negative correlations between the means and the stability parameters; the combined use of those parameters was shown more efficient in the selection for adaptability and stability. The methodologies were similar with relationship to the ranking of the lines; however, they differed for the precision, explanation, information on the G x E interaction and on adaptability of the lines. The ecovalence method can be used to select for stability and, when associated with the mean, also for adaptability, whenever the breeder is not interested in obtaining additional information on recommendation lines for specific environments. The linear regression of Eberhart & Russel was more influenced by the environmental effects than the effect of G x E interaction, and it did not explain satisfactorily the performance of the lines. The pattern adjacent to G x E interaction was low and the high presence of noises (random variation caused by microenvironments factors), evidencing that only part of the variation observed for the G x E interaction was important to explain the line performance. The graphic interpretation of the AMMI analysis by biplots AMMI1 and AMMI2, for model that includes more than two axes, was efficient in explaining the stability of the lines and environments, but the adaptability was better understood with the aid of means predicted by the selected model for lines and environments. The AMMI method was more efficient than the ecovalence and linear regression of Eberhart & Russel methods, because allowed to analyze with more details the effects of G x E interaction, gaining precision and improving the selection process. The lines that gathered larger adaptability with stability for PG and PO, inside of each maturity cycle, were: USP 94-1086 (early), USP 93-2316 (semi-early), USP 93-5243 (intermediate), and USP 93-5684 (semi-late).

Carotenoides são pigmentos encontrados em grande abundancia em frutos do tomateiro. A capacidade de sequestro de radicais destes pigmentos faz do tomate uma excelente opção para inclusão de compostos nutricionais pela dieta. Embora a síntese de carotenoides seja reconhecida como uma das respostas da cascata de eventos que levam ao amadurecimento, pouco se sabe a respeito de sua influência neste processo. Deste modo, o objetivo deste trabalho foi determinar se o conteúdo e a composição de carotenóide nos frutos acarretam alterações na conservação e na suscetibilidade dos frutos ao fungo B. cinerea. Foram utilizadas linhagens quase isogênicas (NILs) ao Micro Tom (MT) carregando as mutações, Beta carotene (B), tangerine (t), yellow flesh (r) e Delta carotene (Del). A caracterização dessas variações alélicas revelou, não apenas alterações no conteúdo de carotenoides, mas também outros efeitos pleiotrópicos relacionados ao amadurecimento, parâmetros de qualidade, espessura da cutícula e propriedades nutricionais dos frutos. Em face disso, subsequentemente investigamos se o diferencial conteúdo e composição de carotenóides nas referidas NILs altera a suscetibilidade dos frutos ao fungo Botrytis cinerea. A caracterização do amadurecimento demonstrou que o pico climatérico dos frutos do mutante r foi antecipado, assim como a transição para o estádio breaker. De modo contrário, a alteração na coloração da epiderme do mutante t foi atrasada, reafirmando suspeitas de outros autores que sugeriram que a enzima carotenoide-isomerase é necessária para a síntese de carotenoides no escuro. O conteúdo de ácido ascórbico também foi contrastante entre estes genótipos, sendo que no mutante r a sua concentração foi elevada, enquanto em t sua concentração foi reduzida. A perda de massa dos frutos foi menor no mutante Del, no entanto, esta característica não esteve relacionada a espessura da cutícula, que foi maior em B. A inoculação com B. cinerea por meio de ferimentos na pele dos frutos revelou menor suscetibilidade do mutante t, e em menor amplitude, do mutante Del. Ainda, o mutante t também se mostrou menos suscetível à inoculação do patógeno sobre frutos intactos. A maior espessura da cutícula de B não reduziu sua suscetibilidade ao fungo, que infectou os tecidos preferencialmente através da cicatriz do pedúnculo. A interação com B. cinerea desencadeou a produção de etileno e de espécies reativas de oxigênio (EROs), assim, é provável que a capacidade de sequestro de radicais livres tenha contribuído para a redução da suscetibilidade em t e Del, que mostraram menor produção de superóxido. Juntos, estes resultados sugerem que a modulação na atividade de enzimas da carotenogênese pode servir como ferramenta para obtenção de frutos com diferente vida útil durante o armazenamento pós-colheita de tomate. / Carotenoids are pigments found in great abundance in tomato fruits. The radical sequestration capacity of these pigments makes tomato an excellent option for inclusion of nutritional compounds in diet. Although the synthesis of carotenoids is recognized as one of the cascade responses that trigger ripening, little is known about its influence in this process. Thus, the aim of this study was to determine if the content and composition of carotenoids in the fruits alters the conservation and the susceptibility of the fruits to the B. cinerea fungus. Micro Tom (MT) near-isogenic lines (NILs) harboring the mutations Beta carotene (B), tangerine (t), yellow flesh (r) and Delta carotene (Del) has been used. The characterization of these allelic variations revealed not only changes in the carotenoid content but also other pleiotropic effects related to maturation, quality parameters, cuticle thickness and nutritional properties of fruit. In this way, we subsequently investigated whether the differential content and composition of carotenoids in NILs alters fruit susceptibility to the fungus Botrytis cinerea. The ripening characterization showed that the climacteric peak of the fruits of the r mutant was anticipated, as well as the transition to the breaker stage. Conversely, the change in epidermal coloration of mutant t was delayed, reaffirming suspicions of other authors who suggested that the carotenoid-isomerase enzyme is required for the synthesis of carotenoids in the dark. The ascorbic acid content was also contrasting among these genotypes, and in the r mutant its concentration was high, while at t its concentration was reduced. The fruit mass loss was lower in Del mutant, however, this characteristic was not related to cuticle thickness, which was higher in B. Wound-inoculation with B. cinerea revealed less susceptibility of the mutant t, and in a lesser extent, the mutant Del. Further, mutant t was also less susceptible to pathogen inoculation on intact fruits. The greater thickness of the cuticle of B did not reduce its susceptibility to the fungus, which infected the tissues preferentially through the scar of the peduncle. The interaction with B. cinerea triggered the production of ethylene and reactive oxygen species (ROS), so the free radical scavenging capacity probably contributed to the reduction of t and Del susceptibility, which showed lower production of superoxide. Together, these results suggest that modulation in carotenogenesis enzyme activity may serve as a tool to obtain fruit with different shelf-life during post-harvest tomato storage.

Um total de 1.520 bactérias isoladas a partir de amostras de lodo de esgoto doméstico e de solo de área preservada foi avaliado para a produção de polihidroxialcanoatos (PHA) com os corantes lipofílicos Nile Red A e Sudan Black B, permitindo a detecção de 261 isolados. Ensaios de produção de PHA revelaram isolados produtores de P3HB apresentando valores superiores à linhagem Burkholderia sacchari LFM101 e valores de produção de PHAMCL superiores à linhagem Pseudomonas sp. LFM046, além de 6 isolados produtores da mistura de P3HB e PHAMCL. Os primers RECF1/RECR permitiram a detecção específica do gene phaC do tipo I de três bactérias produtoras de P3HB, e os primers P613F/P613R detectaram genes phaC do tipo I em bactérias produtoras da mistura de polímeros. Um fragmento de DNA de 4 kpb de uma biblioteca genômica do isolado RMP1058BII, produtor da mistura de P3HB e PHAMCL, foi detectado utilizando os primers P613F/P613R, e a expressão desse fragmento de DNA uma linhagem de Pseudomonas mutada no gene phaC levou à produção de pequena quantidade de P3HB. / A total of 1520 isolates from domestic sewage sludge or soil of preserved area were evaluated in regards of PHA production using the lipophilic Nile Red A or Sudan Black B dyes, allowing the detection of 261 isolates. PHA production experiments revealed P3HB producing isolates at higher amounts than the strain Burkholderia sacchari LFM101 and PHAMCL production rates higher than those presented by the strain Pseudomonas sp. LFM046, besides 6 isolates producing P3HB and PHAMCL mixtures. The RECF1/RECR primers allowed the specific type I phaC genes detection in three P3HB producing bacteria and the P613F/P613R primers detected type I phaC genes in the polymer mixture producing isolates. A 4 kbp DNA fragment from a genomic library of the isolate RMP1058BII was detected using the P613F/P613R primers. This DNA fragment expression in a Pseudomonas strain mutated in phaC gene leaded to the production of small amounts of P3HB.

Duas linhagens filogenéticas principais (LI e L2) foram definidas em Trypanosoma cruzi, com base em sequências de genes de rDNA e mini-exon e análise por RAPD (Souto et al. 1996). Neste trabalho investigamos a estrutura e atividade dos promotores do cistron ribossômico das duas linhagens de T. cruzi. O promotor da cepa Dm28 (L2) foi clonado e sua seqüência foi comparada com seqüências publicadas da região homóloga de CL (L1) e La Cruz (L2). A identidade entre os dois promotores de L2 foi de 98%, e entre estes e o de L1 foi de 82%. O ponto de início de transcrição foi mapeado, apresentando a mesma localização nas duas linhagens. A atividade dos promotores de L1 e L2 foi determinada em construções plasmidiais contendo o gene reporter da cloranfenicol acetil transferase (CAT). Experimentos de expressão transitória mostraram que o promotor de L1 foi funcional apenas em isolados de L1, enquanto que o promotor de L2 foi funcional em ambas as linhagens. A expressão do promotor de L2 em isolados de L1 foi maior do que a do promotor homólogo. Analisamos ainda a atividade dos dois promotores em um grupo de isolados que apresentam dois tipos de cistrons ribossômicos (grupo 1/2). Neste grupo de cepas observamos que ambos os promotores presentes nas construções são funcionais, embora o promotor de L2 induza maior expressão de CAT. Por outro lado, demonstramos que nestes isolados apenas o cistron ribossômico de tipo 2 é expresso in vivo. Neste trabalho analisamos ainda a eficiência de entrada das construções plasmidiais nas cepas de T. cruzi; caracterizamos a atividade de regiões do promotor de L2 e a eficiência do processo de \"trans-splicing\" para gerar mRNA de CAT contendo a seqüência de mini-exon na extremidade 5\'. / Two major phylogenetic lineages (L1 and L2) have been defined in Trypanosoma cruzi based on rDNA and mini-exon sequences and RAPD analysis (Souto et al., 1996). In the present work we have investigated the structure and activity of ribosomal RNA promoters from the two T. cruzi lineages. The promoter region of Dm28 strain (L2) was cloned and its sequence was compared with the homologous regions from the CL (L1) and La Cruz (L2) strains, whose sequences were previously published. The identity found between promoters of the two L2 strains was 98%, while the identity between L2 and L1 promoters was 82%. The transcription start point mapped in the two Lineages showed the same localization. The activity of L1 and L2 promoters was investigated through the use of plasmid constructs bearing bacterial chloramphenicol acetyl transferase (CAT) as reporter gene. Experiments of transient expression showed that the L1 promoter drove high CAT activity in L1 isolates, but essentially no activity in L2 strains. On the other hand, L2 promoter was functional in both Lineages. The expression driven by L2 promoter in L1 isolates was higher than that driven by the homologous promoter. We have also analysed the activity of both L1 and L2 promoters in a particular group of T. cruzi isolates (group 1/2) which contains two types of rRNA cistrons. It was observed that both promoters were functional in this group of strains, although L2 promoter drove higher CAT activity. This is an interesting result since we have shown that in group 1/2 isolates only the type 2 rRNA cistron is expressed in vivo. In the present study, we have also analysed the transfection efficiency of the plasmid constructs in T. cruzi strains; the activity of segments of the L2 promoter; and the efficiency of the \"trans-splicing\" process involved in the generation of mature CAT mRNA containing the mini-exon sequence at the 5\' end.

O Fator VII recombinante (FVIIr) tem sido a principal escolha terapêutica dos pacientes hemofílicos que desenvolvem inibidores contra os fatores VIII e IX utilizados como tratamento. Atualmente, o produto utilizado é produzido em células de camundongo (BHK-21), o qual oferece desvantagens considerando a complexidade das modificações pós-traducionais desta proteína e a inserção de glicosilações de origem murina altamente imunogênicas aos seres humanos. Dessa maneira a produção de proteínas para uso terapêutico em linhagens celulares humanas surge como uma alternativa promissora. Dentro desse contexto, o objetivo principal deste trabalho foi clonar e expressar o FVII de coagulação sanguínea em 3 linhagens celulares humanas (HepG2, Sk-Hep, HKB-11), compará-las com a linhagem murina BKH-21, e selecionar a melhor produtora da proteína recombinante. As células foram modificadas com o vetor lentiviral p1054-CIGWS, contendo os genes do FVII e do marcador GFP. Após a modificação das células foi observada uma eficiência de transdução de 80% nas células BHK-21-FVIIr, 73% nas células HepG2-FVIIr, 32% nas células HKB-11-FVIIr e 95% Sk-Hep-FVIIr. Análises da expressão gênica por PCR em Tempo Real mostraram que as três linhagens humanas modificadas apresentaram expressão do RNAm relativo ao FVIIr, sendo que a linhagem celular HepG2 foi a que teve maior expressão de FVIIr, seguida da Sk-Hep-1 e HKB-11. Quando submetidas ao tratamento com vitamina K por um período de 10 dias em cultura, a expressão do gene FVIIr foi semelhante para as três linhagens (HepG2: 164563 URE, HKB-11: 119122 URE e Sk-Hep: 124919 URE). O FVII é uma proteína que para sua ativação, possui como principal modificação pós traducional a -carboxilação vitamina K dependente, que ocorre por meio do ciclo da vitamina K com a participação de 3 enzimas, -carboxilase, VKORC1 e calumenina (inibidor). A expressão gênica dessas enzimas foi avaliada antes e após o tratamento com a vitamina K. Foi possível observar que houve um aumento nos níveis de RNAm nas células humanas tratadas com vitamina K, sugerindo que esta é capaz de ativar as enzimas do ciclo da -carboxilação. A cinética de crescimento celular em garrafas estáticas mostrou que a as células murinas BHK-21 modificadas possuem uma velocidade específica de crescimento 25% mais elevada que das células humanas. Contudo a cinética de produção das linhagens recombinantes mostrou que as células humanas produzem cerca de 3 vezes mais FVIIr do as células BHK-21. Devida a baixa produção de FVIIr na linhagem celular murina, e ao fato de que a linhagem humana HepG2 apresenta um perfil de crescimento extremamente lento, as linhagens recombinantes Sk-Hep-1-FVIIr e HKB-11-FVIIr foram selecionadas para ensaios de cultivo em suspensão utilizando microcarregadores em frascos spinners. Ao longo de 10 dias de cultivo as células HKB-11-FVIIr mostraram uma produção acumulada de 152 g de FVIIr, o que corresponde a 304 UI. As células Sk-Hep-1-FVIIr produziram cerca de 202,6 g de FVIIr, o que corresponde a 405,2 UI. Em suma, nossos dados comprovam que as linhagens celulares humanas são eficazes para a produção de fator VII recombinante, uma vez que, utilizando nosso modelo de produção, estas mostraram-se melhores do que a de células murinas (BHK-21) utilizadas pela indústria. Assim, estas linhagens celulares humanas podem ser usadas como uma nova plataforma para a produção de FVII, bem como para outras proteínas recombinantes, de maneira mais segura e com menor risco de desenvolvimento de anticorpos inibidores / Recombinant factor VII (FVIIr) has been the main therapeutic choice for hemophilic patients who develop inhibitors antibidies to conventional treatments (FVIII and FIX). Currently, the comercial product is produced in murine cells (BHK-21) which gives disadvantages considering the complexity of post-translational modifications of these proteins. The insertion of murine residues can be highly immunogenic in humans. Thus the production of proteins for therapeutic use in human cell lines appears as a promising alternative. In this context, the aim of this study was to clone and express the blood coagulation FVII in 3 human cell lines (HepG2, Sk-Hep-1, HKB-11) and select the best cell line for production of recombinant protein. The cells were modified with the lentiviral vector p1054-CIGWS containing the FVII gene and GFP gene marker. After cells modification we observed efficiency of transduction, in which 80% of BHK-21-FVIIr cells showed GFP expression, 73% of HepG2-FVIIr cells, 32% of HKB-11-FVIIr cells and 95% SK- Hep-FVIIr. Gene expression analysis by real-time PCR showed that the three modified human cell lines exhibited RNAm expression relative to FVIIr. When cells were treated with 5 ug/mL vitamin K in culture, the gene expression of FVIIr was similar in the three cell lines (HepG2: 164 563 URE, HKB-11: 119122 and SK-Hep URE: 124919 URE). For FVII activation, the main post translational modification is -carboxylation vitamin-K-dependent which envolves three enzymes, -carboxylase, VKORC1 and calumenina (inhibitor) . Gene expression of these enzymes was evaluated before and after treatment with vitamin K. It was observed that there was an increase in mRNA levels in human cells treated with vitamin K, suggesting that the treatment is capable of activating the enzymes of the vitamin K cycle. Cell growth kinetics showed that modified murine cells BHK-21 have a higher specific growth rate, around 25% more than human cells. However the kinetics of production of recombinant cell lines showed that human cells expressing rFVII 3-fold more rFVII than BHK-21 cells. Due the low rFVII production of murine cells, and the extremely slow growth profile of human cell line HepG2, the recombinant cell lines Sk-Hep-1-rFVII and HKB-11-rFVII have been selected for cultivation tests in suspension using microcarriers in spinners flasks. Over 10 days of cultivation the HKB-11 cells showed a cumulative production of rFVII 152 ug, corresponding to 304 IU and SK-Hep-1 cells showed a rFVII production of 202.6 ug, corresponding to 405.2 IU. In summary, our data demonstrate that human cell lines are effective for producing recombinant factor VII. Using our production model, human cells were better than murine cells (BHK-21) used by the industry. Thus, these human cell lines can be used as a new platform for the FVII production, as well as for other recombinant proteins, with less risk of developing inhibitor antibodies

Dentre as diversas questões envolvendo a tecnologia duplo haploides (DH) em milho, uma que tem sido pouco discutida é a geração em que se deve induzir haploides, no caso, F1 ou F2. Destas, a F1 tem sido a mais utilizada. No entanto, o seu uso constante pode levar a perdas de ganhos genéticos, devido ao menor número de recombinações. Com isso, alguns autores aconselham o uso da F2 na indução, o que possibilitaria maiores ganhos em variabilidade genética. Desse modo, os objetivos foram verificar o efeito das gerações F1 e F2 na expressão do R1-navajo em germoplasma tropical, na eficiência relativa de cada uma das etapas da metodologia e na variabilidade genética das linhagens DH obtidas. Para isso, cinco fontes de germoplasma, em gerações F1 e F2, foram cruzadas com o indutor de haploidia tropicalizado LI-ESALQ. As sementes deste cruzamento foram agrupadas por meio do marcador R1-navajo em três classes: haploides putativos, diploides e inibidas. Após esta etapa, as sementes dos haploides putativos foram submetidas à duplicação cromossômica e as plantas duplicadas foram transplantadas a campo para a obtenção de linhagens DH. As unidades de sementes, plântulas e plantas em cada etapa da metodologia foram quantificadas para o estudo da eficiência relativa na obtenção de DH. Também foram coletadas amostras foliares das linhagens DH para genotipagem por meio de marcadores SNP (Single nucleotide polymorphism). As taxas de indução de haploides (HIR), sementes diploides (DSR) e inibidas (ISR) foram analisadas por meio de um modelo linear generalizado misto considerando distribuição logit multinomial. As eficiências relativas das fontes de germoplasma e gerações em cada etapa da metodologia DH foram estimadas por meio de porcentagem. Os marcadores SNP foram utilizados em estudos de diversidade genética, estrutura populacional e desequilíbrio de ligação. Os valores médios observados para as taxas de HIR, ISR e DSR foram, respectivamente, 1,23%, 23,4% e 75,2% para a geração F1 e 1,78%, 19,6% e 82,3% para a geração F2. O maior valor de HIR na F2 ocorreu devido à segregação dos genes que inibem o marcador R1-navajo durante a indução de haploides. Entretanto, apesar da geração F2 apresentar maior HIR, ela não deve substituir a F1, uma vez que se perde tempo com um ciclo adicional. A eficiência relativa na obtenção de linhagens DH apresentou o mesmo valor (0,4%) para as gerações F1 e F2, indicando que a escolha da geração não interfere na quantidade de DH produzidos. As estimativas dos parâmetros populacionais para as linhagens DH obtidas de geração F1 apresentaram valores para variância genética (VG) de 700,55, tamanho efetivo populacional (Ne) de 43,1, diversidade genética de Nei (GD) de 0,28 e conteúdo de informação polimórfica (PIC) de 0,23. Para a geração F2 as estimativas foram de VG=648,88, Ne=39,61, GD=0,26 e PIC=0,22. Os valores de desequilíbrio de ligação foram de 0,069 na geração F1 e de 0,067 na geração F2. Ou seja, as linhagens DH oriundas destas duas gerações apresentaram magnitudes semelhantes de diversidade genética e de desequilíbrio de ligação. O uso da geração F2 teoricamente permitiria obter maior variabilidade genética, devido à recombinação adicional. Entretanto, neste trabalho esta tendência não foi observada. Com isto, em milho tropical, recomenda-se o uso da geração F1 para a obtenção de DH, por apresentar o melhor balanço entre tempo e variabilidade genética. / Among the several questions involving doubled haploid technology (DH), one that has been little discussed is the generation in which one should induce haploids, in the F1 or F2. Overall, the F1 generation has been the most used. However, their constant use can lead to losses of genetic gains with the selection cycles due to the lower number of recombination. Thereby, some authors advise the use of F2 in inductions, which would allow greater gains in genetic variability. Thus, the objectives were to check the effect of the F1 and F2 generations on the expression of the R1-navajo in tropical germplasm, on the relative efficiency of each step of the methodology and the genetic variability of the DH lines obtained. For this purpose, five germplasm sources, in F1 and F2 generations, were crossed with the tropicalized haploid inducer LI-ESALQ. The seeds from this cross were grouped using the R1-navajo marker into three classes: putative haploids, diploid and inhibited. Then, putative haploid seeds were submitted to chromosome duplication, and the duplicate seedlings were transplanted to the field in order to obtain DH lines. Hence, seed, seedling, and plant at each stage of the methodology were quantified to study the relative efficiency in developing DH lines. Moreover, leaf samples from the D0 lines were collected for genotyping using SNP (Single nucleotide polymorphism) markers. Finally, the haploid inducer rate (HIR), diploid seed rate (DSR) and inhibited seed rate (ISR) were analyzed using a generalized linear mixed model considering multinomial logit distribution. The relative efficiency of germplasm sources and generation in each stage of the DH methodology was estimated by percentage. SNP markers were used in studies of genetic diversity, population structure, and linkage disequilibrium. The observed mean values of HIR, ISR and DSR were, respectively, 1.23%, 23.4% and 75.2% for the F1 generation and 1.78%, 19.6% and 82.3% for the F2 generation. The higher value of HIR in F2 occurred due to the segregation of genes, which inhibit the R1-navajo marker during haploid induction. However, in spite of the higher value of HIR for F2 generation, it should not replace F1 since time is lost with an additional cycle. The relative efficiency observed in the obtention of DH lines was the same value (0.4%) for generations F1 and F2, indicating that the choice between those generations does not interfere with the quantity of produced DH. Estimates of the population parameters for the DH lines obtained from F1 generation presented values for genetic variance (VG) of 700.55, effective population size (Ne) of 43.1, Nei\'s genetic diversity (DG) of 0.28 and polymorphic information content (PIC) of 0.23. For F2 generation the estimates were VG = 648.88, Ne = 39.61, GD = 0.26 and PIC = 0.22. Linkage disequilibrium values were 0.069 in the F1 generation and 0.067 in the F2 generation. Thus, DH lines from these two generations showed similar values of genetic diversity and linkage disequilibrium. Nonetheless, the use of the F2 generation theoretically would allow obtaining greater genetic variability, due to the additional cycle of crossing-overs. However, this trend was not observed in this study. Thus, in tropical maize, the use of the F1 generation to obtain DH lines is recommended, because it performs the best balance between time and genetic variability.

Avaliaram-se 36 linhagens diaplóides de trigo, obtidas via cultura de anteras in vitro oriundas de plantas híbridas, em geração F1, divididas em dois ensaios com dezoito linhagens e dois cultivares controles (IAC-24 e IAC-289), nos anos de 1999 e 2000. Cada ensaio foi instalado em dois locais do Estado de São Paulo: Ensaio I - Estações Experimentais de Agronomia de Capão Bonito (solo ácido, sem aplicação de calcário e em condição de sequeiro) e Tatuí (solo ácido, com aplicação de calcário e em condição de irrigação por aspersão) e Ensaio II - Estações Experimentais de Agronomia de Tatuí e Monte Alegre do Sul (ambos em solo ácido com aplicação de calcário e condição de irrigação por aspersão). Em cada ensaio, avaliaram-se os seguintes parâmetros: acamamento, altura da planta, ciclos da emergência ao florescimento e da emergência à maturação, produção de grãos, resistência às moléstias, comprimento da espiga e componentes de produção. Todos os genótipos foram, também, avaliados quanto à tolerância à toxicidade de alumínio, em solução nutritiva, em condição de laboratório. No Ensaio I, destacaram-se, pela produção de grãos, as linhagens 4 (2.309 kg ha -1 ) e 5 (2.319 kg ha -1 ), provenientes do cruzamento PF70402/ALD'S'//PAT72160/ALD'S'/3/PEW'S'/4/OPATA/5/IAC-60; 9 (2.150 kg ha -1 ), provinda do cruzamento MLR'S'/BUC'S'//BUC'S'/3/IAC-24, 11 (2.102 kg ha -1 ) e 12 (2.056 kg ha -1 ), oriundas do cruzamento TEPOCA/IAC-24. A 13 (JUN/GEN//IAC-24) apresentou as plantas mais baixas (53 cm). As linhagens 2, 4 e 18, originárias dos cruzamentos JUN/GEN//IAC-24,PF70402/ALD'S'//PAT72160/ALD'S'/3/PEW'S'/4/OPATA/5/IAC-60 e TEPOCA/IAC-24, revelaram, ao mesmo tempo, moderada resistência aos agentes causais da ferrugem-da-folha e da mancha-da-folha. Todos os genótipos, com exceção do cultivar IAC-289 e da linhagem 13 (JUN/GEN//IAC-24), foram considerados tolerantes a 10 mg L -1 de Al 3+ , quando avaliados em solução nutritiva. No Ensaio II, a linhagem 8 (ANA/IAC-24) e o cultivar IAC-289 apresentaram elevadas produções de grão (3.311 e 3.341 kg ha -1 respectivamente). A linhagem 13 exibiu o porte mais baixo (61 cm) entre os genótipos estudados e a 3 (ANA/IAC-24//IAC-24), mostruo, ao mesmo tempo, resistência ao agente causal da ferrugem-da-folha, moderada resistência ao agente da mancha-da-folha e imunidade ao agente causal do oídio. As linhagens 8 (ANA/IAC-24) e 14 (PF70402/ALD”S”//PAT72160/ ALD”S”/3/PEW”S”/4/OPATA/5/ IAC-60) mostraram elevada tolerância à toxicidade de alumínio, associada a alta produção de grãos. / Thirty six dihaploid wheat lines, originated via anther culture from F1 hybrid plants were evaluated in two trials with eighteen lines plus two control cultivars (IAC-24 and IAC-289), in 1999 and 2000. Each trial was carried out in two locations of the State of São Paulo: trial I - Capão Bonito Agronomy Experiment Station (acid soil without lime application and upland condition) and Tatuí Agronomy Experiment Station (acid soil with lime application and sprinkler irrigation condition) and trial II - Monte Alegre do Sul and Tatuí Agronomy Experiment Station (both with acid soil with lime application and sprinkler irrigation condition). In each the genotypes were evaluated for lodging, plant height, cycle from emergence to flowering and from emergence to maturation, grain yield, resistance to disease, head length and yield components. All genotypes were also evaluated for aluminum toxicity tolerance, in nutrient solution, under laboratory condition. Considering trail I, the lines 4 (2.309 kg ha -1 ) and 5 (2.319 kg ha -1 ) originated from the cross PF70402/ALD'S'//PAT72160/ALD'S'/3/PEW'S'/4/OPATA/5/IAC-60, 9 (2.150 kg ha -1 ) from the cross MLR'S'/BUC'S'//BUC'S'/3/IAC-24, and the lines 11 (2.102 kg ha -1 ) e 12 (2.056 kg ha -1 ) from the cross TEPOCA/IAC-24, presented high grain yield. The line 13 (JUN/GEN//IAC-24) showed the shortest plants (53 cm). The lines 2, 4 and 18 originated from crosses JUN/GEN//IAC-24,PF70402/ALD'S'//PAT72160/ALD'S'/3/PEW'S'/4/OPATA/5/IAC-60 and TEPOCA/IAC-24, showed at the same time moderate resistance to the causal agents of leaf rust and leaf spot. All genotypes, with exception of the cultivar IAC-289 and the line 13 (JUN/GEN//IAC-24) , were considered tolerant to 10 mg L -1 Al 3+ , when evaluated in nutrient solutions. Considering trial II, the line 8 (ANA/IAC-24) and the cultivar IAC-289 presented high grain yield (3.311 e 3.341 kg ha -1 respectively). The line 3 (ANA/IAC-24//IAC-24) exhibited at the same time resistance to the causal agent of leaf rust, moderate resistance to the causal agent of leaf spot and immunity to the causal agent of powdery mildew. The lines 8 (ANA/IAC-24) and 14 (PF70402/ALD“S”//PAT72160/ALD“S”/3/PEW“S”/4/OPATA/5/IAC-60), also showed high tolerance to aluminum toxicity being associated to high grain yield, and so could be used in breeding programs with the objective to get cultivars for acid soils.

Um total de 1.520 bactérias isoladas a partir de amostras de lodo de esgoto doméstico e de solo de área preservada foi avaliado para a produção de polihidroxialcanoatos (PHA) com os corantes lipofílicos Nile Red A e Sudan Black B, permitindo a detecção de 261 isolados. Ensaios de produção de PHA revelaram isolados produtores de P3HB apresentando valores superiores à linhagem Burkholderia sacchari LFM101 e valores de produção de PHAMCL superiores à linhagem Pseudomonas sp. LFM046, além de 6 isolados produtores da mistura de P3HB e PHAMCL. Os primers RECF1/RECR permitiram a detecção específica do gene phaC do tipo I de três bactérias produtoras de P3HB, e os primers P613F/P613R detectaram genes phaC do tipo I em bactérias produtoras da mistura de polímeros. Um fragmento de DNA de 4 kpb de uma biblioteca genômica do isolado RMP1058BII, produtor da mistura de P3HB e PHAMCL, foi detectado utilizando os primers P613F/P613R, e a expressão desse fragmento de DNA uma linhagem de Pseudomonas mutada no gene phaC levou à produção de pequena quantidade de P3HB. / A total of 1520 isolates from domestic sewage sludge or soil of preserved area were evaluated in regards of PHA production using the lipophilic Nile Red A or Sudan Black B dyes, allowing the detection of 261 isolates. PHA production experiments revealed P3HB producing isolates at higher amounts than the strain Burkholderia sacchari LFM101 and PHAMCL production rates higher than those presented by the strain Pseudomonas sp. LFM046, besides 6 isolates producing P3HB and PHAMCL mixtures. The RECF1/RECR primers allowed the specific type I phaC genes detection in three P3HB producing bacteria and the P613F/P613R primers detected type I phaC genes in the polymer mixture producing isolates. A 4 kbp DNA fragment from a genomic library of the isolate RMP1058BII was detected using the P613F/P613R primers. This DNA fragment expression in a Pseudomonas strain mutated in phaC gene leaded to the production of small amounts of P3HB.