Comme nous l’indiquions dans le But du Travail, le mélanome figure parmi les cancers associés aux pronostics les plus sombres, et ce en raison de son taux de réponse très faible à la radiothérapie et à la chimiothérapie. Cette résistance à la radiothérapie et à la chimiothérapie provient essentiellement du fait que les cellules de mélanomes sont résistantes à l’apoptose, et que la radiothérapie ainsi que bon nombre d’agents chimiothérapiques induisent la mort des cellules cancéreuses en y induisant l’apoptose. Nous avons voulu investiguer les rôles de la gastrine et de la galectine 1 sur le comportement biologique des cellules de mélanomes afin de voir s’il était possible de proposer la gastrine et/ou la galectine 1 comme nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le cas du mélanome. <p>Notre stratégie de recherche est basée sur le principe (démontré sur le plan expérimental par de nombreuses études) selon lequel les cellules cancéreuses migrantes résistent à l’apoptose, et sont dès lors protégées contre les effets pro-apoptotiques de la chimiothérapie et de la radiothérapie qui représentent la quasi totalité de l’arsenal thérapeutique dont disposent les oncologues pour combattre les cancers. Diverses études expérimentales ont démontré que le fait de réduire le taux de migration de cellules cancéreuses résistantes à l’apoptose conférait à celles-ci une sensibilité accrue aux agents pro-apoptotiques. Nos résultats démontrent que la gastrine modifie de manière très significative les propriétés migratoires des cellules de mélanomes, sans toutefois modifier leur sensibilité à des agents pro-apoptotiques. Au contraire, la gastrine protègerait les cellules de mélanomes contre l’apoptose. Nous démontrons également dans notre travail, in vivo, un rôle pro-angiogénique pour la gastrine au sein de xénogreffes de mélanomes humains. Signalons que notre travail est le premier à démontrer un rôle potentiel de la gastrine au niveau de la biologie des mélanomes, tout au moins sur le plan expérimental. <p>Tout comme nous l’avons observé pour la gastrine, la galectine 1 semble également conférer aux cellules de mélanomes un certain degré de résistance aux agressions chimiothérapiques. Cette fois, le fait de diminuer le taux d’expression de la galectine 1 au sein de cellules du mélanome murin expérimental B16F10 (qui exprime des quantités importantes de galectine 1) renforce l’effet thérapeutique du témozolomide qui est une molécule cytotoxique. Cet effet semble survenir, tout au moins partiellement, suite à une diminution du taux d’expression de la protéine Hsp70 (suite à la diminution du taux d’expression de la galectine 1), avec pour conséquence une augmentation de la mort cellulaire par perméabilisation de la membrane des lysosomes.<p>Nous proposons une nouvelle approche thérapeutique pour combattre les mélanomes en faisant appel à la technique des petits ARN interférants (siRNA), dirigés dans le cas présent contre la galectine 1.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Comme nous l’indiquions dans le But du Travail, le mélanome figure parmi les cancers associés aux pronostics les plus sombres, et ce en raison de son taux de réponse très faible à la radiothérapie et à la chimiothérapie. Cette résistance à la radiothérapie et à la chimiothérapie provient essentiellement du fait que les cellules de mélanomes sont résistantes à l’apoptose, et que la radiothérapie ainsi que bon nombre d’agents chimiothérapiques induisent la mort des cellules cancéreuses en y induisant l’apoptose. Nous avons voulu investiguer les rôles de la gastrine et de la galectine 1 sur le comportement biologique des cellules de mélanomes afin de voir s’il était possible de proposer la gastrine et/ou la galectine 1 comme nouvelles cibles thérapeutiques potentielles dans le cas du mélanome. Notre stratégie de recherche est basée sur le principe (démontré sur le plan expérimental par de nombreuses études) selon lequel les cellules cancéreuses migrantes résistent à l’apoptose, et sont dès lors protégées contre les effets pro-apoptotiques de la chimiothérapie et de la radiothérapie qui représentent la quasi totalité de l’arsenal thérapeutique dont disposent les oncologues pour combattre les cancers. Diverses études expérimentales ont démontré que le fait de réduire le taux de migration de cellules cancéreuses résistantes à l’apoptose conférait à celles-ci une sensibilité accrue aux agents pro-apoptotiques. Nos résultats démontrent que la gastrine modifie de manière très significative les propriétés migratoires des cellules de mélanomes, sans toutefois modifier leur sensibilité à des agents pro-apoptotiques. Au contraire, la gastrine protègerait les cellules de mélanomes contre l’apoptose. Nous démontrons également dans notre travail, in vivo, un rôle pro-angiogénique pour la gastrine au sein de xénogreffes de mélanomes humains. Signalons que notre travail est le premier à démontrer un rôle potentiel de la gastrine au niveau de la biologie des mélanomes, tout au moins sur le plan expérimental. Tout comme nous l’avons observé pour la gastrine, la galectine 1 semble également conférer aux cellules de mélanomes un certain degré de résistance aux agressions chimiothérapiques. Cette fois, le fait de diminuer le taux d’expression de la galectine 1 au sein de cellules du mélanome murin expérimental B16F10 (qui exprime des quantités importantes de galectine 1) renforce l’effet thérapeutique du témozolomide qui est une molécule cytotoxique. Cet effet semble survenir, tout au moins partiellement, suite à une diminution du taux d’expression de la protéine Hsp70 (suite à la diminution du taux d’expression de la galectine 1), avec pour conséquence une augmentation de la mort cellulaire par perméabilisation de la membrane des lysosomes. Nous proposons une nouvelle approche thérapeutique pour combattre les mélanomes en faisant appel à la technique des petits ARN interférants (siRNA), dirigés dans le cas présent contre la galectine 1.

Le mélanome est un cancer dont l'incidence est toujours en augmentation et dont la mortalité ne faiblit pas, malgré les dispositifs de prévention et de détection précoce. Ce constat peut être principalement imputé au caractère invasif très marqué de cette pathologie, associé à un manque de traitements efficaces face à la maladie disséminée. Le travail présenté dans ce mémoire s'inscrit dans l'initiation d'une stratégie d'adressage tumoral actif de prodrogues, qui s'appuie sur un vecteur ciblant les mélanines (ICF01012) posédant un profil pharmaco-cinétique favorable (fixation tumorale forte, spécifique et durable). Une première génération de quatre prodrogues constituées par un principe actif anticancéreux modèle (l'IUdR) conjugué au vecteur via diverses fonctions espaceurs (ester, acétal, carbonate et carbamate) a été synthétisée et évaluée in vitro sur des critères métabolique et physico-chimique. Les études de biodistribution in vivo après radiomarquage des deux composés les plus pertinents ont démontré une absence de vectorisation, principalement imputable à une métabolisation très rapide des prodrogues conduisant à la perte de l'édifice vecteur. Ainsi, une seconde génération de trois prodrogues variant la nature des espaceurs (chaînes pegylées, pour l'amélioration de ce dernier point et fonction cétal) a été synthétisée. Les résultats biologiques indiquent que l'insertion d'une chaîne pegylée courte augmente la stabilité métabolique par encombrement de la fonction amine tertiaire, conduisant à une faible fixation tumorale. De plus, un espaceur sensible au pH acide constitué par une fonction cétal a été identifié et devrait permettre une libération sélective du principe actif au sein de la tumeur grâce au pH intramélanosomal acide. La libération sélective d'un principe actif par l'action d'une enzyme propre aux mélanosomes, la tyrosinase, a également été abordée par la synthèse de huit "prosondes" constituées par un substrat de l'enzyme (phénol ou catéchol), un espaceur auto-clivable et une sonde permettant d'étudier le mécanisme de libération. Une prosonde vectorisée incluant le vecteur a également été préparée. Des voies d'accès versatiles ont été conçues pour faciliter l'insertion ultérieure de principes actifs. L'aboutissement de cette étude devrait conduire à des prodrogues doublement spécifiques (i.e. distribution tumorale et libération spécifiques) conçues pour le traitement du mélanome métastasé. / Despite prevention campaigns and early detection, incidence and mortality of cutaneous melanoma are still increasing, due to its high invasiveness and the lack of efficient treatments against disseminated disease. This work is the starting point of a melanoma targeted prodrug therapy approach based on a melanin-targeting ligand (ICF01012) which displays an appropriate in vivo kinetic profile (strong, specific and long-lasting tumor uptake). A first generation of four prodrugs with varied spacers (ester, acetal, carbonate and carbamate) was synthesized and evaluated in vitro onphysicochemical and metabolic stability criteria. Two of them were selected and radiolabelled for in vivo evaluation which demonstrated non-specific distribution, mainly because of early metabolism leading to the loss of the targeting moeity. Taking into account these results, a second generation of three prodrugs varying the properties of spacers (pegylated chain for improving this last point and ketal function) was synthesized. Insertion of a short pegylated chain improved the metabolic stability by structural hindering of the tertiary amine fonction and led to a weak tumor uptake. Moreover, the ketal fonction was identified as a pH-sensitive linker able to selectively release the drug into the tumor due to the acidic intramelanosomal pH. The enzymatic drug release by tyrosinase, a specific melanosomal enzyme, was also explored. Eight "pro-probes" including an enzyme substrate moiety (phenol or catechol), a self-immolative spacer and a probe allowing the release mechanism were synthesized. A proprobe which includes the targeting moiety was also developed. During these studies, versatile synthetic pathways were designed for further easy incorporation of drugs. Achievement of this study should lead double specific prodrugs (i.e. specific tumor distribution and release) designed for metastatic melanoma treatment.

Le mélanome acro-lentigineux (ALM) est le 4ème sous-type histologique de mélanome et représente moins de 10% des mélanomes. Beaucoup de controverses entourent ce sous-type rare, comme un plus mauvais pronostic. L’objectif de notre travail était de mieux caractériser l’ALM sur le plan épidémiologique, clinique, histologique, et évolutif et d’identifier d’éventuels facteurs pronostiques. Entre 1996 et 2004, 126 cas d’ALMs (6% des mélanomes) ont été répertoriés et suivis dans le service de dermatologie de l’Hôpital de l’Hôtel-Dieu, Lyon. Toutes les lames histologiques ont été récupérées et systématiquement relues. Les analyses statistiques ont été réalisées par comparaison de sous-groupes, calculs et comparaison des courbes de survie par la méthode de Kaplan-Meier et le test de Log-Rank, et recherche de facteurs pronostiques indépendants en utilisant le modèle de régression logistique de Cox. La survie médiane sans récidive et spécifique étaient respectivement de 10,1 et 13,5 ans. Le taux de survie à 5 ans était de 76%. Dans la première partie de notre travail, nous avons étudié toutes les caractéristiques épidémiologiques et cliniques de l’ALM, afin de mieux comprendre l’histoire clinique. Les hommes avaient un plus mauvais pronostic ainsi que les formes achromiques. La seconde partie est une étude détaillée des particularités anatomo-pathologiques des ces tumeurs, avec une évaluation de leur signification pronostique. L’analyse multivariée des facteurs pronostiques a permis de souligner l’impact de l’index mitotique et de la présence de microsatellites en histologie. Enfin, la troisième partie de notre travail avait pour but de préciser les critères dermoscopiques d’aide au diagnostic de l’ALM, dont le retard diagnostique est fréquent. A partir d’une des plus grandes séries de cas d’ALM, notre travail souligne le caractère distinct de ce sous-type de mélanome, dont le mauvais pronostic est vraisemblablement lié à un stade avancé au diagnostic, la dermoscopie constituant une aide précieuse pour un diagnostic plus précoce. / Acral Lentiginous Melanoma (ALM) is the fourth main histological subtype of melanoma and accounts for less than 10% of all melanomas. Many controversies surround this rare subtype, as a poorer prognosis. The aim of our study was to investigate the distinctive epidemiological, clinical and histological characteristics and outcome of ALM, and to evaluate their prognostic values in order to identify independent prognostic factors. Between 1996 and 2004, 126 patients with ALMs (6% of all melanomas) were retrieved and followed up at the Department of Dermatology, Hôtel-Dieu University Hospital, Lyon, France. All histological material were systematically reexamined. Statistical analysis was performed by comparing the baseline characteristics of subgroups with appropriate tests. ALM-specific and disease-free survivals were estimated using the Kaplan-Meier method and compared using the Log-Rank test. A Cox proportional hazards model was used to identify independent prognostic factors. The median disease-free and ALM-specific survivals were 10.1 and 13.5 years, respectively. The 5-year survival rate was 76%. In the first part of this study, we reviewed patient demographics, the initial presentation of the lesion, and clinical outcome. Male gender and amelanosis were significantly associated with a poorer prognosis. The second part is a detailed analysis of histopathological features, with evaluation of their prognostic value. The presence of microsatellites and a high mitotic rate appeared to be of particular importance in predicting the outcome of ALM. Then, the third part emphasized all dermoscopic features of ALM, in order to improve recognition of suspicious cases and to permit an earlier diagnosis. This large register-based review of ALM shows that ALM is an unusual subtype of melanoma that exhibits distinctive epidemiological, clinical and pathological features. The classical poorer prognosis is mainly due to a more advanced stage at the time of diagnosis. Dermoscopy could be helpful to improve the diagnostic accuracy in such locations.

La dérégulation de la transcription résultant de mutations des molécules clés des voies de signalisation est une caractéristique des cancers. Dans les mélanomes, les facteurs de transcription MITF et BRN-2 contrôlent la survie, la prolifération, la différenciation et la migration/invasion cellulaire, avec une forte expression de MITF caractérisant les cellules les plus différenciées. BRN-2 est surexprimé dans les cellules de mélanomes où il peut réprimer l’expression de MITF conduisant ainsi les cellules vers un phénotype moins différencié et plus invasif. Comment BRN-2 est régulé est une question majeure. Nous avons montré que l’expression de BRN-2 est modulée en réponse aux variations des concentrations en oxygène et glucose et que cet effet est en partie médié par la PI3K. L’inhibition de la voie PI3K réduit l’invasion des cellules de mélanome et diminue l’expression des protéines BRN-2 et PAX3. PAX3 régule l’expression de BRN-2 par liaison directe sur son promoteur. Ces résultats suggèrent, qu’en plus des voies β-caténine/LEF1 et BRAF/MAPK, la voie PI3K régule l’expression de BRN-2 et pourrait jouer un rôle majeur dans le changement du phénotype prolifératif à invasif / Deregulation of transcription arising from mutations in key signaling molecules is a hallmark of cancer. In melanoma, MITF and BRN-2 transcription factors control survival, proliferation, differentiation and migration/ invasiveness, with high levels of MITF being a characteristic of differentiated melanocytes. BRN-2 represses MITF expression, thereby driving cells to a less differentiated and more invasive phenotype. How BRN-2 is regulated is therefore a key issue. We showed that up-regulation of BRN-2 expression in response to glucose involves the PI3K pathway. Inhibition of PI3K reduces invasiveness and decreases the levels of BRN-2 and PAX3. We showed that PAX3 regulates BRN-2 expression by direct binding on its promoter. Altogether, our results highlight a crucial role for the PI3K pathway in regulating BRN-2 expression and imply that PI3K signaling may be a key determinant of melanoma subpopulation diversity and prime cells for a proliferative to invasive phenotype switch.

Le mélanome est un cancer de la peau agressif et au mauvais pronostic. Si de nouvelles solutions thérapeutiques efficaces ont été développées, les taux de réponses sont variables et transitoires. Découvrir de nouveaux mécanismes oncogéniques dans cette pathologie reste donc nécessaire. Durant mes travaux, j’ai pu démontrer que la protéine tyrosine-kinase FES est exprimée dans les mélanocytes normaux. Cette expression est largement perdue dans un panel de lignées cellulaires de mélanome, au niveau protéique et transcriptionnel ainsi que dans des cultures primaires d’échantillons de patients. La perte de FES est due à une hyper-méthylation de son promoteur et est réversible. En ré-exprimant FES de manière stable dans deux lignées cellulaires de mélanomes, j’ai montré que cette réexpression entraînait une diminution des capacités oncogéniques des cellules. De plus, en analysant les données d’une cohorte de mélanomes (TCGA), j’ai pu établir qu’une diminution importante ou une perte d’expression de FES se retrouve dans près de 40% des patients, et qu’elle est corrélée à une hyper-méthylation du gène FES. Les patients ayant une faible expression de FES présentent un moins bon pronostic soulignant l’importance de ce phénomène. Enfin, en croisant un modèle murin déficient pour le gène Fes avec un modèle de mélanome, nous observons que les tumeurs sous fond Fes KO sont plus prolifératives et plus volumineuses.Ainsi, par des analyses in vitro, sur des données de patients ou en croisant des modèles murins, j’ai pu démontrer que FES est exprimée au niveau des mélanocytes normaux et y exerce un rôle de suppresseur de tumeur. / Among skin cancers, melanoma is the most aggressive and has the worst prognosis. In the last years, new therapeutic tools have been developed but responses differ between patients and are often transient due to resistance mechanisms. This highlights the need to improve understanding of molecular mechanisms of the disease. During my thesis, I have shown for the first time that FES tyrosine kinase is expressed in normal melanocytes, and that its expression is lost at the protein and RNA levels in most melanoma cell lines. The same result is observed in a panel of 12 patients’ short-term cultures. The lack of expression is due to FES promoter hyper-methylation and can be reverted using a hypomethylating agent. By restoring FES expression in two melanoma cell lines, I observe a decrease of oncogenic properties of the cells. Moreover, the analysis of the TCGA data on melanoma indicate that FES expression is strongly decreased or lost in about 40% of patients, and that this loss of expression is correlated with FES promoter methylation. Importantly, patients with low level of FES mRNA have poor prognosis compared to FES expressing patients. Finally, Fes knock-out mice crossed with an inducible melanoma mouse model indicate that tumors proliferation and size are more important under a Fes KO background.In conclusion, by using melanoma cells in vitro, data from melanoma patients and mouse models, I have demonstrated that FES is expressed in normal melanocytes and clearly plays a tumor suppressor role.in melanoma.

La progression tumorale dépend d'un dialogue entre les cellules cancéreuses et leur environnement. Parmi les cellules du microenvironnement du mélanome, les adipocytes ont longtemps été ignorés. Pourtant, ces cellules sont le composant majeur de l'hypoderme, la couche la plus profonde de la peau. Ainsi, elles sont proches du mélanome lors de la tumorigenèse et, lorsque la tumeur envahi les couches profondes de la peau, les deux types cellulaires entrent en contact. Il est donc important de comprendre l'impact des adipocytes sur la progression du mélanome, d'autant plus que des études épidémiologiques montrent que l'obésité est un facteur de mauvais pronostic pour ce cancer. Le surpoids et l'obésité sont en hausse constante avec près d'un tiers de la population mondiale affectée, faisant du lien entre l'obésité et le cancer un enjeu de santé publique majeur. Parmi les différents moyens de communication cellulaire, les vésicules extracellulaires (VE) jouent un rôle important dans le cancer. Les VE régulent la communication entre les cellules cancéreuses mais aussi entre les composants du microenvironnement et la tumeur. Les VE sécrétées par les adipocytes sont peu caractérisées et leur rôle sur la progression tumorale reste à élucider. Les VE adipocytaires pourraient être modifiées qualitativement et quantitativement en obésité car différents stress (inflammation, hypoxie...), connus pour modifier les VE, sont retrouvées dans le tissu adipeux d'individus obèses. Dans ce contexte, le premier objectif de ma thèse était de caractériser les VE adipocytaires et déterminer leur impact sur le mélanome dans un contexte normopondéral et d'obésité. Les résultats obtenus montrent que ces VE favorisent la migration et l'invasion des cellules de mélanome. Une analyse protéomique a révélé une signature spécifique dans ces VE, fortement enrichies en protéines du métabolisme des acides gras (AG).[...] / It is now clear that tumor progression is the result of a permanent dialog between cancer cells and the tumor microenvironment (TME). Among the cells found within the melanoma microenvironment, adipocytes had long been ignored. However, adipocytes are the main component of the hypodermis, the deepest skin layer, and are therefore close to melanoma from tumorigenesis and, as the tumor becomes aggressive and invades the deeper skin layers, the two cell types come into contact. Thus, understanding how adipocytes influence melanoma progression is of major importance, especially since epidemiological studies show that obesity is a poor prognosis factor for melanoma. As overweight and obesity are constantly rising and affect around a third of the World's population, the link between obesity and cancer is a major public health issue. Among the different ways in which cells communicate, extracellular vesicles (EV) play a particularly important role in cancer. Moreover, not only can tumor cells communicate with each other through EV, but the cellular components of the TME also use EV to communicate with cancer cells. Adipocyte-derived EV are poorly characterized and their role in tumor progression remains to be determined. In obesity, adipocyte EV may be qualitatively and quantitatively altered since various stresses (inflammation, hypoxia etc.), which are known to modify EV, are found in the adipose tissue of obese individuals. In this context, the first aim of my thesis was to characterize adipocyte EV and their impact on melanoma in lean and obese individuals. The results obtained show that EV secreted by adipocytes promote migration and invasion of melanoma cells. Analysis of their proteome revealed a protein signature specific to adipocyte EV, which was highly associated with fatty acid (FA) metabolism, a metabolic pathway involved in tumor aggressiveness. In melanoma treated with adipocyte EV, fatty acid oxidation (FAO) is increased and FAO inhibitors reverse their pro-invasive effect. Moreover, adipocytes secrete increased numbers of EV in obesity and, using equal numbers of EV from lean or obese subjects, their effect on tumor aggressiveness is increased and remains dependent on FAO. T[...]

Le mélanome cutané est le plus agressif des cancers de la peau. Une fois métastasé, les options thérapeutiques sont limitées et peu efficaces. Dans le but de trouver de nouveaux marqueurs d'agressivité du mélanome cutané, une étude protéomique comparative entre deux lignées de mélanome murin, génétiquement semblables mais avec des agressivités différentes, a permis d'identifier l'annexine A1 (ANXA1) comme une protéine pro-invasive. Le but de ce travail de thèse a été d'évaluer la valeur pronostique d'ANXA1 et de déterminer son rôle et son mode d'action dans les processus d'invasion des mélanomes humains. Lors d'une étude immunohistologique rétrospective sur deux centres (Clermont-Ferrand et Saint-Etienne), il a été observé, indépendamment de l'indice de Breslow, une corrélation inverse entre le taux d'ANXA1 dans les tumeurs primitives de 61 patients et le délai d’apparition des métastases. Cette association est due à l’implication d’ANXA1 dans les processus d’invasion. En effet,nous avons démontré dans différentes lignées de mélanome qu'ANXA1 extracellulaire stimule les récepteurs aux peptides formylés (FPRs) exprimés par ces cellules. Cette fixation aux FPRs induit les voies des MAPK et STAT3 qui entraînent l'activation des métalloprotéases (MMP2). L'induction des MMP2 par ANXA1 augmente significativement le pouvoir invasif des lignées de mélanome. Nous avons aussi démontré qu’ANXA1 est transloquée coté externe de la membrane cytoplasmique là où elle subit un clivage par une sérine protéase qui pourrait être la nicaline. Ce clivage qui se produit après la sérine 28 n'a pas été décrit et jouerait un rôle dans la capacité invasive des mélanomes en libérant un ou des peptide(s) proinvasif(s). A long terme, ce travail vise à utiliser ANXA1 comme marqueur pronostique et/ou cible thérapeutique du mélanome cutané. / Cutaneous melanoma is the most aggressive skin cancer. Treatment options are limited and inefficient when melanoma has metastasized. In order to identify new markers of melanoma dissemination, protein profiles of two genetically similar murine melanoma cell lines have been compared. Both B16F10 and B16Bl6 cells induced primary tumours after subcutaneous graft, however, only B16Bl6 melanomas develop metastases. Among proteins differentially expressed, annexin A1 (ANXA1) is overexpressed in the aggressive B16Bl6 melanoma.The aim of the present work was to assess ANXA1 prognostic value in human melanoma and todecipher its implication in the invasion process. We report that, regardless of Breslow index, ANXA1 expression in primary tumours of 61 patients is inversely correlated with time to metastasis. This correlation is due to ANXA1 involvement in the invasion processes. Indeed, we show that in different human melanoma cell lines, extra cellular ANXA1 stimulates Formylated Peptide Receptors (FPRs). FPRs/ANXA1 interaction induces MMP2 activity through MAP Kinase and STAT3 pathways. ANXA1-stimulated MMP2 induces a significant increase of cell invasion ability. We also show that ANXA1 is externalized and localized on the cell surface where it is cleaved by a serine protease, which could be nicalin. ANXA1 cleavage occurs after Serine 28, a so far not described site. These data suggest that ANXA1 cleavage might be associated with invasion ability of melanoma cells by release of proinvasive peptide(s).These findings identify ANXA1 as a melanoma proinvasive protein that might be a promising prognosis marker and therapeutic target.

Bien qu'il concerne que 10% des cancers de la peau, le mélanome cutané est à l'origine de 80% de la mortalité due à ce type de cancer. L'objectif de mon travail de thèse était de mesurer l'efficacité cytotoxique de nouveaux complexes de platine (les NHC-Pt) dans le mélanome cutané métastatique, mais également de décrire leurs mécanismes d'action. Ces complexes pouvant être radiomarqués, nous avons vérifié l'hypothèse selon laquelle les propriétés chimiotoxiques du platine peuvent être combinées aux propriétés radiotoxiques d'électrons de faible énergie émis par l'iode 123. Enfin, ce radiomarquage a permis une première approche de la biodistribution des composés NHC-Pt. J'ai montré que le composé NHC-Pt-I2, avait un effet cytotoxique important dans des lignées de mélanome métastatiques BRAF mutés et wild-type ainsi que dans des lignées de mélanome rendues résistantes au vemurafenib, un inhibiteur de BRAF. L'obtention de cet effet après une exposition très courte (1h) des cellules, témoigne de la rapidité de déclenchement des processus cytotoxiques cellulaires, contrairement à ce qui a été observé avec le cisplatine et la dacarbazine. Les études de pharmacocinétique ont permis de rapporter l'importance de l'effet cytotoxique obtenu avec un traitement d'1h sur les cellules à une accumulation cellulaire du composé NHC-Pt-I2 importante. Cette accumulation était supérieure (95 fois) à celle du cisplatine, et permettait une induction massive de dommages à l'ADN. Les études mécanistiques ont montré que les composés NHC-Pt induisaient l'apoptose des cellules d'une part via la voie Bcl-xL, et d'autre part via une autre voie dépendante des pan-caspases non identifiée à l'heure actuelle. Le radiomarquage par l'iode-123 du composé NHC-Pt-Br2 a permis d'étudier sa biodistribution in vivo chez la souris. Le composé NHC-Pt-Br-123I présente une distribution rapide et importante vers le compartiment sanguin, une accumulation très faible dans les principaux organes, et une légère accumulation tumorale. En revanche, l'étude de la synergie des effets cytotoxiques du Pt par l'effet des électrons de faible énergie émis par l'I123 a été limitée par le très faible rendement de marquage de composés radiomarqués obtenu. Les résultats obtenus durant ce projet de thèse ont permis de révéler le potentiel important des composés NHC-Pt comme outil thérapeutique du mélanome cutané métastatique / Although only 10% of skin cancers are due to cutaneous melanoma, but it’s still responsible for 80% of the mortality caused by this type of cancer. The aim of my thesis was evaluating the cytotoxicity of new platinum complexes (NHC-Pt) in metastatic cutaneous melanoma and investigating their mechanisms of action. These complexes can be radiolabeled. We studied if chemotoxicity of platinum combined by radiotoxicity of low energy electrons emitted by 123 Iodine (123I) can lead to a higher cytotoxicity. This radiolabelling also permitted us to study the biodistribution of the NHC-Pt compounds. We have shown that the compound NHC-Pt-I2, not only had a significant cytotoxic effect on mutated and wild-type BRAF metastatic melanoma cell lines but also on melanoma cell lines resistant to vemurafenib which is a BRAF inhibitor. Getting results in a very short cell exposure time (1h), showed a rapid onset of cellular cytotoxicity, and it’s contrary to what was observed in cisplatin and dacarbazine. We also showed that cytotoxic effect obtained by 1h treatment of cells was due to higher cellular accumulation of the NHC-Pt-I2. This higher accumulation was about 95 times more than that of cisplatin and allowed much more DNA damage induction. Our Mechanistic studies showed that NHC-Pt compounds induce cell apoptosis via the Bcl-xL pathway and also there is another pathway dependent on pancaspases which is still unidentified. The radiolabelling with 123I of the NHC-Pt-Br2 enabled the in vivo study of its biodistribution in mice. The NHC-Pt-Br-123I compound had a fast and important distribution to the blood compartment, and a very slight accumulation in the main organs, and also in tumors. On the other hand, the study of amplification of Pt cytotoxicity by the effect of 123I was limited by very low labelling efficiency of radiolabelled compounds. The reason of this low efficacy may be the special commercial saline solutions of 123I that we used. The results achieved during this thesis project revealed the important potential of NHC-Pt compounds as a therapeutic tool for metastatic cutaneous melanoma

Le mélanome cutané est l'un des cancers les plus agressifs et mortel capables de dissémination métastatique à distance. L’intravasation cellules tumorales dans le vaisseau sanguin dans les tumeurs primaires et l'extravasation sont des étapes importantes dans la formation de métastases. Ces étapes impliquent la perturbation de la barrière endothéliale par des cellules tumorales afin de faciliter leur migration transendothéliale et la colonisation métastatique. Cependant, le processus par lequel les cellules tumorales modulent l'intégrité des jonctions vasculaires est encore mal compris. Afin de déterminer les facteurs de perméabilité sécrétés par les cellules métastatiques, nous avons identifié la protéine matricielle SPARC comme un facteur critique contribuant à la perméabilité vasculaire et l'extravasation des cellules tumorales. Nous montrons que SPARC sécrété par les cellules de mélanome induit une perméabilité vasculaire via l'ouverture des jonctions intercellulaires des monocouches endothéliales et entraîne la migration transendothéliale de cellules de mélanome. In vivo, l’extinction de SPARC mène à une diminution drastique dans la colonisation à court et long terme des poumons et de la perméabilité des capillaires pulmonaires. A l’inverse, sa surexpression augmente les capacités d’extravasation et les métastases. / Cutaneous melanoma is one of the most aggressive cancers capable of distant and lethal metastatic spread. Tumor cell intravasation into blood vessel at primary tumor sites and subsequent extravasation are critical steps in the formation of metastases. These steps entail disruption of the endothelial barrier by tumor cells to facilitate their transendothelial passage and metastatic seeding. However, the way by which tumor cells modulate vascular junction integrity is still poorly understood. In an attempt to determine permeability factors secreted by metastatic cells, we identified the matricellular protein SPARC as a critical signaling factor that contributes to elevated vascular permeability and tumor cell extravasation. We show that SPARC released by melanoma cells enhances vascular leakiness by inducing opening of intercellular junctions of endothelial monolayers and drives melanoma cell transendothelial migration. In vivo vascular permeability and metastatic assays demonstrate that SPARC deficiency abrogates tumor-induced permeability of lung capillaries and prevents extravasation from blood vessels and metastasis, whereas overexpression of SPARC increases the lung metastatic potential of melanoma cells. Mechanistically, SPARC-induced endothelial gap formation and transmigration is dependent on vascular cell adhesion molecule (VCAM1) and p38 MAPK signaling pathway in endothelial cells. Importantly, blocking VCAM1 impedes melanoma cell extravasation. The clinical relevance of our findings is highlighted by the high levels of SPARC detected in tumor cells from human pulmonary melanoma lesions.