Previous research has shown that cannabidiol (CBD), a non-psychoactive compound in the hemp plant Cannabis sativa, may be useful in treating drug craving, one of the hallmarks of drug addiction. However, the neural mechanism by which CBD attenuates craving is poorly understood. Studies from other laboratories have shown that neuroplastic changes associated with brain NMDA glutamate systems may at least partially serve as a neural mechanism for craving. In the current study, the noncompetitive NMDA receptor antagonist MK-801 maleate was used to induce locomotor sensitization, a form of NMDA glutamate-mediated neuroplasticity, in mice to test the sensitization-attenuating potential of CBD. Separate groups of mice (N=8) received either CBD (1.0 mg/kg, i.p.) or saline thirty minutes prior to an intraperitoneal injection of MK-801 (0.5 mg/kg, i.p.) or saline and tested for locomotor performance in an open field (Induction Trial). Seventy-two hours later all mice, regardless of drug pretreatment, were tested for locomotor activity following a second administration (0.5 mg/kg, i.p.) of MK-801 (Sensitization Trial). Results revealed a significant difference across groups for the Induction Trial, with groups receiving SAL-MK801 and CBD-MK801 significantly more active than SAL-SAL and CBD-SAL groups. Pretreatment with CBD had no effect on the locomotor activating effects of MK-801 during the Sensitization Trial with similar levels of locomotor performance across drug groups. Possibilities for the lack of CBD effects are discussed, as well as implications and future research directions.

La fascitis plantar es un proceso degenerativo doloroso y frecuente, con diversos tratamientos poco sustentados por la evidencia. Sí lo están la adaptación de ortesis plantares semirrígidas y las ondas de choque extracorpóreas (OCE). Queremos establecer los beneficios clínicos y funcionales para las actividades de la vida diaria (AVD) al acabar el tratamiento y a lo largo de tres meses de seguimiento cuando se asocian plantillas semirrígidas individualizadas al tratamiento de la fascitis plantar con OCE. Detectaremos y cuantificaremos además los efectos secundarios. METODOLOGIA: Estudio prospectivo aleatorizado. Hemos reclutado cuarenta pacientes diagnosticados de fascitis plantar. Treinta han sido tratados con ortesis asociadas a OCE, y diez con OCE exclusivamente. Hemos medido el dolor a la palpación en la tuberosidad interna del calcáneo y el dolor al comienzo de la marcha después de un periodo de reposo por medio de la Escala Analógico Visual (EVA). La funcionalidad para las AVD la hemos medido con el Cuestionario FAAM (Foot and Ankle Ability Measure). Hemos determinado los resultados al acabar el tratamiento, al mes y tres meses después. RESULTADOS: Ha mejorado el dolor en ambos grupos tras tres meses de seguimiento, aunque sólo se consigue que la mejoría sea progresiva a lo largo de esos tres meses cuando se asocian ortesis semirrígidas a OCE. La funcionalidad para las AVD sólo ha mejorado asociando ambos tratamientos. El efecto secundario más frecuente ha sido el dolor durante la administración de OCE, aunque en ningún caso ha sido causa de abandono de la terapia. Hemos detectado además un caso de Algodistrofia Simpático Refleja, que hasta ahora no había sido documentado en la literatura después del tratamiento con OCE. / Plantar fasciitis is a common and painful degenerative condition. There are commonly used treatments, but the evidence base underpinning these treatment strategies is often unknown. Customized functional Orthosis and Extracorporeal Shock Waves (ESW) are evidence based. We want to determine the clinical and functional daily life activity benefits once the treatment has finished and along the three-month follow-up when associating both therapies, and to detect the main side effects. METHODS: Prospective and randomized study. Forty patients with plantar fasciitis were treated. Thirty were treated with customized foot orthosis associated to ESW. Ten were treated with ESW only. We measured both pain upon palpation in the internal calcaneal tuberosity and pain in the first footsteps after resting by means of the ten-point Analogic Visual Scale. Functional Daily Life Activities were measured by the FAAM Questionnaire (Foot and Ankle Ability Measure). All measures were acquired when therapies finished, with follow-ups one month and three months afterwards. RESULTS: Pain improved in all patients after three months of follow-up, although that improvement was only evident throughout those three months when both treatments were combined. Likewise, function improved only when both treatments were associated. No relevant adverse events occurred in either intervention group. Pain was the most frequently secondary event while ESW were administered, although it was not necessary to abandon treatment in any case. We detected one single case of Complex Regional Pain Syndrome. This event was unknown in the literature after treatment with ESW.

El objetivo principal de esta tesis es el estudio de la aplicación de microindentación del hueso en la clínica. El uso de la densidad mineral ósea para evaluar la calidad ósea no es suficiente. De hecho, hay pacientes con densidad mineral ósea normal o casi normal que presentan fracturas. Se ha publicado que la capacidad predictiva de la densidad mineral ósea para el riesgo de fractura oscila entre el 65-70%. Esto podría explicarse por el hecho de que con la densidad mineral ósea estamos midiendo uno de los elementos de la resistencia ósea, pero quedan otros componentes sin medir. La microindentación es una nueva técnica que puede medir las propiedades del material del hueso directamente in vivo. Esta técnica permite determinar la dureza de un material, considerando dureza la resistencia a la penetración del indentador. La técnica de la microidentación consiste, por tanto, en aplicar una fuerza sobre la superficie ósea y medir la resistencia del material a la penetración en la superficie. Esta nueva técnica nos permite medir las propiedades intrínsecas del hueso in vivo. Hemos publicado dos artículos principales que validan la técnica. El primero de ellos muestra la validez de la técnica y su aplicabilidad clínica. En este primer trabajo, se estudian las diferentes propiedades materiales del hueso de dos grupos: uno de mujeres con fracturas osteoporóticas y el otro sin fracturas. Tras ajustar por edad encontramos que los pacientes con fracturas osteoporóticas tienen peores propiedades materiales, medidos por microindentación, en comparación con el grupo control. Y eso era, además, independiente de la densidad mineral ósea. Asimismo, en un estudio con microscopía electrónica hemos observado que tras la microindentación se ha producido la apertura de microcracks en la cortical ósea. Esto es muy similar a lo observado en fracturas inducidas en el laboratorio. En este estudio, la variabilidad interobservador fue baja. En el segundo artículo se estudiaron las propiedades materiales del hueso en pacientes que presentaron fracturas femorales atípicas tras tratamiento prolongado con bisfosfonatos (más de cinco años). Estos pacientes presentaron peores propiedades materiales que los controles a pesar de tener densidad mineral ósea normal o casi normal. Y, además, sus propiedades materiales no fueron diferentes a aquellos pacientes con fracturas femorales típicas. Asimismo, aunque, no encontramos diferencias con otro grupo de pacientes que han estado largo tiempo en tratamiento con bifosfonatos (más de cinco años) los valores de microindentación estaban en otro orden de magnitud sugieriendo peores propiedades materiales del hueso en el grupo de las fracturas femorales atípicas. En conclusión, hemos validado una nueva herramienta de diagnóstico para enfermedades óseas que mide un componente diferente de la calidad del hueso respecto de la densidad mineral ósea. La microindentación permite la medición de las propiedades materiales del hueso in vivo, y representa un progreso importante en la comprensión de enfermedades óseas. Su aplicación no sólo será para el diagnóstico, sino también para la evaluación de las propiedades materiales del hueso en otras condiciones clínicas. / The main objective of this thesis is to study the application of microindentation of the bone by in clinics. Bone mineral density, measured clinically to assess bone quality, is not enough. There are many patients with normal or near normal bone mineral density that have fractures to accurately predict bone’s risk of fracture. It was found to predict 65-70% of fracture risk. This could be explained by the fact that with bone mineral density we are measuring one of the elements of bone strength. Microindentation is a new technique which can measure bone material properties directly in vivo. The indentation technique allows us to determine the hardness of a material. The hardness is the resistance to the penetration of a hard indenter. This test consists of applying a force on the indenter and then measuring the material’s resistance to the surface penetration. With this new technique we are able to measure intrinsic bone material properties in vivo. We have published two main articles validating the techinque. The first of them shows the reliability of the technique and its applicability. In this first paper, we study the bone material properties differences between two groups of women with osteoporotic fractures and without fractures, after adjusting by age we found that patients with osteoporotic fractures had worse material properties measured by microindentation when compared with control patients. And that was independent of bone mineral density. In the paper we also studied what is going on on bone at microscale structure, and we described the existence of cracks induced by microindentation. The interobserver variability was low. In the second article we studied the bone material properties in patients that have atypical femoral fractures after long term bisphosphonates treatment. We reported that those patients had worse material properties than controls, eventhough they had normal or near normal bone mineral density. And their bone material properties were not different to those patients with typical femoral fractures. And, although, we did not find differences with another group of patients that have been long time in bisphosphonate treatment the microindentation values were in a different order of magnitude suggesting a worse material properties in the atypical femoral fractures group. In conclusion we have validated a new diagnostic tool for bone that measures a different side of bone quality than bone mineral density. Microidnetation allows the measurement of bone material properties in vivo, and without harm to patients, and it represents a major progress in understanding bone diseases and could be applied not only for diagnostic but also to the assessment of bone material properties in other clinical conditions.

<p>Locomotion in any environment requires the use of energy to overcome the physical</p><p>forces inherent in the environment. Most large marine vertebrates have evolved</p><p>streamlined fusiform body shapes to minimize the resistive force of drag when in</p><p>a neutral position, but nearly all behaviors result in some increase in that force.</p><p>Too much energy devoted to locomotion may reduce the available surplus necessary</p><p>for population-level factors such as reproduction. The population of North Atlantic</p><p>right whales has not recovered following legal protection due to decreased fecundity,</p><p>including an increase in the intercalf interval, an increase in the years to first calf and</p><p>an increase in the number of nulliparous females in the population. This reproductive</p><p>impairment appears to be related to deficiencies in storing enough energy to meet the</p><p>costs of reproduction. The goal of this study was to determine whether increases in</p><p>moving between prey patches at the cost of decreased foraging opportunities could</p><p>shift these whales into a situation of negative energy gain. The first step is to</p><p>understand the locomotor costs for this species for the key behaviors of traveling and</p><p>foraging.</p><p>This study investigated the cost of locomotion in right whales by recording the</p><p>submerged diving behaviors of free-ranging individuals in both their foraging habitat</p><p>in the Bay of Fundy and their calving grounds in the South Atlantic Bight with a</p><p>suction-cupped archival tag. The data from the tags were used to quantify the oc-</p><p>currence of different behaviors and their associated swimming behaviors and explore</p><p>three behavioral strategies that reduce locomotor costs. First, the influence that</p><p>changes in blubber thickness has on the buoyancy of these whales was investigated</p><p>by comparing the descent and ascent glide durations of individual whales with differ-</p><p>ent blubber thicknesses. Next, the depth of surface dives made by animals of different</p><p>sizes was related to the depth where additional wave drag is generated. Finally, the</p><p>use of intermittent locomotion during foraging was investigated to understand how</p><p>much energy is saved by using this gait. The final piece in this study was to deter-</p><p>mine the drag related to traveling and foraging behaviors from glides recorded by</p><p>the tags and from two different numerical simulations of flow around whales. One, a</p><p>custom developed algorithm for multiphase flow, was used to determine the relative</p><p>drag, while a second commercial package was used to determine the absolute mag-</p><p>nitude of the drag force on the simplest model, the traveling animal. The resulting</p><p>drag estimates were then used in a series of theoretical models that estimated the</p><p>energetic profit remaining after shifts in the occurrence of traveling and searching</p><p>behaviors.</p><p>The diving behavior of right whales can be classified into three stereotyped be-</p><p>haviors that are characterized by differences in the time spent in different parts of the</p><p>water column. The time budgets and swimming movements during these behaviors</p><p>matched those in other species, enabling the dive shapes to be classified as foraging,</p><p>searching and traveling behaviors. Right whales with thicker blubber layers were</p><p>found to perform longer ascent glides and shorter descent glides than those with</p><p>thinner blubber layers, consistent with the hypothesis that positive buoyancy does</p><p>influence their vertical diving behavior. During horizontal traveling, whales made</p><p>shallow dives to depths that were slightly deeper than those that would cause ad-</p><p>ditional costs due to wave drag. These dives appear to allow whales to both avoid</p><p>the costs of diving as well as the costs of swimming near the surface. Next, whales</p><p>were found to glide for 12% of the bottom phases of their foraging dives, and the</p><p>use of `stroke-glide' swimming did not prolong foraging duration from that used by</p><p>continuous swimmers. Drag coefficients estimated from these glides had an average</p><p>of 0.014 during foraging dives and 0.0052 during traveling, values which fall in the</p><p>range of those reported for other marine mammals. One numerical simulation deter-</p><p>mined drag forces to be comparable, while the other drastically underestimated the</p><p>drag of all behaviors. Finally, alterations to the behavioral budgets of these animals</p><p>demonstrated their cost of locomotion constitutes a small portion (8-12%) of the</p><p>total energy consumed and only extreme increases in traveling time could result in a</p><p>negative energy balance. In summary, these results show that locomotor costs are no</p><p>more expensive in this species than those of other cetaceans and that when removed</p><p>from all the other stressors on this population, these whales are not on an energetic</p><p>`knife edge'.</p> / Dissertation

El recién nacido prematuro y los bebés de bajo peso al nacer frecuentemente presentan retrasos/anomalías en el desarrollo motor, cognitivo y emocional(1). Son una población que será clasificada como niños con riesgo de retraso en el desarrollo psicomotor(2). Uno de los diagnósticos más frecuentes en esta población es el de parálisis cerebral (PC)(3), que suele establecerse a partir de los 12 meses de edad del niño(4). El tapiz rodante se ha utilizado en población pediátrica con diferentes diagnósticos para estimular la adquisición de la marcha autónoma, como aspecto clave del desarrollo motor del niño, dada la relación que tiene con aspectos cognitivos y emocionales(5). Estudios en niños con PC(6,7) han resultado en una mejora de sus capacidades globales de desarrollo después de recibir la intervención. El impacto del entrenamiento con el tapiz rodante se desconoce en el caso de población clasificada como con riesgo. Esta tesis, que se presenta como compendio de publicaciones, plantea dos objetivos principales en relación a esta población: (1) explorar el estado actual de la evidencia científica respecto a la respuesta al tapiz rodante de los niños con riesgo de retraso en el desarrollo motriz, y (2) estudiar los efectos del entrenamiento de la marcha con el tapiz, en relación al desarrollo motriz y a la adquisición de la marcha autónoma. Para responder al primero de los objetivos, se realizó una revisión sistemática de la literatura publicada sobre las intervenciones con tapiz rodante en niños con riesgo de retraso en el desarrollo motriz, con edades comprendidas de los 0 hasta los 6 años. Las conclusiones principales encontradas en esta revisión fueron que faltaban ensayos clínicos controlados con muestras mayores en población con riesgo, sobre todo en relación al estudio de los efectos del entrenamiento de la marcha con el tapiz. En relación al segundo de los objetivos de esta tesis, se presentan los resultados de un ensayo clínico controlado realizado con una muestra de 28 niños con riesgo de retraso en el desarrollo motriz. Aproximadamente la mitad recibieron un entrenamiento protocolizado de la marcha con el tapiz. Al inicio del estudio los niños tenían edades comprendidas entre los 8 y los 11 meses. En este estudio no se observaron diferencias entre grupos en cuanto a la edad de inicio de la marcha autónoma, pero sí se vio una mejora en la calidad de los pasos en el tapiz, en aquellos sujetos que habían recibido el entrenamiento. Asimismo, se estableció una relación significativa entre la frecuencia de pasos en el tapiz y la edad de inicio de la marcha autónoma. Finalmente, se hizo un tercer estudio de caso con unas mellizas con antecedentes de prematuridad leve, en el cual se implementó un entrenamiento individualizado a partir de los 8 meses de edad, a la melliza que mostró mayor retraso motriz. Las conclusiones de este estudio fueron que, posiblemente, el entrenamiento con el tapiz tuvo un impacto positivo sobre la velocidad de desarrollo motriz de la melliza entrenada. En relación a aspectos de locomoción y la respuesta al tapiz rodante, se observó una mejora en la calidad de los pasos, y un aumento en la frecuencia de pasos alternos sobre el tapiz. Esto ocurrió en ambas mellizas, pero de una manera más acentuada en la melliza que recibió el entrenamiento. Como síntesis final, el tapiz rodante es una herramienta en uso creciente en el ámbito de la pediatría para potenciar aspectos relacionados con la locomoción. La evidencia científica disponible hasta la fecha indica que el entrenamiento de la marcha con el tapiz puede tener efectos positivos en niños con riesgo de retraso en el desarrollo motriz, tanto para la detección de retrasos o anomalías en el desarrollo, como para la prevención de retrasos más severos en relación a la adquisición de la marcha autónoma. Conseguir este hito motriz es de gran importancia, ya que conllevará la autonomía del niño, la cual es fundamental dada la relación de la misma con el desarrollo cognitivo y con la calidad de vida de las personas. Referencias 1. Almond D, Chay KY, Lee DS. The costs of low birth weight. Q J Econ. 2005;120(3):1031-1083. 2. Angulo-Barroso R, Tiernan CW, Chen L, Ulrich D, Neary H. Treadmill responses and physical activity levels of infants at risk for neuromotor delay. Pediatr Phys Ther. 2010;22(1):61-68. 3. Korvenranta E, Lehtonen L, Peltola M, et al. Morbidities and hospital resource use during the first 3 years of life among very preterm infants. Pediatrics. 2009;124(1):128-134. 4. Wood E. The child with cerebral palsy: Diagnosis and beyond. Semin Pediatr Neurol. 2006;13(4):286-296. 5. Campos JJ, Anderson DI, Barbu-Roth MA, Hubbard EM, Hertenstein MJ, Witherington D. Travel broadens the mind. Infancy. 2000;1(2):149-219. 6. Richards CL, Malouin F, Dumas F, Marcoux S, Lepage C, Menier C. Early and intensive treadmill locomotor training for young children with cerebral palsy: A feasibility study. Pediatr Phys Ther. 1997;9(4):158-165. 7. Mattern-Baxter K, McNeil S, Mansoor JK. Effects of home-based locomotor treadmill training on gross motor function in young children with cerebral palsy: A quasi-randomized controlled trial. Arch Phys Med Rehabil. 2013;94(11):2061-2067. 8. Begnoche DM, Pitetti KH. Effects of traditional treatment and partial body weight treadmill training on the motor skills of children with spastic cerebral palsy. A pilot study. Pediatr Phys Ther. 2007;19(1):11-19. 9. Day JA, Fox EJ, Lowe J, Swales HB, Behrman AL. Locomotor training with partial body weight support on a treadmill in a nonambulatory child with spastic tetraplegic cerebral palsy: A case report. Pediatr Phys Ther. 2004;16(2):106-113. 10. Valentin-Gudiol M, Mattern-Baxter K, Girabent-Farres M, Bagur-Calafat C, Hadders-Algra M, Angulo-Barroso RM. Treadmill interventions with partial body weight support in children under six years of age at risk of neuromotor delay. Cochrane Database Syst Rev. 2011;(12):CD009242. 11. Angulo-Barroso RM, Tiernan C, Chen LC, Valentin-Gudiol M, Ulrich D. Treadmill training in moderate risk preterm infants promotes stepping quality--results of a small randomised controlled trial. Res Dev Disabil. 2013;34(11):3629-3638. / Low birth-weight and premature infants are considered to be at risk for neuromotor, cognitive and emotional developmental delays(1). Some of these infants are diagnosed with cerebral palsy (CP), while others with early motor behaviour problems do not develop CP(2). Locomotor difficulties have been demonstrated in children with CP. Studies in children with CP have used a paediatric treadmill to improve functional gait and ambulation. Treadmill training (TT) has been shown to improve ambulatory capability in children with CP6(8,9). However, little is known about the impact of such training in infant populations at risk for neuromotor delay. This thesis aimed to: (1) assess the current state of scientific evidence regarding treadmill interventions in infants at risk for neuromotor delays (ND), and (2) to study the effects of TT in relation to motor development and the onset of independent walking. First, a systematic review about treadmill interventions in children under 6 years of age at risk of ND was carried out. The findings indicated that task-specific training (TT for independent walking acquisition) might be a useful tool to promote development in children at risk for ND. However, the number of studies found was limited and fairly heterogeneous, especially regarding the type of population studied (different diagnoses), treadmill parameters and training protocols(10). A controlled clinical trial was then conducted with a sample of 28 infants at risk for ND. The experimental group, which received TT (entry age 8-11 months), demonstrated an improvement in step quality. Although no differences were found between groups regarding age of onset of independent walking, a significant relationship between treadmill step frequency and onset of independent walking was established(11). Finally, an individualised TT protocol was implemented in a case study of twins with a history of mild prematurity. At 8 months corrected age, the twin who showed greater motor delays started to receive TT. An increase in the rate of gross motor development was shown in the trained twin 2 months after training had started. Improvement in step quality and frequency of alternate treadmill steps occurred in both twins, but was more accentuated on the trained one. In conclusion, TT may be considered as a useful tool to potentiate aspects related to locomotion in infants with or at risk for ND. Locomotion and walking acquisition is a key milestone for all children since it is associated with cognitive and emotional development(5), as well as quality of life. Referencias 1. Almond D, Chay KY, Lee DS. The costs of low birth weight. Q J Econ. 2005;120(3):1031-1083. 2. Angulo-Barroso R, Tiernan CW, Chen L, Ulrich D, Neary H. Treadmill responses and physical activity levels of infants at risk for neuromotor delay. Pediatr Phys Ther. 2010;22(1):61-68. 3. Korvenranta E, Lehtonen L, Peltola M, et al. Morbidities and hospital resource use during the first 3 years of life among very preterm infants. Pediatrics. 2009;124(1):128-134. 4. Wood E. The child with cerebral palsy: Diagnosis and beyond. Semin Pediatr Neurol. 2006;13(4):286-296. 5. Campos JJ, Anderson DI, Barbu-Roth MA, Hubbard EM, Hertenstein MJ, Witherington D. Travel broadens the mind. Infancy. 2000;1(2):149-219. 6. Richards CL, Malouin F, Dumas F, Marcoux S, Lepage C, Menier C. Early and intensive treadmill locomotor training for young children with cerebral palsy: A feasibility study. Pediatr Phys Ther. 1997;9(4):158-165. 7. Mattern-Baxter K, McNeil S, Mansoor JK. Effects of home-based locomotor treadmill training on gross motor function in young children with cerebral palsy: A quasi-randomized controlled trial. Arch Phys Med Rehabil. 2013;94(11):2061-2067. 8. Begnoche DM, Pitetti KH. Effects of traditional treatment and partial body weight treadmill training on the motor skills of children with spastic cerebral palsy. A pilot study. Pediatr Phys Ther. 2007;19(1):11-19. 9. Day JA, Fox EJ, Lowe J, Swales HB, Behrman AL. Locomotor training with partial body weight support on a treadmill in a nonambulatory child with spastic tetraplegic cerebral palsy: A case report. Pediatr Phys Ther. 2004;16(2):106-113. 10. Valentin-Gudiol M, Mattern-Baxter K, Girabent-Farres M, Bagur-Calafat C, Hadders-Algra M, Angulo-Barroso RM. Treadmill interventions with partial body weight support in children under six years of age at risk of neuromotor delay. Cochrane Database Syst Rev. 2011;(12):CD009242. 11. Angulo-Barroso RM, Tiernan C, Chen LC, Valentin-Gudiol M, Ulrich D. Treadmill training in moderate risk preterm infants promotes stepping quality--results of a small randomised controlled trial. Res Dev Disabil. 2013;34(11):3629-3638.

Objetivo: Comprobar la seguridad y valorar la eficacia del uso del constructo formado por células mesenquimales de médula ósea humana (MSC) sembradas y cultivadas sobre matriz po-rosa de fosfato tricálcico (FTC) asociadas a matriz ósea desmineralizada (MOD) implantada en en ratones inmunodeprimidos NOD/SCID. Objetivos específicos: Estudiar la toxicidad aguda y crónica del implante (FTC+MSC+MOD) en modelo murino NOD/SCID. Estudiar la biodistribución del constructo (FTC+MSC+MOD) implantado en modelo murino NOD/SCID. Valorar si hay formación de tejido óseo en el lugar del implante en el ratón NOD/SCID del constructo (FTC+MSC+MOD). Valorar a partir de que momento se observa formación ósea en el lugar del implante en el ratón NOD/SCID del constructo (FTC+MSC+MOD). Metodología: Estudio prospectivo analítico con 30 ratones NOD/SCID divididos en 2 grupos de ensayo. El grupo experimental, de 25 ratones, se implanta subcutánea e intramuscularmente un constructo formado por células madre mesenquimales humanas sembradas en fosfato tricálcico mezcladas con matriz ósea desmineralizada (MSC+FTC+MOD). En el segundo grupo, control, de 5 ratones se implanta de forma análoga el constructo formado por suero salino fisiológico al 0,9%, fosfato tricálcico y matriz ósea desmineralizada (SSF 0,9%+FTC+MOD). Los ratones del primer grupo fueron sacrificados por parejas de macho y hembra a las 24h, a las 48h, a la semana, a las 2, 5, 7 y 9 semanas tras la cirugía. Los ratones del se-gundo grupo y los 11 ratones restantes del primer grupo se sacrificaron a las 12 semanas. Se ha evaluado la toxicidad aguda, a las 24 y 48 horas tras la cirugía, mediante el control del peso, el índice de bienestar animal, análisis sanguíneo, bioquímico y estudios histológicos de los órganos: hígado, pulmón, bazo, cerebro, riñón, corazón, gónadas, médula ósea y hueso. La toxicidad crónica fue evaluada mediante los mismos estudios que en fase aguda sacrificando 2 ratones en la 1ª, 2ª, 5ª, 7ª, 9ª semana, once ratones en la 12ª semana y los 5 ratones del 2º grupo. Para evaluar la biodistribución del constructo se realizó análisis PCR-RT de 2 proteínas, la Actina y la β2microglobulina a hígado, pulmón, bazo, cerebro, riñón, corazón, gónadas, médula ósea y de la sangre periférica de cada ratón sacrificado. Para valorar la eficacia se realizaron estudios histológicos del constructo implantado con hematoxilina-eosina, tricrómico de Masson y estudios inmunohistoquímicos cualitativos y cuantitativos con anticuerpos anti-osteocalcina. Resultados o Conclusiones El implante subcutáneo o intramuscular del constructo FTC+MSC+MOD no ha mostrado signos de toxicidad aguda o crónica en el modelo murino NOD/SCID. Tras la implantación del constructo FTC+MSC+MOD implantado de forma subcutánea o intramuscular en el modelo murino NOD/SCID no han sido halladas células mesenquima-les humanas en ningún órgano. Permaneciendo las células en el lugar del implante. No se han observado diferencias estadísticamente significativas entre el poder osteogéni-co del constructo FTC+MSC+MOD. Aunque si existen entre el poder osteogénico del im-plante subcutáneo e intramuscular. La formación de tejido óseo estructurado se ha observado a partir de la semana 7 en la zona de implante subcutánea y a partir de la semana 9 en la zona de implante intramus-cular. / To check the security and assess the effectiveness, of the use of mesenchymal cells of human bone marrow (MSC) seeded and cultured on tricalcium phosphate porous matrix (FTC) associated with demineralized bone matrix (MOD) implanted in immunosuppressed mice NOD/SCID. Specific objectives: To study the acute and chronic toxicity of the implant (FTC+MSC+MOD) construct in muri-ne NOD/SCID model. To study the biodistribution of the implant (FTC+MSC+MOD) construct in murine NOD/SCID model. To evaluate the formation of bone tissue at the site of the (FTC+MSC+MOD) construct im-plant. To evaluate the cronology of bone tissue formation at the site of the (FTC+MSC+MOD) construct implant. Methodology Analytical prospective study with 30 NOD/SCID mice divided into 2 treatment groups was performed. In the first group of 25 mice, a construct of mesenchymal stem cells seeded and cultured on tricalcium phosphate porous matrix and associated with demineralized bone matrix (MSC+FTC+MOD) was implanted subcutaneously and intramuscularly In the second group of 5 mice, a construction of 0,9% saline, matrix porous tricalcium phosphate associated with demineralized bone matrix (SSF0,9%+FTC+MOD) was im-planted also subcutaneously and intramuscularly Male and female mice pairs of the first group were - sacrificed at 24 h, 48 h, 1 week and then 2,5,7 and 9 weeks after surgery. The second group of mice and the 11 remaining mice of the first group were sacrificed at 12 weeks. Acute toxicity was evaluated by the assessment of - weight, the animal welfare score, blood and biochemical analysis and histological studies of organs: liver, lung, spleen, brain, kidney, heart, gonads, bone marrow and bone of each mouse sacrificed in the first 48h after surgery. Chronic toxicity was evaluated by the same studies sacrificing 2 mice in the 1st, 2nd, 5th, 7th and 9th week, eleven mice in the 12 th week, and the remaining 5 of the second group. Biodistribution of the construct was analysed by RT-PCR test of 2 proteins, actin and the β2microglobulin of liver, lung, spleen, brain, kidney, heart, gonads, bone marrow and pe-ripheral blood from each mouse sacrificed. Effectiveness was evaluated at implanted site by qualitative and quantitative studies Im-munohistochemistry with anti-osteocalcin antibodies and histological studies with hema-toxylin-eosin, Masson's trichrome were performed. Conclusions Construct (FTC+MSC+MOD) implanted via subcutaneous or intramuscular has not pre-sented any signs of acute or chronic toxicity in the mouse model NOD / SCID. Human mesenchymal stem cells have not been found in any organ analyzed at murine model of Construct (FTC+MSC+MOD) implanted subcutaneously or intramuscularly . These have remained at the implant site. No statistically significant differences were observed between the osteogenic power of the construct MSC + FTC + MOD. However, it has definetely been found between subcutane-ous and intramuscular implant. Structured bone formation is observed from week 7 in the subcutaneous implant and from week 9 in the intramuscular implant.

En las sociedades occidentales, el aumento de la esperanza de vida y el fenómeno de inversión demográfica, están generando un incremento en los sectores de mayor edad. Es por tanto prioritaria, la investigación de nuevas fórmulas que atenúen los padecimientos propios del envejecimiento, que pueden limitar la calidad de vida, como son la fatiga y el deterioro cognitivo. El objetivo de este trabajo es analizar el efecto de la L-Carnitina en la fatiga y en las funciones cognitivas, en un grupo de ancianos institucionalizados. Para ello seleccionamos treinta y tres residentes de una institución geriátrica, que fueron distribuidos en dos grupos homogéneos a recibir placebo o L-Carnitina, a dosis de dos g al día, durante cuatro meses. Realizamos tres valoraciones, al inicio, al segundo mes y al cuarto mes. Se determinaron los valores plasmáticos de L-Carnitina, Total y Libre, y se aplicaron los siguientes cuestionarios de valoración: el cuestionario de la naturaleza de la fatiga de Wessely-Powell, el cuestionario de severidad de la fatiga de Krupp, así como el cuestionario de Pfeiffer para la situación cognitiva. Además decidimos incluir el índice de Katz para la valoración funcional y un test de cribado ultracorto de depresión geriátrica. Encontramos que la deficiencia de L-Carnitina estaba presente casi en un tercio de nuestra población. Los valores plasmáticos finales de L-Carnitina Libre solamente se incrementaron en los varones del grupo experimental, de forma significativa con respecto a los varones del grupo placebo. Los valores de L-Carnitina Total, también se encontraban aumentados en los varones del grupo experimental así como en mujeres del grupo placebo. En relación a la fatiga, las mujeres del grupo de la L-Carnitina fueron las únicas que disminuyeron, de forma no significativa, la naturaleza de la fatiga, y que mantuvieron los valores en la de severidad de la fatiga, a diferencia del resto de grupos que empeoró. Se evidenció una tendencia a la mejoría en las funciones cognitivas en el grupo de la L-Carnitina, frente a un claro empeoramiento significativo en el caso de las mujeres del grupo placebo. La valoración funcional se mantuvo invariable en todos los grupos a lo largo del estudio y el cribado de depresión ultracorto evidenció un empeoramiento significativo en el grupo placebo, con una ligera mejora en los varones del grupo experimental. Concluimos que la deficiencia de L-Carnitina es una situación prevalente en los ancianos, que su administración oral es muy bien tolerada y que ésta podría disminuir, tanto el grado de fatiga, como sucedió con las mujeres, como el deterioro cognitivo. / In Western societies, the increase in life expectancy and the phenomenon of demographic investment are generating an increase in older sectors. It is therefore a priority to research new ways of mitigating the suffering of elderly people, which can limit the quality of life through fatigue and cognitive impairment, amongst others. The aim of this paper is to analyze the effect of L-Carnitine on fatigue and cognitive function in a group of institutionalized elderly. We selected thirty-three elderly in a geriatric institution, which were distributed in two homogeneous groups, to receive placebo or L-Carnitine at a dose of two grams per day for four months. We performed three evaluations: at the beginning, the second month and the fourth month. Plasma levels of L-Carnitine (total and free) were determined, and the following assessment questionnaires were applied: the Wessely-Powell questionnaire on the nature of fatigue, the Krupp questionnaire on fatigue severity and the Pfeiffer questionnaire on cognitive status. In addition, we decided to include the Katz index for functional assessment and a short test for geriatric depression screening. We found that L-Carnitine deficiency was present almost a third of our population. The final free L-Carnitine plasma levels only increased significantly in males in the experimental group, with respect to men in the placebo group. The total L-Carnitine values were also increased in the male experimental group as well as female placebo group. With regard to fatigue, the L-carnitine group women were the only ones that reduced the nature of fatigue, (but not statistically significant), and that maintained values in the severity of fatigue, whilst the other groups worsened. A trend towards improved cognitive functions was observed in in the L-Carnitine group, against a clear significant worsening in the case of the placebo group women. Functional assessment remained unchanged in all groups throughout the study, and depression screening showed a significant worsening in the placebo group, with a slight improvement in the male experimental group. We conclude that carnitine deficiency is a prevalent situation in the elderly, oral administration is well tolerated and that it could reduce both the degree of fatigue, as happened with women, such as cognitive impairment

La resección meniscal o meniscectomía fue el tratamiento de elección de las lesiones meniscales durante mucho tiempo. Desde que la literatura reportó reiteradamente los cambios articulares degenerativos tras este gesto quirúrgico a largo plazo, la forma de tratar estas lesiones ha ido cambiando hacia un proceder cada vez más conservador. Además, la resección meniscal conlleva en muchos casos al dolor compartimental a medio o largo plazo, denominado como síndrome postmeniscectomía. En un intento de paliar de forma biológica este dolor y de potencialmente prevenir la degeneración articular debida a una disminución de tejido meniscal, a mediados de los años 80’ se planteó el trasplante meniscal alogénico (TMA) como una posible solución. Esta alternativa terapéutica ha reportado buenos resultados a medio y largo plazo. Si bien el efecto positivo del TMA sobre el síndrome postmeniscectomía es ya incuestionable, el efecto condroprotector a largo plazo del TMA no ha sido claramente demostrado. Dentro de las técnicas de fijación del implante, si bien la fijación mediante suturas representa una menor dificultad técnica, estudios en cadáver han demostrado una mejor transmisión en las fuerzas de presión cuando la fijación se realiza con tejido óseo conservado en el menisco trasplantado. Sin embargo, la superioridad clínica de una técnica de fijación sobre la otra no ha sido demostrada. El término extrusión meniscal hace referencia a la situación en la que el tejido meniscal se encuentra al menos en un 25% desplazado por fuera del margen tibial. Es evidente y así se ha sugerido, que este “desnudamiento” de la superficie tibial atenta contra el normal funcionamiento biomecánico del menisco. Trasladando esta situación de extrusión meniscal al contexto del TMA podría limitar los potenciales beneficios de ésta técnica. Incluso se ha especulado sobre si el método de fijación del injerto puede afectar la mecánica articular. Otro tema de controversia alrededor del TMA, es el método de preservación del injerto. Mientras que la liofilización se ha dejado de usar dado que se ha demostrado que altera la ultraestructura del injerto conllevando a pobres resultados funcionales, la congelación ha resultado ser un método simple y con buenas resultados funcionales. Sin embargo, aunque para algunos autores con la congelación simple el injerto seguiría mantenimiento sus características biomecánicas, recientemente Gelber et al. han demostrado que esta congelación afecta la ultraestructura de la red colágena. Esto puede evitarse con la criopreservación del tejido que incluso parece mantener la estructura celular, aunque este último punto también está en debate. Finalmente, el injerto fresco se presentaría como la opción más idónea, ya que no produce destrucción celular e incluso preserva la capacidad de producir proteoglicanos y fibras de colágeno por dichas células. La principal limitación de esta técnica de preservación meniscal es la dificultad logística y la necesidad de incubar previamente al injerto a trasplantarse con el suero del receptor, aunque esto último se podría evitar si se utilizasen medios de cultivo genéricos como el Insulin-Transferrin-Selenio (ITS). Sin embargo, no se ha reportado hasta la fecha su utilización en el terreno de la conservación meniscal. / Meniscectomy or meniscal resection was the treatment of choice for meniscal injuries for a long time. Once the literature repeatedly reported degenerative joint changes after this surgical action, the way to treat these injuries has shifted towards increasingly conservative procedures. Furthermore, meniscal resection often provokes medium to long term compartmental pain, which is called postmeniscectomy syndrome. In an attempt to alleviate this pain by biological means and potentially prevent joint degeneration due to decreased meniscal tissue, meniscal allograft transplantation (MAT) was put forth as a possible solution in the mid-80's. This alternative therapy has reported good results in the medium and long term. While the positive effect of TMA on the postmeniscectomy syndrome is unquestionable, the long-term chondroprotective effect of TMA has not been clearly demonstrated. Within the area of implant fixation techniques, while fixation with sutures has shown less technical difficulty in cadaver studies, it has shown a better transmission of the pressure forces when the fixing is done with the bone tissue in the preserved transplanted meniscus. However, the clinical superiority of one technique over another has not been demonstrated. The term meniscal extrusion refers to the situation in which the meniscal tissue is displaced by at least 25% outside the tibial margin. It is obvious and as has been suggested that this "stripping" of the tibial surface undermines the normal biomechanical functioning of the meniscus. Transferring this situation of meniscal extrusion to the context TMA may limit the potential benefits of this technique. It has even been speculated that the graft fixation method can affect joint mechanics. Another topic of controversy surrounding the TMA is the graft preservation method. While lyophilization is no longer used as it has been shown to alter graft ultrastructure and so lead to poor functional results, freezing has proven to be a simple method with good functional results. Although for some authors the graft would continue maintaining its biomechanical characteristics with simple freezing, Gelber et al. have recently shown that this freezing affects the ultrastructure of the collagen network. This can be avoided with tissue cryopreservation that even appears to maintain cellular structure, although the latter is also being debated. Finally, the fresh graft is presented as the most suitable option as it does not produce cellular destruction and even preserves the ability of said cells to produce proteoglycans and collagen fibers. The main limitation of this meniscal preservation technique is the logistical difficulty and the need to previously incubate the graft to be transplanted in serum from the recipient, even though the latter could be avoided if generic culture media such as Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) is used. However, its use in this field of meniscal conservation has not been reported, to date.

Objetivos: La osteoporosis es una enfermedad ósea definida por la pérdida de masa ósea generalizada con un elevado riesgo de fracturas óseas asociado a una alta morbimortalidad. Las Células Stem Mesenquimales (CSM) de médula ósea (MO) pueden representar un tratamiento óptimo para la osteoporosis debido a su capacidad innata de diferenciación a osteoblastos. Aunque el injerto de las CSM ha sido demostrado, su tropismo óseo es bajo cuando se administran de forma intravenosa, imprescindible para el tratamiento de esta enfermedad sistémica. Su tropismo depende de la interacción de sus receptores de superficie con los que se encuentran en las células endoteliales. La proteína E-selectina es inducida en el endotelio de la microvasculatura de tejidos inflamatorios en respuesta a citoquinas y es constitutivamente expresada en las células endoteliales de MO. La glicoforma de CD44 (HCELL), un potente ligando de E y L-selectina, es expresada de forma innata por las Células Stem Hematopoyéticas (CSH). HCELL es la molécula clave para el reclutamiento celular hacia la MO. Las CSM expresan CD44 pero no HCELL ni otros ligandos de E-selectina de forma constitutiva. La fucosilación (adición de una fucosa) ex vivo en posición α1,3 del antígeno CD44 mediante la enzima fucosiltransferasa VI (FTVI) produce HCELL en las CSM, incrementando su afinidad por E-selectina y por tanto su osteotropismo. EL objetivo de este estudio preclínico es evaluar la seguridad y la eficacia de las CSM humanas fucosiladas en un modelo murino inmunocomprometido (NOD/SCID). Métodos: 31 ratones NOD/SCID fueron randomizados a recibir de forma intravenosa: 1x106 CSM fucosiladas (n=13), 1x106 CSM (n=14), o salino (n=4). Las toxicidades fueron evaluadas por un score clínico, peso y un examen histológico (corazón, pulmón, hígado, bazo, riñón, gónadas, cerebro, hueso y MO). Se realizó estudio de biodistribución mediante detección de los genes β-actina y β2-microglobulina humanas. La integridad genética fue evaluada por cariotipo. Se realizó inmunohistoquímica con un anticuerpo policlonal anti-Osteocalcina humana para valorar eficacia. Las células osteocalcina positivas fueron identificadas por un precipitado citoplasmático de color marrón oscuro. Resultados: No se produjo ningún fallecimiento inesperado y ningún ratón mostró toxicidad aguda. Un ratón en el brazo de salino presentó toxicidad crónica leve (piloerección y cambios moderados en el comportamiento). La histología de corazón, hígado, bazo, riñón, cerebro, hueso y MO fue normal en todos los ratones. Se objetivaron áreas localizadas inflamatorias en los pulmones de un 15%, 42% y 25% de los ratones infundidos con CSM fucosiladas, CSM y salino respectivamente sin diferencias significativas (p=0.28). La biodistribución fue normal en todos los ratones con la excepción de un ratón (infundido con CSM sin fucosilar) que mostró expresión de ARN humano (β-actina and β2-microglobulina) en la muestra pulmonar tomada a las 12 semanas después de la infusión. Se observaron osteoblastos en el 100% de los ratones infundidos con CSM fucosiladas, en 62,5% de los infundidos con CSM, y ninguno en el grupo de salino (p=0.01). Los ratones infundidos con CSM fucosiladas presentaron un mayor número de osteoblastos osteocalcina positivos en 10 campos de gran aumento (400x) de secciones de tibia y calota con respecto a los infundidos con no fucosiladas (32 vs 5.5) (p=0.0082). Las CSM fucosiladas. Los osteoblastos humanos fueron detectados en el hueso desde la quinta a la doceava semana post-infusión. Conclusiones: Nuestro ensayo preclínico demuestra que la infusión intravenosa de CSM fucosiladas es segura y eficaz en guiar las células al hueso con un potencial más elevado de osificación en ratones NOD/SCID que las CSM no fucosiladas. Estos resultados van a permitir comenzar con un Ensayo clínico en humanos con CSM fucosiladas. / Objectives: Osteoporosis is a skeletal disease characterized by systemic bone loss with an increased risk to bone fractures, associated with high morbidity and mortality. Mesenchymal stem cells (MSC) from bone marrow (BM) are ideal candidates for the treatment of osteoporosis because they are able to differentiate to osteoblasts. Although bone graft of MSCs has been demonstrated, its osteotropism is low when they are administered intravenously (IV), of choice in this multifocal disease. MSC homing depends upon the adhesive interaction between MSC surface receptors and counter receptors on endothelial cells. E-selectin protein is induced on microvascular endothelium in inflammatory tissues in response to cytokines and it is constitutively expressed in BM endothelial cells. The Hematopoietic cell E and L-selectin ligand (HCELL), a glycoform of CD44, is a potent E-selectin ligand expressed constitutively in the Hematopoietic stem cells (HSC). HCELL represents the key to involve in cell recruitment to the BM. MSC express CD44 but do not express HCELL or other E-selectin ligands. Ex vivo fucosylation (adding a fucose residue) in α1-3 position of the CD44 antigen by use of the enzyme fucosyltransferase VI (FTVI) yields HCELL in MSC increasing the affinity for E-selectin and osteotropism. The aim of this preclinical study was to describe the safety and efficacy of human fucosylated MSC infused in an immunocompromised mice model (NOD/SCID). Methods: 31 NOD/SCID mice were randomized to by tail vein injection: 1x106 fucosylated MSC (n=13), 1x106 MSC (n=14) or saline (n=4). Toxicities were evaluated by a clinical score, weight and histological assessment (heart, lung, liver, spleen, kidney, gonads, brain, bone and BM). RT-PCR array-based evaluation of the expression of human β-actin and β2-microglobulin genes was performed to study biodistribution of MSC. The maintenance of genetic integrity was evaluated during in vitro culture by karyotype. Additional samples of tibia and calota were to immunostained with a polyclonal Rabbit anti-human osteocalcina to demonstrate efficacy. Osteocalcin-positive cells were identified by a dark-brown cytoplasmic precipitate. Results: There was no unexpected death and none of the mices had any acute toxicity. One mouse in the saline arm had mild chronic toxicity primarily manifested as piloerection, and moderate changes in behavior. The histology of heart, liver, kidney, spleen, gonads, brain, bone and bone marrow was normal in all mice. There were localized areas of lung inflammation in 15%, 42% and 25% of mice infused with fucosylated MSC, MSC, and saline, respectively without significance differences (p=0.28). Biodistribution was normal with except one mice (infused with MSC non-fucosylated) showed an expression of human RNA β-actin and β2-microglobulin in the lung sample taken after 12 weeks of intravenous infusion .Osteoblasts were seen in 100% of mices infused with fucosylated MSC, in 62.5%% of animals infused with MSC alone, and none in saline group (p=0.01). NOD/SCID mice infused with fucosylated MSC presented a higher number of osteoblasts positive for osteocalcin in 10 high-power fields (400x) of tibia and calvarium sections that non-fucosylated (32 vs 5.5) (p=0.0082). Human osteoblasts were detected inside the bone from the fifth to the twelfth week after infusion. Conclusions: Our preclinical trial demonstrate that the intravenous infusion of human fucosylated MSC is safe and effective in guiding the cells to bone with a higher potential to ossification in NOD/SCID mices that non-fucosylated MSC. These results are allowing to start a human clinical trial with intravenous fucosylated MSC as treatment in patients with osteoporosis.

L'artritis reumatoide (AR) és una malaltia crònica localitzada principalment en les articulacions, on es produeix inflamació de la membrana sinovial, degeneració del cartílag i l'os, que finalment originen la seva deformació i incapacitació. A més a més, l'AR és una malaltia autoimmunitària, on es desenvolupen diferents tipus d'autoanticossos, com el factor reumatoide dirigit contra la propia IgG i anticossos contra el col.làgen articular. Avui encara es desconeix l'etiologia i la patogènesi del procés artrític i per això resulta essencial disposar de models animals que presentin mecanismes patogènics semblants als de la malaltia humana per tal de dissenyar millors estratègies terapèutiques.L'artritis adjuvant (AA) és una patologia induïda en rata que es considera model d'AR i que cursa amb inflor, eritema, dolor i impotència funcional de les articulacions dels animals afectats. Avui s'accepta que aquesta patologia és mitjançada fonamentaJment per limfòcits T.En el present treball es va pretendre: identificar les poblacions cel.lulars presents en el teixit sinovial inflamat: esbrinar el possible paper dels limfòcits T gamma/delta, T CD4 i T CD8 en el desenvolupament i perpetuació de l'AA; i conèixer si la teràpia amb un anticòs monoclonal (AcMo) dirigit contra la molècula CD4 és capaç de modificar el curs de l'AA. Per assolir els objectius esmentats, és a dir, per delimitar quines subpoblacions de limfòcits T estan implicades en l'AA, es van realitzar diferents protocols d'immunoteràpia amb AcMo dirigits contra determinades molècules de superfície presents en els limfòcits T alfa/beta, T gamma/delta, T CD4 i T CD8.Yoshino i col.laboradors, al 1990, ja van demostrar la implicació dels limfòcits T alfa/beta en el desenvolupament i en la perpetuació de l'AA, i en el present estudi el mateix AcMo R73 dirigit contra el TCR-alfa/beta de rata ha estat utilitzat com a control positiu de tractament. Fins a l'actualitat no es coneixia el paper dels limfòcits T gamma/delta a l'AA a causa de que no existia un AcMo anti-TCR-gamma/delta de rata. En el present treball, i gràcies al recent descobriment per part del grup del Prof. Hünig de Würzburg de l'AcMo V65 s'ha pogut avaluar la implicació d'aquestes cèl.lules en aquest model experimental. D'altra banda, també s'han realitzat estudis d'immunoteràpia emprant un AcMo anti-CD4. el W3/25, que no havia estat utilitzat anteriorment en l'AA, i que per tant, no es coneixia el seu potencial terapèutic en aquest model experimental. A més a més, s'ha assajat la teràpia combinada anti-CD4 + anti-CD8, que tampoc no ha estat descrita fins a l'actualitat, i que ha permès determinar els efectes de la població CD8+ sobre els Iimfbcits T CD4+-. Totes aquestes teràpies anaven encaminades a inhibir el desenvolupament de l'AA.La inducció de l'AA en rates de la soca Wistar o Lewis es va realitzar mitjançant l'administració d'una suspensió de Mycobaeterium butyricum o de Mycobaeterium tuberculosis al 0,5% en vaselina liquida, per via intradèrmica a la base de la cua. Durant els primers dies després de la inducció no s'observa cap signe extern i a partir dels 10-12 dies es manifesta una.inflamació sistèmica que afecta a les extremitats posteriors i sovint també a les anteriors de l'animal. En els diferents experiments s'ha realitzat un seguiment de la inflamació dels animals mitjançant paràmetres clínics, com l'índex d'artritis, que comprèn la valoració clínica del grau d'eritema i d'edema de les quatre articulacions; i l'increment de volum articular de les extremitats posteriors, mesurat per pletismometria.Per a l'anàlisi de les poblacions cel·lulars presents en teixit sinovial s'ha utilitzat una tècnica immunohistoquímica. Com a substrat s'han utilitzat talls criostàtics de membrana sinovial i la identificació de determinats antígens de membrana s'ha realitzat utilitzant AcMo dirigits contra aquests antígens de superfície cel·lular. La reacció s'ha revelat amb el mètode peroxidasa-anti-peroxidasa.A partir de mostres de plasma dels animals artrítics. s'ha detenninat la concentració d'anticossos dirigits contra el micobacteri, la concentració dels AcMo administrats i de la resposta dirigida contra aquests, mitjançant tècniques d'ELISA.Per a determinar l'efecte a nivell cel.lular dels AcMo administrats s'ha utilitzat la citometria de flux. Aquesta tècnica permet la identificació de poblacions cel.lulars mitjançant la detecció d'antígens de la seva superfície, prèviament marcats amb anticossos conjugats a un fluorocrom. Un pas previ per a l'anàlisi citomètrica de les poblacions de sang perifèrica és l'aïllament dels limfòcits. Amb el fi de conèixer quin mètode és el més adequat per analitzar els limtècits de sang perifèrica dels animals dels estudis d'immunoteràpia, es van comparar els efectes de quatre mètodes d'aïllament de limfòcits sobre sang de rata: gradient de Ficoll-Isopaque, lisi amb clorur amònic, lisi amb reactiu de Becton & Dickinson i lisi mitjançant el sistema Coulter Q-prep.Els limfòcits es van marcar amb AcMo dirigits contra diferents subpoblacions limfocítiques. En considerar tots els marcatges realitzats no es van trobar diferències entre els mètodes, la qual cosa dona validesa als 4 mètodes per a sang de rata. Però l'anàlisi estadística que va considerar els resultats obtinguts per cada AcMo per separat va mostrar algunes diferències significatives. El gradient Ficoll-Isopaque, és el que va proporcionar uns percentatges més baixos de limfòcits CDS+, CD4+ i CD25+, suggerim una pèrdua selectiva d'alguns limfòcits T. Per altra banda, amb el clorur amònic, es van obtenir els percentatges més baixos de limfòcits B, i aquest fet es pot atribuir a que una part dels limfòcits B són sensibles a les condicions d'aquest mètode. En els dos mètodes comercials, els percentatges corresponents a la majoria de les poblacions estudiades van presentar valors intermitjos. En el nostre estudi, es va triar el clorur amònic com a mètode de lisi per els estudis d'immunoteràpia. Aquest mètode no afecta selectivament cap població de limfòcits T i, a més a més permet realitzar el marcatge sobre cèl.lules aïllades i presenta un baix cost.Per conèixer quins tipus cel.lulars estan involucrats a nivell de l'articulació inflamada en l'AA, es va realitzar l'estudi histològic de la membrana sinovial de genoll. La membrana sinovial està formada per teixit conjuntiu i revesteix tota la cavitat articular, a excepció dels cartílags. El teixit sinovial artrític augmenta de mida i en general incrementa unes tres vegades el seu pes.L'estudi histològic de la membrana sinovial mostra en el teixit control una capa íntima formada per 1 ó 2 fileres de sinoviòcits i una capa subíntima formada per teixit adipós amb alguns vasos sanguinis. Als 14 dies de la inducció, amb inflamació articular ja establerta, a nivell sinovial s'observa un augment en el nombre de fileres de cèl.lules de la capa íntima. També s'observen plegaments cap a la cavitat articular. Existeix un gran nombre de cèl.lules mononuclears i gran quantitat de fibres de col.làgen en la capa subíntima.L'estudi immunohistoquímic de la membrana sinovial es va realitzar amb el mètode peroxidasa-antiperoxidasa. En alguns teixits sinovials inflamats, es van identificar algunes cèl.lules CD5+ amb l'AcMo OX19. Aquestes cèl.lules CD5+ no van aparèixer en cap teixit control sa. El nombre de cèl.lules CD8+ de la capa subíntima va incrementar significativament del dia 14 al 28 postinducció respecte als teixits control. L'AcMo W3/25, que s'uneix a l'antigen CD4 de limfòcits T col.laboradors i de macròfags, ja detecta cèl.lules positives en tots els teixits sinovials control i el seu nombre augmenta en els teixits artrítics. A causa de les poques cèl.lules CD5+ trobades i de la morfologia i la tinció citoplasmàtica d'aquestes cèl.lules es poden considerar macròfags. L'AcMo OX6 que detecta la molècula lA present en diferents tipus cel.lulars marca un gran nombre de cè1.lules a nivell de l'enzima sinovial dels animals control, i en els animals artrítics aquest nombre és molt elevat.Com a primer estudi d'immunoteràpia i per tal d'analitzar la implicació dels limfòcits T gamma/detla en l'AA, van portar a terme diferents protocols terapèutics amb un AcMo dirigit contra el TCR-gamma/delta de rata, l'AcMo V65. Es van desenvolupar diferents protocols d'administració d'aquest anticòs: un tractament preventiu, realitzat a animals nounats des del moment del naixement i a dosis creixents durant 8 setmanes, és a dir durant tot el període previ a la inducció de l'AA; i 2 tractaments curatius. Un dels protocols va consistir en administrar els anticossos els dies 12, 15 i l8, és a dir, començant abans del màxim d'inflamació articular i l'altre protocol, en el qual es van assajar tres dosis diferents de l'anticòs, es va iniciar durant el màxim d'inflamació, és a dir el dia 15. En els dos tractaments curatius. es va realitzar un tractament paral.lel amb l'AcMo R73, dirigit contra el TCR-alfa/beta, com a control positiu del tractament.En tractar amb l'AcMo V65 només es van observar algunes cèl.lules gamma/delta amb una expressió normal del seu TCR a nivell de sang perifèrica, ganglis limfàtics poplitis i mesentèrics. El que apareix és una població de limfòcits amb una expressió antigènica disminuïda de les molècules de TCR gamma/delta i de CD3 en la seva superfície. Aquest fet indica que l'AcMo V65 va produir la down-regulation del receptor i també la comodulació de la molecula CD3. Ara bé, el percentatge d'aquesta subpoblació amb el TCR modulat era inferior al percentatge de Iimfòcits T gamma/delta detectats abans del tractament, indicant que alguns limfòcits T van perdre totalment l'expressió del TCR o que es van depleccionar. El pretractament amb V65 des del naixement, que va provocar que aquests animals no tinguessin en cap moment Iimfòcits T gamma/delta amb expressió normal del seu TCR, no va aconseguir prevenir el desenvolupament de la patologia i els animals van seguir el mateix curs inflamatori que els animals artrítics control. El tractament curatiu amb l'AcMo V65, iniciat abans del màxim d'inflamació no va aconseguir modificar el volum articular respecte al grup artrític control d'isotip i el mateix va succeir amb la VSG. En canvi, l'AcMo R73, anti-TCR-alfa/beta, sí que mostra un efecte beneficiós, disminuint tant el volum articular com la VSG durant el tractament. El tractament curatiu iniciat durant el màxim d'inflamació tampoc va aconseguir modificar els paràmetres inflamatoris ni la VSG propis de les rates artrítiques, en cap de les dosis assajades.Tot i la manca d'efecte curatiu de l'AcMo V6S observada en les variables estudiades quan el tractament es va iniciar abans del màxim d'ínflamació, es va observar un grau de destrucció articular significativament superior a l'observat en les rates artrítiques control en fases tardanes de la patologia. Aquest fet indica un paper protector fase-depenent dels limfòcits T gamma/delta a l'AA.Després de descartar la intervenció directa dels limfòcits T gamma/delta en la patogènesi del procés artrític experimental, es va centrar l'atenció cap als limfòcits T alfa/beta, concretament cap a la població limfocítica CD4+ i la CD8+. Per estudiar la implicació d'aquestes dues poblacions limfocítiques en el desenvolupament de l'artritis, es va realitzar una immunoteràpia durant el període de latència, emprant l'AcMo anti-CD4 W3/25, a dosi de 3 mg, l'AcMo anti-CD8 OX8 a dosi d'1 mg i ambdós AcMo conjuntament.Durant el tractament amb els AcMo W3/25 i OX8 es van estudiar també els seus efectes a nivell cel.lular per citometria de flux. L'administració de l'AcMo anti-CD4 W3/25 va produir la down-regulation dels limfòcits T CD4+, mentre que l'administració de l'AcMo OX8 va produir la deplecció dels limfòcits T CD8+ de sang perifèrica. L'administració de l'AcMo anti-CD4 W3/25 durant el període de latència administrat sol o conjuntament amb l'AcMo OX8, va inhibir el desenvolupament del procés inflamatori de l'AA, fins i tot després d'una segona inducció de la patologia, fet que confirma el paper essencial dels limfòcits T CD4+ en la patogènesi de l'AA. En canvi, l'administració de l'AcMo anti-CD8 no va modificar el curs de l'artritis, seguint els animals tractats amb aquest AcMo un curs similar al grup artrític control, la qual cosa indica que els limfòcits T CD8+ no intervenen directament ni exerceixen un paper regulador sobre els limfòcits T CD4+ en la patogènesi de l'AA.Com a últim protocol terapèutic i amb el fi de conèixer la implicació dels limfòcits T CD4+ i els CD8+ en la perpetuació de l'AA, es va realitzar una immunoteràpia amb els mateixos AcMo que en l'estudi anterior però iniciant la teràpia el dia 14 postinducció. un cop l'artritis ja està establerta. En aquest estudi es va disposar també d'un grup tractat amb W3/25, un grup tractat amb OX8 i un grup tractat amb ambdós AcMo conjuntament.El tractament amb l'AcMo OX8 no va aconseguir modificar el procés inflamatori ja existent. D'altra banda, el tractament amb W3/25 sol o conjuntament amb l'anticòs OX8 va ser capaç de revertir el procés inflamatori, fet que indica una implicació directa dels limfòcits T CD4+ en la perpetuació de l'AA. Aquest efecte, però, va ser transitori, ja que va desaparèixer després de 6 dosis. Aquest fet es pot atribuir al desenvolupament d'anticossos contra les 1g de ratolí administrades. que es van detectar en els animals tractats amb W3/25. A l'avaluar els nivells d'anticossos anti micobacteri desenvolupats pels diferents grups de l'estudi, cal destacar que ¡'administració de l'AcMo OX8 administrat sol va produir nivells 4 vegades superiors al dels altres grups i que van ser elevats durant tot l'estudi, el que suggereix que els limfòcits T CDS5+ tenen un efecte regulador sobre les cèl.lules responsables de la resposta humoral dirigida contra el micobacteri.En resum, en aquest treball s'ha demostrat la implicació dels limfòcits T CD4+ o col.laboradors no només en la fase de desenvolupament del procés artrític. sinó també en el procés de cronificació, fet que permet considerar els limfòcits T CD4+ com a possibles dianes d'un tractament en l'AR humana. Cal tenir en compte, però, que aquest tractament s'ha de realitzar de forma contínua i amb molècules que no estimulin una resposta immunitària. A més a més, s'ha demostrat que els limfòcits T gamma/delta juguen un paper secundari en el desenvolupament de l'AA i que aquest paper és més aviat protector, modulant l'acció exercida per altres tipus cel.lulars en una determinada fase de la patologia. D'altra banda, els limtòcits T CD8+ no estan implicats en el desenvolupament de l'artritis, ni tan sols com a moduladors de l'acció dels limtòcits T CD4+ artritogènics. Per últim, malgrat la rellevància dels limfòcits T col.laboradors en el procés artrític, la presència d'aquestes cèl.lules a nivell inflamatori local és mínima, suggerint un efecte regulat majoritàriament per citocines des dels òrgans limfoides. / Rheumatoid arthritis (RA) is an autoimmune disease characterized by joint chronic inflammation, associated with synovitis and erosion of cartilage and bone. Adjuvant arthritis (AA) is an experimental autoimmune disease in rats which shares certain clinical and immunological features with RA. Although the pathogenesis of AA is unknown, a strong T lymphocyte dependence has been described.The objectives of the present work were to identify cell populations present on inflamed tissue from arthritic rats and to determine the role of gamma/delta, CD4 and CDS T lymphocytes on the development and the perpetuation of adjuvant arthritis. For these purposes, we performed different immunotherapy protocols using monoclonal antibodies (MoAb) directed against alpha/beta, gamma/delta, CD4 and CD8 T cells.The immunohistochemical analysis of synovia revealed that only a few CD5+ cells appeared on some arthritic tissues. No CD5+ cell appeared on healthy lissues. Arthritic tissues showed a higher number of CD5+, CD4+ and Ia+ cells than healthy tissues.Immunotherapy with an anti-gamma/delta-TCR MoAb was applied according to a preventive and to a pre-peak and a late therapeutic schedule. Although all protocols down-regulated gamma/delta-TCR expression in peripheral blood and lymph nodes cells, none influenced clinical parameters of AA. If rats were treated before the clinical peak of AA, joint destruction was more severe than in vehicle-treated rats, suggesting a stage-dependent protective role of gamma/delta T cells in AA.To study the pathogenic role of CD4 and CD8 T cells on arthritis, an immunotherapy using an anti-CD4 MoAb, W3/25, an anti-CDS MoAb, OX8 or both together was performed during the latency period of AA. W3/25 (which was found to be non-depleting) alone or in combination with OX8 prevented the inflammatory process of AA. To ascertain if any of the last MoAb could reverse AA, an immunotherapy beginning on day 14 postinduction was applied. During treatment with W3/25, a strong amelioration of inflammatory signals occurred. This study indicates that CD4+ cells play an important role both on the initiation and the perpetuation of AA, while CD8+ cells do not appear relevant for the development of the disease.