Le mélanome métastatique est un des cancers les plus agressifs avec une croissance constante du nombre de nouveaux cas par an dans le monde.Deux mutations sont principalement à l’origine de ce cancer : BRAF(V600) et NRAS(Q61). Les principaux traitements sont des thérapies ciblant BRAF lui-même ou MEK, prescrites en monothérapie ou en combinaison. La moitié des patients répondent à ce traitement mais malheureusement rechutent dans les 6 mois à 1 an après le début du traitement. Les mécanismes de résistance décrits passent par une réactivation de la voie des MAPK, de la voie PI3K/Akt/mTOR ou par une dérégulation de l’apoptose.Les deux premières voies de signalisation permettent la régulation d’un complexe : le complexe d’initiation de la traduction eIF4F. Ce complexe est composé de 3 protéines : eIF4E, une protéine qui s’associe à la coiffe 7-methyl-guanosine, eIF4A une hélicase et eIF4G une protéine échafaudage dont un des rôles est de maintenir la cohésion de ce complexe.Le complexe eIF4F étant en aval de deux voies dérégulées dans le mélanome, le but de ma thèse a été de mettre en évidence une potentielle implication de ce complexe dans la résistance aux thérapies ciblant BRAF et MEK.Pour cela, dans un premier temps, nous avons traiter des lignées cellulaires de mélanome BRAF(V600) sensibles et résistantes aux anti-BRAF et anti-MEK. Nous avons ensuite quantifié les interactions eIF4E-eIF4G, synonymes d’activation du complexe eIF4F, et les interactions eIF4E-4EBP1, synonymes d’inhibition de la traduction par une technique de Proximity Ligation Assay (PLA). Ces expériences ont permis de conclure que les inhibiteurs de BRAF et de MEK induisaient une dissociation du complexe dans les lignées sensibles, alors qu’il reste maintenu dans les lignées résistantes. Ces résultats ont été confirmés sur des tumeurs de patients répondeurs et non répondeurs à ces mêmes traitements. Par la suite, nous avons reproduits ces expériences avec un panel de lignées cellulaires mutées en NRAS(Q61) et avons observé les mêmes résultats.Nous avons donc pu mettre en évidence l’implication du complexe eIF4F dans la résistance aux thérapies ciblant la voie des MAPK dans les mélanomes mutés en BRAF et en NRAS, mais également découvert une nouvelle cible thérapeutique potentielle.La seconde partie de cette thèse a consisté au test de plusieurs inhibiteurs connus et spécifiques d’eIF4A (silvestrol, flavaglines, hippuristanol, patéamine A) ou de l’interaction eIF4E-eIF4G (4EGI1). Tous ces inhibiteurs ont sensibilisé les lignées résistantes aux thérapies ciblées mais aucun ne pouvait être potentiellement utilisable en clinique.L’utilisation d’un vecteur bicistronique dans le cadre d’un criblage de drogue a permis d’identifier 4 flavaglines qui inhibent significativement le complexe d’initiation de la traduction. L’une d’entre elles (FL3) a été testé in vivo dans un modèle de xénogreffes issues de lignées cellulaires de mélanomes résistantes. Les résultats ont montré un effet synergique de cette drogue en combinaison avec le vemurafenib (anti-BRAF) ainsi qu’une inhibition de la croissance tumorale. En conclusion, nous avons identifié une nouvelle cible thérapeutique et un nouveau biomarqueur de résistance aux thérapies ciblées dans deux contextes mutationnels de mélanome différents : BRAF et NRAS. / In BRAF(V600) or NRAS(Q61)-mutant tumours, most mechanisms of resistance to drugs that target the BRAF and/or MEK kinases rely on reactivation of the RAS–RAF–MEK–ERK mitogen-activated protein kinase (MAPK) signal transduction pathway or on activation of the alternative PI(3)K–AKT–mTOR pathway (which is ERK independent). These two pathways converge to regulate the formation of the eIF4F eukaryotic translation initiation complex. By using an in situ method to detect the eIF4E-eIF4G and eIF4E-4EBP1 interactions, we recently showed that the persistent formation of the eIF4F complex, comprising the eIF4E cap-binding protein, the eIF4G scaffolding protein and the eIF4A RNA helicase, is associated with resistance to anti-BRAF and/or anti-MEK in BRAF(V600)-mutant cancer cell lines. We next focused on NRAS-mutant cancer cell lines and found that this complex is also involved in the resistance to anti-MEK compounds. Strikingly, inhibiting the eIF4F complex in BRAF or NRAS-mutated cell lines is able to overcome resistance and to synergize with drugs targeting BRAF or MEK kinases. As a result, eIF4F appears to be a promising therapeutic target in a BRAF or NRAS-mutation context.

Le but de ce travail de thèse a été d’identifier par séquençage d’exomes, de nouveaux gènes de prédisposition dans 2 pathologies rares dont l’étiologie est peu connue. Le 1er projet a porté sur une famille à 3 cas de sarcomes, sans mutation du gène TP53. Nous avons identifié une mutation pathogénique du gène CDKN2A, dans les 3 cas. Le gène CDKN2A étant le gène majeur de prédisposition au mélanome, nous avons recherché parmi 3 collections différentes des cas de sarcomes associés à une mutation du gène CDKN2A. Nous avons identifié 8 cas de sarcomes indépendants, porteurs d’une mutation du gène CDKN2A et montré une perte d’hétérozygotie au niveau du site de la mutation constitutionnelle CDKN2A dans 5/7 cas, montrant ainsi une perte de fonction complète. Les sarcomes étant rares chez les porteurs de mutations CDKN2A, nous avons recherché des variants rares modificateurs potentiels, par séquençages d’exomes constitutionnels des 8 cas index, et identifié 3 variants du gène PDGFRA. Des études de modélisation ont montré que 2 de ces variants, pourraient avoir un impact sur la structure du domaine extracellulaire de la protéine PDGFRA. Nous avons ainsi démontré que le gène CDKN2A peut prédisposer aux sarcomes et identifié PDGFRA comme gène modificateur potentiel.Dans le second projet nous avons travaillé sur les mélanomes de l’enfant, d’apparence sporadique. Notre hypothèse de travail était que ces mélanomes surviennent suite à un accident génétique de novo. Nous avons analysé des exomes constitutionnels de 41 trios (enfant atteint et ses 2 parents sains). Nos analyses bio-informatiques ont montré l’existence de mutations de novo post-zygotiques de gènes impliqués dans le développement de la crête neurale ou le cancer, dans 5 cas. Les analyses plus complètes des exomes tumoraux sont en cours, ainsi que des études fonctionnelles des gènes et de leurs mutations, dans un modèle d’embryon de poulet. Ce travail permettra d’accroitre la compréhension des mécanismes moléculaires et cellulaires dérégulés dans ces maladies, ouvrant ainsi, de nouvelles perspectives thérapeutiques. / The aim of this thesis was to identify by sequencing of exomes new predisposing genes in 2 rare pathologies whose etiology is not well known.The first project involved a family with 3 cases of sarcomas, without mutation of TP53 gene. We identified a pathogenic mutation of the CDKN2A gene, in the 3 cases. Since CDKN2A gene is the major melanoma predisposing gene, we have searched in 3 different collections, sarcoma cases link to CDKN2A mutations. In total, we have identified 8 independent sarcomas cases, carrying a germline mutation of the CDKN2A gene and showed a loss of heterozygosity at the site of the constitutional mutation of CDKN2A in 5/7 cases, thus proving a complete loss of function. Since sarcomas are rare in carriers of CDKN2A mutations, we looked for potential modifying rare variants, by sequencing constitutional exomes of the 8 index cases, and identified 3 variants of the PDGFRA gene. Modeling studies have shown that 2 of these variants could have an impact on the structure of the extracellular domain of the PDGFRA protein. We have thus demonstrated that the CDKN2A gene can predispose to sarcomas and identified PDGFRA as a potential modifier gene. In the second project, we worked on childhood melanomas, of sporadic appearance. Our working hypothesis was that these melanomas occur as a result of a de novo genetic accident. We analyzed constitutional exomes of 41 trios (affected child and his 2 healthy parents). Our bioinformatics analyzes identified the existence of de novo post-zygotic mutations of genes involved in neural crest development or cancer, in 5 cases. More complete analyzes of tumor exomes are underway, as well as functional studies of genes and their mutations, in a chick embryo model.This work improves the understanding of molecular and cellular mechanisms that are deregulated in these diseases, thus opening up new therapeutic perspectives.

Le mélanome constitue un problème majeur de santé publique. En 2018, on estimait à 15 513 nouveaux cas en France et 1975 décès dûs à ce cancer. S’il ne représente qu’environ 10% des cancers cutanés, il est le plus agressif en raison de son très fort potentiel métastatique. Le développement de ces métastases met en jeu différentes étapes qui nécessitent d’être coordonnées par un ensemble de gènes. Dans les mélanomes, le facteur de transcription MITF connu pour son importance dans la différenciation et la survie des mélanocytes, joue ainsi un rôle majeur dans la progression tumorale. Plusieurs altérations génétiques telles que des mutations ou amplifications du gène ont été décrites et montrent son caractère oncogène, sans que les mécanismes expliquant les conséquences de ces modifications soient encore bien compris. Les altérations génétiques de MITF ne sont pas les seuls événements impliqués dans la mélanomagenèse. Les variations des niveaux d’expression de MITF sont également déterminantes dans l’évolution du mélanome. En effet, si son expression stimule la prolifération, son inhibition est nécessaire à l'émergence des métastases. Il est donc essentiel de comprendre les mécanismes en aval de ce facteur de transcription impliqués dans la progression tumorale.Mes travaux de thèse s’articulent autour de deux axes qui visent à mieux comprendre l’influence de MITF dans l’invasion. Le premier consiste à étudier les effets d’une mutation de MITF dans la progression tumorale du mélanome. Une analyse comparative de plusieurs lignées de mélanomes exprimant la forme sauvage ou mutée de MITF a ainsi permis d’identifier S100A4 comme étant différentiellement régulé dans les mélanomes mutés pour MITF. Notre étude montre que MITF réprime l’expression de S100A4 et que cette répression est levée lorsque MITF est muté, ce qui a pour conséquence de stimuler le potentiel d’invasion des mélanomes. Ces résultats sont confirmés par les données cliniques qui montrent que les patients atteints de mélanomes et présentant une amplification de S100A4 ont une espérance de vie plus faible que les patients où l'expression de S100A4 n'est pas altérée.Le deuxième axe de mon projet s’intéresse au rôle d’une cible en aval de MITF, le récepteur à l’IGF2 (IGF2R), dont l’expression est nécessaire à l’invasion des mélanomes. L'analyse des différentes fonctions de ce récepteur ont révélé que son rôle dans l’adressage des hydrolases vers les lysosomes est requis pour que ces cellules soient invasives. Ce transport nécessite le marquage des hydrolases au mannose-6-phosphate notamment catalysé par l’enzyme codée par GNPTAB dans l’appareil de Golgi et la perte d’expression de ce gène entraîne le même effet que la déplétion d’IGF2R, à savoir une inhibition forte de l’invasion. De manière intéressante, la déplétion d’IGF2R et de GNPTAB induit également une augmentation du nombre de lysosomes, associée à une augmentation de l’expression de TFEB, un régulateur connu de la biogenèse des lysosomes. Nos résultats montrent que ce facteur de transcription appartenant à la même famille que MITF est également impliqué dans la régulation de l’invasion tumorale des mélanomes. / Melanoma constitutes a major public health issue. In 2018, we estimated 15 513 new melanoma cases in France and 1975 deaths caused by this cancer. If it only represents 10% of all cutaneous cancers, it is the most aggressive one due to its high potential to form metastasis. Metastasis cascade is a multi-step process requiring the coordination of specific genes. In melanoma, the microphthalmia-associated transcription factor MITF, the master regulator of melanocyte differentiation and survival has also a crucial role during melanoma tumor progression. Some genetic alterations have been described, mutations and gene amplification, and showed its oncogenic properties, even if mechanisms associated to these genetic modifications in tumor progression remained unknown. Genetic alterations of MITF are not the only events involved in melanomagenesis. In fact, MITF expression levels are determining for melanoma evolution. MITF expression activates proliferation and its inhibition is necessary for metastasis. It is therefore crucial to understand what are the mechanisms downstream of MITF, involved in tumor progression.My PhD project is indeed organized in two different axis, in order to better understand the importance of MITF in melanoma invasion. The first one consisted to study the impact of a single-point MITF mutation in melanoma tumor progression involving direct regulation of S100A4 gene. A comparative analysis using melanoma cell lines expressing the wild-type or mutated form of MITF led us to identify S100A4 as one of the most up-regulated genes in MITF-mutant melanoma. Our findings showed us that the MITFE87R mutant form increases S100A4 transcription, whereas the wild-type form of MITF has an opposite effect. This regulation is important in melanoma tumor progression because it can stimulate invasive potential of non-invasive melanoma. These results are confirmed by clinical data showing that harboring S100A4 amplification is associated to a poor prognosis in melanoma patients, compared to patients presenting no S100A4 alteration.The second axis was interested in the role of IGF2 receptor (IGF2R), a MITF target gene known to regulate melanoma invasion. Among all the different functions attributed to this receptor, our data indicates that only its role in hydrolase trafficking to lysosomes is required for invasion. This transport requires mannose-6-phosphate binding to these hydrolases by the enzyme encoding by GNPTAB gene in Golgi apparatus; loss of GNPTAB expression leads to the same effect as IGF2R depletion, a high decrease of melanoma invasion. Interestingly, IGF2R and GNPTAB depletion also induce an increase in lysosome number, associated to an increase of TFEB expression, a well-known regulator in lysosome biogenesis. Our data showed that this member of the same MiT-TFE family as MITF is also involved in this melanoma invasion regulation.

Le mélanome uvéal représente la majorité des cancers primaires intraoculaires chez l'adulte et 90% des cas sont situés dans la choroïde. Souvent, le mélanome uvéal est traité par curiethérapie ou radiothérapie interne. Dans ce traitement, une plaque épisclérale contenant des sources radioactives est placée par chirurgie sur la sclère du patient afin d'y déposer une dose énergétique permettant de faire diminuer le volume tumoral. Le mélanome uvéal se caractérise par des différences dans les niveaux de radiosensibilité des cellules présentes dans la tumeur. Or, ce facteur n'est pas considéré dans les modèles dosimétriques (« fantômes ») actuellement employés par les physiciens médicaux pour la planification du traitement de curiethérapie. Ce projet de maîtrise consiste à concevoir un fantôme dosimétrique à base d'hydrogel, produit par bioimpression, reprenant certaines caractéristiques géométriques de l'œil, et contenant des cellules présentant différents niveaux de radiosensibilité. Pour ce faire, un hydrogel à d'alginate (fonction mécanique), de gomme de xanthane (fonction imprimabilité) et de collagène de type I (fonction cellulaire) a été optimisé en fonction de son imprimabilité en appareil de bioimpression. Une technique a été développée, permettant l'impression d'un dôme d'hydrogel reprenant la géométrie d'une sclère humaine. La viabilité de cellules du mélanome uvéal dans l'hydrogel a été quantifiée pour trois (3) lignées (Mel270, Mμ2, 92.1) possédant des niveaux de radiosensibilité différents, ainsi que pour une lignée saine (fibroblastes stromaux choroïdiens). Ces tests, comparant les valeurs de viabilité avec et sans procédure de bioimpression, ont permis de déterminer la fenêtre optimale d'utilisation des différentes lignées cellulaires pour des expériences de dosimétrie futures. Le modèle de fantôme ainsi développé permettra d'imprimer des formes tumorales contenant des cellules de différents niveaux de radiosensibilité, afin de mieux mesurer le dépôt de la dose par les plaques épisclérales sur les cellules du mélanome uvéal et de la sclère pendant le traitement de curiethérapie. / Uveal melanoma is the most frequent type of intraocular primary cancer and 90% of these tumours are located in the choroid. Uveal melanoma is usually treated by brachytherapy or internal radiotherapy. In this treatment, an episcleral plaque containing radioactive sources is surgically placed onto the patient's sclera to deposit an energetic dose that will reduce the tumor volume. Uveal melanoma is known to be a type of cancer that shows a wide range of radiosensitivity among the different cells that compose the tumour. However, radiosensitivity data are not taken into account in the current dosimetry models ("phantoms") used to prepare the treatment by the medical physicists. This master's project aims at developing, by 3D printing, an eye-shaped cell-laden hydrogel dosimetry phantom that could be used for studying the effect of radiotherapeutic treatments on different cell types that are associated with different radiosensitivity levels. A hydrogel of alginate (mechanical function), collagen type I (cellular function) and xanthan gum (printability function) was optimized for its printability. A technique was developed to print a dome-shaped hydrogel having the geometry of the human sclera. The cell viability of uveal melanoma in the hydrogel was quantified for 3 cell lines (Mel270, Mμ2, 92.1) having different levels of radiosensitivity, as well as for a healthy cell line (choroidal stromal fibroblasts). These tests that compare the cell viability with and without printing procedures indicated the optimal window for the use of the different cell lines in future dosimetry experiments. The dosimetry phantoms model thus developed will allow the printing of tumor shape containing cells with different radiosensitivity level to better measure the deposition of the dose by the episcleral plaque son uveal melanoma cells and the sclera during the treatment of brachytherapy.

La transformation maligne des mélanocytes de l'uvée mène au principal cancer intraoculaire chez l'adulte, le mélanome uvéal (MU). Plus de 50% des patients atteints de cette maladie développent des métastases principalement au foie, la survie des patients n'étant alors que de quelques mois, ce qui fait du MU un cancer rare mais très agressif. De plus, 40% des patients ne présentent aucun symptôme lors de la formation de la tumeur intraoculaire, ni douleurs ou troubles visuels, ce qui explique la présence antérieure de métastases hépatiques lors du dépistage de la tumeur primaire intraoculaire. Dans la littérature, l'analyse moléculaire de l'expression de 12 gènes, incluant le récepteur 2B à la sérotonine (HTR2B), permet d'identifier les patients à risque d'évoluer vers la forme métastatique et agressive de la maladie. La surexpression du gène HTR2B est l'élément le plus discriminant de cette signature, cette surexpression étant observée chez les patients qui développent des métastases. L'objectif central de ce projet consistait à étudier la régulation de l'expression du gène HTR2B dans les lignées de MU. Pour ce faire, notre premier volet s'intéressait aux facteurs de transcription (FTs) qui modulent la transcription du gène HTR2B. HTR2B étant un récepteur hormonal, la liaison de la sérotonine à celui-ci active la voie de signalisation JAK (Janus Kinase) /STAT (Signal Transducer and Activators of Transcription), qui à son tour, peut altérer l'expression du gène HTR2B. Ce type de boucles de rétroaction est très documenté dans la littérature, dans les systèmes de récepteurs hormonaux semblables à notre gène HTR2B, afin d'éviter que la signalisation ne s'emballe. Nous avons démontré que HTR2B est sous le contrôle des FTs appartenant à la famille STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) via un élément de régulation qui se situe 280 paires de bases (pb) en amont du site d'initiation de la transcription du gène HTR2B, et que la liaison des protéines STAT à cet élément active la transcription du gène HTR2B dans nos lignées de MU. Les niveaux d'expression d'une protéine sont tout aussi bien contrôlés au niveau transcriptionnel que traductionnel, voir même post-traductionnel. Dans le second volet, nous nous sommes intéressés aux modifications post-traductionnelles de la protéine HTR2B dans nos lignées de MU, et vérifier si ces dernières pouvaient contribuer, au moins en partie, aux altérations de l'expression du gène HTR2B dans les lignées de MU. Les modifications post-traductionnelles servent, entre-autre, à l'activation de certains sentiers signalétiques, mais elles modifient également la stabilité des protéines et leur devenir. C'est le cas de l'ubiquitination qui oriente globalement les protéines cibles vers le système de dégradation ubiquitine-protéasome (SUP). Les lignées métastatiques de MU se caractérisent par des niveaux élevés d'activité du SUP. Cependant, nos travaux ont permis de démontrer que cette activité accrue du SUP ne semble avoir que peu d'impact sur le niveau global de HTR2B, qui semble être stabilisé sous sa forme ubiquitinée dans les lignées métastatiques. Dans le dernier volet, nous nous sommes intéressés aux modifications post-traductionnelles subies par les FTs STAT qui modulent l'expression du gène HTR2B dans le MU. Les résultats préliminaires que nous avons obtenus démontrent une hyperglycosylation de la protéine STAT3 dans les lignées métastatiques de MU, ainsi qu'une forte ubiquitination de celle-ci, cette forme hyperglycosylée/ubuiquitinée semblant s'avérer beaucoup plus stable dans les lignées métastatiques. Nos travaux permettent ainsi de mieux comprendre la mécanistique de régulation de l'expression du gène HTR2B humain, qui joue un rôle central dans le dépistage des patients à risque d'évoluer vers la forme métastatique du MU. Ils vont, en outre, permettre également d'identifier de nouveaux FTs/gènes qui pourraient affiner la signature moléculaire servant au dépistage des patients à haut risque de développer la forme métastatique de la maladie. La portée clinique de notre projet est donc élevée. / The malignant transformation of uveal melanocytes leads to the primary intraocular cancer in adults, uveal melanoma (UM). Over 50% of patients with this disease develop metastases primarily to the liver, with patient survival typically only extending for a few months, underscoring UM's rarity but high aggressiveness. Additionally, 40% of patients exhibit no symptoms during the formation of the intraocular tumor, such as pain or visual disturbances, potentially explaining the presence of hepatic metastases upon primary intraocular tumor screening. In literature, molecular analysis of the expression of 12 genes, including the serotonin receptor 2B (HTR2B), helps identify patients at risk of progressing toward the metastatic and aggressive form of the disease. Overexpression of the HTR2B gene stands out as the most discriminating element within this signature, observed in patients who develop metastases. The primary objective of this project was to study the regulation of the HTR2B gene expression in UM cell lines. To achieve this, our initial focus was on transcription factors (TFs) that modulate the transcription of the HTR2B gene. As HTR2B is a hormonal receptor, serotonin binding by this receptor activates the JAK (Janus Kinase)/STAT (Signal Transducer and Activators of Transcription) signaling pathway, which can in turn alter the expression of the HTR2B gene. Such feedback loops are extensively documented in the literature within hormonal receptor systems akin to our HTR2B gene, aiming to prevent signaling overdrive. We demonstrated that HTR2B is under the control of transcription factors belonging to the STAT (Signal Transducer and Activator of Transcription) family via a regulatory element located 280 base pairs upstream of the HTR2B gene's transcription initiation site. The binding of STAT proteins to this element activates the transcription of the HTR2B gene in our UM cell lines. Protein expression levels are equally controlled transcriptionally, translationally, and even post-translationally. In the second phase, we investigated post-translational modifications of the HTR2B protein in our UM cell lines, assessing whether these could contribute, at least partly, to the alterations in HTR2B gene expression in UM cell lines. Post-translational modifications serve various purposes, including pathway activation, but also affect protein stability and fate. Ubiquitination, for instance, generally directs targeted proteins toward the ubiquitin-proteasome degradation system (UPS). Metastatic UM cell lines are characterized by heightened UPS activity. However, our work demonstrated that this increased UPS activity appears to have minimal impact on the overall level of HTR2B, which seems to be stabilized in its ubiquitinated form in metastatic cell lines. In the final phase, we investigated the post-translational modifications undergone by STAT TFs that modulate HTR2B gene expression in UM. Our preliminary results highlighted the hyperglycosylation of the STAT3 protein in metastatic UM cell lines, alongside significant ubiquitination, suggesting that this hyperglycosylated/ubiquitinated form proves considerably more stable in metastatic cell lines. Our research thus provides better insights into the mechanistic regulation of human HTR2B gene expression, crucial in identifying patients at risk of developing the metastatic form of UM. Moreover, it will aid in identifying new TFs/genes that could refine the molecular signature used to screen patients at high risk of developing the metastatic form of the disease. Hence, the clinical implications of our project are substantial.

Le mélanome uvéal est une tumeur intraoculaire fortement métastatique: plus de 50% des patients développent des métastases au foie malgré le traitement de la tumeur oculaire. Des analyses immunohistochimiques ont démontré précédemment une corrélation entre l’expression du principal médiateur de la réponse à l’hypoxie hypoxia-inducible factor 1 alpha et le développement de métastases. Nous avons donc exposé des cellules tumorales du mélanome uvéal et des mélanocytes de la choroïde à des taux d'oxygène hypoxiques ou à 21% afin de comparer leur transcriptome, leur prolifération, leur métabolisme énergétique et leur chimiorésistance. Nos analyses du transcriptome des cellules tumorales hypoxiques ont montré qu’il y avait une répression des transcrits de différenciation du mélanocyte ainsi qu’une surexpression de transcrits associés à la glycolyse aérobique (e.g. LDHA, PKM2). Nous avons également observé un ralentissement de la prolifération des cellules tumorales et une résistance accrue aux fortes concentrations de l’agent chimiothérapeutique cisplatine en conditions hypoxiques. / Uveal melanoma is the most common intraocular tumor in adults and is highly metastatic: up to half of patients develop metastases to the liver following the eye treatment. Previous immunohistochemistry analyses showed a correlation between the expression of hypoxia-inducible factor 1 alpha and the development of metastases. We therefore exposed uveal melanoma cells and choroidal melanocytes to hypoxic oxygen levels or to 21% O2 in order to compare their transcriptome, proliferation, energetic metabolism and chemoresistance. Our analyses of the transcriptome of hypoxic uveal melanoma cells showed a downregulation of melanocyte differentiation transcripts and an upregulation of transcripts associated to aerobic glycolysis (e.g. LDHA, PKM2). We also observed a reduction of tumor cell proliferation and a greater resistance to high concentrations of the chemotherapeutic agent cisplatin in hypoxic conditions.

Le réseau vasculaire est composé non seulement des vaisseaux sanguins mais aussi des vaisseaux lymphatiques. Les premiers assurent l'approvisionnement des cellules en nutriments et oxygène et la récolte de leurs déchets métaboliques tandis que les seconds collectent les fluides, macromolécules et cellules immunitaires extravasés dans les tissus interstitiels pour les ramener à la circulation sanguine. Au cours de ces travaux de recherche, nous avons mis au point un substitut cutané reconstruit par génie tissulaire, contenant un réseau sanguin fonctionnel, exempt de toute matière exogène et potentiellement autologue. Ses applications cliniques sont particulièrement prometteuses puisque l'une des raisons majeures d'échec des greffes de peau sur les patients grands brûlés par exemple est la nécrose du greffon. Au cours d'une étude in vivo, nous avons démontré que le réseau contenu dans notre substitut cutané est fonctionnel, s'inoscule en moins de quatre jours avec le réseau vasculaire de l'hôte et qu'il apporte un avantage à la néovascularisation par rapport à un substitut non microvascularisé. Un substitut cutané microvascularisé tumoral a ensuite été développé pour étudier la biologie du mélanome. Notre modèle est particulièrement pertinent et complet pour ce type d'étude puisque les cellules cancéreuses interagissent avec les trois principaux types cellulaires du derme et de l'épidémie et évoluent au sein d'une matrice extracellulaire sécrétée par ces cellules. Ainsi, il a été vérifié que les cellules cancéreuses conservent le même type de comportement, tant au niveau du potentiel invasif que du potentiel pro-angiogénique, dans notre modèle tridimensionnel de peau qu'/« situ chez les patients. Les capillaires lymphatiques fournissent une voie privilégiée pour le processus métastatique de cancers comme les mélanomes, c'est pourquoi nous travaillons à ajouter un réseau lymphatique à notre substitut cutané microvascularisé. Jusque là, nous avons démontré que les cellules endothéliales lymphatiques s'organisent spontanément en réseau dans un substitut 3D de tissu conjonctif.

Le mélanome est le cancer de la peau le plus mortel et l’exposition solaire est le facteur étiologique ayant la plus grande incidence sur son initiation. Cependant, l’influence des rayons UV sur la progression du mélanome primaire vers un état métastatique reste inconnue. Notre hypothèse est que les rayons UV peuvent, en plus d’initier la tumeur, stimuler la progression de la maladie vers un état métastatique. L’objectif de cette étude était donc de déterminer les conditions d’irradiation à utiliser, puis d’évaluer les effets directs et indirects des rayons UV sur la migration du mélanome. Les lignées A375, WM983a et SK-MEL-28 ont été cultivés sous forme de sphéroïdes et traitées chroniquement aux rayons UV directement ou indirectement. Puis, leur migration a été évaluée dans deux modèles 3D, soit en gel de collagène I ou en chambre de Boyd en inversée. L’exposition directe des sphéroïdes était constituée de5 minutes d’irradiation (570J/m2) au simulateur solaire tous les 12h pendant 7 jours. Aucune différence significative de migration des cellules cancéreuses n’a pu être observée dans cette condition. Pour l’exposition indirecte, les sphéroïdes ont été mis en contact avec un milieu de culture de kératinocytes immortalisés (HaCaT)ayant été préalablement irradiés de façon chronique aux UVB avec une dose de 75J/m2 tous les 12h pour un total de quinze irradiations (CLUV). Une augmentation significative de la migration des cellules cancéreuses dans le milieu CLUV a été observée pour les sphéroïdes de WM983a et SK-MEL-28. Le profilage des cytokines présentes dans le milieu CLUV a révélé un enrichissement de nombreuses cytokines tel que PDGFaa. En conclusion, le milieu CLUV augmente le potentiel de migration des trois lignées de mélanome primaire. Ainsi, l’exposition chronique aux rayons UV pourrait donc indirectement induire un plus grand pouvoir métastatique via notamment l’action de cytokines surexprimées.

L’apoptose est une mort cellulaire programmée nécessaire à l’homéostasie tissulaireau cours du développement. Les cellules cancéreuses acquièrent la capacité à échapper àl’apoptose. Restaurer la capacité des cellules tumorales à mourir est une stratégiethérapeutique qui permettrait de lutter contre le cancer. Il est donc important d’identifier denouvelles cibles au sein de la signalisation apoptotique et de tester de nouvelles molécules.La mitochondrie, intégrateur central des signaux de mort cellulaire et actrice de l’exécution de l’apoptose, est une cible de choix pour développer des thérapies anti-tumorales.L’ANT (Adenine Nucleotide Translocase) est la protéine majoritaire de la membrane internemitochondriale. Elle est possède une fonction de transporteur ATP/ADP, en conditionphysiologique, et suite à un stimulus apoptotique, acquiert une activité de pore létal. Ainsi, ilest intéressant d’inhiber la fonction transporteur et d’activer la fonction pore d’ANT pourinduire l’apoptose. Il existe quatre isoformes d’ANT : ANT1, 2, 3 et 4. Nous avons étudié lerôle d’ANT4, récemment identifiée, dans la signalisation apoptotique. Notre étude montre lerôle anti-apoptotique d’ANT4 dans des cellules cancéreuses et l’intérêt d’ANT comme ciblethérapeutique anti-cancéreuse.Une augmentation de l’expression de protéines anti-apoptotiques, l’adaptation auxstress cellulaires et l’activation de voies de survie sont les mécanismes les plus fréquemmentdécrits pour expliquer la chimiorésistance du mélanome. A l’aide de modèles cellulaires, nousavons étudié la capacité de deux nouvelles molécules : Withaférine A (WFA) et Plumbagine(PBG) à stimuler l’apoptose et déterminé les mécanismes moléculaires impliqués. Nous avonsmontré la capacité de WFA à induire spécifiquement la voie mitochondriale de l’apoptose decellules de mélanome par un mécanisme dépendant de la production d’espèces activées del’oxygène (EAO) qui déclenchent la voie mitochondriale et de la diminution du niveaud’expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. En revanche, PBG induit une mortapoptotique et une mort nécrotique des cellules de mélanomes. Dans les deux cas, PBG agitpar l’augmentation des EAO suite au déclenchement d’un stress du reticulum endoplasmique.WFA et PBG sont donc deux molécules pro-oxydantes capables d’induire la mort des cellulesde mélanome en tirant partie de leur vulnérabilité au stress oxydant.Nos travaux ont participé à la mise en évidence d’une cible thérapeutique anticancéreusepotentielle et de deux agents capables d’induire la mort cellulaire dans un contextede chimiorésistance. / Apoptosis is a programmed cell death process necessary for tissue homeostasis duringdevelopment. Cancer cells acquire the capacity to evade apoptosis. Restoring tumor cellsability to die is a therapeutic strategy against cancer. It is therefore important to identify newtherapeutic targets within the apoptotic signaling and to test new molecules.Mitochondrion being a central integrator of cell death signals and a key player inapoptosis execution, it is a target of choice to develop new anticancer therapies. ANT(Adenine Nucleotide Translocase) is the main protein of the inner mitochondrial membrane. Itpresents a ADP/ATP transporter function in physiological conditions and acquire a lethal poreactivity upon apoptotic stimulus. It is thus interesting to inhibit the transporter function and- 6 -activate ANT pore function in order to induce apoptosis. There are four isoforms: ANT1, 2, 3and 4. We studied the role of the recently discovered ANT4 in apoptotic signaling. Our studyemphasize ANT4 anti-apoptotic role in cancer cells and ANT potential as an anticancertherapeutic target.Increase in anti-apoptotic proteins, adaptation to cellular stress and activation ofsurvival pathways are the main mechanisms responsible for chemoresistance. Using cellularmodels we studied the ability of two molecules: Withaferin A (WFA) and Plumbagin (PBG)to stimulate apoptosis and determined the molecular mechanisms involved. We showed WFAcapacity to specifically induce the mitochondrial pathway of apoptosis in melanoma cellsthrough reactive oxygen species (ROS) generation leading to mitochondrial pathwayactivation and the decrease in anti-apoptotic protein Bcl-2 expression level. However, PBG isresponsible for apoptosis and necrosis induction in melanoma cells. In both cases PBG actsthrough an increase in ROS following endoplasmic reticulum stress. WFA and PBG are thustwo pro-oxidant molecules able to induce the death of melanoma cells by taking advantage oftheir vulnerability to oxidative stress.Our work took part in the demonstration of a potential anticancer target and two agentsable to induce cell death in a context of chemoresistance.

Le mélanome métastatique représente le plus mortel des cancers cutanés par sa forte résistance aux thérapies conventionnelles. Les cellules initiatrices de tumeurs (CIT) sont présentes dans de nombreux cancers dont le mélanome. Ces cellules, capables de s’autorenouveller, sont à l’origine de la récidive tumorale et des métastases représentant une cible pour le développement de nouveaux traitements. Les CIT sont confinées dans un microenvironnement tumoral dans lequel des facteurs sécrétés tels que l'Insulin-Like Growth Factor-1 (IGF-1) et le Transforming growth factor (TGF-β) favorisent la transition épithéliomésenchymateuse (TEM), un processus clef lié à l’émergence des CIT. En utilisant des cellules de mélanome métastatique, nous avons montré qu’une inhibition d’IGF-1 induit une diminution de la tumorigénicité des cellules en diminuant la capacité des B16-F10 à former des métastases pulmonaires. Outre son action sur la prolifération cellulaire, IGF-1 est impliqué dans le processus de TEM favorisant les propriétés migratoires et invasives des cellules B16-F10. Par ailleurs, IGF-1 joue un rôle majeur dans le maintien des CIT expliquant la forte résistance des mélanomes aux thérapies conventionnelles. Des expériences préliminaires suggèrent que ces activités induites par IGF-1 pourraient être médiées en partie par le facteur TGF-β, un facteur clef de la TEM. D'autres résultats confortent cette hypothèse en montrant une implication directe du TGF-β dans le caractère souche des cellules B16-F10. Ces travaux montrent que l’inhibition de la voie IGF-1/IGF-1R dans le microenvironnement tumoral pourrait être une bonne stratégie pour le développement de traitements anti-tumoraux contre le mélanome. / Metastatic melanoma is arguably the most virulent among human cancers, owing to its propensity to metastasize, and its resistance to conventional therapies. Like in many other cancers, tumor stem cells or tumor initiating cells (TIC), have been identified in melanoma. These cells have the unique ability to self-sustain and renew the tumor and thus represent an interesting target for the development of new therapeutic strategies. TIC are nested in a confined microenvironment where secreted-factors such as Insulin-Like Growth Factor- 1 (IGF-1) and transforming growth factor (TGF-β) promote epithelialmesenchymal transition (EMT), a key process in stemness features acquisition. In this context, we investigated the effects IGF-1 on TIC behavior. Using B16-F10 metastatic melanoma cell line, we show that IGF-1 downregulation curbs lung metastasis suggesting that IGF-1 plays a direct role in the intrinsic tumorigenic potential of these cells.markers associated with an increased expression of the epithelial marker E-cadherin and of the major regulator of melanocyte differentiation MITF. Most importantly, IGF-1 inhibition sharply decreased stemness features, reducing the expression of key stem markers and functional characteristics of MIC. This was associated with an important sensitivity to mitoxantrone treatment. Interestingly, our preliminary data suggest the EMT key component, TGF-β, conveys IGF-1-mediated effects. Indeed, TGF-β directly affects B16-F10 stemness phenotype and markers. In summary, we show that the IGF-1/IGF-1R nexus represents an interesting target for the development of novel therapeutic strategies against metastatic melanoma.