Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2007. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 88-106).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2006. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 91-98).

Orientador: Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T20:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Farias_AlessandrodosSantos_D.pdf: 4349733 bytes, checksum: 319c7b608b0ec53ed2bab3d2bbb43a23 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A Esclerose múltipla (EM) é a mais comum doença neurológica crônica que acomete adultos jovens. Apesar da etiologia da EM ser desconhecida, está bem descrito que a doença é resultante da combinação de uma pré-disposição genética associada a fatores ambientas. Nos últimos anos, tem sido evidenciada a hipótese da participação da vitamina D na evolução da EM e do modelo experimental, a encefalomielite experimental auto-imune (EAE). No presente estudo, fomos capazes de mostrar que a administração da vitamina D3 in vivo na EAE, assim como a transferência de células dendríticas tolerogênicas, induzidas pela vitamina D3 in vitro, aumentam significativamente a porcentagem das células reguladoras CD4+CD25+Foxp3+ e a expressão de IL-10 nos linfonodos, resultando na redução dos sinais clínicos nesses animais. Simultaneamente, há uma diminuição do numero de células nos infiltrados inflamatórios no sistema nervoso central, acompanhada da diminuição das citocinas proinflamatórias como a IL-17A, IFN'gama' e TNF'alfa'. Ainda, os animais tratados apresentam uma maior quantidade de IL-10 e TGF'beta'1 liberados no soro, quando comparados aos animais não tratados. Esses mecanismos contribuem ativamente para a criação de um microambiente no linfonodo que é capaz de suprimir a ativação das células auto-reativas, diminuindo a resposta inflamatória no sistema nervoso central. Ainda, fomos capazes de demonstrar que a maioria das mudanças neurológicas que acontece durante a fase aguda da EAE desaparecem quando a resposta inflamatória é controlada. No presente estudo avaliamos a expressão diferencial de proteínas no SNC em diferentes fases da EAE. Nossos resultados demonstram que várias proteínas estão diferencialmente expressas na fase aguda da doença em comparação aos animais naive como: as proteases e proteínas estruturais e metabólicas, que estão envolvidas na neurodegeneração. Essas alterações retornam aos níveis normais durante a fase de remissão da doença / Abstract: A growing body of evidence supports the hypothesis that vitamin D is an environmental factor important in the etiology of T-cell-mediated autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS). In the present study, evidence is provided that the in vivo administration of vitamin D3, as well as the adoptive transfer of vitamin D3-induced immature/tolerogenic dendritic cells lead to a significant increase of the percentage of CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells in the lymph nodes but, not in the blood or spleen, in the rat model of MS, the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). Simultaneously with the increase of this cell population the treatment with Vitamin D3 induced is a significant decrease in the number of auto-reactive T cells in the central nervous system, as well as the reduction of the expression of pro-inflammatory cytokines. Moreover, the treatment increases the level of IL-10 and TGF'beta'1 in the serum and in the lymph nodes. The adoptive transfer of vitamin D3-induced DC also induces a significant increase in the expression of IL-10 in the lymph nodes, with no change in the expression of TGF'beta'1. These mechanisms contribute actively to the generation of a microenvironment in the lymph nodes that suppress the activation of encephalitogenic T cells, which result in the downregulation of the inflammatory response in the central nervous system. Moreover, we provide evidence that most of neurological changes that take place during the clinical phase of EAE disappear when inflammatory response is controlled. We have identified protein expression in different phase of the EAE. The result demonstrated various proteins which are regulated during the acute phase of the disease, such as some enzymes and proteins from the neurodegenerative process, return to normal levels in the remission phase of the disease / Doutorado / Ciencias Basicas / Doutor em Clínica Médica

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Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karolinska institutet, 2010.

Introdução: Os linfócitos T regulatórios CD4+CD25+Foxp3+ (Tregs) desempenham um papel fundamental na manutenção da tolerância aos antígenos próprios e no controle da magnitude da resposta imunológica. Alterações quantitativas ou funcionais foram descritas em diversos distúbios auto-imunes. O pênfigo foliáceo endêmico (PFE) é uma doença bolhosa cutânea de natureza auto-imune, que compartilha características clínicas e imunopatológicas com o pênfigo foliáceo clássico, mas apresenta achados epidemiológicos próprios. Auto-anticorpos circulantes e teciduais da classe IgG dirigidos contra caderinas desmossômicas (desmogleína 1), levam à perda de adesão entre os queratinócitos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar se a perda de tolerância é associada com alterações quantitativas nos linfócitos Tregs CD4+CD25+Foxp3+ na pele de pacientes com PFE. Métodos: Amostras de pele de 22 pacientes e 10 controles saudáveis foram submetidos à análise imunoistoquímica com anti-CD4, anti-CD25 e anti-Foxp3. Fotomicrografias foram obtidas de campos consecutivos ao longo de toda epiderme e derme. A seguir, foi realizada quantificação dos linfócitos Foxp3+, CD4+, CD25+, CD4+Foxp3+ e CD25+Foxp3+ em cada compartimento, considerando-se a respectiva área de cada campo (m2). Valores significantemente estatísticos foram considerados como p<0,05. Resultados: Encontramos um infiltrado epidérmico aumentado de linfócitos imunomarcados CD25+(p=0,003), Foxp3+(p=0,04) e CD25+Foxp3+ (p=0,007), em comparação com os controles. O infiltrado dérmico exibiu uma maior expressão de linfócitos CD4+ (p<0,001) e CD25+ (p=0,008) em amostras de pele de pacientes com PFE, quando comparados aos controles. Conclusões: Nossos achados sugerem que a quebra de tolerância imunológica periférica nos pacientes com PFE não se correlaciona com uma diminuição dos linfócitos T reg CD4+CD25+Foxp3+ na pele afetada. Entretanto, uma maior expressão de linfócitos CD25+Foxp3+ no infiltrado epidérmico poderia representar outra população de linfócitos com atividade regulatória, a ser definida. / Background: CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) play a crucial role in the maintenance of self tolerance and control of the magnitude of the immune response. Their quantitative or functional impairment has been reported in several autoimmune disorders. Endemic pemphigus foliaceus (EPF) is an autoimmune organ-specific blistering skin disorder that shares many clinical and immunopathological features with classic pemphigus foliaceus, but with unique epidemiological features. Circulating and tissue-bound IgG auto-antibodies react against desmosomal cadherins (desmoglein 1), causing loss of adhesion between keratinocytes. Aims: The purpose of this study was to evaluate whether the loss of tolerance is associated with impairment of CD4+CD25+Foxp3+ Tregs in the skin of EPF patients. Methods: Skin samples from 22 patients and 10 controls were submitted to immunohistochemistry with anti-CD4, CD25 and Foxp3. Photomicrographs were obtained from consecutive fields along epidermis and dermis; quantification of Foxp3+, CD4+, CD25+, CD4+Foxp3+ and CD25+Foxp3+ cells were performed in each compartment, taking into account the respective field area (m2). Significance was set at p<0.05. Results: We found an enhanced epidermal infiltrate of CD25+(p=0.003), Foxp3+(p=0.04) and CD25+Foxp3+(p=0.007) immunostained T cells in EPF patients, when compared to controls. Dermal infiltrate exhibited a higher expression of CD4+ (p<0.001) and CD25 p=0.008) T cells in EPF skin samples than in controls. Conclusions: Our findings suggest that the break of peripheral immunologic tolerance in EPF patients did not correlate with an impairment of CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells present in the affected skin. However, higher expression of CD25+Foxp3+ cells in the epidermal infiltrate could be a counterpart of a diverse population of T cells, previously described as exerting a regulatory activity, yet to be defined

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2007. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 122-140).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2007. / Vita. Includes bibliographical references (p. 133-145).

Introdução: Os linfócitos T regulatórios CD4+CD25+Foxp3+ (Tregs) desempenham um papel fundamental na manutenção da tolerância aos antígenos próprios e no controle da magnitude da resposta imunológica. Alterações quantitativas ou funcionais foram descritas em diversos distúbios auto-imunes. O pênfigo foliáceo endêmico (PFE) é uma doença bolhosa cutânea de natureza auto-imune, que compartilha características clínicas e imunopatológicas com o pênfigo foliáceo clássico, mas apresenta achados epidemiológicos próprios. Auto-anticorpos circulantes e teciduais da classe IgG dirigidos contra caderinas desmossômicas (desmogleína 1), levam à perda de adesão entre os queratinócitos. Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar se a perda de tolerância é associada com alterações quantitativas nos linfócitos Tregs CD4+CD25+Foxp3+ na pele de pacientes com PFE. Métodos: Amostras de pele de 22 pacientes e 10 controles saudáveis foram submetidos à análise imunoistoquímica com anti-CD4, anti-CD25 e anti-Foxp3. Fotomicrografias foram obtidas de campos consecutivos ao longo de toda epiderme e derme. A seguir, foi realizada quantificação dos linfócitos Foxp3+, CD4+, CD25+, CD4+Foxp3+ e CD25+Foxp3+ em cada compartimento, considerando-se a respectiva área de cada campo (m2). Valores significantemente estatísticos foram considerados como p<0,05. Resultados: Encontramos um infiltrado epidérmico aumentado de linfócitos imunomarcados CD25+(p=0,003), Foxp3+(p=0,04) e CD25+Foxp3+ (p=0,007), em comparação com os controles. O infiltrado dérmico exibiu uma maior expressão de linfócitos CD4+ (p<0,001) e CD25+ (p=0,008) em amostras de pele de pacientes com PFE, quando comparados aos controles. Conclusões: Nossos achados sugerem que a quebra de tolerância imunológica periférica nos pacientes com PFE não se correlaciona com uma diminuição dos linfócitos T reg CD4+CD25+Foxp3+ na pele afetada. Entretanto, uma maior expressão de linfócitos CD25+Foxp3+ no infiltrado epidérmico poderia representar outra população de linfócitos com atividade regulatória, a ser definida. / Background: CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) play a crucial role in the maintenance of self tolerance and control of the magnitude of the immune response. Their quantitative or functional impairment has been reported in several autoimmune disorders. Endemic pemphigus foliaceus (EPF) is an autoimmune organ-specific blistering skin disorder that shares many clinical and immunopathological features with classic pemphigus foliaceus, but with unique epidemiological features. Circulating and tissue-bound IgG auto-antibodies react against desmosomal cadherins (desmoglein 1), causing loss of adhesion between keratinocytes. Aims: The purpose of this study was to evaluate whether the loss of tolerance is associated with impairment of CD4+CD25+Foxp3+ Tregs in the skin of EPF patients. Methods: Skin samples from 22 patients and 10 controls were submitted to immunohistochemistry with anti-CD4, CD25 and Foxp3. Photomicrographs were obtained from consecutive fields along epidermis and dermis; quantification of Foxp3+, CD4+, CD25+, CD4+Foxp3+ and CD25+Foxp3+ cells were performed in each compartment, taking into account the respective field area (m2). Significance was set at p<0.05. Results: We found an enhanced epidermal infiltrate of CD25+(p=0.003), Foxp3+(p=0.04) and CD25+Foxp3+(p=0.007) immunostained T cells in EPF patients, when compared to controls. Dermal infiltrate exhibited a higher expression of CD4+ (p<0.001) and CD25 p=0.008) T cells in EPF skin samples than in controls. Conclusions: Our findings suggest that the break of peripheral immunologic tolerance in EPF patients did not correlate with an impairment of CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells present in the affected skin. However, higher expression of CD25+Foxp3+ cells in the epidermal infiltrate could be a counterpart of a diverse population of T cells, previously described as exerting a regulatory activity, yet to be defined

Introdução: A sepse é causada por uma resposta desregulada a uma infecção cujo tratamento é de suporte, inexistindo alternativas imunomoduladoras. Linfócitos T reguladores são responsáveis por limitar a inflamação, mas podem causar imunossupressão e os Th17 são pró-inflamatórios e responsáveis pela imunidade de mucosas; ambos apresentam-se elevados nos pacientes com sepse. A PARP é uma enzima sensor de dano ao DNA que é continuamente ativada na sepse, sendo importante também na diferenciação¸ dos linfócitos T reguladores e como coativador de NF-kB. Neste estudo, avaliamos se o tratamento com inibidor de PARP é capaz de manter os linfócitos Th17 e T reguladores próximos aos valores basais, impedindo que ocorra a resposta exacerbada causada por estas células e servindo, portanto, como opção de tratamento imunomodulador. Métodos: Camundongos machos da linhagem C57Bl/6 com 7 semanas de idade e pesando entre 20-25 gramas foram submetidos à ligadura e punção cecal e receberam tratamento com olaparibe (10mg/Kg) após 30 minutos e após 8 horas da cirurgia. Baço, timo e sangue foram coletados e utilizados para análise das populações de linfócitos T reguladores e Th17, citocinas e miRNAs. Resultados: O modelo de ligadura e punção cecal foi capaz de mimetizar a linfopenia encontrada em pacientes e o aumento de linfócitos T reguladores e Th17. O tratamento com olaparibe reduziu os linfócitos T reguladores no baço tanto em porcentagem quanto em quantidade de células. Tanto o nível de IL-10 quanto a expressão do miRNA 146a-5p caíram em ambos os grupos CLP, sugerindo menor atividade supressora destes linfócitos. No sangue houve aumento dos linfócitos T reguladores, mas apenas o grupo não tratado apresentou alta de IL-10, sugerindo que o tratamento conteve o perfil supressor. No timo o tratamento parece agir por uma forma diferente; embora ocorra aumento dos linfócitos T reguladores, o grupo tratado teve aumento da expressão do miRNA 17a-5p, que reduz a atividade supressora desses linfócitos, mostrando que as células produzidas tem sua atividade supressora alterada, o que é corroborado pelo não aumento de IL-10 nesse grupo. Os linfócitos Th17, que são pró-inflamatórios, foram controlados com o tratamento no baço e no sangue. Isso possivelmente ocorreu pela ação da PARP que impediu o aumento de citocinas como IL-1beta, IL-6, TNF-alfa, IL-17A, INF-y, que estavam elevadas apenas no grupo não tratado. Além disso, a relação entre linfócitos Th17 e T reguladores foi controlada, sugerindo melhora no desfecho clínico. Conclusões: O tratamento com olaparibe se mostrou eficiente em reduzir as respostas inflamatória (causada pelo Th17) e supressora (causada pelo Treg) neste modelo, talvez pela alteração de citocinas e da expressão dos miRNA 17a-5p e 146a-5p / Introduction: Sepsis is caused by a dysregulated response to an infection whose treatment is supportive, and there are no immunomodulatory alternatives. Regulatory T lymphocytes are responsible for limiting inflammation but may cause immunosuppression and Th17 are proinflammatory and responsible for mucosal immunity; both are elevated in patients with sepsis. PARP is a DNAdamaging enzyme that is continuously activated in sepsis, also important in the di_erentiation of regulatory T lymphocytes and as a cofactor of NF-kB. In this study, we evaluated whether treatment with PARP inhibitor is able to keep the T regulatory and Th17 lymphocytes close to the baseline values, preventing the exacerbated response caused by these cells and therefore serving as an option for immunomodulatory treatment. Methods: C57Bl male mice at 7 weeks of age weighing between 20-25 grams were submited at cecal binding and puncture and received treatment with olaparib (10mg/kg) after 30 minutes and after 8 hours of the surgery. Spleen, thymus and blood cells have been used for analysis of T regulatory and Th17 lymphocytes populations, cytokines and miRNA. Results: The cecal ligation and puncture model was able to mimic the lymphopenia found in patients and the increase of T regulatory and Th17 lymphocytes. Treatment with olaparib reduced the T regulatory lymphocytes in the spleen in both percentage and number of cells. Both the IL-10 level and the 146a-5p miRNA expression fell in both CLP groups, suggesting lower suppressor activity of these lymphocytes. In the blood there was an increase in the T regulatory lymphocytes, but only the untreated group showed high IL-10, suggesting that the treatment contained the suppressor profile. In the thymus the treatment seems to act in a di_erent way; although there is an increase in the T regulatory lymphocytes, the treated group had increased expression of 17a-5p miRNA, which reduces the suppressive activity of these lymphocytes, showing that the cells produced have their supressor activity altered, which is corroborated by the non-increase of IL- 10 in this group. Th17 lymphocytes, which are proinflammatory, were controlled with treatment in the spleen and blood. This was possibly due to the action of PARP which prevented the increase of cytokines such as IL-1beta, IL-6, TNF-alpha, IL-17A, INF-y which were raised only in the group not treated. In addition, the ratio between Th17 and T regulatory lymphocytes was controlled, suggesting improvement in clinical outcome. Conclusions: The treatment with olaparib was e_cient in reducing inflammatory responses (caused by Th17) and suppressor (caused by Treg) in this model, perhaps due to the alteration of cytokines and the expression of miRNAs 17a-5p and 146a-5p