La première partie de la thèse était de définir et de valider une méthode d'extraction de cellules épidermiques la plus simple, la plus efficace et la plus applicable à des petits échantillons, et évitant les réactifs animaux. Dans cette étude, TrypLPM, une enzyme de dissociation cellulaire exempte d'origine animale, a remplacé la dispase et la trypsine comme enzyme destinée à l'extraction des mélanocytes. Ce produit pourrait simplifier le protocole d'extraction, éliminer les contaminants pathogènes potentiels de l'animal et diminuer la contamination par les kératinocytes pendant l'extraction et la culture des mélanocytes. L'efficacité d'extraction a été jugée sur les critères suivants: séparation épiderme / derme, fonctionnalité des mélanocytes extraits (prolifération, synthèse de la mélanine).La deuxième partie de la thèse était d'explorer l'interaction entre l'épiderme et le derme dans l'hyperpigmentation, en se focalisant sur la protéine Dickkopf 1 (Dkkl) qui est sécrétée par le fibroblaste dermique et codée par le gène Dkkl. Dkkl est un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt, qui en isolant le co-récepteur LRP5 / 6, empêche la formation du complexe Frizzeled-Wnt­LRP5 / 6. Nous avons émis l'hypothèse que TGF-β1 participe au développement du lentigo solaire en réduisant l'expression de Dkkl dans les fibroblastes par la voie p38 MAP kinase, ce qui conduit à une activation de la cascade de signalisation Wnt / β-caténine. Cette hypothèse a été confirmée dans le modèle cellulaire 2D de fibroblastes issus de lentigo et de peau normale adjacente, et également dans le modèle de peau 3D irradiée aux UV, en étudiant l'expression génique et la sécrétion protéique de Dkk 1. / The first part of the thesis was to define and validate an epidermal cell extraction method being the simplest, the most effective and applicable to smaller samples and avoiding animal reagents. In this study, TrypLE™, an animal origin-free cell dissociation enzyme, replaced dispase and trypsin as dissociated enzyme for melanocytes extraction. This product could simplify extraction protocol, eliminate potential pathogenic contaminants from animal and decrease keratinocytes contamination during extraction and subculture of melanocytes. The extraction efficiency was judged on the following criteria: separation epidermis / dermis, functionality of the extracted melanocytes (proliferation, melanin synthesis).The second part of the thesis was to explore the role of cross-talking between epidermis and dermis in hyperpigmentation, focused on Dickkopf-related protein l(Dkkl) which is secreted by dermal fibroblast and encoded by Dkkl gene is an antagonistic inhibitor of the Wnt signaling pathway, by isolating the LRP5/6 co-receptor and preventing the Frizzeled-Wnt-LRP5/6 complex formation. We hypothesized that TGF-βl mediates development of solar lentigo by reducing Dkkl expression in fibroblasts through the p38 MAP kinase pathway, which leads to an activation of the Wnt/ β-catenin signaling cascade. This hypothesis was confirmed in the fibroblast of lentigo and adjacent normal skin, also in the UV A-irradiation 3D skin mode! by testing of Dkkl secretion in protein level and Dkkl expression in RNA level.

Dans le cadre de cette thèse, je me suis intéressée aux traits colorés chez les rapaces. Plus particulièrement, j'ai tenté de comprendre les fonctions potentielles associées à deux types de traits colorés chez les rapaces, les traits à base de caroténoïdes (et qui reflètent dans les ultraviolets), et les traits à base de mélanine, à travers l'étude du polymorphisme de plumage. Pour ce faire, j'ai choisi d'étudier deux espèces proches de busards, le Busard des roseaux Circus aeruginosus et le Busard cendré Circus pygargus et j'ai employé des méthodes à la fois empirique et expérimentale. Dans un premier temps, j'ai tenté de comprendre l'origine et le maintien du polymorphisme de plumage existant au sein d'une population de Busard des roseaux, en tentant d'une part de décrire précisément les variations de coloration au sein de ce polymorphisme, et en m'intéressant d'autre part à l'existence d'éventuels avantages adaptatifs selon les différents morphes exprimés chez les individus, et en particulier les mâles, en terme d'accès aux ressources alimentaires, de dominance sociale et d'accès aux partenaires de reproduction. Très brièvement, le polymorphisme de plumage existant au sein de cette population semble être du à une très forte densité, qui aurait engendrée l'apparition de deux stratégies comportementales alternatives au sein du sexe mâle, la première étant la plus répandue dans les populations à faible densité et concernant des mâles exprimant un morphe 'gris', à tendance solitaire et territoriale, et la seconde concernant l'apparition d'un morphe 'sombre', de type femelle, pour lequel les mâles seraient beaucoup plus sociaux, et bénéficierait de l'imitation du plumage des femelles à travers la réduction des conflits avec les mâles 'gris'. Par ailleurs, j'ai également étudié les fonctions potentielles de ce polymorphisme au cours d'un type particulier de relations sociales existant chez les busards, la défense de groupe ou « mobbing ». Il apparaît des 'rôles' au sein d'une séquence de défense de groupe classique définis entre autre par les morphes exprimés par les individus. Dans un deuxième temps, j'ai analysé les mécanismes de développement, et j'ai testé une fonction potentielle associée à l'expression des traits à base de caroténoïdes chez les poussins de busards. Plus particulièrement, j'ai démontré que les jeunes busards expriment des traits à base de caroténoïdes dès leur plus jeune âge, mais qu'ils sont limités, en condition naturelle, pour l'accès aux caroténoïdes, et ce, essentiellement à travers l'abondance de leur espèce-proie principale, le campagnol. Par ailleurs, il semble apparaître que les traits colorés des jeunes busards seraient impliqués dans la communication parents-enfants, et plus particulièrement, que la modification de leur coloration, au niveau des ultraviolets ou du 'jaune' (i.e. caroténoïdes), entraîne des conséquences en terme de nourrissage, de la part de leurs parents. Il reste cependant encore à analyser plus en détail la fonction associé aux traits colorés chez les jeunes busards, comme par exemple au niveau de la communication entre jeunes d'une même nichée.

L’hormone de la mélano-concentration (Melanin-Concentrating Hormone - MCH) joue un rôle important dans la régulation du bilan d'énergie. Les projections des neurones à MCH vers l’enveloppe du noyau accumbens (Nucleus Accumbens Shell - NAcSh) induisent, lorsque stimulées, la prise alimentaire. Aussi, l'injection intra-NAcSh d’opiacés induit une augmentation de la prise alimentaire chez les rongeurs. Compte tenu de la présence de récepteurs du MCH de type 1 (MCHR1) sur les neurones dynorphine et enképhaline du NAcSh, le système opioïde du NAcSh pourrait jouer un rôle de médiateur de l'effet orexigène du MCH. Les sites et les mécanismes de l'action orexigène du MCH sont cependant encore incomplètement connus.. Connaissant la longue portée des fonctions attribuées au NAcSh dans la modulation de la récompense et du plaisir, nous avons supposé que l’agoniste du MCH dans le NAcSh augmente le plaisir associé à la prise alimentaire à travers des neurones opioïdes dans le NAcSh. Deux expériences chez des rats Wistar mâles ont été effectuées. Nous avons d’abord mesuré la capacité de 3 antagonistes des récepteurs opioïdes (µ: β-Funaltrexamine, β-FNA ; δ: Naltrindole, NTI ; κ: Nor-Binaltorphimine, Nor-BNI) de bloquer l'augmentation de la prise alimentaire induite par l'injection de MCH. Le Nor-BNI, le NTI ou le β-FNA ont été administrés à différentes doses dans le ventricule latéral 90 min ou 22 h avant l’injection de MCH ou de véhicule et la prise alimentaires des animaux a été mesurée pendant les 3 heures suivant le traitement. .. Nous avons constaté que le blocage des récepteurs opioïdes par des antagonistes spécifiques a diminué la prise alimentaire induite par le MCH. Nous avons aussi évalué le niveau de plaisir en réponse à un stimulus sucré (1 ml de sucre à 2%, intra-oral) en quantifiant les mimiques faciales, suivant le test de réactivité gustative décrit précédemment. Les réponses hédoniques ont été évaluées 15 min après l’injection dans le ventricule latéral de 4 µl de l’agoniste du MCH (2 nmol) par rapport au véhicule. Le même test de réactivité gustative a été répété après le traitement avec les antagonistes des différents récepteurs des opioïdes. La capacité des antagonistes des opioïdes de bloquer l'effet du MCH a été mesurée. Nous avons constaté que les trois antagonistes des récepteurs opioïdes ont modifié l'augmentation de la réponse hédonique induite par le MCH en atténuant les propriétés hédoniques de la solution de sucre. Nos résultats indiquent que les effets orexigènes et hédoniques du MCH sont liés aux 3 récepteurs opioïdes. Le MCH peut activer un sous-type de récepteurs spécifiques aux opioïdes (κ, µ) pour exercer ses effets sur la consommation alimentaire. L’interaction des deux systèmes, MCH et opioïdes, semble jouer un rôle important dans la régulation hédonique du contrôle de l'appétit. / The brain melanin-concentrating hormone (MCH) system plays an important role in the regulation of energy balance. The sites and mechanisms of the orexigenic action of the MCH are still uncertain. Knowing the function of the NAcSh in the regulation of reward and pleasure, we hypothesize that MCH agonism in the NAcSh increases the pleasure associated with food intake through the opioid neurons within NAcSh. The presence of MCH receptor (MCHR1) on dynorphin and enkephalin neurons of NAcSh supports this hypothesis. Two different experiments in Wistar male were conducted. Firstly, we measured the capacity of three different opioid antagonists injected in the lateral ventricle at doses of 10 nmol and 40 nmol (for κ and δ) or of 10 nmol and 50 nmol (for µ) to block the increase in food intake induced by MCH injection in the lateral ventricle. The rats pretreated with a microinjection of an opioid antagonist 90 min (for the κ and δ) or 22 h (for µ), received a MCH or vehicle injection. Food intake was monitored during one, two and three hours after MCH or vehicle injection. We found that the blockade of opioid receptors by selective antagonists decreased MCH-induced feeding. Secondly, we assessed the level of pleasure in response to sweet stimulus (one milliliter of a sucrose solution, intraoral) by quantifying facial mimics induced by the presence of sucrose in the mouth. The hedonic responses were monitored, 15 min after the injection of a MCH agonist in the lateral ventricle. The same taste reactivity test was repeated following the injection of MCH in the presence of κ, δ and  opioid antagonists. We found that the three opioid antagonists were capable of modifying the increased hedonic response induced by MCH by attenuating the positive hedonic properties of sucrose solution. Our results indicate that the orexigenic and hedonic effects of MCH are linked to three opioid receptors. MCH might activate a specific opioid receptor subtype (κ, µ) for exerting its effects on food intake. The interaction of the MCH and opioids systems could represent an important link in the modulation of the hedonic appetite control.

Le mélanome cutané est le cancer de la peau le plus agressif et malgré d’importants progrès dans sa prise en charge thérapeutique, la recherche de nouvelles stratégies se poursuit pour les patients non éligibles à la chimiothérapie ciblée ou non répondeurs aux thérapies actuelles. Le laboratoire UMR990 travaille sur une stratégie de radiothérapie interne vectorisée (RIV) utilisant des ligands ciblant spécifiquement et durablement la mélanine. Parmi ceux-ci la molécule ICF01012 couplée à l’iode 131 induit une inhibition significative de la croissance tumorale de tumeurs murines et de xénogreffes humaines pigmentées, associée à un allongement de la médiane de survie des animaux. Les objectifs de la thèse ont eu pour but i) de réaliser des études de dosimétrie dans un modèle de mélanome humain ii) d’approfondir les mécanismes de réponse à la RIV dans les modèles murins et humains iii) de potentialiser l’effet de cette stratégie par la co-injection de molécules radiosensibilisantes. L’étude dosimétrique réalisée sur le modèle de xénogreffe SK-Mel 3 montre ainsi que la croissance de ces tumeurs, qui possèdent environ 3 fois moins de mélanines que les tumeurs B16, est contrôlée de façon significative par 3 injections successives de 25 MBq. Ceci conforte l’idée d’approche théranostique avec la nécessité de caractériser les lésions d’un patient par imagerie en termes de cibles disponibles pour adapter le traitement. Nous montrons que dans les tumeurs SK-Mel 3, l’augmentation de la quantité de mélanines chez les animaux traités avec [131I]ICF01012 est similaire pour la phéo et l’eumélanine. De façon intéressante dans le modèle B16Bl6, le traitement avec [131I]ICF01012 réduit le nombre de métastases spontanées ou de colonies pulmonaires. Ce traitement est donc performant sur les petites tumeurs ou les cellules circulantes. Les mécanismes associés à la RIV sont superposables avec ceux induits par des irradiations externes à savoir cassures de l’ADN et arrêt de cycle. Les altérations moléculaires sont cependant différentes en fonction du statut du gène p53 des cellules tumorales. Le traitement avec [131I]ICF01012 induit un contrôle tumoral limité dans le temps, l’utilisation de radiosensibilisants est donc d’intérêt. Le coDbait est une petite molécule d’ADN qui mime une cassure double-brin d’ADN et sert ainsi de leurre pour les enzymes de réparation. Les modèles B16Bl6 et SK-Mel 3 ont été traités par [131I]ICF01012 associé à des injections intratumorales de coDbait. Les résultats obtenus sur la croissance tumorale et la survie des animaux montrent que l’association des deux molécules est synergique dans le modèle SK-Mel 3 à croissance lente et additive dans le modèle B16Bl6. Nous avons ainsi montré la possibilité d’augmenter les effets de la RIV dans les modèles précliniques par la déstabilisation des processus de réparation. Des travaux préliminaires montrent également un effet positif des nanoparticules de gadolinium sur l’efficacité d’[131I]ICF01012 dans le modèle B16Bl6. Les mécanismes mis en jeu restent à être définis. En conclusion, nos travaux montrent que la molécule [131I]ICF01012 constitue une thérapie alternative aux traitements conventionnels pour le mélanome métastatique pigmenté. [131I]ICF01012 est en cours de transfert clinique chez l’homme. / Melanoma is a highly aggressive skin cancer and despite the significant progress in its therapeutic management, the research keeps on developing new strategies for non-eligible patients for targeted chemotherapy or without successful therapy. The UMR990 is working on targeted radiotherapy (TRT) using ICF01012 vector labeled with iodine 131, with a high affinity for melanin and therefore for pigmented melanoma. [131I]ICF01012 induces a significant decrease of the tumoral growth in syngenic B16 models and human melanoma xenografts and a significant improvement of the survival median. The aims of the present work were i) to evaluate the dosimetry in human melanoma model, ii) to study mechanisms after TRT injection in xenografts and murin pigmented melanoma, iii) to potentiate the efficiency of this strategy using radiosensitizer. The dosimetric study showed that in SK-Mel 3 model, less pigmented than B16Bl6 tumors, the tumoral growth was significant controlled by 3 successive injections of 25 MBq. The theranostic approach is then necessary to characterize the available quantity of targets in the patient before treatment. The melanin content demonstrated that repeated injections of [131I]ICF01012 in xenografts induced an increase of melanin without any enrichment of the pheomelanin, an oxydant pigment. Interestingly, the treatment with [131I]ICF01012 reduced the number of spontaneous metastases or lung colonies in the B16Bl6 model. This treatment was then effective on small tumors or circulating cells. Consecutive mechanisms to the TRT were similar to those induced by external irradiation: DNA breaks and cell cycle arrest. However, they differed depending on p53 status of tumoral cells. The tumor regression was uncompleted after [131I]ICF01012 treatment and co-injection with radiosensitizers could improve its efficiency. We used small DNA molecules, called coDbait, mimicking the double-strand breaks to trap repairing enzymes. Syngenic model B16Bl6 and xenograft SK-Mel 3 were treated by [131I]ICF01012 and coDbait intratumoral injection. A synergistic effect of the two molecules was observed on SK-Mel 3 model, while the effect was additive in B16Bl6, a model with a fast doubling time. The coDbait destabilized the repairing process after treatment with [131I]ICF01012. Preliminary studies showed a positive effect of gadolinium nanoparticles on the efficiency of [131I] ICF01012 towards B16Bl6 tumors. The mechanisms involved remained to be defined. In conclusion, these data suggest that [131I]ICF01012 is a promising treatment for patients with pigmented metastatic melanoma.

Dans l’épiderme, les mélanocytes participent à la protection de la peau contre les rayons ionisants du soleil en synthétisant un pigment, la mélanine, dans des compartiments apparentés aux lysosomes appelés melanosomes. La mélanogenèse est un processus séquentiel initié par la production de fibres amyloïdes dont la composante principale est la protéine PMEL. Ces fibres séquestrent la mélanine et permettent l’élimination d’intermédiaires toxiques produits lors de sa synthèse. La mélanogenèse et le phénotype pigmenté sont affectés lorsque le processus de formation des fibres est altéré. Les fibres résultent du clivage de PMEL dans les endosomes précurseurs des mélanosomes mais les protéases impliquées dans ce processus restent peu ou pas caractérisées. Afin de mieux comprendre les mécanismes de formation des fibres amyloïdes dérivées de PMEL, j’ai étudié le rôle de deux protéases : les Bêta-sécrétases BACE1 et BACE2. En combinant des techniques de biochimie, d’immunocytochimie et d’imagerie photonique et électronique, j’ai montré que la perte de l’expression de Bace2 in vivo (souris KO BACE2) ou sa déplétion (siRNA) dans une lignée de mélanocytes inhibent le clivage amyloïdogénique de PMEL et affectent à la fois la formation de fibres de PMEL dans les mélanosomes et la pigmentation. J’ai pu notamment reproduire in vitro le clivage spécifique de PMEL en utilisant une forme recombinante de BACE2. En parallèle, j’ai également étudié le rôle de BACE1 dans la mélanogenèse. Mes résultats indiquent que BACE1, bien que n’étant pas impliquée dans le clivage de PMEL, régulerait la maturation des mélanosomes précoces in vivo et in cellulo, en modulant les contacts entre mélanosomes et réticulum endoplasmique (RE). Dans les mélanocytes, BACE1 est présente dans le RE et interagit avec des protéines impliquées dans les contacts RE-endosomes. Ces contacts seraient cruciaux pour le transfert de molécules nécessaires à la maturation des mélanosomes. L’ensemble de ces résultats démontre un rôle pour chacune des Bêta-sécrétases dans le processus de mélanogenèse, levant le voile sur des processus clés liés à la biogenèse des mélanosomes. Par ailleurs, les fibres de PMEL constituant le modèle le plus abouti de l’amyloïdogenèse physiologique chez les mammifères, ces études pourraient à plus long terme aider à la compréhension de la formation des fibres amyloïdes pathologiques ; notamment dans la maladie d’Alzheimer où l’amyloïdogenèse d’APP est très similaire à celle de PMEL. / In the epidermis, melanocytes synthetize a pigment called melanin, in lysosome-related-organelles called melanosomes, in order to protect the skin against the ionizing radiations of the sun. Melanogenesis is a sequential process initiated by the formation of amyloid fibrils whose principal component is the protein PMEL. Those fibrils sequester the melanin pigment and allow the removal of toxic intermediates formed during its synthesis. Melanogenesis and the pigmented phenotype are affected when the process of fibrils formation is altered. Fibrils come from the processing of PMEL in endosome precursors of melanosomes but the proteases implicated in this process are not well characterized. In order to better understand the mechanisms implicated in the formation of the PMEL amyloid fibrils, I studied the role of two proteases: the Beta-secretases BACE1 and BACE2. Using a combination of biochemical, immunocytochemical methods and photonic and electronic imaging, I have shown that the loss of Bace2 expression in vivo (BACE2 KO mice) or its depletion (siRNA), in a melanocyte cell line, inhibit the amyloidogenic processing of PMEL and affect both the formation of the PMEL fibrils in melanosomes and pigmentation. I could reproduce in vitro the specific cleavage of PMEL by using a recombinant form of BACE2. In parallel, I have also studied the role of BACE1 in melanogenesis. My results indicate that BACE1, even though it is not implicated in PMEL processing, could regulate the maturation of early melanosomes in vivo and in cellulo, by modulating the contacts between melanosomes and endoplasmic reticulum (ER). In melanocytes, BACE1 is present in the ER and interacts with proteins implicated in ER-endosomes contacts. Those contacts would be crucial for the transfer of molecules that are necessary for melanosome maturation. All together those results demonstrate the role of both Beta-secretases in melanogenesis, and reveal key processes involved in melanosome biogenesis. Moreover, because PMEL fibrils are the most completed model of physiological amyloidogenesis in mammals, theses studies could help in the future the understanding of the formation of pathological amyloid fibrils; in particular in the Alzheimer’s disease where the amyloidogenesis of APP is very similar to the one of PMEL.

Résumé La malaria et le VIH-l sont comptés parmi les maladies les plus meurtrières de ce siècle. Ensemble, elles causent plus de quatre millions de mort annuellement au niveau des mêmes régions géographiques, notamment en Afrique sub-saharienne. Les conséquences de cette co-infection sont des problèmes majeurs de la santé publique à l'échelle mondiale. L'agent responsable de la forme la plus sévère de la malaria est le parasite Plasmodium falciparum. Afin d'infecter correctement son hôte humain, le parasite doit dégrader l'hémoglobine en vu d'assurer son développement. Cette dégradation provoque la synthèse de molécules d'hème qui, étant toxique pour le parasite, seront cristallisées sous la forme de pigments malariques appelés hémozoïne (HZ). Ces pigments sont régulièrement associés directement ou indirectement à la physiopathologie de la malaria. Notre étude repose sur l'investigation de l'influence des pigments malariques sur l'infection rétrovirale du VIH-l dans les cellules les plus ciblées par ces deux infections: les cellules phagocytaires humaines dérivées de monocytes (MDC), à savoir les macrophages, les cellules dendritiques et les lymphocytes T CD4 +. Lorsque les pigments d' HZ sont présents dans les MDC, on observe une inhibition de l'infection virale mais une augmentation de la dissémination du VIH -1 dans les lymphocytes. En effet, dans les macrophages dérivés de monocytes cette phagocytose d' HZ est responsable de l'arrêt du cycle viral à une étape comprise entre la transcription inverse et l'intégration du VIH -1. Le mécanisme responsable de cette inhibition n'est pas tout à fait identifié, cependant l'explosion oxydative induite par la phagocytose d'HZ semble être responsable d'une inhibition de la production intracellulaire d'ATP, vitale pour le transport du VIH-l dans le noyau. En ce qui concerne les cellules dendritiques, les changements phénotypiques induits par l'HZ démontrent une diminution de l'expression du récepteur CCR5, essentiel pour l'entrée du VIH-l dans la cellule hôte. La présence d'HZ dans les MDC rend les cellules plus aptes à activer les lymphocytes, favorisant ainsi la réplication virale. Effectivement, l'HZ accroit la prolifération des lymphocytes T CD4+ résultant en une augmentation de l'infection et du transfert du VIH-l. Les co-infections étant de plus en plus contraignantes, il est primordial d'augmenter le nombre d'études fondamentales afin de mieux comprendre les interactions régissant l'aboutissement fatal de ces deux maladies. Ceci est impératif pour le développement de nouvelles thérapies combinatoires pour les patients co-infectés.

Titre de l'écran-titre (visionné le 15 avril 2024) / $\bf{\underline{Introduction :}}$ Le traitement des patients souffrant de brûlures extensives constitue un défi au niveau médical puisqu'ils font face à une paucité de sites donneurs pour réaliser le traitement conventionnel de greffe cutanée d'épaisseur partielle (STSG : split-thickness skin graft). La peau reconstruite bilamellaire autologue (PRBA), un produit développé au Laboratoire d'Organogenèse Expérimentale (LOEX) et évalué précédemment dans une série de cas, est une alternative potentielle. Les qualités physiques de la PRBA suivant sa greffe chez le patient brûlé doivent être évaluées. <br>$\bf{\underline{Methode :}}$ Dans le cadre de l'étude clinique SASS-2 (*Self-Assembled Skin Substitute for the Autologous Treatment of Severe Burn Wounds in Acute Stage of Burn Trauma*), la PRBA a été greffée côte à côte à la STSG. La qualité de la cicatrice a été évaluée quantitativement à l'aide de trois instruments de mesure : le Dermascan (épaisseur du derme), le Cutomètre® (élasticité et fermeté de la peau), et le Mexamètre® (érythème et mélanine). Les cicatrices ont aussi été évaluées par l'échelle de Vancouver modifiée. Les patients ont été évalués à trois, six, 12, 24 et 36 mois post-greffe. Chaque donnée recueillie par les appareils de mesure était obtenue à trois reprises. <br>$\bf{\underline{Resultats :}}$ Aucune différence de l'érythème, l'épaisseur du derme, et des propriétés viscoélastiques n'a été objectivée entre les deux greffes. Le contenu en mélanine était significativement plus bas suite aux greffes de PRBA. Le score de Vancouver était similaire pour les deux substituts. Aucune cicatrice pathologique n'a été diagnostiquée cliniquement. <br>$\bf{\underline{Conclusion :}}$ La peau à la suite des greffes de PRBA avait une épaisseur et des propriétés viscoélastiques similaires à celle obtenue suite à la greffe de STSG. Le contenu de mélanine était inférieur, comme on pouvait s'y attendre en raison de la croissance limitée des mélanocytes pendant la production des PRBA. Ces résultats indiquent que la PRBA pourrait être une alternative intéressante à la STSG chez les patients souffrant de brûlures graves. / $\bf{\underline{Introduction:}}$ Severely burned patients present great medical challenges as viable skin used for conventional Split Thickness Skin Graft (STSG) gets scarce. Self-Assembled Skin Substitute (SASS), a skin substitute created at the Laboratoire d'Organogenèse Expérimentale (LOEX) and used in a previous case series, could become an alternative for such patients. The physical properties of SASS following its graft in burn victims must be evaluated. <br>$\bf{\underline{Methods:}}$ Within the SASS-2 clinical trial (*Self-Assembled Skin Substitute for the Autologous Treatment of Severe Burn Wounds in Acute Stage of Burn Trauma*), SASS has been grafted next to the STSG. Long term scar quality was evaluated using three devices: the Dermascan (dermal thickness), the Cutometer® (firmness and elasticity), and the Mexameter® (melanin and erythema). Measurements of both test sites and other sites were performed at three-, six-, 12-, 24- and 36-months post-graft. All measurements were repeated 3 times. The modified Vancouver Scar Scale (mVSS) was also used in the follow-up appointments. <br>$\bf{\underline{Results:}}$ No difference has been detected in dermal thickness, skin firmness or elasticity between the scars of the areas grafted with SASS and the areas grafted with STSG. Erythema values were similar between sites and diminished with time in all patients. Melanin levels were significantly lower in the sites grafted SASS than the sites grafted withSTSG. mVSS scores were lower in the sites grafted with STSG. No skin graft met the required criteria for pathologic scar at the end of their evaluation. <br>$\bf{\underline{Conclusion:}}$ Following graft, SASS shows a similar thickness, and viscoelastic properties when compared to STSG. Its melanin content was inferior, which was to be expected owing to the poor growth of melanocytes during production of SASS. These results show that SASS could provide a good alternative to STSG in severely burned patients.

Yarrowia lipolytica a la particularité de pousser sur de nombreux substrats hydrophobes et de les métaboliser via la β-oxydation ou de les stocker dans des corps lipidiques. Le premier contact entre la cellule et les substrats hydrophobes se déroule sur la surface cellulaire. A cette étape, la composition de la paroi cellulaire en protéines, en β-glucane et en chitine pourrait jouer un rôle important sur l'adhésion et la prise en charge des substrats hydrophobes. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié l'effet d'une source de carbone hydrophobe (par rapport au glucose) et de la composition du milieu de culture sur la structure pariétale et la production de mélanine chez Y. lipolytica. Les résultats de nos analyses biochimiques et moléculaires ont montré que l'oléate de méthyle (un composé utilisé comme modèle de source de carbone hydrophobe) a induit des modifications au niveau de la paroi cellulaire et que ces modifications ont conduit ou non à l'adhésion de gouttelettes lipidiques à la surface cellulaire ; à une modification du contenu des composés pariétaux ; à la résistance des cellules à des composés toxiques ayant pour cible la paroi cellulaire ; et à la modification des profils d'expression de 27 gènes analysés codant des protéines de paroi cellulaire. L'identité des gènes surexprimés suggère la participation de leurs protéines dans l'intégrité de la paroi cellulaire, dans l'adhésion des gouttelettes lipidiques et dans la réponse au stress par l'oléate de méthyle et/ou le manque d'azote. Nos résultats ont aussi montré que la présence d'oléate de méthyle, huile de ricin et ricinoléate de méthyle a induit la production de DHN-mélanine chez une souche génétiquement modifiée de Y. lipolytica (MTLY40-2p) dont la β-oxydation est affectée

Le présent mémoire comportait deux buts expérimentaux principaux. Tout d'abord, nous avons fait l'étude in vivo du remodelage à long terme du réseau microvasculaire de la peau reconstruite endothélialisée suite à sa transplantation chez la souris. La peau reconstruite endothélialisée est un biopolymère tridimensionnel constitué en majeur partie de collagène bovin sur lequel nous cultivons des fibroblastes, des kératinocytes et des cellules endothéliales d'origine humaine afin de développer un modèle expérimental comportant des caractéristiques similaires à celles présentées par la peau normale humaine. Nous avons observé une diminution progressive de la quantité de tabules d'origine humaine au sein du greffon au profit de capillaires murins qui ont envahi ce dernier et lui ont permis de s'intégrer au sein des tissus hôtes. Ces résultats montrent que notre peau reconstruite est vascularisée par les vaisseaux hôtes et que cette dernière pourrait donc éventuellement être utilisée à des fins thérapeutiques afin de recouvrir des plaies présentant une perte tissulaire importante. Le deuxième but visé était de développer à partir de notre PRL un modèle de culture de cellules malignes mélanocytaires. Des cellules tumorales provenant de lésions primaires et de sites métastatiques ont été cultivées sur les PRL pendant un total de 31 jours. Ces dernières ont bien proliféré au sein du biopolymère et la quantité ensemencée a influencé la densité de capillaires retrouvée au sein du modèle in vitro. Ces résultats nous indiquent que notre PRL pourrait devenir un bon modèle expérimental nous permettant d'étudier la physiopathologie cancéreuse ainsi que les interactions existant entre les cellules tumorales et le réseau micro-vasculaire de leur environnement.

Le phytomanagement est une méthode de gestion de sites pollués basée sur la capacité des plantes à séquestrer les polluants. L’utilisation de symbiotes fongiques peut représenter un atout afin d’augmenter la production de biomasse. Les endophytes bruns septés (DSE) pourraient stimuler la croissance végétale et augmenter leur protection contre les éléments-traces-métalliques (ETM). Cette thèse se déroule dans le cadre du projet LORVER et vise à comprendre l’interaction « plantes-DSE-sols pollués ». A ces fins, des champignons DSE isolés de racines de peupliers issues de sols pollués par des ETM ont été caractérisés. Ils appartiennent aux genres Leptodontidium, Phialophora, Cadophora et Phialocephala. Trois de ces souches ont ensuite été inoculées à des plantes en présence d’ETM. Dans certains cas, la croissance végétale a été stimulée et une augmentation de la teneur en chlorophylles, en P et en K, ou une réduction de la teneur en Cd dans les parties aériennes ont été mises en évidence. Puis, la souche la plus efficace sur la croissance végétale, Cadophora sp. Fe06, a été utilisée dans un double inoculum avec une souche endomycorhizienne, chez du ray-grass en présence d’ETM. Cette association diminue la teneur en Cd dans les feuilles. Enfin, les mécanismes impliqués dans la tolérance aux ETM chez les DSE ont été examinés via le criblage d’une banque de mutants d’insertions aléatoires, et via l’étude du rôle de la mélanine. Ce travail met en évidence que l’utilisation de DSE, de part leur capacité à coloniser de nombreuses plantes dans différents sols et à stimuler leur croissance, pourrait représenter un atout considérable pour des opérations de phytomanagement / Phytomanagement is a handling method of contaminated sites based on the ability of plants to sequester pollutants. Fungi could favor plant growth in contaminated sites but were far less studied in the context of phytomanagement. Dark septate endophytes (DSE) were reported to improve plant tolerance against metallic trace elements (TE). The present work is part of the LORVER project and aims to understand the “plant-DSE-TE”. DSE were isolated from poplar roots growing on TE-contaminated soils and characterized. They belong to Leptodontidium, Phialophora, Cadophora and Phialocephala genera. Three strains were inoculated to birch and poplar in TE-contaminated soils. Leptodontidium sp. improved plant growth with an increase in chlorophyll, P and K concentrations, whereas Cadophora sp. decreased Cd concentration in shoots of birch. Then, Cadophora sp. Fe06, was used with an endomycorrhizal fungus, to co-inoculate ryegrass in a TE-polluted soil. The co-inoculation leads to the decrease of Cd concentration in shoots. Finally, the mechanisms involved in TE-tolerance by DSE were studied through the screening of a library of Leptondontidium sp. insertional random-mutants and an evaluation of the role of melanin against TE stress. The present work highlights the complexity of the interactions between DSE and plants under TE stress. These interactions were influenced by different parameters including plant species, DSE strains, and soil properties. Nevertheless, the ability of DSE to colonize a broad spectrum of plants in different soils and to promote plant growth, suggest that DSE could represent a substantial benefit for the fungus-assisted phytomanagement of polluted soils