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Le séquençage du génome humain et l'émergence de nouvelles technologies de génomique à haut débit, ont initié de nouveaux modèles d'investigation pour l'analyse systématique des maladies humaines. Actuellement, nous pouvons tenter de comprendre les maladies tel que le cancer avec une perspective plus globale, en identifiant des gènes responsables des cancers et en étudiant la manière dont leurs produits protéiques fonctionnent dans un réseau d’interactions moléculaires. Dans ce contexte, nous avons collecté les gènes spécifiquement liés à la Leucémie Lymphoblastique Aiguë (LLA), et identifié de nouveaux partenaires d'interaction qui relient ces gènes clés associés à la LLA tels que NOTCH1, FBW7, KRAS et PTPN11, dans un réseau d’interactions. Nous avons également tenté de prédire l’impact fonctionnel des variations génomiques tel que des fusions de gènes impliquées dans LLA. En utilisant comme modèles trois différentes translocations chromosomiques ETV6-RUNX1 (TEL-AML1), BCR-ABL1, et E2A-PBX1 (TCF3-PBX1) fréquemment identifiées dans des cellules B LLA, nous avons adapté une approche de prédiction d’oncogènes afin de prédire des perturbations moléculaires dans la LLA. Nous avons montré que les circuits transcriptomiques dépendant de Myc et JunD sont spécifiquement dérégulés suite aux fusions de gènes TEL-AML1 et TCF3-PBX1, respectivement. Nous avons également identifié le mécanisme de transport des ARNm dépendant du facteur NXF1 comme une cible directe de la protéine de fusion TCF3-PBX1. Grâce à cette approche combinant les données interactomiques et les analyses d'expression génique, nous avons fourni un nouvel aperçu à la compréhension moléculaire de la Leucémie Lymphoblastique Aiguë. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Notre groupe a montré que l’hypoxie sévère (0.1% O2) induit un arrêt du cycle cellulaire en G0 des cellules humaines CD34+ et des cellules murines FDCP mix. Peu d’études ont exploré l’existence de Cellules Initiatrices de Leucémie (CIL) dans les LAL et leur rôle dans les rechutes. Notre projet s’est focalisé sur l’effet de l’hypoxie sévère sur la quiescence des CIL dans les LAL, qui pourrait être responsable d’un pourcentage de rechutes. En effet dans la niche hématopoïétique, ou sont localisées les Cellules souches hématopoïétiques et probablement les CIL, la concentration d’oxygène avoisinerait 0,1%.Nous avons utilisé la lignée de LAL NALM6 pour explorer les effets de l’hypoxie sévère sur leur survie, leur cycle cellulaire et leur chimiorésistance. Nos résultats ont mis en évidence qu’une culture à 0.1% O2 durant 7 jours de la lignée NALM6: - inhibe leur prolifération sans surmortalité, - révèle une population restreinte de CIL quiescentes et chimiorésistantes capables d’induire une leucémie dans des souris. Nous avons recherché les relations entre l’hypoxie sévère et quelques caractéristiques des cellules primaires de patients atteints de LAL : existence et rôle de CIL résistantes à l’hypoxie et aux agents thérapeutiques conventionnels des LAL ; localisation de ces cellules résiduelles dans la moelle osseuse des souris xénogreffées. Nos résultats suggèrent que certaines rechutes de LAL pourraient être dues à la persistance à long terme de « quiescent/dormant » CIL dans les niches hypoxiques de la moelle osseuse. Ce modèle est intéressant pour explorer les mécanismes in vitro et in vivo de chimiorésistance dans les LAL et le rôle de l’environnement dans ce phénomène. / Our group showed that severe hypoxia (0.1% O2) induces G0 cell-cycle-arrest of human CD34+ cells and of murine FDCP-mix Cells. Few studies explored the existence of quiescent Leukemia Initiating Cells (LIC) in ALL and their role in primary chemoresistance and relapses. Our project is focused on the effect of very low O2 concentrations in the maintenance of quiescent LIC in ALL, that could be responsible of a percentage of relapses. Indeed in bone marrow niches, where hematopoietic stem cells and probably LIC are located, the O2 concentrations are below 0.1%.In the present study we used the NALM-6 ALL cell line to explore the effects of culture at 0.1% O2 on their survival, cell cycle and chemoresistance. Our results evidence that a 7 days culture of NALM-6 cells at 0.1% O2: - inhibits their proliferation without major cell death; - reveals a restricted LIC population of quiescent and chemoresistant LIC; - maintains quiescent chemoresistant LIC that induce leukemia when injected in immunodeficient mice. We investigated the relationships between severe hypoxia and some characteristics of ALL primary cells obtained from patients: existence and role of quiescent chemoresistant LICs in ALL relapses; location of these residual cells inside the bone marrow of engrafted mice. Our results suggest that some ALL relapses could be due to the long term persistence of “quiescent / dormant” LIC in hypoxic bone marrow niches. This model is of interest for exploring the in vitro and in vivo (xenograft) mechanisms of chemoresistance in ALL and the role of the bone marrow environment in this phenomenon.

Les leucémies aiguës lymphoblastiques de la lignée B (LAL-B) sont les cancers pédiatriques les plus fréquents. Dans ce type de leucémie, l'une des anomalies génétiques les plus fréquentes est la translocation t(12 ;21) aboutissant à la protéine de fusion ETV6-RUNX1. Cette pathologie est décrite comme un modèle à deux « hits ». Le premier, se produit in utero et génère la protéine de fusion. Le second, correspond à l’acquisition d’anomalies génétiques après la naissance. Ces réarrangements génomiques aberrants ont été décrits comme provenant d’une activité anormale de la recombinasse RAG. Notre travail a consisté dans un premier temps à compléter le modèle de leucémogénèse à plusieurs « hits ». En continuant notre étude des LAL B à translocation ETV6-RUNX1, nous nous sommes concentrés sur le rôle de RUNX1, gène dérégulé dans ce type de leucémie.L’ensemble de nos résultats confirme le rôle prépondérant de RUNX1 dans l’hématopoïèse et la leucémogenèse grâce à sa capacité à s’associer à des protéines aux fonctions différentes et grâce à son implication dans la transcription de gènes clé en hématologie. Nos résultats ouvrent donc de nouvelles perspectives dans la compréhension du contrôle de l’activité transcriptionnelle de RUNX1 et dans son rôle dans les hémopathies malignes. / B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is the most common pediatric cancer. In this type of leukemia, one of the most common genetic abnormalities is the ETV6-RUNX1 rearrangement. This malignancy is described as a two "hits" model. The first event occurs mainly in utero and generates the fusion gene ETV6-RUNX1. The second event consists in the acquisition of additional genetic abnormalities after birth. These aberrant genomic modifications have been described as resulting from abnormal activity of the RAG recombinase. Our work consisted initially in completing the leukemogenesis model. In continuing our study of ETV6-RUNX1 B-ALL, we focused on the role of RUNX1, an upregulated gene in this type of leukemia. All results confirm the predominant role of RUNX1 in hematopoiesis and leukemogenesis thanks to its ability to associate with proteins with different functions and its involvement in the transcription of key genes in hematology. Our results therefore open new perspectives in understanding the control of transcriptional activity of RUNX1 and its role in malignant hematology.

Objectifs. L’objectif principal de cette étude est d’évaluer l’influence du groupe pronostique auquel le patient est attribué au moment du diagnostic et du protocole de traitement sur le développement d’anomalies dentaires et leur sévérité chez les enfants traités pour la leucémie aigüe lymphoblastique (LAL). L’étude comporte un objectif secondaire : confirmer les résultats des études précédentes ayant montré un nombre et une sévérité plus élevée d'anomalies dentaires chez le groupe 0-5 ans. Hypothèse. Chez des enfants ayant été traités pour la LAL, la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires seront plus élevées chez ceux ayant fait partie du groupe pronostique de très haut risque, ayant reçu une combinaison de chimiothérapie, de radiothérapie et de greffe de moelle osseuse et ayant eu leur diagnostic avant l’âge de 6 ans. Méthodes. Des patients âgés entre 14 et 25 ans et ayant reçu un diagnostic de LAL avant l’âge de 11 ans ont été recrutés au Centre Hospitalier Universitaire Sainte-Justine. Un examen dentaire et radiologique ont été effectués. Des données concernant le diagnostic, le groupe pronostique et le type de traitement reçu ont été notées à partir du dossier médical des participants. Résultats. Des défauts dentaires ont été observés chez 26 (50,98%) des 51 sujets, la microdontie étant l’anomalie la plus prévalente (39,22%). Les participants des catégories haut risque et très haut risque ayant reçu de la chimiothérapie haute dose étaient significativement plus à risque de présenter une anomalie dentaire comparé à ceux de la catégorie risque standard ayant reçu la chimiothérapie conventionnelle (p=0.046). Un âge ≤ 5 ans au diagnostic augmentait significativement la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires (p<0.001). Conclusion. Le traitement de la LAL pédiatrique affecte l’odontogénèse. Le groupe pronostique et le protocole de traitement ont augmenté le risque de développer au moins une anomalie dentaire. L’âge au diagnostic a affecté la prévalence et la sévérité des anomalies dentaires. / Objective. The main objective of this study is to assess the influence of the risk group to which the patient is assigned at diagnosis and the treatment protocol on the development and severity of dental anomalies in children treated for acute lymphoblastic leukemia (ALL). The secondary aim was to confirm the results of previous studies that showed an increased number and severity of dental defects in children aged 0 to 5 years old at diagnosis. Hypothesis. In children treated for ALL, the prevalence and severity of dental anomalies will be the highest in those who were in the very high risk prognostic group, who received a combination of chemotherapy, total body irradiation and hematopoietic stem cell transplantation and who were diagnosed before the age of 6 years old. Methods. Patients aged between 14 and 25 years old who received diagnosis of ALL before the age of 11 years were recruited at the Sainte-Justine Mother and Child University Hospital Center. Dental and radiographic examinations were performed. Data about the diagnosis, risk group and type of treatment received were collected from medical records. Results. Dental anomalies were recorded in 26 (50.98%) out of 51 subjects and microdontia was the most prevalent dental defect (39.22%). Participants in the high risk and very high risk categories receiving high-dose chemotherapy were significantly more likely to show a dental anomaly compared to those in the standard risk group receiving conventional chemotherapy (p=0.046). Age ≤5 years at diagnosis significantly increased the prevalence of dental anomalies and the severity rating (p<0.001). Conclusion. Therapy for childhood ALL affects the developing dentition. Risk group and treatment protocol influenced the odds of developing at least one dental anomaly. Age at diagnosis affected both the prevalence and severity of dental defects.

Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes causées par la prolifération de cellules immatures T bloquées à un stade donné de leur différenciation. Leur oncogenèse est multigénique. Une anomalie de type A (à l’origine du blocage de différenciation) ainsi que des anomalies de type B (gains de fonctions de type prolifération, métabolisme, résistance à l’apoptose…) sont souvent retrouvées chez le même patient. Ces leucémies reproduisent individuellement les différentes étapes de la maturation thymique humaine. En fonction de l’immunogénétique (phénotype et réarrangement des loci des TCR), 3 groupes de LAL-T sont ainsi identifiables : les LAL-T immatures (correspondant aux formes non T-restreintes), les LAL-T corticales (bloquées autour de la b-sélection) et les LAL-T matures TCR/CD3+. Mon travail de thèse a consisté à déterminer à quel point l’activation et la signalisation du TCR pouvaient être impliquées dans la biologie de cette hémopathie. Nous avons utilisé le modèle transgénique Marilyn TCR-HY et montré in vitro (lignée TLX+) et in vivo (modèle de leucémogénèse TEL-JAK2) que l’activation du TCR par la reconnaissance de son peptide spécifique (DBY, peptide présent uniquement dans les souris mâles) empêche le développement et le maintien de la leucémie. L'induction de la signalisation du TCR par des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne de signalisation CD3e (anti-CD3e humain, OKT3 ; anti-CD3e murin, 145-2C11) entraîne également une mort massive des cellules leucémiques en induisant un programme d'expression génique et de phosphoproteomique ressemblant à la sélection négative thymique. In vitro dans des LAL-T primaires, la stimulation du complexe CD3/TCR par un anticorps anti-CD3 entraîne la mort cellulaire des LAL-T CD3/TCR+ et non des TCR/CD3- quelque soit leur mécanisme oncogénétique sous-jacent. Finalement, le traitement anti-CD3 in vivo empêche la leucémogenèse chez les souris transplantées avec des LAL-T murines et humaines. Ces données fournissent un fort rationnel en faveur d’une thérapie ciblée, basée sur le traitement anti-CD3 des LAL-T matures CD3/TCR+. Ce travail démontre aussi que des étapes-clés du développement (comme la sélection négative) peuvent être des cibles thérapeutiques et sont actionnables malgré l’accumulation d’altérations géniques et épigénétiques dans les cellules cancéreuses. Par ailleurs, j’ai étudié la fréquence et l’impact pronostique des anomalies de la signalisation du TCR/pré-TCR dans une grande série protocolaire de LAL-T de l’adulte (GRAALL-2003 et -2005). Les voies de prolifération RAS/MAPK et PI3K/PTEN/AKT participent à la signalisation du TCR/pré-TCR et ont été rapportées comme dérégulées dans des séries de LAL-T pédiatriques. Dans notre série, j’ai identifié des délétions/mutations perte de fonction de PTEN (12 %) ou des mutations activatrices de KRAS/N-RAS (11%) montrant que les anomalies du pré-TCR/TCR sont fréquentes dans les LAL-T puisqu’elles sont retrouvées dans 23% des cas. Les anomalies de RAS/PTEN sont associées à un pronostic défavorable. Leur impact pronostique en fonction du statut mutationnel NOTCH1/FBXW7 (N/F) a également été étudié et montre que les anomalies de RAS/PTEN abrogent le bon pronostic des mutations N/F. Ce travail permet de proposer une classification oncogénétique basée sur les anomalies de N/F et RAS/PTEN. Cette classification définit les patients de bas risque comme ceux ayant N/F muté mais sans anomalie de RAS et PTEN (51 %) et les hauts risques qui regroupent tous les autres patients (49 %). Cette classification oncogénétique est dorénavant utilisée dans le nouveau protocole GRAALL-2014 des LAL-T de l’adulte. / T-cell acute lymphoblastic leukemias (T-ALL) are rare lymphoid neoplasms characterized by the proliferation of T lymphoblasts arrested at specific stages of maturation. Leukemic transformation of maturating thymocytes is caused by a multistep pathogenesis involving numerous genetic abnormalities that drive normal T cells into uncontrolled cell growth and clonal expansion. Depending on immunogenetic, T-ALLs are classified in 3 groups: immature, cortical (blocked around b-selection) and mature (CD3/TCR+) T-ALL. My work was to determine if activation and TCR signalling are involved in the biology of this disease. We demonstrate in T-ALL that, irrespective of the complex oncogenic abnormalities underlying tumor progression, experimentally induced, persistent TCR signalling has anti-leukemic properties and enforces a molecular and phosphoproteomic program resembling thymic negative selection, a major developmental event in normal T cell development. Using mouse models of T-ALL, we show that induction of TCR signalling by high affinity self-peptide/MHC or treatment with monoclonal antibodies to the CD3e chain (anti-CD3) causes massive leukemic cell death. Importantly, anti-CD3 treatment hampered leukemogenesis in mice transplanted with either mouse or patient-derived T-ALLs. These data provide a strong rationale for targeted therapy based on anti-CD3 treatment of TCR-expressing T-ALL patients and demonstrate that endogenous developmental checkpoint pathways are amenable to therapeutic intervention in cancer cells. Besides, I studied frequency and prognostic impact of anomalies concerning pre-TCR/TCR signalling in a large cohort of adult T-ALL included in GRAALL trials. RAS/MAPK and PI3K/PTEN/AKT pathways are involved in pre-TCR/TCR signalling and are reported as deregulated in pediatric T-ALL. I identified deletion/mutation loss-of-function of PTEN (12%) and activating mutations of KRAS/N-RAS (11%) in 23% of patients. These anomalies predict poor outcome and abrogate the good prognosis of NOTCH1/FBXW7 mutations. We proposed a purely genetic stratification of patients based on N/F/RAS/PTEN status, identifying low-risk patients (51%) with N/F mutations without RAS/PTEN anomalies and high-risk patients (49%) composed by the remaining cohort. This stratification will be used for the next protocol of adult-T-ALL.

INTRODUCTION Des réponses thérapeutiques variables aux glucocorticoïdes (GCs) sont observées parmi les patients atteints de la leucémie lymphoblastique aiguë (LLA). Les protéines Bax et Bim ont déjà montré un rôle important dans l’apoptose des cellules leucémiques. L’expression de Bax était plus basse chez les patients leucémiques résistants au médicament, de même une sensibilité diminuée aux GCs a été associée avec une expression réduite de Bim. La différence dans l’expression pourrait être due à des polymorphismes présents dans ces gènes et donc être associés avec la résistance aux GCs. MÉTHODE Dix-huit polymorphismes en régions régulatrices, 2 polymorphismes exoniques et 7 polymorphismes en région 3’UTR de ces gènes ont été analysés chez les témoins (n=50) et ont permis de déterminer un nombre minimal de polymorphismes suffisants pour définir les haplotypes (tagSNPs). Ces 8 polymorphismes ont ensuite été génotypés chez 286 enfants atteints de la LLA et ont été testés pour l’issue de la maladie par l’analyse de survie. RÉSULTATS Une survie sans évènement et une survie sans rechute diminuées ont été observées pour l’haplotype 3 (p=0,03 et p=0,02). Une survie globale diminuée a été associée avec l’homozygotie pour l’allèle exonique T298C>T (p=0,03), de même que pour les haplotypes 1 et 4 (p=0,04 et p=0,02) du gène Bim. CONCLUSION Les polymorphismes ont été associés avec une survie diminuée chez des enfants atteints de LLA. Il reste à tester d’autres polymorphismes présents dans ces deux gènes ainsi qu’à définir leurs fonctions afin de comprendre leurs rôles dans la réponse aux GCs. / INTRODUCTION Variable therapeutic responses to glucocorticoids (GCs) are observed for acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. Proteins Bax and Bim have already shown to play a major role in mediating GC-induced apoptosis in leukemia cells. Bax expression was lower in drug-resistant leukemia samples; likewise lower sensitivity to GC was associated with reduced Bim expression. The difference in the expression can be due to polymorphisms in these genes and therefore associated to GC resistance. METHOD Eighteen polymorphisms in the regulatory region, two exonic polymorphisms and seven polymorphisms in 3’UTR of these genes were analysed in controls (n=50) and have permitted to determine a minimal number of polymorphisms sufficient to define haplotypes (tagSNPs). These 8 single nucleotide polymorphisms (SNPs) were then genotyped in 286 LLA children and were tested for disease outcome by survival analysis. RESULTS A diminished event free survival and a diminished relapse free survival were observed for haplotype 3 (p=0,03 and p=0,02). A diminished overall survival was associated with the exonic T298C>T allele (p=0,03) and with haplotypes 1 and 4 (p=004 and p=0,02) of Bim gene. CONCLUSION Bax and Bim were associated with a diminished survival in LLA children. We still have to test other polymorphisms located in these genes and to define their functions in order to understand their roles in GC response.

Nous avons investigué la relation entre les polymorphismes de nucléotides simples (SNPs) chez trois gènes/loci candidats : DARC, CXCL2 et le loci ORMDL3-GSDMA-CSF3 situés sur le chromosome 17q21 et les complications neutropéniques et infectieuses qui en résultent durant la chimiothérapie chez les patients atteints de la leucémie lymphoblastique aigue. Ces loci codent pour certaines composantes du système immunitaire altérant la concentration de chémokines et leur distribution (DARC), stimulant le relâchement et la migration des neutophiles de la moelle épinière (CXCL2) et régulant la prolifération et la survie des granulocytes (G-CSF). Il est possible que des polymorphismes dans ces loci lorsqu’associés à de la chimiothérapie puissent mettre des individus suceptibles à un risque plus élevé de complication reliées à la chimiothérapie. Une sélection des marqueurs SNPs dans ces gènes ont été génotypés chez des enfants traités au CHU Ste-Justine pour une ALL entre 1989 et 2005. Après correction pour tests multiples, un polymorphisme DARC rs3027012 situé dans le 5’UTR a été associé à un compte phagocytaire peu élevé (APC<500 et <1000 cellules/µL, p=0.001 and p=0.0005, respectivement) ainsi qu’une hospitalisation due à une neutropénie (p=0.007) ou due à une infection et/ou neutropénie (p=0.007). Un effet protecteur a été identifié pour la mutation non sense Gly42Asp variant rs12075 (p=0.006). Des polymorphismes sur le chromosome 17q2 étaient associés à une hospitalisation due à une infection (rs3859192, p= 0.004) et à une neutropénie (rs17609240, p=0.006) L’infection était aussi modulée par CXCL2 (rs16850408, p=0.008) Cette étude identifie pour la première fois que les loci modulant le décompte des leucocytes et des neutrophiles pourraient jouer un rôle dans de déclenchement de complications dues à la chimiothérapie et pourraient ainsi servir de marqueurs pour un ajustement et un suivi du traitement. / We investigated the relationship between single nucleotide polymorphisms (SNPs) in 3 candidate genes/chromosomal loci: DARC, CXCL2 and ORMDL3-GSDMA-CSF3 locus on chromosome 17q21, and neutropenic and infectious complications during chemotherapy in pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) patients. These loci encode the components of immune system altering chemokine concentration and distribution (DARC), stimulating neutrophil release from bone marrow and migration (CXCL2) and regulating granulocyte proliferation and survival (G-CSF). It is possible that polymorphisms of these loci when associated with chemotherapy may put susceptible individuals at higher risk of chemotherapy complications. Selected tag SNPs in these genes are genotyped in children treated at the CHU Sainte-Justine for (ALL) between 1989 and 2005. After correction for multiple testing, DARC polymorphism rs3027012 in 5’UTR was associated with low absolute phagocyte count (APC<500 and <1000 cells/µL, p=0.001 and p=0.0005, respectively) and hospitalisation due to febrile neutropenia (p=0.007) or due to infection and/or febrile neutropenia (p=0.007). A protective effect was instead noted for missense Gly42Asp variant rs12075 (p=0.006). The polymorphisms on chromosome 17q2 were associated with hospitalisation due to infection (rs3859192, p= 0.004) and neutropenia (rs17609240, p=0.006). Infection was also modulated by CXCL2 (rs16850408, p=0.008) This study identifies for the first time that the loci modulating white blood cell and neutrophil count may play a role in the onset of chemotherapy complications and may thus serve as markers for adjustment or follow-up of the treatment.

Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes causées par la prolifération de cellules immatures T bloquées à un stade donné de leur différenciation. Leur oncogenèse est multigénique. Une anomalie de type A (à l’origine du blocage de différenciation) ainsi que des anomalies de type B (gains de fonctions de type prolifération, métabolisme, résistance à l’apoptose…) sont souvent retrouvées chez le même patient. Ces leucémies reproduisent individuellement les différentes étapes de la maturation thymique humaine. En fonction de l’immunogénétique (phénotype et réarrangement des loci des TCR), 3 groupes de LAL-T sont ainsi identifiables : les LAL-T immatures (correspondant aux formes non T-restreintes), les LAL-T corticales (bloquées autour de la b-sélection) et les LAL-T matures TCR/CD3+. Mon travail de thèse a consisté à déterminer à quel point l’activation et la signalisation du TCR pouvaient être impliquées dans la biologie de cette hémopathie. Nous avons utilisé le modèle transgénique Marilyn TCR-HY et montré in vitro (lignée TLX+) et in vivo (modèle de leucémogénèse TEL-JAK2) que l’activation du TCR par la reconnaissance de son peptide spécifique (DBY, peptide présent uniquement dans les souris mâles) empêche le développement et le maintien de la leucémie. L'induction de la signalisation du TCR par des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne de signalisation CD3e (anti-CD3e humain, OKT3 ; anti-CD3e murin, 145-2C11) entraîne également une mort massive des cellules leucémiques en induisant un programme d'expression génique et de phosphoproteomique ressemblant à la sélection négative thymique. In vitro dans des LAL-T primaires, la stimulation du complexe CD3/TCR par un anticorps anti-CD3 entraîne la mort cellulaire des LAL-T CD3/TCR+ et non des TCR/CD3- quelque soit leur mécanisme oncogénétique sous-jacent. Finalement, le traitement anti-CD3 in vivo empêche la leucémogenèse chez les souris transplantées avec des LAL-T murines et humaines. Ces données fournissent un fort rationnel en faveur d’une thérapie ciblée, basée sur le traitement anti-CD3 des LAL-T matures CD3/TCR+. Ce travail démontre aussi que des étapes-clés du développement (comme la sélection négative) peuvent être des cibles thérapeutiques et sont actionnables malgré l’accumulation d’altérations géniques et épigénétiques dans les cellules cancéreuses. Par ailleurs, j’ai étudié la fréquence et l’impact pronostique des anomalies de la signalisation du TCR/pré-TCR dans une grande série protocolaire de LAL-T de l’adulte (GRAALL-2003 et -2005). Les voies de prolifération RAS/MAPK et PI3K/PTEN/AKT participent à la signalisation du TCR/pré-TCR et ont été rapportées comme dérégulées dans des séries de LAL-T pédiatriques. Dans notre série, j’ai identifié des délétions/mutations perte de fonction de PTEN (12 %) ou des mutations activatrices de KRAS/N-RAS (11%) montrant que les anomalies du pré-TCR/TCR sont fréquentes dans les LAL-T puisqu’elles sont retrouvées dans 23% des cas. Les anomalies de RAS/PTEN sont associées à un pronostic défavorable. Leur impact pronostique en fonction du statut mutationnel NOTCH1/FBXW7 (N/F) a également été étudié et montre que les anomalies de RAS/PTEN abrogent le bon pronostic des mutations N/F. Ce travail permet de proposer une classification oncogénétique basée sur les anomalies de N/F et RAS/PTEN. Cette classification définit les patients de bas risque comme ceux ayant N/F muté mais sans anomalie de RAS et PTEN (51 %) et les hauts risques qui regroupent tous les autres patients (49 %). Cette classification oncogénétique est dorénavant utilisée dans le nouveau protocole GRAALL-2014 des LAL-T de l’adulte. / T-cell acute lymphoblastic leukemias (T-ALL) are rare lymphoid neoplasms characterized by the proliferation of T lymphoblasts arrested at specific stages of maturation. Leukemic transformation of maturating thymocytes is caused by a multistep pathogenesis involving numerous genetic abnormalities that drive normal T cells into uncontrolled cell growth and clonal expansion. Depending on immunogenetic, T-ALLs are classified in 3 groups: immature, cortical (blocked around b-selection) and mature (CD3/TCR+) T-ALL. My work was to determine if activation and TCR signalling are involved in the biology of this disease. We demonstrate in T-ALL that, irrespective of the complex oncogenic abnormalities underlying tumor progression, experimentally induced, persistent TCR signalling has anti-leukemic properties and enforces a molecular and phosphoproteomic program resembling thymic negative selection, a major developmental event in normal T cell development. Using mouse models of T-ALL, we show that induction of TCR signalling by high affinity self-peptide/MHC or treatment with monoclonal antibodies to the CD3e chain (anti-CD3) causes massive leukemic cell death. Importantly, anti-CD3 treatment hampered leukemogenesis in mice transplanted with either mouse or patient-derived T-ALLs. These data provide a strong rationale for targeted therapy based on anti-CD3 treatment of TCR-expressing T-ALL patients and demonstrate that endogenous developmental checkpoint pathways are amenable to therapeutic intervention in cancer cells. Besides, I studied frequency and prognostic impact of anomalies concerning pre-TCR/TCR signalling in a large cohort of adult T-ALL included in GRAALL trials. RAS/MAPK and PI3K/PTEN/AKT pathways are involved in pre-TCR/TCR signalling and are reported as deregulated in pediatric T-ALL. I identified deletion/mutation loss-of-function of PTEN (12%) and activating mutations of KRAS/N-RAS (11%) in 23% of patients. These anomalies predict poor outcome and abrogate the good prognosis of NOTCH1/FBXW7 mutations. We proposed a purely genetic stratification of patients based on N/F/RAS/PTEN status, identifying low-risk patients (51%) with N/F mutations without RAS/PTEN anomalies and high-risk patients (49%) composed by the remaining cohort. This stratification will be used for the next protocol of adult-T-ALL.

Les Leucémies Aigues Lymphoblastiques T (LAL-T) sont des hémopathies malignes causées par la prolifération de cellules immatures T bloquées à un stade donné de leur différenciation. Leur oncogenèse est multigénique. Une anomalie de type A (à l’origine du blocage de différenciation) ainsi que des anomalies de type B (gains de fonctions de type prolifération, métabolisme, résistance à l’apoptose…) sont souvent retrouvées chez le même patient. Ces leucémies reproduisent individuellement les différentes étapes de la maturation thymique humaine. En fonction de l’immunogénétique (phénotype et réarrangement des loci des TCR), 3 groupes de LAL-T sont ainsi identifiables : les LAL-T immatures (correspondant aux formes non T-restreintes), les LAL-T corticales (bloquées autour de la b-sélection) et les LAL-T matures TCR/CD3+. Mon travail de thèse a consisté à déterminer à quel point l’activation et la signalisation du TCR pouvaient être impliquées dans la biologie de cette hémopathie. Nous avons utilisé le modèle transgénique Marilyn TCR-HY et montré in vitro (lignée TLX+) et in vivo (modèle de leucémogénèse TEL-JAK2) que l’activation du TCR par la reconnaissance de son peptide spécifique (DBY, peptide présent uniquement dans les souris mâles) empêche le développement et le maintien de la leucémie. L'induction de la signalisation du TCR par des anticorps monoclonaux dirigés contre la chaîne de signalisation CD3e (anti-CD3e humain, OKT3 ; anti-CD3e murin, 145-2C11) entraîne également une mort massive des cellules leucémiques en induisant un programme d'expression génique et de phosphoproteomique ressemblant à la sélection négative thymique. In vitro dans des LAL-T primaires, la stimulation du complexe CD3/TCR par un anticorps anti-CD3 entraîne la mort cellulaire des LAL-T CD3/TCR+ et non des TCR/CD3- quelque soit leur mécanisme oncogénétique sous-jacent. Finalement, le traitement anti-CD3 in vivo empêche la leucémogenèse chez les souris transplantées avec des LAL-T murines et humaines. Ces données fournissent un fort rationnel en faveur d’une thérapie ciblée, basée sur le traitement anti-CD3 des LAL-T matures CD3/TCR+. Ce travail démontre aussi que des étapes-clés du développement (comme la sélection négative) peuvent être des cibles thérapeutiques et sont actionnables malgré l’accumulation d’altérations géniques et épigénétiques dans les cellules cancéreuses. Par ailleurs, j’ai étudié la fréquence et l’impact pronostique des anomalies de la signalisation du TCR/pré-TCR dans une grande série protocolaire de LAL-T de l’adulte (GRAALL-2003 et -2005). Les voies de prolifération RAS/MAPK et PI3K/PTEN/AKT participent à la signalisation du TCR/pré-TCR et ont été rapportées comme dérégulées dans des séries de LAL-T pédiatriques. Dans notre série, j’ai identifié des délétions/mutations perte de fonction de PTEN (12 %) ou des mutations activatrices de KRAS/N-RAS (11%) montrant que les anomalies du pré-TCR/TCR sont fréquentes dans les LAL-T puisqu’elles sont retrouvées dans 23% des cas. Les anomalies de RAS/PTEN sont associées à un pronostic défavorable. Leur impact pronostique en fonction du statut mutationnel NOTCH1/FBXW7 (N/F) a également été étudié et montre que les anomalies de RAS/PTEN abrogent le bon pronostic des mutations N/F. Ce travail permet de proposer une classification oncogénétique basée sur les anomalies de N/F et RAS/PTEN. Cette classification définit les patients de bas risque comme ceux ayant N/F muté mais sans anomalie de RAS et PTEN (51 %) et les hauts risques qui regroupent tous les autres patients (49 %). Cette classification oncogénétique est dorénavant utilisée dans le nouveau protocole GRAALL-2014 des LAL-T de l’adulte. / T-cell acute lymphoblastic leukemias (T-ALL) are rare lymphoid neoplasms characterized by the proliferation of T lymphoblasts arrested at specific stages of maturation. Leukemic transformation of maturating thymocytes is caused by a multistep pathogenesis involving numerous genetic abnormalities that drive normal T cells into uncontrolled cell growth and clonal expansion. Depending on immunogenetic, T-ALLs are classified in 3 groups: immature, cortical (blocked around b-selection) and mature (CD3/TCR+) T-ALL. My work was to determine if activation and TCR signalling are involved in the biology of this disease. We demonstrate in T-ALL that, irrespective of the complex oncogenic abnormalities underlying tumor progression, experimentally induced, persistent TCR signalling has anti-leukemic properties and enforces a molecular and phosphoproteomic program resembling thymic negative selection, a major developmental event in normal T cell development. Using mouse models of T-ALL, we show that induction of TCR signalling by high affinity self-peptide/MHC or treatment with monoclonal antibodies to the CD3e chain (anti-CD3) causes massive leukemic cell death. Importantly, anti-CD3 treatment hampered leukemogenesis in mice transplanted with either mouse or patient-derived T-ALLs. These data provide a strong rationale for targeted therapy based on anti-CD3 treatment of TCR-expressing T-ALL patients and demonstrate that endogenous developmental checkpoint pathways are amenable to therapeutic intervention in cancer cells. Besides, I studied frequency and prognostic impact of anomalies concerning pre-TCR/TCR signalling in a large cohort of adult T-ALL included in GRAALL trials. RAS/MAPK and PI3K/PTEN/AKT pathways are involved in pre-TCR/TCR signalling and are reported as deregulated in pediatric T-ALL. I identified deletion/mutation loss-of-function of PTEN (12%) and activating mutations of KRAS/N-RAS (11%) in 23% of patients. These anomalies predict poor outcome and abrogate the good prognosis of NOTCH1/FBXW7 mutations. We proposed a purely genetic stratification of patients based on N/F/RAS/PTEN status, identifying low-risk patients (51%) with N/F mutations without RAS/PTEN anomalies and high-risk patients (49%) composed by the remaining cohort. This stratification will be used for the next protocol of adult-T-ALL.