A pele possui um grande número de mecanismos de defesa antioxidante. No entanto, a exposição prolongada à radiação ultravioleta (RUV), é capaz de aumentar a concentração de espécies reativas de oxigênio (EROs) provocando um desequilíbrio antioxidante/oxidante. A geração de EROs pode levar ao fotoenvelhecimento e doenças, como o câncer. A administração tópica de antioxidantes é uma maneira eficiente de enriquecer o sistema protetor cutâneo endógeno e, assim, uma estratégia para reduzir os danos oxidativos causados pela RUV à pele. Entretanto, para fornecer a proteção adequada à pele, estas substâncias devem ultrapassar a barreira imposta pelo estrato córneo. O extrato de Lychnophora salicifolia Mart. possui compostos com atividades antioxidante, anti-inflamatória e analgésica, como o ácido clorogênico e a vicenina-2, sendo, portanto, um possível candidato à agente protetor dos danos induzidos pela radiação na pele. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial fotoquimiopreventivo deste extrato e do ácido clorogênico, bem como de formulações contendo o extrato e a substância isolada encapsulados em lipossomas. Para atingir tal objetivo, foram realizados experimentos in vitro e in vivo de atividade antioxidante e eficácia fotoquimiopreventiva para comprovação do potencial antioxidante e anti-inflamatório, estudos de liberação e estudos de penetração cutânea das formulações utilizando pele humana e pele de orelha de porco. Os resultados obtidos demonstraram que o extrato possui atividade antioxidante in vitro e baixa citotoxicidade. A incorporação do extrato e da substância isolada em lipossomas foi bem sucedida, uma vez que estes demonstraram uma boa estabilidade físico-química e aumentaram a penetração dos compostos na pele de camundongos sem pelos. As formulações contendo lipossomas permitiram que os compostos do extrato e o ácido clorogênico isolado atravessassem o estrato córneo chegando até epiderme e derme na pele humana ex vivo. O acúmulo de partículas nos folículos pilosos parece não exercer influencia neste processo. Os extrato foi capaz de sequestrar EROs intracelulares e evitar a depleção do antioxidante endógeno GSH tanto em cultura de células como nos experimentos in vivo. Também foi observada a inibição in vivo da metaloproteinase de matriz-9 (MMP-9), enzima ativada pela RUV e que tem a capacidade de degradar os componentes da matriz extracelular da pele. Além disso, o extrato apresentou atividade anti-inflamatória superior à do ácido clorogênico, verificada pela diminuição dos níveis de citocinas pró-inflamatórias (IL-1?, IL-6 e TNF-?) e da atividade da enzima mieloperoxidase (MPO) in vivo. Portanto, o extrato parece ser um agente fotoquimiopreventivo promissor para uso tópico e, as formulações desenvolvidas, um sistema viável para liberação destas substâncias na pele. / The skin has several defense mechanisms to avoid oxidant damages. However, a prolonged exposition under ultraviolet radiation (UVR) may increase reactive oxygen species (ROS) concentration causing antioxidant/oxidant imbalance. ROS generation can induce photoaging and skin cancer. Topical administration of antioxidants is an efficient way to fortify the endogenous protection system and to reduce the oxidative damage caused by UVR. Nevertheless, to be effective, these compounds need to pass through the skin barrier imposed by stratum corneum. Lychnophora salicifolia Mart. extract has antioxidant, antiinflammatory and analgesic compounds, such as chlorogenic acid and vicenin-2, and it may be a skin protector agent against UVR damage. Therefore, the aim of this study was to evaluate the photochemopreventive potential of this extract and chlorogenic acid, as well as their formulation containing liposomes. In vitro and in vivo tests were performed to prove antioxidant and antiinflammatory activity. Formulation release and skin penetration studies were also carried out in human and porcine ear skin. The results showed that the extract has antioxidant activity in vitro and low cytotoxicity. The extract and the isolated compound were successfully entrapped in liposomes, demonstrating a good physic and chemical stability and increasing the skin penetration in hairless mice. The formulations containing liposomes allowed that the extract compounds and chlorogenic acid passed through the stratum corneum and reached epidermis and dermis in human skin ex vivo. The hair follicle uptake of the particles do not influenced the penetration process. The extract was able to scavenge intracellular ROS and avoid the depletion of the endogenous GSH both in cell culture and in vivo, even as it inhibited matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), enzyme activated by UVR that degrades skin matrix extracellular components. The extract also presented larger antiinflammatory properties than chlorogenic acid, decreasing the cytokines (IL-1?, IL-6 and TNF-?) levels and the mieloperoxidase activity in vivo. Therefore, the results suggest the potential applicability of the extract as a photochemopreventive agent to topical use and the developed formulations seem to be a viable system to release these compounds to the skin.

Uma das principais características da família Asteraceae é sua capacidade de produzir uma grande diversidade de metabólitos secundários que podem possuir efeitos terapêuticos ou tóxicos. Para verificar a existência de variações inter e intrapopulacionais na sua composição metabólica secundária de Lychnophora granmongolense (Duarte) Semir & Leitão Filho e caracterização desses metabólitos foi desenvolvida uma metodologia analítica em CLAE DAD. Essa metodologia permitiu a identificação de três compostos, vicenina-2, quercetina e pinocembrina, através da coinjeção de padrões, ou seja, pela comparação do tempo de retenção com padrões previamente isolados associados com os dados do espectro no UV. Com a utilização da técnica de espectrometria de massas, CLAE-DAD-EM e CLAE-DAD-EM/EM, foram identificadas quatro lactonas sesquiterpênicas (LST), centraterina, 4,5-di-idrocentraterina, lychnofolido e 15-desoxigoyazensolido. No estudo de variação populacional, os resultados indicaram grandes variações quantitativas e qualitativas tanto inter quanto intrapopulacionais para os metabólitos de alta e média polaridade. A análise dos metabólitos mais apolares presentes nas folhas permitiu a identificação de 8 triterpenos e 8 triterpenos acetilados. Contudo, esses metabólitos apresentam somente pequena variação que não é significativa. Assim, esse estudo contribuiu para o aumento do conhecimento sobre o ritmo metabólico dessa espécie. / One of the main characteristics of plants of the Asteraceae family is their capacity to produce a huge diversity of secondary metabolites having therapeutic and toxic effects. An analytical method was developed based on HPLCDAD which was used to verify the existence of variations in Lychnophora granmongolense (Duarte) Semir & Leitão Filho secondary metabolite levels among species within populations and between distinct populations and to characterize the major secondary metabolites. Through this method three compounds, namely vicenin-2, quercetin and pinocembrin were identified by co-injection of standards. This identification was based on the comparison of retention time with isolated standards and the UV spectrum. Four sesquiterpenes lactones centratherin, 4,5-dihydrocentratherin, lycnopholide and 15-deoxygoyazensolide were identified by mass spectrometry techniques coupled with HPLC (HPLC-DAD-MS e HPLC-DAD-MS/MS). In the populational variation study, the results show large qualitative and quantitative differences among species within populations and between populations for high and medium polarity secondary metabolites. Eight triterpenes and eight acetyl triterpenes were identified by apolar compound analysis. However, small, insignificant variation was observed for these particular metabolites. Thus, this study contributed to an increase in the knowledge of the metabolic rhythm of this specie.

A análise pelas técnicas hifenadas CLAE-DAD-EM e CLAE-DAD-EM/EM de extratos foliares de Lychnophora ericoides Mart. levou à identificação de 34 metabólitos secundários diretamente a partir dos extratos vegetais. Destes, 19 foram relatados pela primeira vez na subtribo Lychnophorinae. Uma metodologia para extração e análise destes metabólitos por CLAE-DAD foi desenvolvida, validada e utilizada para determinação de suas variações populacionais e temporais. Perfis metabólicos bem semelhantes, com diferenças quantitativas, mas não qualitativas, foram observados entre os indivíduos de uma mesma população. Entre as cinco populações analisadas, foi observado um metabolismo secundário bem mais diversificado, caracterizado pela presença de lactonas sesquiterpênicas, nas plantas da população de Ibiraci-MG. As concentrações mais elevadas de ácidos cafeoilquínicos foram encontradas no período da seca no cerrado (inverno) e as menores quando a planta se encontrava florida. Os teores de flavonóides foram maiores durante o período de chuvas (verão) e os de C-glicosilflavonas e lactonas sesquiterpênicas se mantiveram estáveis. Variações circadianas significativas de flavonóides e ácidos cafeoilquínicos também foram observadas nas duas populações nas quais estes fatores foram estudados. Foi verificado que o envelhecimento das folhas resulta em uma pronunciada redução no conteúdo de todos os metabólitos secundários e concentrações menores dos metabólitos foram observadas nas folhas dos ramos floridos em relação aos ramos sem flores de um mesmo indivíduo. Finalmente, conclui-se que as variações temporais e populacionais observadas em L. ericoides podem ser determinantes para a intensidade da atividade antiinflamatória e/ou analgésica desta planta, utilizada popularmente para estes propósitos. / The analyses of Lychnophora ericoides Mart. leaves extracts by HPLC-DAD-MS and HPLC-DAD-MS/MS resulted in the identification of 34 secondary metabolites directly from the plant extracts. Nineteen of these metabolites are being reported for the first time in the Lychnophorinae subtribe. A method for the extraction and analyses of these metabolites by CLAE-DAD was developed, validated and employed for the determination of their populational and temporal variations. Very similar metabolic profiles, exhibiting quantitative but not qualitative differences, were found among each population individuals. Among the five studied populations, a more diversified secondary metabolism, characterized by sesquiterpene lactones presence, was observed for the plants collected at Ibiraci-MG. The highest concentrations of caffeoylquinic acids were found in the cerrado dry season (winter), and the lowest when the plants were blooming. The flavoinoid contents were higher during the rainy season (summer), while C-glucosylflavones and sesquiterpene lactones levels remained stable. Significant circadian variations were also detected regarding flavonoids and caffeoylquinic acids in the two populations analyzed on this respect. It was also found a pronounced reduction in the contents of all the secondary metabolites as the leaves get old. Lower levels of all the metabolites were also found for the flowery branches when compared to the non flowery ones in the same individual. Finally, it can be concluded that the temporal and populational variations detected in L. ericoides leaves could highly influence the intensity of the anti-inflammatory and/or analgesic activities of this plant, used in popular medicines for these purposes.

O estudo de determinada espécie vegetal com fins medicinais é uma tarefa multidisciplinar que envolve a realização de pesquisas físicas, químicas e biológicas. Neste contexto, estudos farmacológicos e toxicológicos possuem papel de destaque pois permitem avaliar parâmetros como segurança e eficácia do medicamento, essenciais para o paciente e necessários para o registro aos órgãos reguladores. Lychnophora ericoides (arnica da serra), uma espécie endêmica no Brasil, é amplamente utilizada pela medicina tradicional para o tratamento de dor e inflamação. Por outro lado, a espécie carece de estudos para comprovar sua segurança e propriedades terapêuticas. Assim, os objetivos deste trabalho são: realizar ensaios farmacológicos in vivo para avaliar as propriedades analgésica (modelo da contorção abdominal induzida por ácido acético em camundongos e teste da formalina em ratos), antiinflamatória (edema de pata induzido por carragenina em ratos) e antipirética (febre induzida por LPS em ratos) de frações polares de L. ericoides e do ácido clorogênico (CGA, ácido 5-cafeoilquínico); avaliar o efeito de metabólitos secundários de L. ericoides sobre a síntese de mediadores inflamatórios produzidos por células U-937 cultivadas in vitro; e estudar o metabolismo oxidativo destes metabólitos em reações catalisadas por metaloporfirinas sintéticas (sistema biomimético do citocromo P450) e por mitocôndrias isoladas de fígado de ratos. Os resultados obtidos nos ensaios farmacológicos mostram que as propriedades farmacológicas do vegetal estão distribuídas em partes distintas da planta. Enquanto as raízes são predominantemente analgésicas, as folhas são tanto analgésicas como antiinflamatórias. Ainda, o ACG possui propriedades tanto analgésica como antiinflamatória, mas não antipirética. Quanto ao efeito dos metabólitos secundários sobre a produção de mediadores inflamatórios, observa-se que a vicenina-2 (VIC-2) é capaz de reduzir significativamente o mediador prostaglandina E2 (PGE2). Este efeito da VIC-2 sobre a PGE2 não decorre da inibição da transcrição/tradução da enzima cicloxigenase-2 e também não decorre da inibição direta da atividade catalítica da enzima. Baixas concentrações do ácido 3,5-dicafeoilquínico e do ácido 4,5-dicafeoilquínico possuem efeito moderado sobre a produção de PGE2, enquanto altas doses levam a um aumento da produção do mediador. Além disso, os ácidos dicafeoilquínicos mencionados e o ácido 3,4,5-tricafeoilquínico são capazes de inibir significativamente a produção da proteína quimioatraente de monócitos-3 (MCP-3), envolvida na migração de células imunes para o foco inflamatório. O ACG é capaz de inibir algumas citocinas, como o fator de necrose tumoral-alfa, interleucina-6 e MCP-3. Por outro lado, seu metabólito oxidado majoritário OX-ACG, obtido nas reações biomiméticas com metaloporfirna, é inativo ou fracamente ativo sobre estes mediadores. Os resultados do metabolismo oxidativo do ACG por metaloporfirinas sintéticas mostram a formação de 3 metabólitos: hidroxilado, dicarbonilado e carbonilado (OX-ACG), sendo o último produzido majoritariamente neste sistema biomimético. O mesmo padrão de oxidação foi verificado nas reações de metabolismo oxidativo dos ácidos dicafeoilquínicos. Por fim, o único metabólito oxidado do ACG produzido por mitocôndrias de fígado de ratos corresponde ao metabólito carbonilado majoritário OX-ACG obtido das reações com metaloporfirina. / The scientific study of medicinal plants is a multidisciplinary task and involves many fields of knowledge such as physics, chemistry and biology. In this context, pharmacological and toxicological studies play an important role since they allow evaluating parameters such as safety and efficacy. These parameters have to be well established, being essential for the patient?s safety and mandatory for the regulatory agencies. Lychnophora ericoides (arnica da serra), an endemic plant from Brazil, is widely used in traditional medicine to treat pain and inflammation. On the other hand, the species still lacks solid information on its safety and therapeutic properties. Therefore, the goals of this study are: to perform in vivo pharmacological assays (acetic acid-induced writhing test in mice, formalin pain in rats, carrageenan-induced rat paw edema, LPS-induced fever in rats) with polar fractions from L. ericoides and also chlorogenic acid (CGA, 5-caffeoylquinic acid); to evaluate the effect of secondary metabolites from L. ericoides on the synthesis of inflammatory mediators produced by in vitro cultured U-937 cells; to study the oxidative metabolism of the metabolites aforementioned catalyzed by synthetic metalloporphyrin (cytochrome P450 biomimetic system) and also by rat liver mitochondria. The results obtained in the pharmacological assays show that the analgesic and anti-inflammatory activities are distributed in distinct parts of the plant. Whereas the roots are predominantly analgesic, the leaves are both analgesic and anti-inflammatory. Also, CGA present both analgesic and anti-inflammatory activities but no antipyretic activity. When it comes to the effect of the secondary metabolites on the production of inflammatory mediators, vicenin-2 (VIC-2) is able to significantly inhibit PGE2 in a dose-dependent fashion. The effect exerted by VIC-2 on PGE2 is due neither to its inhibition on the synthesis of cycloxigenase-2 nor on the direct inhibition of the catalytic activity of the enzyme. Lower concentrations of 3,5-dicaffeoylquinic and 4,5-dicaffeoylquinic acids present a slight inhibitory effect on PGE2 synthesis; however, increasing doses stimulate the production of the mediator. In addition, the dicaffeoylquinic acids and the 3,4,5-tricaffeoylquinic acid are able to significantly inhibit the production of the chemokine monocyte chemoattractant protein-3 (MCP-3), involved in the migration of immune cells to the inflammatory site. CGA is able to inhibit some of the evaluated cytokines, such as tumor necrosis factor alpha, interleukin-6 and MCP-3. On the other hand, the major oxidized metabolite from CGA (OX-CGA) obtained from the metalloporphyrin biomimetic reactions is inactive or weakly active on the production of such cytokines. The results obtained in the metalloporphyrin-catalyzed oxidation reactions of CGA show the formation of 3 metabolites: hydroxylated, dicarbonylated and carbonylated (OX-CGA), the last being the major compound obtained in this biomimetic system. The same oxidation pattern is observed in the biomimetic oxidation of the dicaffeoylquinic acids. Finally, the single CGA oxidized metabolite produced by rat liver mitochondria corresponds to the carbonylated metabolite OX-CGA obtained in the metalloporphyrin reactions.

Uma das principais características da família Asteraceae é sua capacidade de produzir uma grande diversidade de metabólitos secundários que podem possuir efeitos terapêuticos ou tóxicos. Para verificar a existência de variações inter e intrapopulacionais na sua composição metabólica secundária de Lychnophora granmongolense (Duarte) Semir & Leitão Filho e caracterização desses metabólitos foi desenvolvida uma metodologia analítica em CLAE DAD. Essa metodologia permitiu a identificação de três compostos, vicenina-2, quercetina e pinocembrina, através da coinjeção de padrões, ou seja, pela comparação do tempo de retenção com padrões previamente isolados associados com os dados do espectro no UV. Com a utilização da técnica de espectrometria de massas, CLAE-DAD-EM e CLAE-DAD-EM/EM, foram identificadas quatro lactonas sesquiterpênicas (LST), centraterina, 4,5-di-idrocentraterina, lychnofolido e 15-desoxigoyazensolido. No estudo de variação populacional, os resultados indicaram grandes variações quantitativas e qualitativas tanto inter quanto intrapopulacionais para os metabólitos de alta e média polaridade. A análise dos metabólitos mais apolares presentes nas folhas permitiu a identificação de 8 triterpenos e 8 triterpenos acetilados. Contudo, esses metabólitos apresentam somente pequena variação que não é significativa. Assim, esse estudo contribuiu para o aumento do conhecimento sobre o ritmo metabólico dessa espécie. / One of the main characteristics of plants of the Asteraceae family is their capacity to produce a huge diversity of secondary metabolites having therapeutic and toxic effects. An analytical method was developed based on HPLCDAD which was used to verify the existence of variations in Lychnophora granmongolense (Duarte) Semir & Leitão Filho secondary metabolite levels among species within populations and between distinct populations and to characterize the major secondary metabolites. Through this method three compounds, namely vicenin-2, quercetin and pinocembrin were identified by co-injection of standards. This identification was based on the comparison of retention time with isolated standards and the UV spectrum. Four sesquiterpenes lactones centratherin, 4,5-dihydrocentratherin, lycnopholide and 15-deoxygoyazensolide were identified by mass spectrometry techniques coupled with HPLC (HPLC-DAD-MS e HPLC-DAD-MS/MS). In the populational variation study, the results show large qualitative and quantitative differences among species within populations and between populations for high and medium polarity secondary metabolites. Eight triterpenes and eight acetyl triterpenes were identified by apolar compound analysis. However, small, insignificant variation was observed for these particular metabolites. Thus, this study contributed to an increase in the knowledge of the metabolic rhythm of this specie.

A análise pelas técnicas hifenadas CLAE-DAD-EM e CLAE-DAD-EM/EM de extratos foliares de Lychnophora ericoides Mart. levou à identificação de 34 metabólitos secundários diretamente a partir dos extratos vegetais. Destes, 19 foram relatados pela primeira vez na subtribo Lychnophorinae. Uma metodologia para extração e análise destes metabólitos por CLAE-DAD foi desenvolvida, validada e utilizada para determinação de suas variações populacionais e temporais. Perfis metabólicos bem semelhantes, com diferenças quantitativas, mas não qualitativas, foram observados entre os indivíduos de uma mesma população. Entre as cinco populações analisadas, foi observado um metabolismo secundário bem mais diversificado, caracterizado pela presença de lactonas sesquiterpênicas, nas plantas da população de Ibiraci-MG. As concentrações mais elevadas de ácidos cafeoilquínicos foram encontradas no período da seca no cerrado (inverno) e as menores quando a planta se encontrava florida. Os teores de flavonóides foram maiores durante o período de chuvas (verão) e os de C-glicosilflavonas e lactonas sesquiterpênicas se mantiveram estáveis. Variações circadianas significativas de flavonóides e ácidos cafeoilquínicos também foram observadas nas duas populações nas quais estes fatores foram estudados. Foi verificado que o envelhecimento das folhas resulta em uma pronunciada redução no conteúdo de todos os metabólitos secundários e concentrações menores dos metabólitos foram observadas nas folhas dos ramos floridos em relação aos ramos sem flores de um mesmo indivíduo. Finalmente, conclui-se que as variações temporais e populacionais observadas em L. ericoides podem ser determinantes para a intensidade da atividade antiinflamatória e/ou analgésica desta planta, utilizada popularmente para estes propósitos. / The analyses of Lychnophora ericoides Mart. leaves extracts by HPLC-DAD-MS and HPLC-DAD-MS/MS resulted in the identification of 34 secondary metabolites directly from the plant extracts. Nineteen of these metabolites are being reported for the first time in the Lychnophorinae subtribe. A method for the extraction and analyses of these metabolites by CLAE-DAD was developed, validated and employed for the determination of their populational and temporal variations. Very similar metabolic profiles, exhibiting quantitative but not qualitative differences, were found among each population individuals. Among the five studied populations, a more diversified secondary metabolism, characterized by sesquiterpene lactones presence, was observed for the plants collected at Ibiraci-MG. The highest concentrations of caffeoylquinic acids were found in the cerrado dry season (winter), and the lowest when the plants were blooming. The flavoinoid contents were higher during the rainy season (summer), while C-glucosylflavones and sesquiterpene lactones levels remained stable. Significant circadian variations were also detected regarding flavonoids and caffeoylquinic acids in the two populations analyzed on this respect. It was also found a pronounced reduction in the contents of all the secondary metabolites as the leaves get old. Lower levels of all the metabolites were also found for the flowery branches when compared to the non flowery ones in the same individual. Finally, it can be concluded that the temporal and populational variations detected in L. ericoides leaves could highly influence the intensity of the anti-inflammatory and/or analgesic activities of this plant, used in popular medicines for these purposes.

O estudo de determinada espécie vegetal com fins medicinais é uma tarefa multidisciplinar que envolve a realização de pesquisas físicas, químicas e biológicas. Neste contexto, estudos farmacológicos e toxicológicos possuem papel de destaque pois permitem avaliar parâmetros como segurança e eficácia do medicamento, essenciais para o paciente e necessários para o registro aos órgãos reguladores. Lychnophora ericoides (arnica da serra), uma espécie endêmica no Brasil, é amplamente utilizada pela medicina tradicional para o tratamento de dor e inflamação. Por outro lado, a espécie carece de estudos para comprovar sua segurança e propriedades terapêuticas. Assim, os objetivos deste trabalho são: realizar ensaios farmacológicos in vivo para avaliar as propriedades analgésica (modelo da contorção abdominal induzida por ácido acético em camundongos e teste da formalina em ratos), antiinflamatória (edema de pata induzido por carragenina em ratos) e antipirética (febre induzida por LPS em ratos) de frações polares de L. ericoides e do ácido clorogênico (CGA, ácido 5-cafeoilquínico); avaliar o efeito de metabólitos secundários de L. ericoides sobre a síntese de mediadores inflamatórios produzidos por células U-937 cultivadas in vitro; e estudar o metabolismo oxidativo destes metabólitos em reações catalisadas por metaloporfirinas sintéticas (sistema biomimético do citocromo P450) e por mitocôndrias isoladas de fígado de ratos. Os resultados obtidos nos ensaios farmacológicos mostram que as propriedades farmacológicas do vegetal estão distribuídas em partes distintas da planta. Enquanto as raízes são predominantemente analgésicas, as folhas são tanto analgésicas como antiinflamatórias. Ainda, o ACG possui propriedades tanto analgésica como antiinflamatória, mas não antipirética. Quanto ao efeito dos metabólitos secundários sobre a produção de mediadores inflamatórios, observa-se que a vicenina-2 (VIC-2) é capaz de reduzir significativamente o mediador prostaglandina E2 (PGE2). Este efeito da VIC-2 sobre a PGE2 não decorre da inibição da transcrição/tradução da enzima cicloxigenase-2 e também não decorre da inibição direta da atividade catalítica da enzima. Baixas concentrações do ácido 3,5-dicafeoilquínico e do ácido 4,5-dicafeoilquínico possuem efeito moderado sobre a produção de PGE2, enquanto altas doses levam a um aumento da produção do mediador. Além disso, os ácidos dicafeoilquínicos mencionados e o ácido 3,4,5-tricafeoilquínico são capazes de inibir significativamente a produção da proteína quimioatraente de monócitos-3 (MCP-3), envolvida na migração de células imunes para o foco inflamatório. O ACG é capaz de inibir algumas citocinas, como o fator de necrose tumoral-alfa, interleucina-6 e MCP-3. Por outro lado, seu metabólito oxidado majoritário OX-ACG, obtido nas reações biomiméticas com metaloporfirna, é inativo ou fracamente ativo sobre estes mediadores. Os resultados do metabolismo oxidativo do ACG por metaloporfirinas sintéticas mostram a formação de 3 metabólitos: hidroxilado, dicarbonilado e carbonilado (OX-ACG), sendo o último produzido majoritariamente neste sistema biomimético. O mesmo padrão de oxidação foi verificado nas reações de metabolismo oxidativo dos ácidos dicafeoilquínicos. Por fim, o único metabólito oxidado do ACG produzido por mitocôndrias de fígado de ratos corresponde ao metabólito carbonilado majoritário OX-ACG obtido das reações com metaloporfirina. / The scientific study of medicinal plants is a multidisciplinary task and involves many fields of knowledge such as physics, chemistry and biology. In this context, pharmacological and toxicological studies play an important role since they allow evaluating parameters such as safety and efficacy. These parameters have to be well established, being essential for the patient?s safety and mandatory for the regulatory agencies. Lychnophora ericoides (arnica da serra), an endemic plant from Brazil, is widely used in traditional medicine to treat pain and inflammation. On the other hand, the species still lacks solid information on its safety and therapeutic properties. Therefore, the goals of this study are: to perform in vivo pharmacological assays (acetic acid-induced writhing test in mice, formalin pain in rats, carrageenan-induced rat paw edema, LPS-induced fever in rats) with polar fractions from L. ericoides and also chlorogenic acid (CGA, 5-caffeoylquinic acid); to evaluate the effect of secondary metabolites from L. ericoides on the synthesis of inflammatory mediators produced by in vitro cultured U-937 cells; to study the oxidative metabolism of the metabolites aforementioned catalyzed by synthetic metalloporphyrin (cytochrome P450 biomimetic system) and also by rat liver mitochondria. The results obtained in the pharmacological assays show that the analgesic and anti-inflammatory activities are distributed in distinct parts of the plant. Whereas the roots are predominantly analgesic, the leaves are both analgesic and anti-inflammatory. Also, CGA present both analgesic and anti-inflammatory activities but no antipyretic activity. When it comes to the effect of the secondary metabolites on the production of inflammatory mediators, vicenin-2 (VIC-2) is able to significantly inhibit PGE2 in a dose-dependent fashion. The effect exerted by VIC-2 on PGE2 is due neither to its inhibition on the synthesis of cycloxigenase-2 nor on the direct inhibition of the catalytic activity of the enzyme. Lower concentrations of 3,5-dicaffeoylquinic and 4,5-dicaffeoylquinic acids present a slight inhibitory effect on PGE2 synthesis; however, increasing doses stimulate the production of the mediator. In addition, the dicaffeoylquinic acids and the 3,4,5-tricaffeoylquinic acid are able to significantly inhibit the production of the chemokine monocyte chemoattractant protein-3 (MCP-3), involved in the migration of immune cells to the inflammatory site. CGA is able to inhibit some of the evaluated cytokines, such as tumor necrosis factor alpha, interleukin-6 and MCP-3. On the other hand, the major oxidized metabolite from CGA (OX-CGA) obtained from the metalloporphyrin biomimetic reactions is inactive or weakly active on the production of such cytokines. The results obtained in the metalloporphyrin-catalyzed oxidation reactions of CGA show the formation of 3 metabolites: hydroxylated, dicarbonylated and carbonylated (OX-CGA), the last being the major compound obtained in this biomimetic system. The same oxidation pattern is observed in the biomimetic oxidation of the dicaffeoylquinic acids. Finally, the single CGA oxidized metabolite produced by rat liver mitochondria corresponds to the carbonylated metabolite OX-CGA obtained in the metalloporphyrin reactions.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-01-22Bitstream added on 2014-06-13T20:03:59Z : No. of bitstreams: 1 haber_ll_dr_botfca.pdf: 866192 bytes, checksum: f6d9dede11b30cda861174dc04f042d3 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Atualmente, Lychnophora pinaster, encontra-se classificada na categoria de plantas vulneráveis, ou seja, os “taxa” cujas populações encontram-se em risco de extinção. Suas folhas e flores são aromáticas e utilizadas na medicina popular sob a forma de extrato alcoólico, como antinflamatório, anestésico e cicatrizante. O presente estudo objetivou realizar a caracterização genética, via marcador molecular microssatélite, e a química dos óleos essenciais de populações de Lychnophora pinaster Mart, visando sua preservação, uso sustentável e estudos futuros de melhoramento genético vegetal. Para tal, foram amostradas quatro populações da espécie coletadas no Estado de Minas Gerais. O estudo da variabilidade populacional realizou-se pela análise de polimorfismo do DNA com marcadores microssatélite e a química, por meio da análise da composição química dos óleos essenciais das folhas das populações nativas e cultivadas. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação e analisados em cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas (Shimadzu, QP-5000). Pelo agrupamento UPGMA, as populações nativas foram divididas em dois grupos, sendo um composto por Estrada Real, Estrada Real 1 e Antena, e o outro representado por Poço Bonito. Pela análise de componentes principais, quimicamente as populações foram, também, divididas em dois grupos, um composto por Estrada Real, Estrada Real 1 e Poço Bonito, tendo como principal constituinte do óleo essencial o trans-cinamato de metila, e, o outro, representado pela população Antena, tendo como o outro principal constituinte o cedr-8-(15)-en-9-alfa-ol. As populações quando cultivadas não tiveram diferenças no perfil químico, tendo como constituinte majoritário o trans-cinamato de metila... / Currently, Lychnophora pinaster is considered an endangered species, that is, it belongs to the taxa whose native populations are risking extinction. Its leaves and flowers are aromatic and used in popular medicine in the form of alcohol extracts as anti-inflammatory, anesthetic and curative agent in wounds. Therefore, the present study aimed to characterize the genetic diversity, using microsatellite molecular markers, and the chemical composition of the essential oil from Lychnophora pinaster Mart populations, so that it can be preserved, sustainably used and be incorporated into further studies of genetic breeding. In order to do so, four native populations of the species were sampled from the state of Minas Gerais. Population variability studies were performed by DNA polymorphism analyses using microsatellite molecular markers and the chemical characterization was performed by analyzing the composition of the essential oil from leaves obtained from native and cultivated populations. Essential oils were extracted by hydro-distillation and analyzed by gas-chromatography mass spectrometry (Shimadzu, QP- 5000). The native populations formed two clusters by UPGMA grouping; one of them consisting of the populations from Estrada Real, Estrada Real 1 and Antena, and the other one consisting of the population from Poço Bonito. Chemically, the populations were also clustered in two groups according to the major compounds analyses; the first one comprising Estrada Real, Estrada Real 1 and Poço Bonito, that had methyl trans-cinnamate as major compound and the second one, represented by Antena population that had cedr-8- (15)-en-9-alpha-ol as major component...(Complete abstract click electronic access below)

Submitted by PAULO SÉRGIO SIBERTI DA SILVA null (sibertisilva@hotmail.com) on 2016-06-23T02:50:14Z No. of bitstreams: 1 tese_definitiva_rev Marcia_final_22_06_2016.pdf: 7944179 bytes, checksum: c1b7190a1c23d0d924b3a8e4d60ff257 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-06-24T18:03:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 silva_pss_dr_bot.pdf: 7944179 bytes, checksum: c1b7190a1c23d0d924b3a8e4d60ff257 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-24T18:03:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 silva_pss_dr_bot.pdf: 7944179 bytes, checksum: c1b7190a1c23d0d924b3a8e4d60ff257 (MD5) Previous issue date: 2016-04-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os objetivos deste estudo foram (i) fornecer a caracterização dos padrões de diversidade genética e estrutura populacional de sete populações naturais de L. pinaster e discutir estratégias de conservação; (ii) avaliar a composição química dos óleos essenciais de três populações naturais da espécie, duas provenientes da região sul e uma do sudeste de Minas Gerais; (iii) caracterizar os princípios ativos, registrados na literatura, dos extratos etanólicos das três populações naturais; (iv) determinar a atividade in vitro dos óleos essenciais e extratos etanólicos das populações contra formas amastigotas de Tripanossoma cruzi; e (v) avaliar as relações entre o polimorfismo químico, os fatores ambientais e genéticos. Os resultados revelaram (i) existência de diferentes níveis de diversidade genética dentro e alto nível de diferenciação genética entre populações. É estritamente necessário o monitoramento das populações remanescentes para que, de fato, seja evitada a extinção da espécie. Os esforços de conservação in situ devem focar na preservação dos habitats de L. pinaster da destruição e no aumento dos tamanhos populacionais, uma vez que o pequeno tamanho populacional e a fragmentação fazem de L. pinaster susceptível às perdas de diversidade genética causada pela endogamia e deriva genética. É sugerido planejamento de coleta de sementes provenientes dos grupos genéticos evidenciados pelo STRUCTURE ou DAPC para a conservação ex situ do germoplasma; (ii) não foi registrada a presença de substâncias da classe dos fenilpropanóides no óleo essencial da população de L. pinaster proveniente da região sudeste, apresentando como constituinte majoritário um sesquiterpeno oxigenado, enquanto as populações do sul apresentaram o E-cinamato de metila, E-cariofileno e α-humuleno como constituintes mais abundantes; (iii) mesmo padrão espacial de composição química foi observado para os extratos, onde as populações do sul apresentaram perfil químico semelhante entre si sob o ponto de vista qualitativo, diferindo da proveniente do sudeste. Dos princípios ativos, somente a quercetina e friedelina foram identificados nos extratos das três populações, tendo as suas quantidades variado entre populações; (iv) os óleos essenciais e extratos etanólicos não apresentam in vitro seletividade e atividade antiparasitária com relação às formas amastigotas T. cruzi equivalente ou superior ao benznidazol, utilizado comercialmente para tratar doença de Chagas; (v) com o aumento das concentrações dos óleos essenciais e extratos, houve aumento da citotoxicidade e, consequentemente, diminuição da taxa de células hospedeiras tanto infectadas como não infectadas. Os extratos se mostraram mais citotóxicos em relação aos óleos essenciais; (vi) comparados à genética, os preditores ambientais - distância geográfica e os diferentes gradientes de solo - se mostraram os elementos mais relevantes para a variação química do óleo essencial entre populações de L. pinaster, indicando que o polimorfismo químico no óleo essencial esteja ocorrendo mais como um reflexo de uma seleção natural de acordo com os fatores ambientais locais e não devido à deriva genética; o que é um alerta quanto à utilização de diferentes populações de L. pinaster como fitoterápico de modo indiscriminado, uma vez que as diferenças na composição química podem comprometer sua eficácia terapêutica. / The aims of this study were (i) to provide the characterization of the genetic diversity and population structure of seven native populations of L.pinaster and to provide strategies for its conservation; (ii) to study the chemical composition of essential oils of three native population of this species, being two from southern and one from southeastern region of the State of Minas Gerais; (iii) to characterize the active ingredients of the ethanolic extracts of these three native populations; (iv) to determine the in vitro activity of the essential oils and ethanolic extracts of the populations against amastigote forms of Tripanossoma cruzi; and (v) to analyze the correlation of the chemical polymorphism of the essential oil with environmental and genetic factors. It were detected (i) existence of different levels of genetic diversity within and high level of genetic differentiation among populations. It is strictly necessary monitoring of the remaining populations so that, in fact, be avoided extinction of L. pinaster. The efforts for in situ conservation should focus on preservation of habitats and the increase of populations size, once the small population size and fragmentation make L. pinaster vulnerable to losses of genetic diversity due to the endogamy and genetic drift. It is suggested collection of seeds from the genetic groups evidenced by STRUCTURE or DAPC for ex situ conservation of germplasm; (ii) It were not detected phenylpropanoids in the essential oil of the population from southeastern region, which presented as majoritary compound an oxygenated sesquiterpene, while in southern populations were detected the majoritary E-methyl cinnamate (phenylpropanoid), followed by E-caryophyllene and α- humelene; (iii) same spatial pattern of chemical composition was observed for extracts, with southern populations having similar profile quantitatively, differing of the southeastern population. Regarding the active ingredients, only quercetin and friedelin were identified in the extracts of the three populations, with quantities differing among populations; (iv) the essential oils and extracts did not show selectivity and antiparasitic activity against T. cruzi amastigotes equivalent or superior to benznidazole, commercially used to treat Chagas disease; (v) the extracts were more cytotoxic than essential oils; and (vi) the environmental predictors – geographical distance and soils – were the most relevant factors to explain the chemical variation of essential oils among populations, indicating the chemical polymorphism is due to a natural selection according to the local environmental factors and not due to the genetic drift, which is an alert regarding the usage of different populations of L. pinaster in an indiscriminate way, once differences in chemical composition could compromise their therapeutic efficacy.

Resumo: Atualmente, Lychnophora pinaster, encontra-se classificada na categoria de plantas vulneráveis, ou seja, os "taxa" cujas populações encontram-se em risco de extinção. Suas folhas e flores são aromáticas e utilizadas na medicina popular sob a forma de extrato alcoólico, como antinflamatório, anestésico e cicatrizante. O presente estudo objetivou realizar a caracterização genética, via marcador molecular microssatélite, e a química dos óleos essenciais de populações de Lychnophora pinaster Mart, visando sua preservação, uso sustentável e estudos futuros de melhoramento genético vegetal. Para tal, foram amostradas quatro populações da espécie coletadas no Estado de Minas Gerais. O estudo da variabilidade populacional realizou-se pela análise de polimorfismo do DNA com marcadores microssatélite e a química, por meio da análise da composição química dos óleos essenciais das folhas das populações nativas e cultivadas. Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação e analisados em cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas (Shimadzu, QP-5000). Pelo agrupamento UPGMA, as populações nativas foram divididas em dois grupos, sendo um composto por Estrada Real, Estrada Real 1 e Antena, e o outro representado por Poço Bonito. Pela análise de componentes principais, quimicamente as populações foram, também, divididas em dois grupos, um composto por Estrada Real, Estrada Real 1 e Poço Bonito, tendo como principal constituinte do óleo essencial o trans-cinamato de metila, e, o outro, representado pela população Antena, tendo como o outro principal constituinte o cedr-8-(15)-en-9-alfa-ol. As populações quando cultivadas não tiveram diferenças no perfil químico, tendo como constituinte majoritário o trans-cinamato de metila ...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Currently, Lychnophora pinaster is considered an endangered species, that is, it belongs to the taxa whose native populations are risking extinction. Its leaves and flowers are aromatic and used in popular medicine in the form of alcohol extracts as anti-inflammatory, anesthetic and curative agent in wounds. Therefore, the present study aimed to characterize the genetic diversity, using microsatellite molecular markers, and the chemical composition of the essential oil from Lychnophora pinaster Mart populations, so that it can be preserved, sustainably used and be incorporated into further studies of genetic breeding. In order to do so, four native populations of the species were sampled from the state of Minas Gerais. Population variability studies were performed by DNA polymorphism analyses using microsatellite molecular markers and the chemical characterization was performed by analyzing the composition of the essential oil from leaves obtained from native and cultivated populations. Essential oils were extracted by hydro-distillation and analyzed by gas-chromatography mass spectrometry (Shimadzu, QP- 5000). The native populations formed two clusters by UPGMA grouping; one of them consisting of the populations from Estrada Real, Estrada Real 1 and Antena, and the other one consisting of the population from Poço Bonito. Chemically, the populations were also clustered in two groups according to the major compounds analyses; the first one comprising Estrada Real, Estrada Real 1 and Poço Bonito, that had methyl trans-cinnamate as major compound and the second one, represented by Antena population that had cedr-8- (15)-en-9-alpha-ol as major component...(Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Márcia Ortiz Mayo Marques / Coorientador: Edivaldo Domingues Velini / Banca: Maria Imaculada Zucchi / Banca: João Domingos Rodrigues / Banca: Maria das Graças Cardoso / Banca: Marcos Aparecido Gimenes / Banca: Luís Vitor Silva do Sacramento / Doutor