La concentration des médicaments cationiques dans les compartiments acides de la cellule est bien connue. Nous avons tenté d'expliquer davantage certains aspects encore inconnus au sujet de cette réaction cellulaire. En premier lieu, nous avons étudié l'accumulation subcellulaire et in vivo d'un médicament cationique fluorescent, la quinacrine, dans un modèle murin. L'accumulation cellulaire de la quinacrine dans les fibroblastes dermiques de souris induisait une inhibition du flux autophagique, ainsi qu'une lysosomogénèse. L'administration de la quinacrine in vivo démontrait une distribution hétérogène et une augmentation autophagique et lysosomale dans les poumons. En deuxième lieu, l'effet cytostatique et cytotoxique d'une série de médicaments cationiques lysosomotropiques furent étudiés dans une série de lignées cellulaires. Une série de 6 triéthylamines substituées furent choisies afin d'étudier davantage l'effet cytostatique de l'ion trapping. L'accumulation du marqueur autophagique LC3 II, le marqueur apoptotique PARP1, la cytotoxicité, le cycle cellulaire et la fonction endocytose furent étudiés plus en détails dans la lignée tumorale U937. Chacun des médicaments cationiques démontrait un effet antiprolifératif significatif, mais aucun signe de cytotoxicité n'était observé à certains niveaux de concentrations. Un cotraitement avec les inhibiteurs de cholestérol, β-cyclodextrine et lovastatine, renversait partiellement l'effet antiprolifératif des amines. L'intensité de l'effet antiprolifératif induit par les médicaments cationiques est clairement prédite par leur puissance de l'inhibition du flux autophagique et par la liposolubilité. L'accumulation tissulaire de la quinacrine et l'effet cytostatique prédit par l'inhibition du flux autophagique et par la liposolubilité des amines substituées offre des possibilités d'application dans le domaine de l'oncologie et de la pharmacocinétique des nombreux médicaments concernés.

Chaque année, les compagnies novatrices mettent sur le marché des nouvelles molécules à visée thérapeutique, pour le bien-être de tous. Dans le développement de ces nouveaux médicaments, les études de métabolisme et l'évaluation des interactions médicamenteuses potentielles constituent une étape essentielle et requise pour l'approbation réglementaire. L'approche expérimentale est basée sur l'utilisation des modèles animaux et les données recueillies servent à la prédiction de la cinétique et de la toxicité chez l'humain. Plusieurs espèces, incluant la souris, le rat, le chien, le lapin, le porc et le singe, sont ainsi utilisées. Cependant, cette approche souffre de quelques limites, en particulier des différences inter-espèces au niveau des enzymes impliqués dans la biotransformation des médicaments chez l'humain, dont les cytochromes P450. De ce fait, il n'est pas rare d'utiliser plusieurs modèles animaux pour prédire la cinétique et la toxicité chez l'homme. Le cobaye (cavia porcellus), qui présente plusieurs avantages au niveau de sa physiologie, pourrait ainsi constituer un modèle animal de plus pour ces études. L'objectif de cette étude est donc de caractériser la sous-famille des cytochromes P450 2C, le transporteur membranaire MDRl/P-gp ainsi que les récepteurs nucléaires PXR et CAR chez le cobaye. Cette étude s'inscrit dans un effort de fournir des données fondamentales afin de supporter l'utilisation de cet animal comme modèle de métabolisme des médicaments. Pour ce faire, les séquences des gènes codant pour ces protéines ont été déterminées par des techniques de biologie moléculaire. L'immunobuvardage de type Western a permis de démontrer l'expression des protéines CYP2C, P-gp/MDRl et PXR. Des études fonctionnelles pour le CYP2C ont été réalisées par l'incubation de microsomes hépatiques de cobaye avec le diclofenac et le tolbutamide, deux substrats du CYP2C9 chez l'homme, en présence des inhibiteurs spécifiques au CYP2C9 ; le sulfaphénazole, l'acide tiénilique et le fluconazole, et au CYP3A4; le kétoconazole. Ces études ont démontré la formation de 4'-hydroxydiclofénac et de 4'-hydroxytolbutamide, deux metabolites du CYP2C9, et l'inhibition de ces réactions par l'acide tiénilique seulement. Des études fonctionnelles de P-gp/MDRl ont été réalisées avec l'essai d'accumulation de calcéine-AM dans des cellules HEK293 transfectées avec le gène ABCB1/MDR1 de cobaye. Elles ont démontré une activité de transport à l'égard de ce substrat, et une inhibition par le verapamil, un inhibiteur de la P-gp. Les études de distribution de la P-gp/MDRl, par les techniques de PCR et d'immunobuvardage de type Western, ont démontré l'expression de cette protéine dans l'intestin, le foie, le poumon, le ventricule, l'oreillette, le cervelet, le lobe du cerveau et la glande surrénale du cobaye. Bref, ces résultats montrent que le cobaye exprime un enzyme fonctionnel de la sous-famille des cytochromes P450 2C, le transporteur membranaire P-gp/MDRl fonctionnel et les récepteurs nucléaires PXR et CAR. En se basant sur ces résultats et considérant l'importance de ces protéines dans la biotransformation des médicaments, il est raisonnable de postuler que cela renforce la pertinence d'utiliser cet animal comme modèle dans de telles études.

When considering oral administration, drug release from its pharmaceutical form and its dissolution into gastrointestinal fluids generally precedes absorption and systemic availability. The solubility-dissolution behaviour of a drug is frequently the rate-limiting step to absorption of drugs from the gastrointestinal tract (BCS class II drugs). Poor aqueous solubility has always been a very challenging obstacle as it is, together with membrane permeability, an essential factor in the limitation of a drug’s bioavailability following oral administration. Since an increasing number of newly developed drug candidates in pre-clinical development phases present poor water-solubility characteristics, there is a great need for formulation approaches to overcome this factor.<p><p>Out of the many ways to increase a product’s solubility/dissolution rate characteristics with the aim of enhancing its oral bioavailability, drug formulation as nanoparticles has received much-increased interest over the last decade. The hypothesis behind dissolution rate enhancement, considering drug particle size reduction to nanometer range, lies primarily in a much-increased effective surface area (Noyes-Whitney) presented by the resulting drug nanoparticles. Out of the various technologies available for drug particle size reduction to nanometer range, milling using high pressure homogenization is regarded as one of the simplest and most effective techniques. High pressure homogenization is a solvent-free process and is relatively rapid (time-saving). Furthermore, and most importantly, the scaling up of this technique is already established; processing capacities ranging from 3 l/h (e.g. EmulsiFlex C3®: minimum sample volume - 10 ml) to 1000 l/h (e.g. EmulsiFlex C1000®: minimum sample volume - 2 l).<p><p>Four model drugs were studied in this work. Nifedipine (NIF), an extensively studied poorly water-soluble drug in the literature, was used as the main model on which most of the development was done. In parallel to the work carried out on NIF, three UCB S.A. molecules currently under development were also studied as poorly water-soluble drugs: these being ucb-35440-3, UCB-A and UCB-B (salt of UCB-A). These three UCB S.A. model drugs are, contrarily to NIF, predicted highly dosed drugs and are weak bases, and thus present pH-dependent solubility profiles, which allowed us to investigate model drugs with different profiles.<p><p>Firstly, investigations regarding appropriate formulation development (stabilizer (surfactant) selection) and appropriate high pressure homogenization operating conditions (pre-milling cycles, influence of the number of high pressure homogenizing cycles, influence of homogenizing pressure, influence of sample temperature) were made. It has been shown, through this development, for the four studied model drugs, that high pressure homogenization is an appropriate technique for reducing drug particle size to nanometer range (NIF &61566; 290 nm, ucb-35440-3 &61566; 180 nm, UCB-A &61566; 350 nm and UCB-B &61566; 250 nm). Investigations regarding water-removal from the nanosuspensions obtained and most importantly regarding the redispersion characteristics of the retrieved powders (i.e. nanoparticles) were then carried out. In that regard, it has been shown that the presence of carriers in the formulation is essential for limiting nanoparticles agglomeration during the water-removal operation.<p><p>Drug crystalline state characterizations before and following particle size reduction were then carried out on the three studied model drugs, mainly through DSC and PXRD studies. In fact, one of the advantages of this particle size reduction approach (using high pressure homogenization), versus other frequently studied solubility/dissolution rate enhancement technologies (e.g. such as solid dispersions), is that original crystalline state shall not be altered in such a way that the achieved increased solubility and dissolution rate characteristics do not rely on the presence of the amorphous form of the drug; this furthermore implying a greater time-stability of the developed formulations. Through the data obtained, it has been shown that original drug crystalline state seems to be unaltered following particle size reduction.<p><p>In vitro solubility and dissolution characteristics were then evaluated on the formulations developed in order to verify the posed hypothesis regarding effective surface area increase. It has been shown through these studies that drug solubility and most importantly drug dissolution rate can be significantly enhanced for nanoparticulate systems (verified for NIF, ucb-35440-3, UCB-A and UCB-B). For example, solubility was enhanced from 26 µg/ml vs. 19.5 µg/ml for NIF nanoparticles and the dissolution characteristics showed that 100% of the tested dose (equivalent to 10 mg NIF) was already dissolved following 10 min vs. less than 5% for un-milled NIF. Following these very interesting and promising results, and preliminary to the in vivo pharmacokinetic studies carried out, in vitro permeation studies (apical to basolateral transfer studies) across intestinal cell models (Caco-2 and HT29-5M21 cultures and co-cultures) were carried out. This evaluation was only carried out using NIF as a model drug and showed a 6-fold increase in the permeation rate for NIF nanoparticles. The influence of chitosan (permeability enhancer/bioadhesive polymer) in the NIF nanoparticle formulation with regard to in vitro NIF permeation rate was also evaluated.<p><p>In vivo pharmacokinetic studies in rats were conducted using NIF and ucb-35440-3 as model drugs. The very different profiles of these two model drugs allowed us to retrieve interesting information regarding the in vivo behaviour of the developed formulations. As expected from the in vitro (i.e. solubility/dissolution/permeation) studies and results obtained for NIF, an increased extent of exposure could be observed for NIF nanoparticles versus un-milled NIF; the difference being more pronounced when the formulations were orally administered into capsules (2.5-fold increase in extent of exposure and 6-fold increase in Cmax). For ucb-35440-3, a poorly water-soluble weak base with a reported significant food effect considering oral bioavailability, an increased extent of exposure for nanoparticles, versus the un-milled drug, could only be observed in fasted state (4-fold increase in extent of exposure and 2.7-fold increase in Cmax). These different, diet-relative observations allowed us to put forward some limitations and precautions (considering poorly water-soluble weak bases) relative to the possibility of drug reprecipitation following stomach’s exiting, particularly if dissolution in the stomach is quite fast (e.g. nanoparticulate systems).<p><p>In parallel to the in vivo pharmacokinetic evaluation of NIF nanoparticles, evaluation of the antihypertensive effect of the systems developed following oral administration, using spontaneously hypertensive rats, was also carried out and compared to un-millled NIF. The results obtained showed a significant drop in systolic blood pressure for NIF nanoparticles (32% reduction of initial SBP following 30 min vs. 1% for un-milled NIF) and nicely complemented the in vitro and in vivo results obtained for NIF nanoparticles.<p><p>Finally, a stability study of the optimized NIF nanoparticle formulation was carried out with respect to reported ICH conditions (25°C/60% RH; 30°C/65% RH; 40°C/75% RH). The results showed that the studied NIF nanoparticle formulation retains all its original characteristics (dissolution, crystalline state, redispersion characteristics); this being verified over time (12 months) and for each of the three storage conditions studied.<p> / Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

La bio-transformation naturelle des médicaments peut produire des métabolites toxiques; l’identification de ces métabolites est essentielle dans la stratégie de choix de molécules thérapeutiques. En appliquant les technologies de fermentation en bioréacteur des cellules hétérologues (souches d’E. coli recombinantes exprimant une iso-enzyme de cytochrome P450 humain avec la réductase humain), la bioconversion du substrat (principe actif) en ses métabolites de dégradation, a été réalisée à grande échelle (& / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Parmi toutes les voies d’administration, la voie orale a toujours suscité un grand intérêt. Les formes prises par voie orale présentent une grande facilité d’administration pour le patient, tandis que pour les chercheurs, la physiologie du système gastro-intestinal peut être facilement modélisable. Malheureusement, son importante variabilité, liée principalement au temps de vidange gastrique, peut conduire à une mauvaise reproductibilité des effets thérapeutiques et à une diminution de la biodisponibilité. Ce problème est surtout rencontré dans le cas des principes actifs présentant une fenêtre d’absorption étroite au niveau de l’intestin supérieur [Deshpande et col. 1996]. Une solution a été de développer des formes galéniques à libération prolongée caractérisées par un temps de résidence gastrique accru. Ainsi, le principe actif est libéré progressivement en amont de sa fenêtre d’absorption. Dans cette optique, plusieurs systèmes ont été développés :des formes bioadhésives, expansibles, gonflantes ou à hautes densités [Singh et Kim, 2000]. Mais parmi toutes ces formes, ce sont les systèmes flottants qui semblent offrir la protection la plus efficace contre une vidange gastrique précoce [Moës, 1989]. Seth et Tossounian ont ainsi développé une gélule flottante à libération prolongée, basée sur le gonflement d’un dérivé cellulosique. Etant une forme monolithique, sa vidange gastrique était soumise au phénomène de tout ou rien. De plus, cette forme présentait un inconvénient majeur puisqu’elle était sujette à des fractionnements intra-gastriques, diminuant de ce fait la reproductibilité inter- et intra-individuelle [Seth et Tossounian, 1984]. <p>\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le thème principal de notre travail consistait en la mise en exergue de l'efficience de la mise en œuvre de techniques hybrides associant l’électrochimie à l’élément biologique (biocapteur) ou l’électrochimie aux performances de la spectrométrie de masse (couplage EC-MS). Les informations fournies, jointes aux résultats des mesures en voltampérométrie sur électrodes solides, permettent une bonne compréhension mécanistique quant au devenir oxydatif de substances médicamenteuses. <p>Notre champ d'investigation s'est plus spécifiquement focalisé sur deux familles de molécules psychotropes (les phénothiazines, et une dibenzoazépine). Celles-ci connaissent un usage thérapeutique intensif et un regain d’intérêt pour des applications nouvelles, mais leur utilisation optimale souffre de l’existence d'effets secondaires physiopathologiques importants et dont l’étiologie est encore mal connue. <p>En premier lieu, les résultats de la voltampérométrie cyclique et les différentes modulations en ligne d'une cellule électrochimique couplée à la détection par spectrométrie de masse, nous ont permis de mettre en évidence des différences essentielles dans le devenir des phénothiazines quant aux produits d'oxydations générés. Plus précisément, un comportement clairement distinct entre les phénothiazines garnies de deux (2C) ou trois carbones (3C) entre les deux azotes au niveau de leur chaîne latérale a pu être mis en évidence. Les phénothiazines 3C s'oxydent de manière classique en leur sulfoxyde correspondant. Par contre, les phenothiazines 2C, conjointement à la formation de leur sulfoxyde, souffrent dans des conditions énergiques d’oxydation (persulfate, potentiel élevé) d'une rupture de la chaîne latérale et libèrent la phénothiazine base aisément oxydable et donc subissant elle-même une oxydation. Au vu des structures moléculaires en trois dimensions, nous émettons l’hypothèse que volume trop important de la chaîne latérale des phénothiazines 2C empêcherait le déploiement aisé des structures aromatiques en un radical cation coplanaire lors du phénomène d'oxydation. Les tensions intrastructurelles apparues conduiraient au bris de la chaîne latérale. Différents modes d'oxydation (chimique, électrochimique, enzymatique) ont été utilisés et laissent chacun apparaître la dépendance directe entre la puissance de l'agent oxydant appliqué et les produits d'oxydation obtenus. Chaque technique de détection, de manière individuelle, a bien confirmé la dualité entre les deux groupes de molécules. La mise en commun des divers résultats nous a permis l'identification irrévocable des espèces intermédiaires instables et des composés finaux. Par corollaire, nous avons pu postuler un schéma général d'oxydation pour les dérivés phénothiaziniques. Il nous paraît intéressant de transposer nos résultats aux biotransformations des phénothiazines car les produits identifiés ne possèdent pas l'activité pharmacologique du composé parent mais présentent un profil toxicologique bien répertorié dans la littérature. Nos résultats suggèrent d’approfondir les études de biotransformation afin de déterminer si ‘l’éclatement’ oxydatif des phénothiazines 2C est également observé in vivo. Une relation cause/effet de ces métabolites pourrait ainsi être établie. <p>En deuxième point, au travers de l'association CE/SM ou CE/CL/SM, nous avons étudié l’électroxydation de la clozapine. La génération et l'identification des principaux métabolites de phases I et II, illustre un mimétisme certain avec le CYP450, et nous a permis de confirmer de nombreuses données de la littérature quant à l'oxydation in vivo et in vitro de la clozapine. L'oxydation électrochimique ne génère cependant pas l'ensemble des réactions de métabolisation prises en charge par le système CYP450. Lors de la combinaison CE/SM, par l'absence de séparation chromatographique dans cette configuration, le spectre de masse présente un pic correspondant à un intermédiaire à demi-vie courte, difficilement et rarement mis en évidence: l'ion nitrénium. Cette espèce hautement réactive envers les fonctions thiols des petites molécules et des protéines, se trouve très régulièrement tenue pour responsable majeur de la toxicité avérée de la clozapine. <p>L'apparition plus abondante de dérivés déméthylés démontre l'influence du potentiel appliqué à l'électrode de travail lors de l'oxydation électrochimique. En effet, les processus de déméthylation nécessitent des potentiels élevés pour être observés. En présence de glutathion, aux différents pics antérieurement identifiés, des pics supplémentaires relatifs à la formation d'adduits de GSH sur la CLZ apparaissent. Les courbes voltampérométriques réalisées sur la clozapine suggèrent la distinctement la formation de l'ion nitrénium et d'une nouvelle espèce aisément électroréduite, probablement une structure quinone imine. L'addition de GSH provoque la disparition des pics de réduction de la CLZ. Ces comportements en VC corroborent les interprétations issues des mesures par couplage EC/CL/SM. <p>La dernière partie de notre travail a consisté en la construction d'un biocapteur à pâte de carbone solide avec inclusion au sein de cette matrice de peroxydase de raifort. Basé sur la capacité reconnue de l'HRP à reproduire in vitro des produits d'oxydation similaires à la métabolisation in vivo, nous avons exploité un tel biocapteur pour l'analyse de la clozapine et de composés thiols. Une compréhension fine du mécanisme opérationnel intrinsèque du biocapteur a pu être suggérée. La génération à la surface de l'électrode de l'ion nitrénium par oxydation enzymatique de la clozapine par l'HRP, suivie de sa réduction immédiate fournit un courant ampérométrique substantiel. Sous des conditions de pH optimales, ce courant de réduction autorise la détermination quantitative de la clozapine dans un domaine de linéarité compris entre 1 x 10-5 M et 1 x 10-6 M. L'addition de composés thiols dans le milieu occasionne une chute de courant par action de ceux-ci sur la structure radical cation ou nitrénium par addition nucléophile. La disparition de l'ion nitrénium et la formation d'un adduit GSH-CLZ inhibent tout processus de réduction à l'électrode du biocapteur. Cette diminution de courant proportionnelle aux concentrations en thiols introduits, permet la détermination quantitative de dérivés thiols. Les courbes de calibration exprimées en pourcentage d'inhibition conduisent facilement à l'évaluation de la constante d'inhibition (Ki) et de CI50. L'étude de la réponse ampérométrique de la clozapine à l'EPC/HRP en l'absence ou présence d'un dérivé thiol envisagé permet la détermination de Km et de caractériser le type d'inhibition qui entre en jeu. De tels paramètres cinétiques nous ont habilités à classer les thiols considérés en fonction de leur puissance réactionnelle envers les substances oxydées de la clozapine.<p><p>Au terme de ce travail, nous espérons avoir illustré, par l’étude de quelques molécules modèles, l’intérêt de la mise en œuvre des techniques électrochimiques couplées à l’élément biologique ou à la spectrométrie de masse. Des améliorations au niveau de la cellule électrochimique sont envisageables par l’emploi d’électrodes modifiées, elles laissent entrevoir la possibilité de mimer totalement le système CYP450.<p>Les résultats fournis par ces techniques hybrides et par voltampérométrie cyclique sont complémentaires, ils procurent un éventail d'informations d'une utilité estimable pour une application dans des études prédictives précoces de candidats médicament. / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished