Les cellules Natural Killer (NK) sont des effecteurs cytotoxiques impliqués dans la réponse immune contre les infections et les tumeurs. Pendant ma thèse j’ai étudié la fonctionnalité des cellules NK humaines en réponse à des lignées cellulaires de carcinome rénal à cellules claires (RCC) et de mélanome métastatique, deux tumeurs immunogènes. Nos résultats montrent que certaines mutations de VHL augmentent la susceptibilité des lignées RCC à la lyse NK. La perte de fonction de VHL corrèle avec une expression membranaire diminuée des molécules HLA-I par les lignées RCC mutées pour VHL. Chez les patients atteints de mélanome métastatique de stade IV, nous avons décrit un phénotype particulier des NK sanguines (NKp46dim/NKG2Adim) qui leur confère une forte activité antitumorale. Après traitement des patients par chimiothérapie, la fonctionnalité NK était réduite et le phénotype modifié. Pour étudier les cellules NK infiltrant les mélanomes, nous avons mis au point des conditions expérimentales pour caractériser les cellules NK de ganglions métastatiques de patients de stade III. Nos résultats préliminaires montrent que, par rapport aux ganglions sains, les NK des ganglions métastatiques présentent un phénotype altéré et un potentiel fonctionnel diminué. Nos résultats suggèrent que d’une part l’immunogénicité dépendante des oncogènes et d’autre part les altérations NK induites par la tumeur et/ou par la chimiothérapie sont des facteurs importants à considérer dans le choix des protocoles d’immunothérapie basés sur les cellules NK. / Natural Killer cells are cytotoxic lymphocytes involved in the immune response against tumours and infections. We investigated the NK-mediated functions in response to clear-cell renal cell carcinoma (RCC) and metastatic melanoma, two human immunogenic tumours. We showed that certain VHL mutations increased RCC cell susceptibility to NK lysis. VHL loss of function correlated with lower expression levels of membrane HLA-I molecules on VHL-mutated RCC and a decreased triggering of inhibitory NK receptors compared to RCC with a functional VHL. In stage IV melanoma patients, we showed that blood NK cells displayed a unique NKp46dim/NKG2Adim phenotype and high lytic potential towards melanoma cells. Following chemotherapy, NK cell function was reduced and the phenotype modulated. To study melanoma-infiltrating NK cells, we have set up experimental conditions to characterise NK cells in metastatic LNs from stage III melanoma patients. Our preliminary data show that, compared to normal LNs, NK cells from metastatic LNs are altered. Our findings suggest that oncogenic-dependent immunogenicity, tumour-associated NK alterations and chemotherapy are important factors that must be taken into account in the choice of immunotherapeutic protocols based on NK cells.

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Bien que son taux d’incidence soit inférieur à 1%, plus de 75% des décès associés à un cancer de la peau lui sont attribués. Au cours des dernières années, de nouvelles stratégies thérapeutiques ont permis d’améliorer la survie des patients. Cependant, des mécanismes de résistance à ces traitements se développent dans la majorité des cas, conduisant à une phase de rechute, et une survie à 5 ans inférieure à 20%. Des modèles d’étude expérimentaux sont nécessaires afin de comprendre les mécanismes impliqués dans l’apparition de ces résistances et développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Différents modèles in vitro sont actuellement utilisés pour le développement de drogues anti-tumorales, tels que celui du sphéroïde. Bien qu’il permette de reproduire l’organisation tridimensionnelle d’une tumeur, l’absence de microenvironnement tumoral empêche l’étude des interactions entre les cellules tumorales et celui-ci alors que ces facteurs jouent un rôle primordial dans la croissance tumorale et le développement de métastases. Dans ce contexte, mes travaux ont porté sur le développement et la caractérisation d’un modèle ex vivo de mélanome humain complet permettant l’étude de l’évolution d’une tumeur dans le tissu sain et l’évaluation de composés pharmacologiques. Les travaux réalisés ont tout d’abord conduit au développement d’un modèle de cancer cutané basé sur la combinaison d’un modèle de sphéroïde de lignée cellulaire de mélanome humain et du modèle de peau humaine ex vivo NativeSkin®, développé par la société Genoskin. Une procédure a été développée et validée pour permettre l’implantation reproductible d’un sphéroïde dans le derme des explants de peau. Parallèlement, j’ai développé une approche d’imagerie in situ par microscopie à feuille de lumière après transparisation des modèles. J’ai également développé une stratégie d’analyse d’images permettant la caractérisation quantitative de l'évolution du sphéroïde implanté en 3 dimensions et de suivre la dispersion des cellules du tumorales au sein de l’explant de peau. La caractérisation histologique du modèle implanté a révélé de façon très inattendue une perte progressive de l’intégrité du sphéroïde après implantation, associée à une diminution rapide de la prolifération des cellules le constituant et l’apoptose massive des cellules situées à sa périphérie. Ce phénomène a été observé de façon similaire lors de l’implantation de sphéroïdes produits à partir de différents types cellulaires. Afin de comprendre ces résultats, j’ai étudié l’implication potentielle de différents paramètres dans l’induction de la mortalité cellulaire observée tels que les conditions d’implantation, les facteurs synthétisés par le modèle et la contrainte mécanique exercée par le derme. Les résultats obtenus suggèrent que les facteurs sécrétés par les modèles après implantation du sphéroïde ont un effet antiprolifératif sur les sphéroïdes de mélanome et qu’ils induisent la mortalité des cellules situées à sa périphérie. Par ailleurs, l’application d’une contrainte mécanique extérieure sur les sphéroïdes de mélanome entraîne la perte de la cohésion de leur structure. Enfin, l’implantation de sphéroïdes dans le derme de biopsies de peau préalablement desséchées, induisant une perte de la viabilité cellulaire, a conduit à des résultats opposés à ceux observés avec de la peau normale : la structure des sphéroïdes reste cohésive et la prolifération des cellules est maintenue en périphérie du sphéroïde sans qu’aucune apoptose massive ne soit observée. L'ensemble de ces travaux semble suggérer que la mortalité du sphéroïde pourrait être, en partie, la conséquence d’une contrainte mécanique exercée par la peau sur le sphéroïde et/ou de facteurs produits par la peau durant sa culture. Ces données ouvrent des perspectives intéressantes dans le domaine de l’ingénierie tissulaire pour l’évaluation pharmacologique de composés thérapeutiques. / Malignant melanoma is the most aggressive form of skin cancer. Although it only occurs in less than 1%, it is responsible for more than 75% of skin cancer-related deaths. Furthermore, melanoma incidence has constantly increased during the last decades. New therapies such as targeted therapy and immunotherapy have emerged over the past years, significantly improving the overall survival rates of patients with advanced melanoma stages. However, resistance to those treatments develops in most cases, leading to relapse with a 5-years survival of those patients under 20%. Experimental models are needed in order to better understand the molecular events underlying these resistance mechanisms, and to develop new therapeutic strategies. MultiCellular Tumor spheroid is an increasingly recognized 3D in vitro model for pharmacological evaluation. Although this model accurately reproduces the 3D architecture, cell-cell interaction and cell heterogeneity found in microtumor in vivo, spheroids lack tumor-microenvironment interactions, which play a key role in tumor growth and metastasis development. In this context, the aim of my project was to develop and characterize a fully ex vivo human melanoma model for the study of tumor growth within the skin and the evaluation of antitumor drugs. Our approach relies on the combination of human melanoma cell lines grown in Multicellular Tumor Spheroids and the NativeSkin® model, an ex vivo human skin model produced by the biotechnology company Genoskin. Hence, I developed and validated a method to reproducibly implant one spheroid into the dermal compartment of skin explants cultured ex vivo. In parallel I have developed in situ imaging strategies based on light-sheet microscopy (SPIM, “Selective Plane Illumination Microscopy”) after optical clearing of the implanted skin biopsies. I also developed analytic methods to allow for the quantitative characterization of the spheroids evolution in 3 dimensions as well as tumor cells dispersal within the dermis of skin explants. Histological characterization of the implanted models over time revealed a progressive loss of the spheroids integrity after implantation associated with a rapid decrease in cell proliferation and massive apoptosis of the cells located in the peripheral layers. These results were shared by implanted spheroids made from different cell types. Further experiments were conducted in order to better understand these results and evaluate the impact of different parameters on the implanted microtumors viability such as the implantation procedure conditions, factors synthesized by the model after spheroid implantation and external mechanical stress. Results suggest that factors produced by the implanted models have an antiproliferative effect on melanoma spheroids and induce mortality in the peripheral layers of the spheroids. Moreover, results show that mechanical stress applied on melanoma spheroids induces loss of their cohesion. Finally, implantation of spheroids within the dermis of previously dessicated biopsies for 7 days, causing loss of skin cells viability, led to opposite results than in normal skin: spheroids maintain both a cohesive structure and proliferation in the peripheral cells without any massive apoptosis. Overall, this work led to the validation of a methodology to reproducibly implant spheroids into an ex vivo skin explant and the setup of an optical clearing technique necessary for in situ imaging of the implanted spheroid. Histological characterization unexpectedly revealed spheroids cells death following their implantation. Results suggest that this mortality could be partly related to mechanical stress exerted on the spheroids by the skin and/or by factors produced by the skin during culture. These data open new perspectives in the research field of tissue engineering for antitumoral pharmacology.

L'objectif de ce travail de recherche est d'évaluer la capacité des spectroscopies optiques d'autofluorescence et de réflectance diffuse à caractériser les différents stades de la transformation néoplasique de la peau et ainsi d'aider au diagnostic des deux lésions de peau les plus létales : le mélanome malin et le carcinome épidermoïde. Dans l'étude portant sur le mélanome, un objet-test (« fantôme ») a été développé pour modéliser différentes épaisseurs de mélanome (indice de Breslow). La spectroscopie de réflectance diffuse résolue spatialement (grâce à l'utilisation de cinq fibres optiques réceptrices situées à cinq distances différentes de la fibre optique excitatrice) a montré sa capacité à discriminer (p<0,05) des indices de Breslow simulés grâce à des fantômes d'épaisseur variant par pas d'1 mm. D'autre part, des mesures de spectroscopie bimodale (combinant autofluorescence en multi-excitation et réflectance diffuse) ont été réalisées sur peau murine tout au long des sept mois de photocarcinogenèse. Des prélèvements cutanés ont permis d'établir trois classes histologiques (en plus de la classe saine du groupe contrôle) : hyperplasie compensatoire, hyperplasie atypique et dysplasie. Puis la précision diagnostique a été évaluée par analyse statistique multivariée. Nos principaux résultats montrent que la bimodalité associant autofluorescence (excitation à 410 nm) et réflectance diffuse permet une amélioration de la spécificité de 9 points de pourcentage comparées aux performances de chacune des modalités utilisée seule lors de la discrimination des trois types d'hyperplasie. Des études cliniques doivent maintenant confirmer l'intérêt de ces résultats.

La dissémination métastatique est associée à de faibles chances de survie dans les cas de mélanomes humains, comme pour d’autres cancers. Le développement de métastases est un processus qui se fait en plusieurs étapes et nécessite la réorganisation du cytosquelette d’actine pour permettre la migration et l’invasion cellulaire. La protéine Nck2 est un adaptateur protéique principalement impliqué dans la réorganisation du cytosquelette. Une étude préliminaire réalisée dans notre laboratoire avait révélé que les niveaux de la protéine Nck2 et de son ARNm sont augmentés dans les lignées de mélanome métastatiques en comparaison aux lignées primaires. Le but de la présente recherche était donc d’étudier le rôle de l’adaptateur Nck2 dans la progression métastatique. Les résultats obtenus confirment que l’expression de Nck2 augmente de façon marquée au cours de la progression métastatique du mélanome humain. Cette étude révèle en plus que l’expression de hauts niveaux de Nck2 dans les cellules de mélanome primaire stimule la prolifération cellulaire et la migration, n’affecte pas l’invasion d’une matrice de collagène de type I, mais semble affaiblir les contacts cellule-cellule et l’adhésion au substrat. Une étude préliminaire effectuée in vivo révèle que ces phénomènes se traduisent par une légère augmentation de la tumorigenèse et de la croissance tumorale. Dans l’ensemble, les résultats obtenus suggèrent que Nck2 pourrait effectivement jouer un rôle dans la progression métastatique du mélanome en favorisant la prolifération des cellules tumorales et en facilitant leur détachement de la tumeur primaire, les rendant plus aptes à se disperser dans l’organisme et à établir des colonies métastatiques. Au niveau moléculaire, nous proposons que Nck2 est recruté dans les invadopodes pour favoriser la formation de complexes protéiques qui stimulent l’invasion. La mobilisation de Nck2 dans ces structures membranaires diminuerait sa disponibilité pour l’établissent d’autres complexes protéiques, entre autres dans les complexes d’adhésion focaux (FAs) et dans les jonctions adhérentes, diminuant ainsi les contacts des cellules cancéreuses avec la matrice extracellulaire et les cellules avoisinantes. / The metastatic process is highly fatal in many cancers, including human melanoma. Metastatic progression is a multistep process in which cytoskeletal organization allows migration and invasion of cancer cells. Nck2 is an adaptor protein mainly associated with cytoskeletal organization. A preliminary study carried out in our laboratory has shown that Nck2 protein and mRNA levels are increased in metastatic melanoma cell lines compared to primary cell lines. In this study, the role of Nck2 in metastatic progression was further investigated. Results confirmed that Nck2 levels are increased in metastatic melanoma compared to primary cell lines. Nck2 overexpression in primary melanoma induced migration and cell proliferation, did not affect invasion in type I collagen matrix, but decreased cell-cell and cell-substrate adhesion. In addition, a preliminary in vivo study suggested that Nck2 overexpression slightly increased tumorigenesis and tumor growth in primary melanoma. All together, these results indicate that Nck2 may effectively influence metastatic progression of melanoma by increasing cancer cell proliferation and detachment from the primary tumor, allowing them to enter the blood circulation and form distant colonies. At the molecular level, we propose that Nck2 is recruited to invadopodia in order to form molecular complexes that increase cell invasion, and this may results in a decrease in Nck2 levels available to form other molecular complexes in others cell compartments, such as focal adhesions (FA) and adherent cell junctions.

La choroïde ou uvée, située entre la rétine et la sclérotique, est une membrane vasculaire qui tapisse la paroi de l'œil, son rôle est d'assurer l'apport en nutriment de la rétine et de l'iris. Ce tissu peut être le siège de nombreuses tumeurs, bénignes ou malignes. Le mélanome de la choroïde est la tumeur intra-oculaire la plus fréquente de l'adulte mais les facteurs de risque sont mal connus: l'exposition aux ultraviolets n'est pas clairement établi dans la genèse de la tumeur, de même que l'âge ou le sexe.L'énucléation a longtemps été considérée comme la seule option thérapeutique, mais depuis de nombreuses années, des techniques dites conservatrices de l'œil se sont développées. Des études ont montré qu'il n'y a pas de différence significative de survie entre les patients ayant subis une énucléation et les patients traités avec des méthodes conservatrices. De plus, à ce jour, aucune thérapie adjuvante n'a montré son efficacité après le traitement du mélanome oculaire primaire. En effet, malgré un traitement initial bien adapté, la moitié des patients va récidiver sur le mode métastatique. Environ 30\% des patients récidivent dans les 5 ans, ce chiffre augmente jusqu'à 50\% à 15 ans.L'œil étant dépourvu de structures lymphatiques, la diffusion métastatique du melanome uvéal se fait par voie hématogène. Le foie est le site privilégié de développement de métastases, faisant toute la gravité du pronostic. La médiane de survie après apparition de métastases est de 2 à 6 mois en l'absence de traitement. Il peut exister de façon plus anecdotique des métastases pulmonaires, ganglionnaires, osseuses ou cutanées.Sur un plan génétique, les critères les plus fréquemment détectés pour le mélanome uvéal sont la perte du chromosome 3 et le gain du 8q. Plusieurs études montrent dans beaucoup de cas des aberrations chromosomiques non aléatoires sur les chromosomes 1, 3, 6 et 8 et que la perte du chromosome 3 et le gain du 8q sont associés significativement à une survie réduite et au développement de métastase. Plusieurs rapports suggèrent deux entités distinctes de mélanome uvéal (avec et sans monosomie du chromosome 3) qui ne peuvent pas être différenciées du fait de leur aspect clinico-pathologique similaire.Afin d'améliorer le diagnostic et le traitement du mélanome de la choroïde, nous proposons d'effectuer des analyses d'expression et du nombre de copie d'ADN de ce mélanome particulier, avec pour objectifs : l'identification des gènes liés à l'apparition de métastase pour classer les patients à haut risque afin qu'ils puissent bénéficier d'une immunothérapie adjuvante spécifique, la caractérisation de ces gènes au niveau moléculaire, et l'étude du potentiel de ces gènes en tant que cibles thérapeutiques.Dans ce manuscrit je décrirai en détail le lignage mélanocytaire afin de comprendre les particularités du mélanome de la choroïde par rapport au mélanome cutané, puis j'aborderai l'importance des approches haut débit dans l'étude des cancers et les techniques d'analyse bioinformatiques utilisées. Je présenterai ensuite les différents résultats obtenus comme la mise en évidence d'une phosphatase, PTP4A3, qui semble avoir de l'importance dans le développement métastatique du mélanome de la choroïde.

Le traitement du mélanome métastatique est longtemps resté cantonné à quelques chimiothérapies cytotoxiques à efficacité limitée. Récemment, le développement des immunothérapies et des thérapies ciblées a constitué une avancée majeure dans la prise en charge du mélanome. La découverte de mutations oncogéniques sur les voies de signalisation de la cellule tumorale a permis de définir de nouvelles cibles pour le développement d' inhibiteurs pharmacologiques. Parmi ces mutations, la mutation BRAF V600E est présente dans 50% des mélanomes. Une des molécules anti-BRAF développée est le vémurafenib. L'efficacité de cette molécule a permis l'allongement de la durée de survie des patients en situation métastatique de 6 à 8 mois. Malheureusement, malgré la réponse initiale, l'échappement est la règle. Les mécanismes moléculaires responsables de la résistance acquise aux inhibiteurs de BRAF sont multiples et conduisent à l'activation de nombreuses voies de signalisation pour suppléer l'inhibition de BRAF. Actuellement la prise en charge des patients résistants aux inhibiteurs de BRAF n'est pas codifiée et s'avère complexe étant donné la multiplicité des mécanismes d'échappement. Dans le cadre de cette nouvelle approche de médecine personnalisée, de nouveaux outils doivent être développés dans le but (i) de tester l'efficacité de nouvelles molécules et (i) de tenter de prédire l'efficacité/la résistance des différents traitements disponibles. L'un de ces outils sont les xénogreffes de tumeurs issues directement des patients (Patient Derived Tumor Xenograft ou PDTX) ou " avatars ". Mon travail a consisté à mettre en place ce type d'outil pour répondre aux questions suivantes : Les modèles animaux développés sont-ils un bon modèle préclinique translationnel ? Permettent-ils d'étudier les modes d'action des nouvelles thérapies ciblées et d'explorer leurs mécanismes de résistance ? Si tel est le cas, peuvent-ils prédire une réponse clinique ? Différents modèles murins de xénogreffes de mélanome ont été mis au point et exploités. Des cellules tumorales puis des fragments de tumeurs ont été greffées en sous-cutané chez la souris immunodéficiente SCID. Les tumeurs ont été caractérisées en histologie et en biologie moléculaire pour montrer leur stabilité dans le modèle. Après plusieurs passages dans différentes générations de souris, les tumeurs conservent leurs mutations particulières. Par ailleurs différents traitements ont été administrés et la réponse à différentes stratégies thérapeutiques a été évaluée. Ce modèle nous a permis de valider l'efficacité des thérapies ciblées antiBRAF (vémurafenib) mais aussi d'autres approches visant les particularités métaboliques du mélanome. Le modèle avatar a permis de tester in vivo une association thérapeutique innovante qui associe un accélérateur de la phosphorylation mitochondriale, le DCA, et une molécule pro-oxydante, l'elesclomol, confirmant l'effet synergique obtenu in vitro. Par ailleurs l'elesclomol a pu être testé in vivo sur une tumeur devenue résistante à l'inhibiteur de BRAF, le vemurafenib. En outre, le modèle avatar constitue un bon modèle préclinique permettant d'aider directement le clinicien dans ses choix thérapeutiques. En effet nous avons réalisé une PDTX tout au long de l'évolution métastatique d'une patiente. Cette PDTX a permis de tester l'efficacité du vemurafenib et de réintroduire ce traitement à la patiente qui a pu bénéficier d'une amélioration clinique notable. 7 autres PDTX de patients ont été développées permettant de renforcer le modèle et de suivre de manière personnalisée le traitement de ces patients.Grâce à ce travail, nous définissons la place que peuvent prendre les avatars dans la prise en charge actuelle du mélanome métastatique. Ces modèles donnent une réponse précoce quant à leur résistance et aux alternatives thérapeutiques de seconde ligne.

20 000 Européens meurent chaque année du mélanome et le taux de mortalité ne cesse de s’accroître. Les cellules de mélanome se caractérisent principalement par la mutation des kinases RAS, B-RAF et RHO-B. Ces mutations leur confèrent une résistance aux agents chimiothérapeutiques. Un grand nombre de travaux a établi que les pigments d’algues présentent un intérêt majeur pour prévenir, diagnostiquer et traiter les cancers. L’objectif de ce travail de thèse est de réaliser un travail de recherche intégré pour identifier des pigments de microalgues pouvant présenter un intérêt pour le diagnostic ou le traitement des mélanomes et de caractériser leur activité pharmacologique. Notre choix s’est porté sur Porphyridium purpureum, une espèce qui contient des phycobiliprotéines, des caroténoïdes dont la zéaxanthine. Nous avons développé des procédés innovants pour l’extraction et l’identification des pigments de microalgues. Ce travail a permis de réaliser la première extraction de phycobiliprotéines assistée sous champ microondes ainsi que l’identification des pigments de microalgue par UPLC-MSE au sein d’un mélange complexe. De plus, nous avons montré l’activité pro-apoptotique de la zéaxanthine et la caractérisation de son mode d’action sur les cellules de mélanome humain A2058. L’IC50 obtenue pour ce pigment est inférieure à celle du cisplatine (agent chimiothérapeutique). Ces résultats montrent le fort potentiel de ce pigment pour le traitement du mélanome résistant à la chimiothérapie. / 20 000 Europeans die from melanoma each year and this number is constantly increasing. Melanoma cells are mainly characterized by the mutation of the RAS, B-RAF and RHO-B kinases. Because of these mutations, the cells are resistant to chemotherapeutic agents. A lot of studies have established that the algae pigments are of major interest to prevent diagnose and treat cancers. The objective of this thesis is to undertake an integrated research work to identify microalgae pigments that may be relevant for the diagnosis or treatment of melanomas and to characterize their pharmacological activity. We selected Porphyridium purpureum, a species which contains phycobiliproteins, carotenoids including zeaxanthin. We developed innovative processes for the extraction and identification of microalgae pigments. This work resulted in the first extraction of phycobiliproteins under microwave-assisted irradiations, and the identification of microalgae pigments by UPLC-MSE within a complex mixture. Moreover, we demonstrated the proapoptotic activity of zeaxanthin and the characterization of its mode of action on A2058 human melanoma cells. The CI50 obtained for this pigment is lower than that of cisplatin (chemotherapeutic drug). These results show the great potential of this pigment for the treatment of melanoma which are resistant to chemotherapy.

Un naevus congénital mélanocytique (CMN) est une prolifération bénigne de mélanocytes cutanés, cliniquement apparente à la naissance. On en retrouve chez approximativement 1% des nouveau-nés. Les CMN de taille large (LCMN), définis par un diamètre le plus large de plus de 20 cm, affectent environ 1 nouveau-né sur 20.000.<p>Puisque les LCMN ont une propension à dégénérer en tumeur mélanomateuse (dans 2 à 5% des cas) et que leur grande taille apporte un contingent cellulaire abondant, ils représentent un bon modèle d’étude des étapes initiales de la mélanotumorigénèse. Nous disposions précisément de cultures primaires de mélanocytes établies à partir de vingt-sept cas de naevi congénitaux (24 de taille large et 3 de taille moyenne (MCMN)) curetés pour la plupart chez des enfants en période néonatale.<p>La première phase de ce projet a permis d’identifier un mécanisme alternatif d’activation de l’oncogène BRAF dans deux cas de LCMN. Nous avons en effet mis en évidence dans ces deux cas de LCMN une translocation chromosomique entrainant une activation constitutive de BRAF par le biais d’une perte de son domaine auto-inhibiteur. Si des mutations activatrices de BRAF sont fréquemment rencontrées dans les tumeurs mélanocytiques, elles restent rares dans les naevi congénitaux et les mélanomes survenant dans des zones non exposées au soleil. Les translocations chromosomiques décrites ici pourraient représenter un mécanisme moléculaire récurrent d’activation de l’oncogène BRAF dans ces groupes de tumeurs mélanocytiques.<p>La seconde phase du projet consistait à réaliser sur notre série de 27 L/MCMN des analyses caryotypiques, des analyses « mutationnelles » (pour rechercher la présence de mutations activatrices des oncogènes BRAF et NRAS) et des études d’expression différentielle.<p>A l’inverse de ce que l’on observe dans le mélanome malin, les anomalies chromosomiques sont rares et isolées, reflétant très probablement le caractère bénin de ces lésions.<p>La mutation BRAFV600E a été mise en évidence pour 4/27 CMN (15%), des mutations du gène NRAS pour 19/27 (70%), soit une situation en miroir de ce que l’on observe dans les CMN de petite taille (SCMN) et dans les naevi acquis bénins, confirmant les résultats obtenus par d’autres. <p>L’étude du profil d’expression transcriptionnelle révèle des dysrégulations communes à l’ensemble des échantillons naeviques, comme une franche augmentation d’expression du transcrit de l’Ostéopontine.<p>Le profil d’expression des échantillons de CMN BRAFV600E semble refléter une réduction de la synthèse et de la distribution de pigment et une activation de gènes impliqués dans la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN. Comme des altérations des mécanismes de la pigmentation peuvent générer des dommages oxydatifs au niveau de l’ADN, l’activation de la réponse cellulaire aux dommages à l’ADN pourrait refléter la capacité des cellules naeviques à se protéger contre le stress cellulaire. Enfin, on observait aussi une expression élevée de gènes médiant la chimiorésistance dans différents cancers, ce qui pourrait éventuellement jouer un rôle dans l’inefficacité caractéristique et bien connue de la chimiothérapie dans le mélanome malin.<p> / Doctorat en Sciences médicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le mélanome est un cancer de la peau très agressif. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) est un facteur de transcription clé contrôlant le développement de la lignée mélanocytaire, ainsi que la prolifération et l’invasion des cellules de mélanome. Pour mieux comprendre les fonctions de MITF, nous avons identifié ses cofacteurs impliques dans la régulation de la transcription. Nous avons montré que le complexe de remodelage de la chromatine NURF interagit avec MITF. Ma thèse a consisté à élucider le rôle de NURF dans le mélanome et les mélanocytes. La perte de BPTF, la principale sous-unité de ce complexe, induit un arrêt de la prolifération et une entrée en senescence des cellules de mélanome. Nous avons montré que BPTF et MITF coopèrent pour réguler l’expression de gènes impliqués dans la prolifération and invasion suggérant que BPTF et un cofacteur de MITF. De façon inattendue, l’inactivation de BPTF spécifiquement dans les mélanocytes entraine la perte progressive et totale de la pigmentation du pelage en raison de l’incapacité des cellules souches mélanocytaire à produire une descendance fonctionnelle. C’est la première fois que l’interaction fonctionnelle entre NURF et MITF est démontrée in vitro, complétée par des observations phénotypique uniques in vivo, contribuant à la compréhension de la biologie des mélanocytes et du mélanome. / Melanoma is a highly aggressive form of skin cancer. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) isa key regulator of development of the melanocyte lineage and proliferation and invasion of melanoma cells.To further elucidate the functions of MITF, we identified factors co-regulating transcription with MITF. We identified the NURF chromatin-remodeling complex as MITF interactor. My thesis aims to elucidate the role of NURF in melanoma and melanocytes. Loss of BPTF, the principal subunit of the complex, led to arrest of proliferation and entry into senescence of melanoma lines. We showed BPTF and MITF co-regulate genes involved in proliferation and invasion suggesting that BPTF acts as cofactor for MITF. Remarkably, the mouse model of melanocyte-specific BPTF ablation led to progressive and complete loss of coat pigmentation due to the inability of the melanocyte stem cells to produce functional progeny. This is the first report of NURF-MITF functional interaction in vitro, complemented with a unique in vivo phenotype, both adding to a general understanding of melanocyte and melanoma biology.

L'infiltration des mélanomes par les macrophages (TAM) est souvent corrélée à un mauvais pronostic. Cependant, les mécanismes qui régulent le recrutement et la fonction de ces cellules restent encore mal compris. Des études récentes ont montré un rôle majeur de la sphingosine kinase 1 (SK1) tumorale, l'enzyme qui produit la sphingosine-1-phosphate (S1P), dans le remodelage du stroma associé à la tumeur. Le but de ce projet a été d'étudier le rôle de la SK1 tumorale sur le microenvironnement inflammatoire, et en particulier les macrophages, lors du développement des tumeurs mélaniques. In vitro, nous avons montré que l'inhibition de SK1 dans les cellules de mélanome : 1) bloque la migration des macrophages. A l'inverse, la surexpression de cette kinase dans les cellules tumorales stimule la migration des cellules inflammatoires. Cet effet est dépendant de la S1P et de sa fixation sur les récepteurs S1PR présents à la surface des macrophages ; 2) réduit la sécrétion de TGF-ß et 3) stimule la différenciation des macrophages vers un phénotype M1 antitumoral. Ce phénomène n'est pas dépendant de la S1P, ni des S1PRs, mais de la sécrétion de TGF-ß par les cellules tumorales. En effet, la différenciation macrophagique peut-être réversée par l'addition de TGF-ß recombinant dans le milieu de sécrétion des cellules tumorales. In vivo, nos résultats montrent que la greffe orthotopique, i.e. intradermique, de cellules de mélanome murin invalidées pour la SK1 à des souris syngéniques C57BL/6 est associée à une réduction de la croissance tumorale, comparée à des souris ayant reçu des cellules de mélanome contrôles. De plus, l'invalidation de la SK1 tumorale conduit à une augmentation significative de l'expression de cytokines anti-tumorales ainsi qu'à une polarisation Th1 au sein de la tumeur. Ce phénomène s'accompagne d'une réduction du pourcentage de macrophages M2 CD206+MHCIIlow, et à l'inverse, d'une augmentation du pourcentage de macrophages M1 CD206-MHCIIhigh ainsi que de lymphocytes T CD4+ et CD8+ infiltrés dans la tumeur. Ces résultats suggèrent un rôle clé de la SK1 tumorale dans le recrutement et la polarisation des macrophages dans les mélanomes. Ainsi, l'axe SK1/ TGF-ß pourrait constituer une cible thérapeutique prometteuse dans le contrôle de la croissance de cette tumeur. / Melanoma infiltration by macrophages (TAM) is often correlated with poor prognosis. However, the mechanisms that regulate the recruitment and function of these cells remain poorly understood. Recent studies have shown a major role of tumor sphingosine kinase 1 (SK1), the enzyme that produces sphingosine-1-phosphate (S1P), in tumor stroma remodeling. The aim of this project was to investigate the role of tumor SK1 on the inflammatory microenvironment, particularly macrophages, during the development of melanoma. In vitro, we showed that the inhibition of SK1 in melanoma cells: 1) blocks macrophage migration. Conversely, overexpression of this kinase in tumor cells stimulates the migration of inflammatory cells. This effect is dependent on S1P binding to its receptors (S1PR) on the macrophage surface; 2) reduces the secretion of TGF-ß and 3) stimulates macrophage differentiation towards an antitumor M1 phenotype. The latter phenomenon does not depend on S1P nor S1PRs, but on the secretion of TGF-ß by tumor cells. Indeed, macrophage differentiation can be reversed by adding recombinant TGF-ß in the tumor cell-conditioned medium. In vivo, our results showed that orthotopic injection, i.e. intradermal, of murine melanoma cells invalidated for SK1 in C57BL / 6 syngenic mice was associated with a reduction in tumor growth compared to mice having received control melanoma cells. Furthermore, the invalidation of tumor SK1 leads to a significant increase in the expression of anti-tumor cytokines and a Th1 polarization within the tumor. This phenomenon is accompanied by a reduction in the percentage of CD206+MHCIIlow M2 macrophages, and conversely, an increase in the percentage of M1 macrophages CD206-MHCIIhigh as well as CD4+ and CD8+ cells infiltrated into the tumor. These results suggest a key role of tumor SK1 in the recruitment of macrophages and their polarization in melanoma. Thus, the axis SK1 / TGF-ß could be a promising therapeutic target in controlling the growth of this tumor.