Orientador: Claudia Maria Bertan Membrive / Resumo: Em bovinos, o 17β-estradiol (17β-E2) estimula a expressão de receptores de estradiol (ER) e ocitocina (OXTR) no endométrio. A ativação de OXTR induz a ativação de uma complexa cascata que resulta na síntese de PGF2α. A hipótese é que o tratamento com 17β-E2, 15 dias após o estro (D15), modula a expressão gênica das proteínas quinase (PKC) e fosfolipase A2 (PLA2), ambas envolvidas na síntese de PGF2α e dependentes de cálcio. Objetivou-se neste estudo determinar os efeitos do 17β-E2 na abundância de trancritos (PKCα, PKCβ, PLA2G4, AKR1B1, AKR1C4 e PTGS2) diretamente envolvidos na síntese de PGF2α. Novilhas (N=50), não prenhes, cíclicas, foram sincronizadas pela inserção de um dispositivo de liberação intravaginal contendo 0,558g de progesterona (P4), pela administração de 1 mg de benzoato de estradiol e 0,075 mg de D-Cloprostenol, ambos intramuscular (IM). Após 6 dias, foi injetado 0,075 mg de D-Cloprostenol, IM. Após 48 horas, o dispositivo contendo P4 foi removido e 0,150 mg de D-Cloprostenol foi administrado IM. Nesta ocasião, um adesivo foi inserido na base da cauda para a identificação dos estros (Boviflag Red Estrus Detector - ABS Pecplan) e observações de estro foram realizadas nos próximos 4 dias. Participaram do experimento somente novilhas identificadas em estro (D0 = dia do estro) e que ovularam (N=46). Entre D14 e D23, a área do corpo lúteo (CL; cm2), fluxo sanguíneo (%) e as concentrações plasmáticas de progesterona (P4) foram avaliadas diariamente. No D15, as novi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In cattle, 17β-estradiol (17β-E2) stimulates expression of estradiol (ER) and oxytocin receptor (OXTR) in the endometrium. The activation of OXTR leads to the induction of a complex cascade of molecular activation resulting in PGF2α synthesis. The hypothesis was that 17β-E2 treatment on day 15 (D15) after estrus modulates the gene expression of protein kinase (PKC) and phospholipase A2 (PLA2), both directly involved in the synthesis of PGF2α and calcium dependent. The aim of this study was to determine the effects of 17β-E2 on the abundance of key transcripts (PKCα, PKCβ, PLA2G4, AKR1B1, AKR1C4 and PTGS2) involved in PGF2α signaling and synthesis. Nelore heifers (N=50), don't pregnant, cyclic were synchronized by insertion an intravaginal release device containing 0.558g of progesterone (P4), and by the administration of 1 mg of estradiol benzoate and 0.075 mg de D-Cloprostenol, both intramuscularly (IM). After 6 days, 0.075 mg D-Cloprostenol was injected, IM. After 48 hours the P4 device was removed and 0.150 mg D-Cloprostenol was administered IM. On this occasion, an adhesive was inserted at the base of the tail for the identification of estrus (Boviflag Red Estrus Detector - ABS Pecplan) and estrous observation were made in the next 4 days. Participated in the experiment only the heifers identified in estrus (D0 = day of estrus) that ovulated (N=46). Between D14 and D23, corpus luteum (CL) area (cm2), blood flow (%), and progesterone (P4) plasmatic concentrations were eval... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Lindsay Unno Gimenes / Resumo: No presente estudo os objetivos foram avaliar a resposta luteolítica de meia dose (50%) ou dose inteira (100%) de cloprostenol sódico (CS) e dinoprost trometamina (DT) administrados em fêmeas bovinas de corte não lactantes cíclicas, nas fases de metaestro e diestro do ciclo estral (4 ou 11 dias após a ovulação (D0), respectivamente), quanto a: dinâmica luteínica, vascularização central e periférica, quantificação de pixels na área vascularizada do CL e dosagem de progesterona sérica (Exp.1) e morfometria das células luteínicas, imunomarcação de caspase-3 e dosagem de progesterona (P4; Exp.2). No Exp. 1, 54 fêmeas tiveram a ovulação sincronizada e receberam os seguintes tratamentos: CS 0 µg (CS0%; n=3/ grupo), CS 250 µg (CS50%; n=5/D4 e n=7/D11), CS 500 µg (CS100%; n=5/ grupo), DT 0 mg (DT0%; n=2/ grupo), DT 12,5 mg (DT50%; n=5/D4 e n=6/D11) ou DT 25 mg (DT100%; n=5/D4 e n=6/D11). No Exp. 2, 25 fêmeas foram sincronizadas, alocadas nos tratamentos no D4 e D11: CS50%; CS100%; DT50%; DT100% (n=3/ grupo, exceto DT100% no D11, n=2) e abatidas dois dias após. Os dados foram analisados por ANOVA em arranjo fatorial (2x2x3, no Exp. 1 e 2x2x2, no Exp. 2) com medidas repetidas no tempo (exceto para morfometria e imunomarcação) e teste de Tukey, com significância a 5%. No Exp. 1, animais avaliados no D4 apresentaram redução numérica da concentração de P4, das dimensões e vascularização luteais. Já animais avaliados a partir de D11 apresentaram redução para todos os parâmetros avaliados a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In the present study the objectives were to evaluate the luteolytic response of half-dose (50%) or full dose (100%) of sodium cloprostenol (SC) and dinoprost tromethamine (DT) administered in beef cattle cyclic non-lactating, at the metaestrous and diestrous stages of the estrous cycle (4 or 11 days after ovulation (D0), respectively), regarding: luteal dynamics, central and peripheral vascularization, quantification of pixels in vascularized area of CL and serum progesterone levels (Exp.1) and luteal cell morphometry, caspase-3 immunolocation and progesterone levels (P4; Exp.2). In Exp. 1, 54 females were synchronized ovulation and received the following treatments: SC0µg (SC0%; n=3/group), SC250µg (SC50%; n=5/D4 and n=7/D11), SC500µg (SC100%; n=5/group), DT0mg (DT0%; n=2/group), DT12.5mg (DT50%; n=5/D4 and n=6/D11) or DT25mg (DT100%; n=5/D4 and n=6/D11). In Exp. 2, 25 females were synchronized, assigned to treatments on D4 and D11: SC50%; SC100%; DT50%; DT100% (n=3/group, except DT100% on D11, n=2) and slaughtered two days later. Data were analyzed by ANOVA in factorial arrangement (2x2x3, in Exp. 1 and 2x2x2, in Exp. 2) with repeated measures in time (except for morphometry and immunolocation) and Tukey test, at 5% level of significance. In Exp. 1, animals evaluated in D4 showed numerical reduction of P4 levels, luteal dimensions and vascularization. Animals evaluated at D11 showed reduction for all parameters evaluated over the experimental moments. The use of 50% or 100%... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

O 17β-estradiol (E2) desempenha um papel importante na função reprodutora e na fertilidade feminina, porém, sua ação é estendida para a maioria dos tecidos. Sabendo que o E2 tem funções pleiotrópicas em diferentes tecidos e órgãos, e que pode estar envolvido tanto na proliferação como na morte celular, nossa hipótese é que o E2 seja um dos iniciadores de regressão luteínica em cadelas não prenhes. Para testar nossa hipótese, foram usados corpos lúteos (CL) provenientes de 28 cadelas nos dias 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e >70 após a ovulação (n = 4/grupo) para os experimentos ex vivo. Nesta etapa foram analisadas as proteínas pró-apoptóticas (CASPASES, 3, 8, 9 e BAX) por imuno-histoquímica e western blotting, além da expressão dos genes CASP3, 8, 9, BAX, FAS, MKI67, ESR1, ESR2m por PCR em tempo real. Na segunda etapa deste trabalho, utilizamos CL de 12 cadelas nos dias 20, 40 e 60 após a ovulação (n=4 por grupo), cujas células foram cultivadas e divididas em seis tratamentos: Controle, E2 (tratado com E2), bloqueador de ERα (tratado com MPP), bloqueador de ERβ (tratado com PHTPP), E2 + bloqueador de ERα (tratado com E2 + MPP) e E2 + bloqueador de ERβ (tratado com E2 + PHTPP). Foram avaliados os mesmos genes do experimento ex vivo, bem como os genes CYP19A1, CYP11A1, HSD3B1 e SLC2A4. De modo geral a expressão dos fatores pró-apoptóticos foi mais alta a partir do dia 40 e atingiu valores máximos nos dias 60 e 70 após a ovulação, assim como a expressão de ERS2. Essa correlação foi observada também nas células do grupo E2 + bloqueador de ERα, que também apresentaram regulação negativa de HSD3B1. Quando do bloqueio do ERβ, as células luteínicas responderam com aumento dos genes relacionados à esteroidogênese e à proliferação celular, principalmente quando oriundas dos dias 20 e 40 p.o. Dessa forma, conclui-se que o bloqueio do ERα levou ao aumento dos genes pró-apoptóticos, e o bloqueio do ERβ possibilitou aumento dos genes luteotróficos. Estes achados confirmam o papel pleiotrópico do estradiol no CL canino e incluem este hormônio, assim como o balanço entre seus receptores, dentre os atores principais da regulação da meia vida do CL canino. / The 17β-estradiol (E2) plays an important role in the reproductive function and female fertility, however, its action is extended to most tissues. Knowing that E2 has pleiotropic roles in different organs and tissues, and that might be involved in both cell death and proliferation, our hypothesis is that E2 is one of the triggers of luteal regression in non-pregnant bitches. To test our hypothesis, corpora lutea (CL) from 28 dogs on days 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 and >70 after ovulation (n = 4/group) were used for ex vivo experiments. Pro-apoptotic proteins expression (CASPASES, 3, 8, 9 e BAX) were analyzed by immunohistochemistry and western blotting, and the gene expression of CASP3, 8, 9, BAX, FAS, MKI67, ESR1 and ESR2 were analyzed by real-time PCR. In the second step of this study, CL from 12 bitches on days 20, 40 and 60 (n = 4 per group) were used. Luteal cells were isolated and divided into six treatments: Control, E2 (treated with E2), ERα Blocker (treated with MPP), ERβ Blocker (treated with PHTPP), ERα + E2 Blocker (treated with E2 + MPP) and E2 + ERβ Blocker (treated with E2 + PHTPP). The expression of the same genes from the in vivo experiment was evaluated, as well as that of CYP19A1, CYP11A1, HSD3B1 and SLC2A4. In general, the expression of pro-apoptotic factors was higher from day 40 and reached highest expression on days 60 and 70 after ovulation, coinciding with increasing in expression of ERS2. This correlation was also observed in the cells from the group E2 + ERα blockade, which also showed HSD3B1down-regulation. When ERβ was blocked, cells of days 20 and 40 post ovulation responded increasing the expression of steroidogenesis and proliferation related genes. Thus, we deduce that the ERα blockade promotes the increase of pro-apoptotic and that o ERβ of luteotrophic genes expression. Our findings confirm the pleiotropic role of estradiol in canine CL and include this hormone, as well as the balance between its two receptors, among the factors controlling canine CL lifespan.

O estradiol (E2) é requerido para a luteólise de fêmeas bovinas e injeções de E2 estimulam a liberação de prostaglandina F2α (PGF2α). É possível que o E2 estimule a síntese e/ou a atividade de moléculas envolvidas na cascata geradora de PGF2α, como enzimas e receptores para outros ligantes. O cálcio é um conhecido cofator para a proteína quinase C e fosfolipase A2, enzimas envolvidas na produção PGF2α. O objetivo geral desse estudo foi investigar os mecanismos endócrinos e moleculares estimulados pelo E2 durante a luteólise. No experimento 1, vacas holandesas não lactantes foram tratadas com 3mg de E2 nos dias 13 (n=2), 15 (n=2), 17 (n=3) e 19 (n=5) do ciclo estral e a produção de PGFM (metabólito plasmático da PGF2α) mensurada por radioimunoensaio. Concluiu-se que a administração de E2 no 17º dia do ciclo estral constitui um modelo experimental adequado para determinar os mecanismos envolvidos na síntese de PGF2α. O experimento 2, foi realizado para investigar o papel do E2 na cascata produtora de PGF2α. Novilhas cruzadas de corte, cíclicas, não lactantes, foram pareadas no dia 17 de um ciclo estral sincronizado, injetadas com 0 (n=6) ou 3mg de E2 (n=7) e abatidas 2 horas após. Explantes endometriais foram tratados com os seguintes estimuladores da síntese de PGF2α: ionóforo de cálcio (CI), melitina ou ocitocina. Explantes foram incubados em quadruplicata e amostras de meio foram coletadas imediatamente e 60 minutos após o início da cultura. As concentrações de PGF2α foram mensuradas por radioimunoensaio. Explantes endometriais tratados in vitro com CI tiveram um incremento na síntese de PGF2α de 48,41% quando foram previamente tratados com o E2 (P≤0,01). No experimento 3, células endometriais bovinas (células BEND) foram tratadas com 0, 10-7, 10-6 ou 10-5M CI por 12h em triplicata, em três experimentos independentes. As concentrações de 10-6 e 10-5M de CI estimularam a produção de PGF2α em comparação às outras concentrações (P≤0,05). No experimento 4, células BEND receberam 0 ou 10-13M E2 e 0 ou 10-6M CI em um arranjo fatorial 2 x 2, durante 12h em triplicata, em três experimentos independentes. A produção de PGF2α foi de 33,1; 32,5; 92,4 e 145,6 (EPM: 21,8) pg/mL para células não tratadas, tratadas com E2, CI e E2 + CI, respectivamente. Houve uma tendência do tratamento com CI estimular a produção de PGF2α (P≤0,08), entretanto, na presença de E2 o CI estimulou significativamente a síntese de PGF2≤ (P≤0,01). Conclui-se que em fêmeas bovinas o E2 potencializou os efeitos do CI na síntese de PGF2α endometrial. Propõe-se que o E2 ativa a síntese de enzimas que, estimuladas pelo cálcio, atuam na síntese de PGF2α endometrial / Estradiol (E2) is required for luteolysis in bovine female and E2 injections stimulate prostaglandin F2α (PGF2α) release. It is possible that E2 stimulates synthesis and/or activity of molecules in the cascade of PGF2α production, such as enzymes and receptors to other ligands. Calcium is a known cofactor for protein kinase C and phospholipase A2, enzymes involved in PGF2α production. The main goal of this study was to investigate endocrine and molecular mechanisms stimulated by E2 during luteolysis. In experiment 1, non-lactating Holstein cows were treated with 3mg E2 on days 13 (n=2), 15 (n=2), 17 (n=3) or 19 (n=5) of the day estrous cycle and production PGFM (a PGF2α plasma metabolite) was evaluated by radioimmunassay. It was concluded that E2 administration on day 17 of the cycle was an adequate experimental model to determine mechanisms involved in endometrial PGF2α synthesis. Experiment 2 was designed in order to investigate the role of E2 in the enzymatic cascade of PGF2α production. Cyclic, cross-bred beef heifers were paired on day 17 of a synchronized estrous cycle, injected with 0 (n=6) or 3mg of E2 (n=7) and slaughtered after two hours. Endometrial explants were treated with stimulators of the cascade of PGF2α synthesis, i.e., calcium ionophore (CI), melittin or oxytocin. Explants were incubated in quadruplicate and medium samples were collected immediately and 60min after to begin culture. The concentrations PGF2α were measured by radioimmunoassay. Endometrial explants in vitro treatment with CI production the PGF2α was 48,41% higher in from cows treated with E2 (P≤0,01). In experiment 3, bovine endometrium cells (BEND cells) were treated with 0, 10-7, 10-6 or 10-5M CI for 12h in triplicate, in three independent experiments. The 10-6 and 10-5M concentrations of CI stimulated production of PGF2α in comparison to other concentrations (P≤0,05). In experiment 4, BEND cells received 0 or 10-13M E2 and 0 or 10-6M CI in a 2 x 2 factorial arrangement, for 12h in triplicate cultures in three independent experiments. Production of PGF2α was 33.1, 32.5, 92.4 and 145.6 (pooled SEM: 21.8) pg/mL for cells treated with nothing, E2, CI and E2 + CI, respectively. Treatment with CI alone tended to stimulate PGF2α production (P≤0,08), however, in the presence of E2, CI significantly stimulated PGF2α synthesis (P≤0,01). It was concluded that in bovine female the E2 improved the CI effects in endometrial PGF2α synthesis. It proposes that E2 active the enzyme synthesis that, calcium stimulated, actuate in endometrial PGF2α synthesis

O estradiol (E2) é requerido para a luteólise de fêmeas bovinas e injeções de E2 estimulam a liberação de prostaglandina F2α (PGF2α). É possível que o E2 estimule a síntese e/ou a atividade de moléculas envolvidas na cascata geradora de PGF2α, como enzimas e receptores para outros ligantes. O cálcio é um conhecido cofator para a proteína quinase C e fosfolipase A2, enzimas envolvidas na produção PGF2α. O objetivo geral desse estudo foi investigar os mecanismos endócrinos e moleculares estimulados pelo E2 durante a luteólise. No experimento 1, vacas holandesas não lactantes foram tratadas com 3mg de E2 nos dias 13 (n=2), 15 (n=2), 17 (n=3) e 19 (n=5) do ciclo estral e a produção de PGFM (metabólito plasmático da PGF2α) mensurada por radioimunoensaio. Concluiu-se que a administração de E2 no 17º dia do ciclo estral constitui um modelo experimental adequado para determinar os mecanismos envolvidos na síntese de PGF2α. O experimento 2, foi realizado para investigar o papel do E2 na cascata produtora de PGF2α. Novilhas cruzadas de corte, cíclicas, não lactantes, foram pareadas no dia 17 de um ciclo estral sincronizado, injetadas com 0 (n=6) ou 3mg de E2 (n=7) e abatidas 2 horas após. Explantes endometriais foram tratados com os seguintes estimuladores da síntese de PGF2α: ionóforo de cálcio (CI), melitina ou ocitocina. Explantes foram incubados em quadruplicata e amostras de meio foram coletadas imediatamente e 60 minutos após o início da cultura. As concentrações de PGF2α foram mensuradas por radioimunoensaio. Explantes endometriais tratados in vitro com CI tiveram um incremento na síntese de PGF2α de 48,41% quando foram previamente tratados com o E2 (P≤0,01). No experimento 3, células endometriais bovinas (células BEND) foram tratadas com 0, 10-7, 10-6 ou 10-5M CI por 12h em triplicata, em três experimentos independentes. As concentrações de 10-6 e 10-5M de CI estimularam a produção de PGF2α em comparação às outras concentrações (P≤0,05). No experimento 4, células BEND receberam 0 ou 10-13M E2 e 0 ou 10-6M CI em um arranjo fatorial 2 x 2, durante 12h em triplicata, em três experimentos independentes. A produção de PGF2α foi de 33,1; 32,5; 92,4 e 145,6 (EPM: 21,8) pg/mL para células não tratadas, tratadas com E2, CI e E2 + CI, respectivamente. Houve uma tendência do tratamento com CI estimular a produção de PGF2α (P≤0,08), entretanto, na presença de E2 o CI estimulou significativamente a síntese de PGF2≤ (P≤0,01). Conclui-se que em fêmeas bovinas o E2 potencializou os efeitos do CI na síntese de PGF2α endometrial. Propõe-se que o E2 ativa a síntese de enzimas que, estimuladas pelo cálcio, atuam na síntese de PGF2α endometrial / Estradiol (E2) is required for luteolysis in bovine female and E2 injections stimulate prostaglandin F2α (PGF2α) release. It is possible that E2 stimulates synthesis and/or activity of molecules in the cascade of PGF2α production, such as enzymes and receptors to other ligands. Calcium is a known cofactor for protein kinase C and phospholipase A2, enzymes involved in PGF2α production. The main goal of this study was to investigate endocrine and molecular mechanisms stimulated by E2 during luteolysis. In experiment 1, non-lactating Holstein cows were treated with 3mg E2 on days 13 (n=2), 15 (n=2), 17 (n=3) or 19 (n=5) of the day estrous cycle and production PGFM (a PGF2α plasma metabolite) was evaluated by radioimmunassay. It was concluded that E2 administration on day 17 of the cycle was an adequate experimental model to determine mechanisms involved in endometrial PGF2α synthesis. Experiment 2 was designed in order to investigate the role of E2 in the enzymatic cascade of PGF2α production. Cyclic, cross-bred beef heifers were paired on day 17 of a synchronized estrous cycle, injected with 0 (n=6) or 3mg of E2 (n=7) and slaughtered after two hours. Endometrial explants were treated with stimulators of the cascade of PGF2α synthesis, i.e., calcium ionophore (CI), melittin or oxytocin. Explants were incubated in quadruplicate and medium samples were collected immediately and 60min after to begin culture. The concentrations PGF2α were measured by radioimmunoassay. Endometrial explants in vitro treatment with CI production the PGF2α was 48,41% higher in from cows treated with E2 (P≤0,01). In experiment 3, bovine endometrium cells (BEND cells) were treated with 0, 10-7, 10-6 or 10-5M CI for 12h in triplicate, in three independent experiments. The 10-6 and 10-5M concentrations of CI stimulated production of PGF2α in comparison to other concentrations (P≤0,05). In experiment 4, BEND cells received 0 or 10-13M E2 and 0 or 10-6M CI in a 2 x 2 factorial arrangement, for 12h in triplicate cultures in three independent experiments. Production of PGF2α was 33.1, 32.5, 92.4 and 145.6 (pooled SEM: 21.8) pg/mL for cells treated with nothing, E2, CI and E2 + CI, respectively. Treatment with CI alone tended to stimulate PGF2α production (P≤0,08), however, in the presence of E2, CI significantly stimulated PGF2α synthesis (P≤0,01). It was concluded that in bovine female the E2 improved the CI effects in endometrial PGF2α synthesis. It proposes that E2 active the enzyme synthesis that, calcium stimulated, actuate in endometrial PGF2α synthesis

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-01-20Bitstream added on 2014-06-13T20:04:47Z : No. of bitstreams: 1 safilho_og_dr_botfmvz.pdf: 780633 bytes, checksum: a3331bb4d14fe517521b9c8184662c1e (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / O objetivo desse experimento foi avaliar a histomorfometria uterina, a expressão gênica endometrial de ER, PR, OTR, COX-1 e COX-2, e a expressão protéica de ER e PR (porcentagem de núcleos positivos e intensidade de coloração dos núcleos positivos, em unidades arbitrárias [UA], à imunohistoquímica) em vacas em anestro ao longo do desenvolvimento da onda folicular. Vacas Nelore primíparas em anestro pós-parto foram avaliadas diariamente por ultrassonografia ovariana, visando acompanhar o desenvolvimento folicular, e submetidas à histerectomia quando o folículo dominante atingiu o diâmetro de 7,0 mm (FP; n = 4), 8,5 mm (FM; n = 4) ou 10,0 mm (FG; n = 4). Um grupo adicional (PRO; n = 4) consistiu em vacas submetidas a remoção de bezerros (RB; 48 h) quando o folículo dominante atingiu o diâmetro de 9,5 mm e histerectomizadas ao final da RB. Os dados foram analisados pelo PROC GLM do programa SAS. A concentração sérica de estradiol no dia da histerectomia foi maior nas vacas do grupo PRO em relação aos demais grupos (FP: 0,7 pg/mL; FM: 0,8 pg/mL; FG: 1,1 pg/mL; PRO: 2,9 pg/mL; P < 0,05). Não houve efeito de grupo (P > 0,1) nas variáveis histomorfométricas e na expressão gênica endometrial de ER, PR, OTR, COX-1 e COX-2. As vacas do grupo PRO apresentaram maior intensidade de coloração dos núcleos positivos para ER nas células epiteliais glandulares superficiais (FP: 75,9 UA; FM: 75,2 UA; FG: 71,5 UA; PRO: 88,5 UA), intensidade de coloração dos núcleos positivos para PR nas células epiteliais glandulares profundas (FP: 70,2 UA; FM: 73,1 UA; FG: 69,2 UA; PRO: 85,7 UA) e porcentagem de núcleos positivos para PR no estroma subepitelial superficial (FP: 58,2%; FM: 58,0%; FG: 57,3%; PRO: 63,4) em relação às vacas dos demais grupos (P < 0,05). As vacas dos grupos FG e PRO apresentaram maior porcentagem de núcleos positivos para ER no estroma... / The objective of this study was to evaluate the uterine histomorphometry, gene expression of ER, PR, OTR, COX-1 and COX-2, and protein expressions of ER and PR (percentage of positive nuclei and staining intensity of positive nuclei, in arbitrary units [AU], at immunohistochemistry) in anestrous cows throughout the development of a follicular wave. Primiparous postpartum anestrous Nelore cows were evaluated daily by ovarian ultrasonography and submitted to hysterectomy when the dominant follicle reached the diameter of 7.0 mm (FP; n = 4), 8.5 mm (FM; n = 4), or 10.0 mm (FG; n = 4). An additional group (PRO; n = 4) consisted in cows submitted to temporary weaning (TW; 48 h) when the dominant follicle reached 9.5 mm and hysterectomized at the end of TW. Data were analyzed by PROC GLM of SAS. Serum concentration of estradiol at the day of hysterectomy was greater in cows from PRO group than in cows from the other groups (FP: 0.7 pg/mL; FM: 0.8 pg/mL; FG: 1.1 pg/mL; PRO: 2.9 pg/mL; P < 0.05). There were no effects of group (P > 0.1) on histomorphometrical variables and on endometrial gene expression of ER, PR, OTR, COX-1, and COX-2. Cows from PRO group had greater staining intensity of ER-positive nuclei in shallow glandular epithelium (FP: 75.9 AU; FM: 75.2 AU; FG: 71.5 AU; PRO: 88.5 AU), staining intensity of PR-positive nuclei in deep glandular epithelium (FP: 70.2 AU; FM: 73.1 AU; FG: 69.2 AU; PRO: 85.7 AU), and greater percentage of PR-positive nuclei in shallow subepithelial stroma (FP: 58.2%; FM: 58.0%; FG: 57.3%; PRO: 63.4%) than cows from the other groups (P < 0.05). Cows from FG and PRO groups had a greater percentage of ER-positive nuclei in deep subepithelial stroma than cows from the other groups (FP: 76.0%; FM: 76.4%; FG: 83.6%; PRO: 86.1%; P < 0.05). In the other endometrial areas, the protein expressions of ER and PR were similar among groups. We concluded that in anestrous... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Maria Emilia Franco Oliveira / Banca: Erika da Silva Carvalho Morani / Banca: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Resumo: Um dos grandes entraves da MOTE é a ocorrência de falhas no tratamento superovulatório, sendo que uma das causas pode ser a alta dose de FSH, podendo promover regressão prematura dos corpos lúteos e consequentemente uma resposta ineficaz ao tratamento superovulatório. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da dose de FSH exógeno no tratamento superestimulatório sobre a dinâmica de desenvolvimento e funcionalidade de corpos lúteos em fêmeas ovinas doadoras de embrião. Foram utilizadas 29 ovelhas Santa Inês, as quais foram submetidas à sincronização do estro com um dispositivo intravaginal de progesterona (CIDR®), inserido no Dia 0, permanecendo até o Dia 8. Concomitantemente ao início do protocolo e retirada do dispositivo intravaginal foi administrado um análogo da PGF2α. O tratamento gonadotrófico teve início 48 horas antes da retirada da progesterona (D6), quando as fêmeas foram aleatoriamente divididas em três grupos experimentais de acordo com a dose total de FSH suíno exógeno: G200 (controle, n=8) - 200 mg de FSH; G133 (n=8) - 133 mg de FSH; e G100 (n=8) - 100 mg de FSH. No D6 (1ª aplicação de FSH), as fêmeas receberam também 300 UI de eCG. As avaliações ultrassonográficas Modo-B e Doppler foram realizadas durante o período de luteogênese (D11) até o dia correspondente a videolaparoscopia (D15), com o propósito de acompanhar o desenvolvimento das estruturas lúteas (dimensões), avaliar os índices do fluxo sanguíneo da artéria ovariana (VPS,VDF,IR e IP) e, de avalia... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: One of the major obstacles of MOTE is occurrence of failures in superovulation, and one reason may be the high dose of FSH, which can promote premature regression of the corpus luteum and therefore ineffective response to superovulation. The aim of the present study was to evaluate the effect of exogenous FSH dose in superstimulatory treatment on development dynamic and function of corpora lutea in embryo donor ewes. Twenty-nine Santa Inês ewes were submitted to estrus synchronization with an intravaginal progesterone device (CIDR®), which was inserted on Day 0 and was remain until the Day 8. At the same time the beginning of the protocol and intravaginal device withdrawal was administered an analog of PGF2α. The gonadotropin treatment was commenced 48 hours before the CIDR withdrawal (D6), when females are randomly divided into three groups according to the total dose of exogenous porcine FSH: G200 (control, n = 9) - 200 mg of FSH ; G133 (n = 10) - 133 mg FSH; and G100 (n = 10) - 100 mg of FSH. The total doses were administered in 8 to applications at 12 hour intervals (20, 20, 15, 15, 10, 10, 5 and 5% FSHp). In D6 (1st application FSH), females also received 300 IU of eCG. Evaluations ultrasound mode-B and Doppler were performed during the luteogênese period (D11) until the corresponding day of videolaparoscopy (D15), in order to follow the development of luteal structures (dimensions), evaluate the contents of the artery blood flow ovarian (VPS, EDV, RI and PI), and macros... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: João Carlos Pinheiro Ferreira / Coorientador: Milo C. Wiltbank / Resumo: Em ruminantes a luteólise natural é caraterizada pela liberação de vários pulsos de prostaglandina F2alfa (PGF) produzidos pelo útero. A PGF é o hormônio luteolítico, enquanto a prostaglandina E1 (PGE1) é considerada um mediador luteoprotetor. Em estudos anteriores, infusões com doses baixas de PGF no útero com intervalos de 6 horas (h) resultou em regressão do corpo luteo (CL). A proposta deste experimento é desenvolver um modelo para avaliar o efeito de baixas doses de PGE1, também infundidas no lúmen uterino sobre a resposta luteal à PGF intrauterina (IU). Vacas no dia 10 do ciclo estral receberam infusões IU de salina (0,1 ml de salina + 0,1 ml de DMSO), PGE (2 mg de PGE1 em 0,1ml de DMSO) ou PGF (0,25 mg of PGF em 0,1 ml de salina) em intervalos de 6 h em um desenho experimental 2 X 2. Portanto os animais foram agrupados em quatro tratamentos: SALINA (4 infusões de salina; n=5), PGE (4 infusões de PGE1; n=5), PGF (4 infusões de PGF; n=5) e PGE+PGF (4 infusões de PGE1+PGF; n=5). As concentrações plasmáticas de progesterona (P4) foram dosadas por radioimunoensaio e o volume luteal foi determinado por ultrassonografia transretal. As concentrações circulantes de PGFM e PGEM foram dosadas antes e 10 minutos após as primeiras duas infusões. Biopsias luteais foram coletadas de cada vaca 30 minutos após cada infusão para determiner a expressão de genes em resposta a cada tratamento. As concentrações circulantes de PGFM 10 minutos após as infusões foram maiores em vacas que receb... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

O 17&beta;-estradiol (E2) desempenha um papel importante na função reprodutora e na fertilidade feminina, porém, sua ação é estendida para a maioria dos tecidos. Sabendo que o E2 tem funções pleiotrópicas em diferentes tecidos e órgãos, e que pode estar envolvido tanto na proliferação como na morte celular, nossa hipótese é que o E2 seja um dos iniciadores de regressão luteínica em cadelas não prenhes. Para testar nossa hipótese, foram usados corpos lúteos (CL) provenientes de 28 cadelas nos dias 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 e >70 após a ovulação (n = 4/grupo) para os experimentos ex vivo. Nesta etapa foram analisadas as proteínas pró-apoptóticas (CASPASES, 3, 8, 9 e BAX) por imuno-histoquímica e western blotting, além da expressão dos genes CASP3, 8, 9, BAX, FAS, MKI67, ESR1, ESR2m por PCR em tempo real. Na segunda etapa deste trabalho, utilizamos CL de 12 cadelas nos dias 20, 40 e 60 após a ovulação (n=4 por grupo), cujas células foram cultivadas e divididas em seis tratamentos: Controle, E2 (tratado com E2), bloqueador de ER&alpha; (tratado com MPP), bloqueador de ER&beta; (tratado com PHTPP), E2 + bloqueador de ER&alpha; (tratado com E2 + MPP) e E2 + bloqueador de ER&beta; (tratado com E2 + PHTPP). Foram avaliados os mesmos genes do experimento ex vivo, bem como os genes CYP19A1, CYP11A1, HSD3B1 e SLC2A4. De modo geral a expressão dos fatores pró-apoptóticos foi mais alta a partir do dia 40 e atingiu valores máximos nos dias 60 e 70 após a ovulação, assim como a expressão de ERS2. Essa correlação foi observada também nas células do grupo E2 + bloqueador de ER&alpha;, que também apresentaram regulação negativa de HSD3B1. Quando do bloqueio do ER&beta;, as células luteínicas responderam com aumento dos genes relacionados à esteroidogênese e à proliferação celular, principalmente quando oriundas dos dias 20 e 40 p.o. Dessa forma, conclui-se que o bloqueio do ER&alpha; levou ao aumento dos genes pró-apoptóticos, e o bloqueio do ER&beta; possibilitou aumento dos genes luteotróficos. Estes achados confirmam o papel pleiotrópico do estradiol no CL canino e incluem este hormônio, assim como o balanço entre seus receptores, dentre os atores principais da regulação da meia vida do CL canino. / The 17&beta;-estradiol (E2) plays an important role in the reproductive function and female fertility, however, its action is extended to most tissues. Knowing that E2 has pleiotropic roles in different organs and tissues, and that might be involved in both cell death and proliferation, our hypothesis is that E2 is one of the triggers of luteal regression in non-pregnant bitches. To test our hypothesis, corpora lutea (CL) from 28 dogs on days 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 and >70 after ovulation (n = 4/group) were used for ex vivo experiments. Pro-apoptotic proteins expression (CASPASES, 3, 8, 9 e BAX) were analyzed by immunohistochemistry and western blotting, and the gene expression of CASP3, 8, 9, BAX, FAS, MKI67, ESR1 and ESR2 were analyzed by real-time PCR. In the second step of this study, CL from 12 bitches on days 20, 40 and 60 (n = 4 per group) were used. Luteal cells were isolated and divided into six treatments: Control, E2 (treated with E2), ER&alpha; Blocker (treated with MPP), ER&beta; Blocker (treated with PHTPP), ER&alpha; + E2 Blocker (treated with E2 + MPP) and E2 + ER&beta; Blocker (treated with E2 + PHTPP). The expression of the same genes from the in vivo experiment was evaluated, as well as that of CYP19A1, CYP11A1, HSD3B1 and SLC2A4. In general, the expression of pro-apoptotic factors was higher from day 40 and reached highest expression on days 60 and 70 after ovulation, coinciding with increasing in expression of ERS2. This correlation was also observed in the cells from the group E2 + ER&alpha; blockade, which also showed HSD3B1down-regulation. When ER&beta; was blocked, cells of days 20 and 40 post ovulation responded increasing the expression of steroidogenesis and proliferation related genes. Thus, we deduce that the ER&alpha; blockade promotes the increase of pro-apoptotic and that o ER&beta; of luteotrophic genes expression. Our findings confirm the pleiotropic role of estradiol in canine CL and include this hormone, as well as the balance between its two receptors, among the factors controlling canine CL lifespan.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:13:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pre textuais.pdf: 419949 bytes, checksum: 16c33c78cc5fa05473d5d08f666f2827 (MD5) Previous issue date: 2009-08-21 / Bovine estrous cycle activates the pathways of MAPKs (mitogen activated protein) via oscillation of hypothalamus-pituitary-gonad axis hormones. The objective of this work was to evaluate in vivo the frequency of expression of active (phosphorylated) form, of p-MEK 1/2 and p-ERK1/2 in all types of ovarian follicles and corpora lutea in different phases of the estrous cycle of cattle. Bovine ovaries were harvested in a local slaughterhouse and the phase of the estrous cycle was determined, considering seven stages, defined as experimental groups: days 1-3 (n = 2), 4-6 (n = 5), 7-9 (n = 5), 10-12 (n = 3), 13-15 (n = 5), 16-18 (n = 5) and 19-21 (n = 5). After processing, the histological sections were subjected to immunohistochemistry using antibodies that specifically recognize the phosphorylated form of MEK 1/2 and ERK 1/2. Histological sections containing corpora lutea were also subjected to immunohistochemistry with antibodies that recognize p-BCL2 (B cell phospho lymphoma 2) and COX-2 (COX-2). The frequency of marked follicles was evaluated for the presence or absence of markup for the two cellular enzymes. The fragments of the corpus luteum were evaluated according to the scores of intensity for positive staining of the four antibodies. The frequencies of the markers studied in the follicles were compared using the chi-square. In preantral follicles, both MEK and ERK 1/2 showed high levels between 16 to 18 days. In the case of p-MEK, the greater activation of primordial follicles and primary held from 7 to 9. In secondary follicles, the less marked for p-MEK occurred in group 4 to 6. Levels of p-ERK began to rise from 13 to 15 days and subsequently decreased. Comparing the frequencies of MEK and ERK, there was statistic difference (p <0.0001) in antral follicles compared to other types of follicles. It was concluded that the intensity of activation of MAPKs MEK / ERK varies with the phases of the estrous cycle and follicular class studied. Since the corpora lutea were evaluated by analysis of variance after transforming the data, it was observed that the proteins studied showed variation in expression profile, in relation to the development, survival and death of the corpus luteum. Since COX-2, a precursor of prostaglandin, is capable of activating the pathways of MEK / ERK 1/2, it reduces the frequency of expression of cell survival factor BCL-2, leading to the corpus luteum at luteolysis. The in vivo evaluation of the activation profile of MAPKs without the use of hormonal protocols demonstrated the importance of this enzyme during the physiological reproductive process, raising new inquiries and providing opportunities to expand knowledge about the functioning of the hormone and its association with the cellular mechanisms activated by hormones / A ocorrência do ciclo estral bovino, a partir de variações dos hormônios do eixohipotálamo- hipófise-gônadas, ativa as vias das MAPKs (proteína ativada por mitógenos) O objetivo desta tese foi avaliar in vivo a freqüência de expressão da forma ativa (fosforilada), de todos os tipos foliculares ovarianos e corpo lúteo para p- MEK 1/2 e p-ERK1/2, em diferentes fases do ciclo estral de bovinos. Para tal, foram coletados em abatedouros locais ovários de bovinos e determinada a fase do ciclo estral, caracterizando sete fases, definidas como grupos experimentais: dias 1-3 (n=2), 4-6 (n=5), 7-9 (n=5), 10-12 (n=3), 13-15 (n=5), 16-18 (n=5) e 19-21 (n=5). Após o processamento histológico os cortes foram submetidos à imunoistoquímica, utilizando anticorpos que reconhecem especificamente a forma fosforilada da MEK 1/2 e ERK 1/2. Cortes histológico que apresentavam corpos lúteos foram submetidos ainda a imunoistoquímica com anticorpos que reconhecem p-BCL2 (fosfo células B de linfoma 2) e COX-2 (ciclooxigenase 2). As freqüências de folículos marcados foram avaliadas em relação à presença ou não de marcação celular para as duas enzimas. Já os fragmentos de corpo lúteo foram avaliados de acordo com escores de intensidade de marcação para os quatro anticorpos. As freqüências das marcações nos folículos estudados foram comparadas por meio do teste qui-quadrado. Em folículos pré-antrais, tanto a MEK quanto a ERK 1/2 apresentaram níveis elevados entre os dias 16 a 18. No caso da p-MEK, a maior ativação dos folículos primordiais e primários ocorreu entre os dias 7 a 9. Em folículos secundários, a menor presença de folículos marcados para p-MEK ocorreu no grupo 4 a 6. Os níveis de p-ERK começaram a se elevar a partir de 13 a 15 dias, e posteriormente diminuíram. Quando comparadas as freqüências de MEK e ERK, foram registradas diferenças (p<0,0001) nos folículos antrais em comparação aos demais tipos foliculares. Concluiu-se que a intensidade de ativação das MAPKs MEK/ERK varia de acordo com as fases do ciclo estral e com a classe folicular estudada. Já os corpos lúteos foram avaliados por meio de análise de variância, após transformação dos dados, na qual foi observada que as proteínas estudadas apresentam variação no perfil de expressão, estando relacionada com o desenvolvimento, sobrevivência e morte do corpo lúteo. Sendo que o COX-2, um precursor da prostaglandina, tem capacidade de ativar as vias das MEK/ERK 1/2, diminuindo a freqüência de expressão do fator de sobrevivência celular BCL-2, levando o corpo lúteo ao momento da luteólise. Assim a avaliação do perfil de ativação das MAPKs in vivo, sem a utilização de protocolos hormonais, demonstrou a importância desta via enzimática durante o processo fisiológico reprodutivo, abrindo espaço para futuras indagações e possibilidades de ampliação de conhecimento a cerca do funcionamento hormonal e sua associação com os mecanismos celulares ativados pelos hormônios