Les chylomicrons (CM) sont des vésicules produites et sécrétées par les entérocytes de l'intestin grêle pour permettre le transport des lipides et des vitamines liposolubles de l'alimentation vers la circulation sanguine. Les mécanismes de transport, de formation et de sécrétion des CM sont très complexes et des défauts dans ces mécanismes peuvent affecter de manière significative la qualité de vie d'un individu. Il est clair qu'il existe des lacunes dans notre compréhension des protéines qui régulent ces processus puisque certains patients atteints de malabsorptions intestinales ne présentent pas de mutations pour des protéines connues et d’autres patients présentant des mutations connues ont des caractéristiques cliniques incompréhensibles. La phospholipase D(PLD) 1 et la Sar1b GTPase sont deux protéines dont le rôle dans l'homéostasie lipidique intestinale reste à mieux préciser. La PLD1 est une enzyme dont le rôle principal est de catalyser la formation d'acide phosphatidique à partir de la phosphatidylcholine. Son produit permet de réguler de nombreux processus cellulaires tels que l’endocytose, l’exocytose et le traffic vésiculaire. Cependant, sa fonction dans l'homéostasie lipidique intestinale était jusqu'à présent inconnue. La Sar1b GTPase, quant à elle, régule la formation des vésicules COPII du réticulum endoplasmique (RE) et sa mutation a été associée à la maladie de rétention du CM (MRC), l'une des trois principales maladies qui provoquent une malabsorption des lipides intestinaux. Cependant, nos connaissances scientifiques sur cette enzyme sont assez limitées et même sa relation de cause à effet reste à définir dans un organisme complexe tel qu'un mammifère. Par conséquent, l'objectif général de cette thèse est de mettre en évidence le rôle de la PLD1 et de la Sar1b GTPase dans le transport et le métabolisme des lipides intestinaux. Pour atteindre ces objectifs, nous avons soit administré des inhibiteurs de l'activité des différents isoformes de PLD à des cellules entérocytaires Caco2/15, ou utilisé des cellules présentant une diminution de l’expression du gène de PLD1. En outre, pour la Sar1b GTPase, nous avons utilisé des souris présentant soit une mutation ponctuelle, soit une délétion de Sar1b. Nos résultats ont montré que la diminution de l'expression protéique de PLD1 réduit la sécrétion de CM et modifie l'expression protéique de facteurs importants impliqués dans la β-oxydation et la lipogenèse. En ce qui concerne la Sar1b GTPase, nous avons pu observer que les souris homozygotes avec une mutation ou une délétion de Sar1b ne sont pas viables et sembleraient mourir juste après la naissance étant donné le développement embryonnaire normal de ces souris. Avec les souris hétérozygotes, nous avons quand même pu confirmer la relation de cause à effet entre le gène et la MRC puisque ces souris récapitulaient plusieurs anomalies gastro-intestinales retrouvées chez les patients. En outre, nous avons observé que la gravité des caractéristiques observées chez les souris peut dépendre du régime alimentaire et du génotype. De plus, nous avons observé que les mâles présentant une mutation ponctuelle reflétaient d’avantage la maladie. Par ailleurs, les lipoprotéines de ces animaux avaient une composition chimique et protéique altérée avec une diminution de la quantité d’ApoB-100 dans les fractions de VLDL et LDL, ainsi qu’une augmentation des ratios cholestérol ester/phospholipides et des ratios lipides estérifiés/lipides non-estérifiés. Enfin, nous avons observé que l'altération du gène Sar1b dans l'intestin affecte son homéostasie lipidique et modifie l'expression génique et protéique de plusieurs facteurs importants dans le stress du RE, la β-oxydation, la lipogenèse et le métabolisme du cholestérol. En conclusion, même si cette thèse comporte plusieurs limites, nous avons pu établir le rôle de la PLD1 et de la Sar1b GTPase dans l'homéostasie lipidique. En effet, nous sommes les premiers à avoir démontré que l'altération du gène PLD1 affecte la sécrétion de CM et le métabolisme des lipides dans les cellules intestinales. De plus, nous avons pu confirmer in vivo la relation de cause à effet entre la MRC et la protéine Sar1b, tout en ayant une meilleure compréhension de son impact sur le métabolisme des lipides qui peut varier en fonction de différents facteurs tels que le génotype et la diète. Une meilleure compréhension de ces protéines permettrait d'augmenter les cibles possibles pour le développement de traitements ciblant la sécrétion de CM et de mieux comprendre les conséquences que la mutation de ces gènes peut avoir chez les patients. / Chylomicrons (CMs) are vesicles produced and secreted by enterocytes in the small intestine to transport lipids and fat-soluble vitamins from the diet into the bloodstream. The mechanisms of CM transport, formation and secretion are very complex and defects in these mechanisms can significantly affect the quality of life of an individual. It is clear that there are gaps in our understanding of the proteins that regulate these processes since some patients with intestinal malabsorptions do not have mutations for known proteins and other patients with known mutations have incomprehensible clinical features. Phospholipase D (PLD) 1 and Sar1b GTPase are two proteins whose role in intestinal lipid homeostasis remains to be better defined. PLD1 is an enzyme whose main role is to catalyze the formation of phosphatidic acid from phosphatidylcholine. Its product regulates many cellular processes such as endocytosis, exocytosis and vesicular trafficking. However, its function in intestinal lipid homeostasis was unknown until now. Sar1b GTPase, on the other hand, regulates COPII vesicle formation in the endoplasmic reticulum (ER) and its mutation has previously been associated with CM retention disease (CRD), one of the three major diseases that cause intestinal lipid malabsorption. However, our scientific knowledge about this enzyme is quite limited and even its cause and effect relationship remains to be defined in a complex organism such as a mammal. Therefore, the overall goal of this thesis is to highlight the role of PLD1 and the Sar1b GTPase in intestinal lipid transport and metabolism. To achieve these objectives, we either administered inhibitors of the activity of different PLD isoforms to Caco2/15 enterocyte cells or used cells with protein depletion of PLD1. In addition, for the Sar1b GTPase, we used mice with either a point mutation or a deletion of Sar1b. Our results showed that decreased protein expression of PLD1 reduces CM secretion and alters the protein expression of important factors involved in β-oxidation and lipogenesis. With regard to the Sar1b GTPase, we could observe that homozygous mice with a mutation or deletion of Sar1b are not viable and would appear to die just after birth given the normal embryonic development of these mice. With the heterozygous mice, we were still able to confirm the causal relationship between the gene and CRD since these mice recapitulated several gastrointestinal abnormalities found in patients. In addition, we observed that the severity of the features observed in the mice may depend on diet and genotype. In addition, we observed that males with a point mutation reflected the most the disease. Also, the lipoproteins of these animals had an altered chemical and protein composition, with a decrease in the amount of ApoB-100 in the VLDL and LDL fractions, as well as an increase in choesteryl ester/phospholipids ratios and esterified/nonesterified lipid ratios. Finally, we observed that alteration of the Sar1b gene in the gut affects its lipid homeostasis and alters the gene and protein expression of several factors important in ER stress, β-oxidation, lipogenesis, and cholesterol metabolism. In conclusion, although this thesis has several limitations, we were able to establish the role of PLD1 and the Sar1b GTPase in lipid homeostasis. Indeed, we are the first to have demonstrated that alteration of the PLD1 gene affects CM secretion and lipid metabolism in intestinal cells. Furthermore, we were able to confirm in vivo the causal relationship between MRC and the Sar1b protein, while having a better understanding of its impact on lipid metabolism which can vary according to different factors such as genotype and diet. A better understanding of these proteins would increase the possible targets for the development of treatments targeting CM secretion and better understand the consequences that mutation of these genes may have in patients.

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques. / Type 2 diabetes (T2D) is a complex metabolic disease caused by genetic as well as environmental factors, such as sedentarity and obesity. Pancreatic β cell dysfunction is now recognized as the key factor in T2D development. Our laboratory is studying the mechanisms of regulation of insulin secretion by the pancreatic β cell in response to nutrients. While the knowledge of the mechanisms responsible for initiation of insulin secretion in response to glucose and fatty acids is quite advanced, the inhibitory processes of insulin secretion in normal or pathological situations are still poorly understood. This doctoral thesis has focused on the identification of some of the mechanisms responsible for negative regulation of insulin secretion in pancreatic β cell. We have addressed this issue under normal situation or pathological conditions related to T2D. We first tested the hypothesis by which a mitochondrial enzyme, short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (SCHAD), negatively regulates glucose-induced insulin secretion (GIIS) by limiting the concentrations of some fatty acids and their derivatives such as acyl-CoA or acyl-carnitine molecules in the β cell. For this purpose, the downregulation of SCHAD by RNA interference (RNAi) was used in the pancreatic β cell line INS832/13. Then, we tested wether a prolonged administration of high-fat diet to mice (diet-induced obesity mouse model, DIO) would modulate intracellular metabolic and molecular pathways responsible for inhibition of insulin secretion. C57BL/6 mice were therefore fed a high-fat diet for 8 weeks followed by insulin secretion, intracellular lipid metabolism, mitochondrial function and intracellular signaling measurements on isolated pancreatic islets of Langerhans of those mice. Our results suggest that SCHAD negatively regulates GIIS and amino acid-induced insulin secretion. We propose that fatty acid oxidation by SCHAD would prevent the accumulation of short-chain acyl-CoAs or acyl-carnitines capable of potentiating insulin secretion. In addition, SCHAD regulates glutamate metabolism by the allosteric inhibition of glutamate dehydrogenase (GDH) preventing the hyperinsulinemia caused by excessive GDH activity. The study of β cell dysfunction in the DIO mouse model stratified LDR and HDR highlighted various fatty acid metabolism pathways involved in the reduction of GIIS. A decrease in the triglycerides/free fatty acid (TG/FFA) cycling associated with an increase in fatty acid oxidation and intracellular accumulation of cholesterol was shown to contribute to the decreased GIIS in DIO-HDR mice. Furthermore, alteration of AMP-activated kinase (AMPK) and protein kinase C epsilon (PKC epsilon) signaling pathways would be responsible for those alterations in metabolic pathways observed in DIO islets and cause decreased insulin secretion. In summary, we have shed light on important pathways negatively regulating insulin secretion in pancreatic β cell. These pathways could either limit the amplitude or duration of insulin secretion after a meal, or help to preserve β-cell function by delaying exhaustion. Some of those signaling pathways could explain the altered insulin secretion observed in T2D obese patients. In light of our research, the development of therapies targeting pathways that negatively regulate insulin secretion may be beneficial for treating diabetic patients.

Le diabète de type 2 (DT2) est une maladie métabolique complexe causée par des facteurs génétiques mais aussi environnementaux, tels la sédentarité et le surpoids. La dysfonction de la cellule β pancréatique est maintenant reconnue comme l’élément déterminant dans le développement du DT2. Notre laboratoire s’intéresse à la sécrétion d’insuline par la cellule β en réponse aux nutriments calorigéniques et aux mécanismes qui la contrôle. Alors que la connaissance des mécanismes responsables de l’induction de la sécrétion d’insuline en réponse aux glucose et acides gras est assez avancée, les procédés d’inhibition de la sécrétion dans des contextes normaux ou pathologiques sont moins bien compris. L’objectif de la présente thèse était d’identifier quelques-uns de ces mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique, et ce en situation normale ou pathologique en lien avec le DT2. La première hypothèse testée était que l’enzyme mitochondriale hydroxyacyl-CoA déshydrogénase spécifique pour les molécules à chaîne courte (short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase, SCHAD) régule la sécrétion d’insuline induite par le glucose (SIIG) par la modulation des concentrations d’acides gras ou leur dérivés tels les acyl-CoA ou acyl-carnitine dans la cellule β. Pour ce faire, nous avons utilisé la technologie des ARN interférants (ARNi) afin de diminuer l’expression de SCHAD dans la lignée cellulaire β pancréatique INS832/13. Nous avons par la suite vérifié chez la souris DIO (diet-induced obesity) si une exposition prolongée à une diète riche en gras activerait certaines voies métaboliques et signalétiques assurant une régulation négative de la sécrétion d’insuline et contribuerait au développement du DT2. Pour ce faire, nous avons mesuré la SIIG, le métabolisme intracellulaire des lipides, la fonction mitochondriale et l’activation de certaines voies signalétiques dans les îlots de Langerhans isolés des souris normales (ND, normal diet) ou nourries à la dière riche en gras (DIO) Nos résultats suggèrent que l’enzyme SCHAD est importante dans l’atténuation de la sécrétion d’insuline induite par le glucose et les acides aminés. En effet, l’oxydation des acides gras par la protéine SCHAD préviendrait l’accumulation d’acyl-CoA ou de leurs dérivés carnitine à chaîne courtes potentialisatrices de la sécrétion d’insuline. De plus, SCHAD régule le métabolisme du glutamate par l’inhibition allostérique de l’enzyme glutamate déshydrogénase (GDH), prévenant ainsi une hyperinsulinémie causée par une sur-activité de GDH. L’étude de la dysfonction de la cellule β dans le modèle de souris DIO a démontré qu’il existe une grande hétérogénéité dans l’obésité et l’hyperglycémie développées suite à la diète riche en gras. L’orginialité de notre étude réside dans la stratification des souris DIO en deux groupes : les faibles et forts répondants à la diète (low diet responders (LDR) et high diet responder (HDR)) sur la base de leur gain de poids corporel. Nous avons mis en lumières divers mécanismes liés au métabolisme des acides gras impliqués dans la diminution de la SIIG. Une diminution du flux à travers le cycle TG/FFA accompagnée d’une augmentation de l’oxydation des acides gras et d’une accumulation intracellulaire de cholestérol contribuent à la diminution de la SIIG chez les souris DIO-HDR. De plus, l’altération de la signalisation par les voies AMPK (AMP-activated protein kinase) et PKC epsilon (protéine kinase C epsilon) pourrait expliquer certaines de ces modifications du métabolisme des îlots DIO et causer le défaut de sécrétion d’insuline. En résumé, nous avons mis en lumière des mécanismes importants pour la régulation négative de la sécrétion d’insuline dans la cellule β pancréatique saine ou en situation pathologique. Ces mécanismes pourraient permettre d’une part de limiter l’amplitude ou la durée de la sécrétion d’insuline suite à un repas chez la cellule saine, et d’autre part de préserver la fonction de la cellule β en retardant l’épuisement de celle-ci en situation pathologique. Certaines de ces voies peuvent expliquer l’altération de la sécrétion d’insuline dans le cadre du DT2 lié à l’obésité. À la lumière de nos recherches, le développement de thérapies ayant pour cible les mécanismes de régulation négative de la sécrétion d’insuline pourrait être bénéfique pour le traitement de patients diabétiques. / Type 2 diabetes (T2D) is a complex metabolic disease caused by genetic as well as environmental factors, such as sedentarity and obesity. Pancreatic β cell dysfunction is now recognized as the key factor in T2D development. Our laboratory is studying the mechanisms of regulation of insulin secretion by the pancreatic β cell in response to nutrients. While the knowledge of the mechanisms responsible for initiation of insulin secretion in response to glucose and fatty acids is quite advanced, the inhibitory processes of insulin secretion in normal or pathological situations are still poorly understood. This doctoral thesis has focused on the identification of some of the mechanisms responsible for negative regulation of insulin secretion in pancreatic β cell. We have addressed this issue under normal situation or pathological conditions related to T2D. We first tested the hypothesis by which a mitochondrial enzyme, short-chain hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (SCHAD), negatively regulates glucose-induced insulin secretion (GIIS) by limiting the concentrations of some fatty acids and their derivatives such as acyl-CoA or acyl-carnitine molecules in the β cell. For this purpose, the downregulation of SCHAD by RNA interference (RNAi) was used in the pancreatic β cell line INS832/13. Then, we tested wether a prolonged administration of high-fat diet to mice (diet-induced obesity mouse model, DIO) would modulate intracellular metabolic and molecular pathways responsible for inhibition of insulin secretion. C57BL/6 mice were therefore fed a high-fat diet for 8 weeks followed by insulin secretion, intracellular lipid metabolism, mitochondrial function and intracellular signaling measurements on isolated pancreatic islets of Langerhans of those mice. Our results suggest that SCHAD negatively regulates GIIS and amino acid-induced insulin secretion. We propose that fatty acid oxidation by SCHAD would prevent the accumulation of short-chain acyl-CoAs or acyl-carnitines capable of potentiating insulin secretion. In addition, SCHAD regulates glutamate metabolism by the allosteric inhibition of glutamate dehydrogenase (GDH) preventing the hyperinsulinemia caused by excessive GDH activity. The study of β cell dysfunction in the DIO mouse model stratified LDR and HDR highlighted various fatty acid metabolism pathways involved in the reduction of GIIS. A decrease in the triglycerides/free fatty acid (TG/FFA) cycling associated with an increase in fatty acid oxidation and intracellular accumulation of cholesterol was shown to contribute to the decreased GIIS in DIO-HDR mice. Furthermore, alteration of AMP-activated kinase (AMPK) and protein kinase C epsilon (PKC epsilon) signaling pathways would be responsible for those alterations in metabolic pathways observed in DIO islets and cause decreased insulin secretion. In summary, we have shed light on important pathways negatively regulating insulin secretion in pancreatic β cell. These pathways could either limit the amplitude or duration of insulin secretion after a meal, or help to preserve β-cell function by delaying exhaustion. Some of those signaling pathways could explain the altered insulin secretion observed in T2D obese patients. In light of our research, the development of therapies targeting pathways that negatively regulate insulin secretion may be beneficial for treating diabetic patients.