Os compostos carbonílicos no estado triplete (CCT) são considerados espécies reativas de oxigênio uma vez que possuem comportamento químico semelhante ao de radicais alcoxil. Quando formadas em sistemas biológicos, estas espécies podem estar envolvidas tanto em processos benéficos quanto deletérios ao organismo, como é o caso da lipoperoxidação, onde CCT não só são gerados como também iniciam ou amplificam o processo. Visando estudar a capacidade de dienos conjugados de suprimir a energia triplete de tais compostos, de forma a diminuir seus efeitos deletérios, determinou-se as constantes de supressão, para quatro diferentes dienos, de acetona triplete gerada pela da termólise do tetrametil-1 ,2- dioxetano e pelo sistema enzimático isobutanal/ \"horseradish peroxidase\"/O2 Todos os dienos apresentaram constantes de supressão de ordem difusional. Foi analisada também a forma pela qual os dienos suprimem a acetona triplete e concluiu-se que tanto dienos com hidrogênios alílicos (2,4-hexadienoato e seu éster etílico), potencialmente abstraíveis, quanto dienos sem estes hidrogênios (2 ,4-pentadienoato e seu éster metílico), suprimem a acetona por um processo físico de transferência de energia, que leva à sua fotoisomerização cis,trans. A reatividade destes dienos frente a espécies reativas de oxigênio comumente formadas em sistemas de lipoperoxidação, como o oxigênio singlete, radicais hidroxil, peroxil e superóxido, foi também testada, mostrando que nenhum dos dienos apresenta atividade sequestradora destas espécies. Experimentos preliminares de lipoperoxidação em sistemas biomiméticos (mitocôndrias e microssomos isolados de fígado de rato), mostraram que o trans, trans-2,4-hexadienoato de etila é capaz de inibir o inchamento mitocondrial induzido por benzofenona triplete e de suprimir a quimiluminescência de microssomos induzida por Fe2+/ ascorbato. Concluiu-se assim que dienos conjugados, contendo ou não hidrogênios alílicos, podem ser usados como supressores específicos de compostos carbonílicos triplete em sistemas biológicos e contribuir para o esclarecimento dos mecanismos de reação destes processos. / Triplet carbonyls can be named reactive oxygen species once they behave chemically as alkyloxyl radicals and therefore can potentially drive beneficial and deleterious processes in biological systems. In the case of lipid peroxidation, these species have been found not only to be reaction products but also to amplify the radical chain by hydrogen abstraction of polyunsatured lipid molecules. With the aim of finding efficient and reliable chemical probes for triplet carbonyls, we studied here the quenching properties of conjugated dienes, namely 2,4-hexadienoate and 2,4- pentadienoate anions and corresponding alkyl esters, upon triplet acetone generated either chemically (thermolysis of tetramethyl-1 ,2-dioxetane) or enzymically (aerobic oxidation of isobutanal/horseradish peroxidase). As expected, the quenching rate constants were found to be diffusion controlled, although those for the pentadienoate derivatives were 3-fold lower than those measured for the hexadienoates. Therefore, independently of the presence of allylic hydrogens in the diene probe, the triplet acetone quenching occurred by a physical process followed by cis,trans-isomerization, without hydrogen abstraction from the quencher. The reactivity of the studied dienes towards oxygen reactive species known to be formed during lipid peroxidation, such as singlet oxygen, and peroxyl, hydroxyl and superoxide radicals, was also investigated to assure they would not interfere with the radical lipoperoxidation chain. Indeed, none of the dienes showed antioxidant activity on classical model systems. Preliminary experiments with model systems widely used to study lipid peroxidation showed that the trans, trans-ethyl sorbate can inhibit the mitochondrial swelling induced by enzymically formed triplet benzophenone and to quench the chemiluminescence of microsome preparations challenged with iron/ascorbate. This is in agreement with reported work showing that the lipid peroxidation chain associated with mitochondria permeabilization and polyunsaturated fatty acid peroxidation is amplified by intermediate triplet carbonyl products. Altogether our data indicate that conjugated dienes can be used as specific quenchers of triplet carbonyls formed in biological systems without reacting with other reactive intermediates.

Os compostos carbonílicos no estado triplete (CCT) são considerados espécies reativas de oxigênio uma vez que possuem comportamento químico semelhante ao de radicais alcoxil. Quando formadas em sistemas biológicos, estas espécies podem estar envolvidas tanto em processos benéficos quanto deletérios ao organismo, como é o caso da lipoperoxidação, onde CCT não só são gerados como também iniciam ou amplificam o processo. Visando estudar a capacidade de dienos conjugados de suprimir a energia triplete de tais compostos, de forma a diminuir seus efeitos deletérios, determinou-se as constantes de supressão, para quatro diferentes dienos, de acetona triplete gerada pela da termólise do tetrametil-1 ,2- dioxetano e pelo sistema enzimático isobutanal/ \"horseradish peroxidase\"/O2 Todos os dienos apresentaram constantes de supressão de ordem difusional. Foi analisada também a forma pela qual os dienos suprimem a acetona triplete e concluiu-se que tanto dienos com hidrogênios alílicos (2,4-hexadienoato e seu éster etílico), potencialmente abstraíveis, quanto dienos sem estes hidrogênios (2 ,4-pentadienoato e seu éster metílico), suprimem a acetona por um processo físico de transferência de energia, que leva à sua fotoisomerização cis,trans. A reatividade destes dienos frente a espécies reativas de oxigênio comumente formadas em sistemas de lipoperoxidação, como o oxigênio singlete, radicais hidroxil, peroxil e superóxido, foi também testada, mostrando que nenhum dos dienos apresenta atividade sequestradora destas espécies. Experimentos preliminares de lipoperoxidação em sistemas biomiméticos (mitocôndrias e microssomos isolados de fígado de rato), mostraram que o trans, trans-2,4-hexadienoato de etila é capaz de inibir o inchamento mitocondrial induzido por benzofenona triplete e de suprimir a quimiluminescência de microssomos induzida por Fe2+/ ascorbato. Concluiu-se assim que dienos conjugados, contendo ou não hidrogênios alílicos, podem ser usados como supressores específicos de compostos carbonílicos triplete em sistemas biológicos e contribuir para o esclarecimento dos mecanismos de reação destes processos. / Triplet carbonyls can be named reactive oxygen species once they behave chemically as alkyloxyl radicals and therefore can potentially drive beneficial and deleterious processes in biological systems. In the case of lipid peroxidation, these species have been found not only to be reaction products but also to amplify the radical chain by hydrogen abstraction of polyunsatured lipid molecules. With the aim of finding efficient and reliable chemical probes for triplet carbonyls, we studied here the quenching properties of conjugated dienes, namely 2,4-hexadienoate and 2,4- pentadienoate anions and corresponding alkyl esters, upon triplet acetone generated either chemically (thermolysis of tetramethyl-1 ,2-dioxetane) or enzymically (aerobic oxidation of isobutanal/horseradish peroxidase). As expected, the quenching rate constants were found to be diffusion controlled, although those for the pentadienoate derivatives were 3-fold lower than those measured for the hexadienoates. Therefore, independently of the presence of allylic hydrogens in the diene probe, the triplet acetone quenching occurred by a physical process followed by cis,trans-isomerization, without hydrogen abstraction from the quencher. The reactivity of the studied dienes towards oxygen reactive species known to be formed during lipid peroxidation, such as singlet oxygen, and peroxyl, hydroxyl and superoxide radicals, was also investigated to assure they would not interfere with the radical lipoperoxidation chain. Indeed, none of the dienes showed antioxidant activity on classical model systems. Preliminary experiments with model systems widely used to study lipid peroxidation showed that the trans, trans-ethyl sorbate can inhibit the mitochondrial swelling induced by enzymically formed triplet benzophenone and to quench the chemiluminescence of microsome preparations challenged with iron/ascorbate. This is in agreement with reported work showing that the lipid peroxidation chain associated with mitochondria permeabilization and polyunsaturated fatty acid peroxidation is amplified by intermediate triplet carbonyl products. Altogether our data indicate that conjugated dienes can be used as specific quenchers of triplet carbonyls formed in biological systems without reacting with other reactive intermediates.

Orientador: Francisco Eduardo Martinez / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T13:39:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Chuffa_LuizGustavodeAlmeida_D.pdf: 15555306 bytes, checksum: 529d72ca8a05307176cbc131d68adbcd (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O alcoolismo crônico está associado a distúrbios no sistema reprodutor feminino como disfunção hormonal, alteração na expressão dos receptores esteróides, produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), entre outros. A melatonina, hormônio secretado pela glândula pineal, possui função moduladora no ciclo reprodutivo e têm papel importante no combate as ERO. Os estudos envolvendo o alcoolismo crônico e sua interação com a melatonina, em fêmeas, são ainda inconclusivos. O presente trabalho tem como objetivo investigar os efeitos da administração exógena da melatonina sobre os hormônios sexuais, os receptores esteróides sexuais (AR, ER-?, ER-?, PRA e PRB) no ovário, oviduto e útero, além do perfil nutricional e o estresse oxidativo nos ovários de ratas adultas UChB (consumidoras voluntárias de etanol a 10%). Foram utilizadas 60 ratas UChB, distribuídas nos seguintes grupos: UChB Co: sem acesso ao etanol; UChB EtOH: consumo diário de 4 - 5 g etanol/100g de peso corpóreo (PC), ambos recebendo solução veículo. Concomitantemente, os grupos UChB Co+M e UChB EtOH+M receberam injeções diárias de melatonina (100?g/100g PC) via i.p, a partir dos 90 dias de idade, durante 60 dias consecutivos. Aos 150 dias de idade, os animais foram eutanasiados em estro (4a.m) e os materiais coletados e processados. A melatonina aumentou os níveis de progesterona, 6-sulfatoximelatonina e reduziu 17?-estradiol, enquanto a combinação entre etanol + melatonina causou uma queda significativa nesses hormônios. Apesar do receptor androgênico (AR) ovariano não ter sido influenciado pela melatonina, os grupos UChB EtOH e UChB EtOH+M mostraram uma diminuição no AR do oviduto. Ambos os receptores de estrogênio (ER-? e ER-?) no oviduto foram pouco expressos em animais recebendo etanol ou melatonina enquanto somente o ER-? uterino foi reduzido. Por outro lado, receptores de progesterona (PRA e PRB) foram positivamente regulados no ovário por etanol ou etanol + melatonina, enquanto PRA foi negativamente regulado no útero e oviduto, exceto quando o etanol e melatonina foram combinados. Os níveis do receptor de melatonina (MT1R) foram maiores no ovário e útero de ratas tratadas com melatonina, independentemente do consumo de etanol. O peso corpóreo dos animais foi reduzido após interação do etanol e melatonina após 40 dias de tratamento. Em ambos os grupos tratados com melatonina, observou-se redução no consumo energético e líquido. Houve diminuição da quantidade de etanol consumida durante o tratamento e o ciclo estral foi maior em ratas que receberam etanol e melatonina, evidenciado por diestro prolongado. Os níveis de hidroperóxido de lipídio foram maiores nos ovários de ratas UChB EtOH e diminuiu após o tratamento com melatonina. Atividades antioxidantes da superóxido dismutase, glutationa peroxidase e glutationa redutase foram aumentadas nos grupos tratados com melatonina. Conclui-se que a melatonina tem efeito oposto ao etanol sobre os hormônios sexuais. Melatonina e etanol regulam diferencialmente os receptores de esteróides sexuais nos tecidos reprodutivos, atuando principalmente através de seu receptor MT1R. Além disso, a melatonina é capaz de alterar a eficiência alimentar, o ciclo estral, e, contudo, protege os ovários contra o estresse oxidativo resultante do consumo de etanol / Abstract: Chronic ethanol intake is associated with female reproductive disturbances including hormonal dysfunction, changes in the steroid receptors expression, production of reactive oxygen species (ROS), among others. Melatonin, an indolamine secreted by pineal gland, plays key roles in the reproductive cycle, besides having an important function in scavenging ROS. Studies focusing chronic alcoholism and its interaction with melatonin, in females, are still inconclusive. This study aims to investigate the effects of exogenous melatonin administration on sex hormones, sex steroid receptors (AR, ER-?, ER-?, PRA and PRB) in the ovary, oviduct and uterus, as well as the nutritional profile and oxidative stress in the ovaries of adult UChB rats (10% (v/v) ethanol voluntary intake). 60 UChB female rats were divided into the following groups: UChB Co: without access to ethanol (used as control); UChB EtOH: drinking daily ethanol at 4 - 5 g ethanol/100g body weight (BW), both receiving vehicle solution. Concomitantly, UChB Co + M and UChB EtOH + M groups received daily injections of melatonin (100?g/100g BW) via i.p, starting from 90 days old and during the next 60 consecutive days. At 150 days of age, all animals were euthanized in estrus (4a.m). Melatonin increased progesterone, 6- sulfatoximelatonin and decreased 17?-estradiol, while the ethanol+melatonin combination caused a significant fall in these hormones. Despite androgen receptor (AR) in ovary has not been influenced by melatonin, ethanol and ethanol+melatonin led to a decrease in oviduct AR. Both estrogen receptors (ER-? and ER-?) were underexpressed by either ethanol or melatonin in oviduct and only uterine ER-? was downregulated. Conversely, progesterone receptors (PRA and PRB) were positively regulated in the ovary by ethanol or ethanol+melatonin, whereas PRA was downregulated in uterus and oviduct, except when ethanol+melatonin were combined. Additionally, melatonin receptor (MT1R) was increased in ovary and uterus of melatonin-treated rats, regardless of ethanol consumption. Body weight gain was reduced with ethanol plus melatonin after 40 days of treatment. In both melatonin-treated groups, it was observed a reduction in food-derived calories and liquid intake toward the end of treatment. The amount of consumed ethanol dropped during the treatment. Estrous cycle was longer in rats that received both ethanol and melatonin, with prolonged diestrus. Following to oxidative status, lipid hydroperoxide levels were higher in the ovaries of ethanol-preferring rats and decreased after melatonin treatment. Additionally, antioxidant activities of superoxide dismutase, glutathione peroxidase and glutathione reductase were increased in melatonin-treated groups . We conclude that melatonin has opposite effect on sex hormones to those of ethanol consumption. Together, melatonin and ethanol differentially regulates the sex steroid receptors in the reproductive tissues, mostly acting "in situ" through its MT1R receptor. Finally, melatonin is able to affect feed efficiency and, conversely, it protects the ovaries against the oxidative stress arising from ethanol consumption. / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

L’infection par le virus de l’hépatite C (VHC) évolue généralement vers le développement d’une hépatite C chronique, fréquemment associée à des perturbations métaboliques, (insulinorésistance et stéatose), et de la structure hépatique (fibrose et cirrhose), favorisant le développement d’un hépatocarcinome. Le stress oxydant semble étroitement lié à la progression de ces pathologies, notamment l’insulino-résistance. Or, les mécanismes moléculaires par lesquels le VHC module le stress oxydant restent confus, ainsi que l’effet réciproque du stress oxydant sur la réplication virale. Jusqu’à récemment, la modulation de ce stress a été étudiée in vitro dans des modèles non réplicatifs du VHC ou dans des modèles d’expression ectopiques des protéines virales. Peu d’études ont encore tenté de caractériser l’effet d’une infection complète et productive dans les cellules cibles naturelles du VHC, les hépatocytes. Mes travaux de recherche ont donc consisté à étudier la modulation de la balance redox cellulaire dans un modèle d’infection complet de type HCVcc, et dans les cellules hépatocytaires Huh7.5. Cette étude a permis de caractériser le stress oxydant dans ce modèle, mais surtout d’identifier un antioxydant à activité pro-virale, la glutathion peroxydase 4 (GPx4). En effet, nous avons observé une stimulation viro-induite de l’expression et de l’activité de GPx4, seule enzyme capable de détoxifier les lipides membranaires oxydés. L’expression de cette enzyme semble nécessaire à la réplication ainsi qu’à l’infectivité virale. Son importance pour le VHC résiderait dans son activité catalytique permettant de maintenir l’intégrité des lipides cellulaires nécessaire au cycle viral / Chronic infection with Hepatitis C virus (HCV) is frequently associated with metabolic disturbances (insulin-resistance and steatosis) as well as with changes to hepatic structure (fibrosis and cirrhosis) that favor hepatocellular carcinogenesis. Insulin resistance is in particular linked to oxidative stress, which is thought to play a key role in driving disease progression. However, molecular mechanisms by which HCV regulates oxidative stress are still unclear and reciprocally, the effect of oxidative stress on viral life cycle is not well understood. Until recently, induction of oxidative stress by HCV has mainly been investigated in non replicative in vitro models or in cell systems expressing viral proteins alone. Few studies have yet investigated oxidative stress in the context of productive HCV infection. My work consisted of studying the modulation of the cellular redox system using the HCVcc infection model, based on a replicative HCV isolate and the hepatoma cell line Huh7.5. This work provided a broad characterization of how HCV induces and prevents oxidative stress and identified glutathion peroxidase 4 (GPx4) as a pro-viral antioxydant enzyme. Indeed, we observed an HCVinduced upregulation of expression and activity of GPx4. We also demonstrated that GPx4 expression is required for viral replication and infectivity. As GPx4 possesses a particular catalytic activity, which is the detoxification of oxidized membrane lipids, we investigated the impact of the accumulation of oxidized lipids on HCV replication. These studies showed that GPx4 is an important host factor for HCV life cycle by maintaining membrane lipid integrity in an oxidative cellular environment

Compostos carcinogênicos estruturalmente diversos ligam-se covalentemente ao DNA formando adutos que, se não reparados, provocam mutações. Inicialmente relacionados apenas a compostos exógenos, atualmente há várias evidências de que compostos gerados endogenamente poderiam modificar o DNA gerando adutos. Dentre os compostos endógenos, os produtos carbonílicos α,β-insaturados destacam-se pois reagem como agentes alquilantes bifuncionais com as bases do DNA, formando adutos exocíclicos. O 2,4-decadienal (DDE) é um aldeído α,β-insaturado que além de estar presente em alimentos e poluentes, é um dos mais importantes produtos da lipoperoxidação. Embora há várias indicações sobre a ação genótoxica do DDE, nenhum aduto deste composto com nucleobases havia sido caracterizado. O presente trabalho mostrou que o DDE é um agente alquilante versátil sendo capaz de gerar cinco adutos diferentes. Este estudo também mostrou que o DDE é capaz de gerar os mesmos adutos que outros dois importantes produtos da lipoperoxidação: o 4-0H-nonenal e o 2-octena1. Todos os adutos foram detectados em DNA tratado in vitro com o DDE. Para possibilitar a detecção dos adutos em sistemas mais complexos, foi desenvolvido um método extremamente sensível baseado em HPLC interfaceado com espectrometria de massa em tandem com ionização por electrospray. Foi também desenvolvida uma estratégia de incorporação de um dos adutos (III) em oligonucleotídeos por via química. A estratégia foi utilizada com sucesso na incorporação do aduto em oligonucleotídeos de sequências diversas. Os oligonucleotídeos foram utilizados em ensaios de reparo por excisão de base e replicação in vitro. / Structurally diverse carcinogenic compounds bind covalently to DNA producing adducts that can, if not repaired, lead to mutations. Firstly restricted to exogenous compounds, nowadays there are evidences that compounds endogenously generated can modify DNA forming adducts. Among these endogenous compounds, α,β-unsaturated carbonyl products are of special interest due their reactivity as bifunctional alkylating agents towards DNA bases leading to exocyclic adducts. 2,4-decadienal (DDE) is an α,β-unsaturatedaldehyde that in addition to be present in food and pollutants, it is one of the most important lipid peroxidation products. Despite of many indications about the DDE genotoxic properties, there was no information about adducts produced between this compounds and nucleobases. This work showed DDE as a versatile DNA alkylating agent being able to generate five different adducts. This study also showed that DDE can generate the same adducts produced from two other important lipid peroxidation products: 4-0H-nonenal and 2-octena1. All adducts were detected in DNA treated in vitro with DDE. To allow adduct detection in more complex systems, we developed a highly sensitive method based on HPLC coupled to electrospray/tandem mass spectrometry. A strategy to incorporate one adduct (III) into oligonucleotides was also developed. The strategy was successfully applied in the adduct incorporation into diverse sequences of oligonucleotides. They were utilized in base excision repair and in vitro replication experiments.

Dans une stratégie de diversification des apports en acides gras polyinsaturés très longue chaîne n-3 (AGPI TLC n-3), essentiels à la santé de l'Homme et majoritairement apportés par les produits de la mer, l'objectif de la thèse était de mieux comprendre les mécanismes cellulaires pouvant expliquer la faible teneur en AGPI TLC n-3 présente dans le muscle de bovin, ceci en explorant trois voies métaboliques de ces acides gras potentiellement limitantes (biosynthèse, captage facilité et peroxydation non-enzymatique) par des approches de qPCR ou de transcriptomique. Les principaux résultats montrent que le foie et les muscles de bovin possèdent tout le matériel génétique nécessaire à la synthèse des AGPI TLC n-3 et pourraient donc assurer leur synthèse, sauf chez le mâle entier où l'expression du gène de l'élongase 5 est réprimée par la présence d'hormones sexuelles mâles. D'autre part, les teneurs musculaires en AGPI TLC n-3 plus élevées avec un régime base d'herbe par rapport à de l'ensilage de maïs et dans un muscle glycolitique par rapport à un muscle oxydatif ne semblent pas s'expliquer par une modulation de l'expression des gènes impliqués dans leur biosynthèse, ni dans leur captage facilité et dans la régulation endogène de leur lipoperoxydation. En conclusion, ce travail de thèse a permis de considérablement faire progresser la compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation des dépôts d'AGPITLC n-3 dans les muscles de bovin. Toutefois, ces régulations sont certainement plus complexes et probablement multifactorielles. De nombreuses pistes restent encore à explorer avant d'envisager augmenter la teneur en AGPI TLC n-3 dans la viande bovine. / N-3 very long chain polyunsaturated fatty acids (n-3 VLC PUFA) are essential for human health but are almost exclusively present in seafood. Thus, in a strategy of diversification of n-3 VLC PUFA sources for human, the aim of this thesis was to better understand the cellular mechanisms that may explain the low n-3 VLC PUFA content in bovine muscle, by exploring three potentially limiting metabolic pathways of these fatty acids (biosynthesis, facilited uptake and non-enzymatic peroxidation) by qPCR or transcriptomic approaches. The main results indicate that the liver and muscles of cattle possess all the genetic material necessary for the synthesis of n-3 VLC PUFA and may therefore ensure their synthesis, except in entire males where gene expression of the elongase 5 is suppressed by the presence of male sex hormones. On the other hand, the higher n-3 VLC PUFA content in muscle of cattle with a grass based diet compard to corn silage and in glycolytic muscle compared to oxidative muscle do not seem to be explained by a modulation of gene expression of proteins involved in their biosynthesis or in their facilited uptake or in the endogenous regulation of their lipoperoxidation. In conclusion, this thesis has greatly advance our understanding of mechanisms involved in the regulation of n-3 VLC PUFA deposits in muscles of cattle. However, these regulations are certainly more complex and probably multifactorial. Many tracks remain to be explored before considering increasing n-3 VLC PUFA content in beef.

Compostos carcinogênicos estruturalmente diversos ligam-se covalentemente ao DNA formando adutos que, se não reparados, provocam mutações. Inicialmente relacionados apenas a compostos exógenos, atualmente há várias evidências de que compostos gerados endogenamente poderiam modificar o DNA gerando adutos. Dentre os compostos endógenos, os produtos carbonílicos α,β-insaturados destacam-se pois reagem como agentes alquilantes bifuncionais com as bases do DNA, formando adutos exocíclicos. O 2,4-decadienal (DDE) é um aldeído α,β-insaturado que além de estar presente em alimentos e poluentes, é um dos mais importantes produtos da lipoperoxidação. Embora há várias indicações sobre a ação genótoxica do DDE, nenhum aduto deste composto com nucleobases havia sido caracterizado. O presente trabalho mostrou que o DDE é um agente alquilante versátil sendo capaz de gerar cinco adutos diferentes. Este estudo também mostrou que o DDE é capaz de gerar os mesmos adutos que outros dois importantes produtos da lipoperoxidação: o 4-0H-nonenal e o 2-octena1. Todos os adutos foram detectados em DNA tratado in vitro com o DDE. Para possibilitar a detecção dos adutos em sistemas mais complexos, foi desenvolvido um método extremamente sensível baseado em HPLC interfaceado com espectrometria de massa em tandem com ionização por electrospray. Foi também desenvolvida uma estratégia de incorporação de um dos adutos (III) em oligonucleotídeos por via química. A estratégia foi utilizada com sucesso na incorporação do aduto em oligonucleotídeos de sequências diversas. Os oligonucleotídeos foram utilizados em ensaios de reparo por excisão de base e replicação in vitro. / Structurally diverse carcinogenic compounds bind covalently to DNA producing adducts that can, if not repaired, lead to mutations. Firstly restricted to exogenous compounds, nowadays there are evidences that compounds endogenously generated can modify DNA forming adducts. Among these endogenous compounds, α,β-unsaturated carbonyl products are of special interest due their reactivity as bifunctional alkylating agents towards DNA bases leading to exocyclic adducts. 2,4-decadienal (DDE) is an α,β-unsaturatedaldehyde that in addition to be present in food and pollutants, it is one of the most important lipid peroxidation products. Despite of many indications about the DDE genotoxic properties, there was no information about adducts produced between this compounds and nucleobases. This work showed DDE as a versatile DNA alkylating agent being able to generate five different adducts. This study also showed that DDE can generate the same adducts produced from two other important lipid peroxidation products: 4-0H-nonenal and 2-octena1. All adducts were detected in DNA treated in vitro with DDE. To allow adduct detection in more complex systems, we developed a highly sensitive method based on HPLC coupled to electrospray/tandem mass spectrometry. A strategy to incorporate one adduct (III) into oligonucleotides was also developed. The strategy was successfully applied in the adduct incorporation into diverse sequences of oligonucleotides. They were utilized in base excision repair and in vitro replication experiments.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Selenium (Se) is an oligoelement crucial for various biological processes. Se has anti-inflammatory and antioxidant properties and plays a key role in brain development. Adenosine deaminase (ADA, EC 3.5.4.4) is a key enzyme in purine metabolism because it helps in the regulation of intracellular and extracellular levels of adenosine, an important nucleoside that acts in the neuromodulation of the immune and nervous systems. Oxidative stress occurs when there is an imbalance between the production of reactive species and their detoxification by systems that remove or repair the resulting damage. In this context, several Se compounds have been developed and studied, among them the 3-methyl-1-phenyl-2-(phenylseleno)oct-2-en-1-one (C12H2HOSe), which is an α, β-unsaturated ketone functionalized vinyl chalcogenide, and sodium selenate (Na2SeO4), the main inorganic form of Se found in animals and plants. The aim of this study was to compare the effects of C12H2HOSe (organic Se) and Na2SeO4 (inorganic Se) on the cell viability, lipoperoxidation and ADA activity in cortex slices of young rats. The results showed that only organic Se caused a reduction in ADA activity at the concentrations of 1, 10 and 30μM in the cerebral cortex slices of the rats tested. However, this result is not related to the oxidation of the thiol groups, since this compound did not alter the NP-SH and LDH levels. Both compounds did not affect the lipoperoxidation levels, although the organic Se was capable of sequestering NO radicals at the highest concentration tested. The inorganic Se protected the cerebral cortex slices against the sodium nitroprusside-induced damage and increased the NP-SH levels. The tests used to evaluate cell viability (LDH and MTT) suggest the maintenance of the cell integrity of the cortex slices exposed to Se compounds. Therefore, our results suggest that organic Se has immunomodulatory properties, due to the reduction in ADA activity, and acted in the maintenance of the cell integrity. In turn, the antioxidant activity of inorganic Se was reaffirmed. Hence, the results of this study paved the way to explore both Se compounds in the CNS. / O selênio (Se) é um oligoelemento essencial em vários processos biológicos. Possui propriedades antiinflamatórias, antioxidantes e desempenha um papel fundamental no desenvolvimento do cérebro. A adenosina deaminase (ADA, E.C. 3.5.4.4) é uma enzima chave no metabolismo das purinas, pois auxilia na regulação dos níveis intra e extracelulares de adenosina, um importante nucleosídeo que atua na neuromodulação dos sistemas nervoso e imune. O estresse oxidativo ocorre quando há desequilíbrio entre a produção de espécies reativas e sua desintoxicação através de sistemas que removem ou reparem os danos por elas causados. Nesse contexto, vários compostos de Se vêm sendo desenvolvidos e estudados, entre eles podemos citar o 3-metil-1-fenil-2-(fenilseleno)oct-2-en-1-um(C12H2HOSe),um organocalcogênio com uma cetona α, β- insaturada funcionando como um vinil calcogênio e o selenato de sódio (Na2SeO4), principal Se inorgânico encontrado em animais e plantas. Este estudo teve como objetivo comparar os efeitos do C12H2HOSe (Se orgânico) e Na2SeO4 (Se inorgânico) na viabilidade celular, parâmetros relacionados ao estresse oxidativo e atividade da ADA em fatias de córtex de ratos jovens. Os resultados demonstraram que apenas o Se orgânico provocou a diminuição na atividade da ADA nas concentrações de 1, 10 e 30μM nas fatias de córtex cerebral dos ratos testados. No entanto, esse resultado não tem relação com a oxidação de seus grupamentos tióis, já que esse composto não alterou os níveis de NP-SH e de LDH. Apesar de ambos os compostos não alteraram os níveis de lipoperoxidação, o Se orgânico apresentou capacidade de sequestrar radicais NO na maior concentração testada. Já o composto inorgânico de Se protegeu as fatias de córtex cerebral contra o dano induzido pelo nitroprussiato de sódio e aumentou os níveis de NP-SH. Os testes de viabilidade celular (LDH e MTT) sugerem a manutenção da integridade celular em fatias de córtex de ratos jovens quando expostos aos compostos de Se. Assim, nossos resultados sugerem que o Se orgânico apresenta propriedades imunomoduladoras por reduzir a atividade da ADA, além de atuar na manutenção da integridade celular. Já o Se inorgânico teve sua atividade antioxidante confirmada. Portanto, os resultados obtidos neste estudo destacam um caminho promissor a ser explorado por ambos os compostos no SNC.