付記する学位プログラム名: 霊長類学・ワイルドライフサイエンス・リーディング大学院 / 京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(理学) / 甲第24467号 / 理博第4966号 / 新制||理||1709(附属図書館) / 京都大学大学院理学研究科生物科学専攻 / (主査)准教授 Huffman Michael Alan, 教授 古市 剛史, 教授 今井 啓雄 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Science / Kyoto University / DFAM

Les microglies sont les cellules immunitaires du cerveau qui exercent des rôles physiologiques cruciaux tout au long de la vie. Pour évaluer si leurs fonctions sont altérées dans la physiopathologie de la maladie de Parkinson (PD), le trouble moteur neurodégénératif le plus commun, nous avons caractérisé leurs changements de densité, de morphologie, d’ultrastructure et d’activité de dégradation dans le putamen sensorimoteur de singes cynomolgus lésés au 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP). Un sous-groupe de singes MPTP a également été traité oralement à la lévodopa (L-DOPA). Ces singes ont développé des dyskinésies induites par la L-DOPA (LID) similaire à celles qu’éprouvent les patients atteints de la PD après seulement cinq à dix ans de traitement. En utilisant la microscopie optique, confocale et électronique, nos résultats ont montré des altérations de densité, de morphologie et de fonction des microglies chez les singes MPTP. Ceux-ci étaient partiellement normalisés avec le traitement à la L-DOPA. La densité microgliale, l’aire des corps cellulaires et des arborisations étaient augmentées chez les singes parkinsoniens, tandis que les animaux traités par la L-DOPA présentaient un phénotype similaire aux témoins. Au niveau de l’ultrastructure, les microglies semblaient saines, sans dilatation de l'appareil de Golgi et du réticulum endoplasmique, parmi d’autres marqueurs de stress cellulaire, chez les singes MPTP. Néanmoins, les microglies avaient moins d'inclusions phagocytaires chez le groupe MPTP, suggérant une activité de dégradation altérée. De plus, une réduction de l’expression de la glycoprotéine CD68 -associée aux lysosomes- a été mesurée dans les microglies d’animaux MPTP traités à la L-DOPA. La localisation subcellulaire du CD68 dans les lysosomes secondaires et les corps résiduels tertiaires des microglies a également été confirmée par microscopie électronique. Dans l’ensemble, ces résultats ont révélé des modifications microgliales phénotypiques au cours de la physiopathologie de la PD qui ont partiellement été renversées par la L-DOPA. / Microglia are the brain immune cells which exert crucial physiological roles across the lifespan. To assess whether their functions are impaired in the pathophysiology of Parkinson disease (PD), the most common neurodegenerative motor disorder, we characterized their changes in density, morphology, ultrastructure, and degradation activity among the sensorimotor functional territory of the putamen, in 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) cynomolgus monkeys. A subset of MPTP monkeys was also treated with oral levodopa (L-DOPA). These monkeys developed L-DOPA-induced dyskinesia (LID) similar to what PD patients experience after only five to ten years of treatment. Using light, confocal and electron microscopy, our results showed alterations of microglial density, morphology and function following MPTP intoxication that were partially normalized with L-DOPA treatment. Microglial density, cell body and arborization areas were increased in the PD monkeys, with these cells showing a more hyper-ramified morphology, whereas L-DOPA- treated animals presented a microglial phenotype similar to control animals. At the ultrastructural level, microglia appeared healthy, without dilation of the Golgi apparatus and endoplasmic reticulum, among other cellular stress markers,in MPTP monkeys. Nevertheless, microglia displayed a reduced number of phagocytic inclusions in the MPTP group, suggesting impaired degradation activity. Moreover, a decreased immunoreactivity for CD68 –a lysosome-associated glycoprotein– was measured in microglia from MPTP animals treated with L-DOPA. The subcellular localization of CD68 among secondary lysosomes and tertiary residual bodies was also confirmed in microglia by electron microscopy. Taken together, these findings revealed significant microglial phenotypic changes during PD pathophysiology that were partially rescued by L-DOPA treatment.

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Es wurde wiederholt gezeigt, dass enge, affiliative soziale Beziehungen (im Folgenden “soziale Beziehungen”) äußerst wichtig für die Gesundheit und das Wohlbefinden des Menschen sind. Eine steigende Zahl von Befunden deutet darauf hin, dass nicht-menschliche Arten Sozialbeziehungen führen, die wichtige Eigenschaften menschlicher sozialer Beziehungen teilen, insbesondere Differenzierung in Stärke, Stabilität und Gleichwertigkeit, und dass diese Beziehungen eine wichtige Rolle für die Fitness und das Wohlbefinden dieser Arten spielen. Allerdings wurden diese Arbeiten von einigen stark kritisiert und es wird argumentiert, die scheinbaren Gemeinsamkeiten zwischen menschlichen und nicht-menschlichen sozialen Beziehungen könnten Begleiterscheinungen anderer, einfacherer Prozesse sein. Zudem wurden nicht alle Aspekte der vorgeschlagenen, gemeinsamen Eigenschaften vollständig mit den menschlichen Entsprechungen verglichen. Untersuchungen nicht-menschlicher sozialer Beziehungen werden außerdem grundsätzlich durch einen Mangel an Übereinstimmung darüber, wie nicht-menschliche soziale Beziehungen am besten quantitativ zu bewerten sind, erschwert. Das allgemeine Ziel dieser Doktorarbeit war, die Eigenschaften sozialer Beziehungen zwischen frei lebenden weiblichen Assam-Makaken zu ermitteln und sorgfältig zu prüfen, inwiefern diese den Eigenschaften enger sozialer Beziehungen zwischen Menschen und anderen nichtmenschlichen Arten gleichen. Ich habe mich im Speziellen mit den Kritiken und den Wissenslücken hinsichtlich nicht-menschlicher sozialer Beziehungen befasst. Des Weiteren habe ich die neuen Möglichkeiten, die die soziale Netzwerkanalyse bietet, um soziales Verhalten zu messen, beurteilt und genutzt, sowie geprüft, ob diese Messmethoden unsere Bewertung nichtmenschlicher Beziehungen verbessern können. Die Daten dieser Arbeit stammen von einer einzelnen Gruppe Assam-Makaken, die in ihrem natürlichen Lebensraum im Phu Khieo Wildlife Sanctuary (16°5′–35′N, 101°20′–55′O) in der Provinz Chaiyaphum im Nordosten Thailands leben. Das Schutzgebiet umfasst 1573km² und ist Teil des ca. 6500 km² umfassenden, zusammenhängenden Western Forest Complex. Die Daten wurden in zwei einjährigen Beobachtungszeiträumen erhoben (Zeitraum 1: Oktober 2007 – September 2008; Zeitraum 2: Mai 2010 – April 2011). Während dieser Zeit bestand die Gruppe aus insgesamt 49-53 Individuen, davon 12 adulten Weibchen im ersten und 15 adulten Weibchen im zweiten Beobachtungszeitraum. Alle adulten Weibchen wurden regelmäßig mittels der Fokustiermethode beobachtet, währenddessen alle sozialen Interaktionen kontinuierlich und allgemeine Aktivitäten nach einer zeitabhängigen Regel aufgezeichnet wurden. Insgesamt wurden über 2100 Stunden an Verhaltensbeobachtungen gesammelt. Die Analyse dieser Daten zeigte, dass die sozialen Beziehungen weiblicher Assam- Makaken wesentliche Charakteristika enger sozialer Beziehungen von Menschen teilen. Wie beim Menschen unterschieden sich die Sozialbeziehungen weiblicher Assammakaken deutlich in ihrer Stärke, wobei Weibchen dazu neigen nur wenige überdurchschnittlich enge soziale Beziehungen zu bilden. Außerdem blieben soziale Beziehungen über ein ganzes Jahr stabil, trotz signifikanter Veränderungen in der Zeit, die Weibchen für andere Verhaltensweisen, wie z.B. Fressen und Ruhen, aufwandten, wie sie mit Veränderungen im weiblichen Reproduktionszyklus einhergehen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die sozialen Beziehungen über mehrere Jahre stabil bestehen bleiben. Ich konnte nachweisen, dass Weibchen Leistungen balanciert austauschen, allerdings wurden die Art und der Zeitrahmen, über den Leistungen ausgetauscht wurden, im Gegensatz zu sozialen Beziehungen beim Menschen nicht durch die Stärke sozialer Beziehungen beeinflusst. Der Einsatz der sozialen Netzwerkanalyse in meiner Arbeit zeigte, dass diese nicht nur nützliche Messwerte liefert, um die Struktur der sozialen Beziehungen weiblicher Assam-Makaken zu quantifizieren, sondern auch andere, potentiell nützliche Messwerte für zukünftige Studien nicht-menschlicher sozialer Beziehungen. Diese Ergebnisse liefern einen wertvollen Beitrag für unser Verständnis sowohl nichtmenschlicher als auch menschlicher Sozialbeziehungen. Sie geben uns einen tieferen Einblick in das Sozialleben von Assam-Makaken im Allgemeinen, in dem gezeigt wird, dass feste soziale Beziehungen eine wichtige Größe des weiblichen Soziallebens dieser Art sind, während die Rangordnung eine untergeordnete Rolle im weiblichen Verhalten spielt. Sie unterstützen den “Ansatz der wertvollen Beziehungen”, der genutzt wird, um nicht-menschliche soziale Beziehungen zu verstehen, und nicht den Ansatz der, von einigen vorgeschlagenen, biologischen Markttheorie. Schließlich haben diese Ergebnisse Auswirkungen auf unser Verständnis des evolutionären Ursprungs menschlicher sozialer Beziehungen, insbesondere für ihren ursprünglichen funktionalen Nutzen, da sie Hinweise darauf geben, dass soziale Beziehungen nicht-menschlicher Arten wichtige Eigenschaften mit engen zwischenmenschlichen Beziehungen gemeinsam haben. In Zukunft können wir unser Verständnis nicht-menschlicher Sozialbeziehungen vertiefen, indem weiter untersucht wird, in welchen Eigenschaften sich diese sozialen Beziehungen ähneln. Zeitgleich sollten wir versuchen, Eigenschaften, die insbesondere für nicht-menschliche Arten von größerer Bedeutung sein könnten, zu ermitteln und zu untersuchen. Schließlich sollten wir beginnen, unsere Aufmerksamkeit auf die vielen schwachen und dynamischen sozialen Beziehungen zurichten, die in Gruppen nicht-menschlicher Arten existieren, und ihren potentiellen Nutzen zu erforschen.

<p>Making decisions is fundamental to everything we do, yet it can be impaired in various disorders and conditions. While research into the neural basis of decision-making has flourished in recent years, many questions remain about how decisions are instantiated in the brain. Here we explored how primates make abstract decisions and decisions in social contexts, as well as one way to non-invasively modulate the brain circuits underlying decision-making. We used rhesus macaques as our model organism. First we probed numerical decision-making, a form of abstract decision-making. We demonstrated that monkeys are able to compare discrete ratios, choosing an array with a greater ratio of positive to negative stimuli, even when this array does not have a greater absolute number of positive stimuli. Monkeys’ performance in this task adhered to Weber’s law, indicating that monkeys—like humans—treat proportions as analog magnitudes. Next we showed that monkeys’ ordinal decisions are influenced by spatial associations; when trained to select the fourth stimulus from the bottom in a vertical array, they subsequently selected the fourth stimulus from the left—and not from the right—in a horizontal array. In other words, they begin enumerating from one side of space and not the other, mirroring the human tendency to associate numbers with space. These and other studies confirmed that monkeys’ numerical decision-making follows similar patterns to that of humans, making them a good model for investigations of the neurobiological basis of numerical decision-making. </p><p>We sought to develop a system for exploring the neuronal basis of the cognitive and behavioral effects observed following transcranial magnetic stimulation, a relatively new, non-invasive method of brain stimulation that may be used to treat clinical disorders. We completed a set of pilot studies applying offline low-frequency repetitive transcranial magnetic stimulation to the macaque posterior parietal cortex, which has been implicated in numerical processing, while subjects performed a numerical comparison and control color comparison task, and while electrophysiological activity was recorded from the stimulated region of cortex. We found tentative evidence in one paradigm that stimulation did selectively impair performance in the number task, causally implicating the posterior parietal cortex in numerical decisions. In another paradigm, however, we manipulated the subject’s reaching behavior but not her number or color comparison performance. We also found that stimulation produced variable changes in neuronal firing and local field potentials. Together these findings lay the groundwork for detailed investigations into how different parameters of transcranial magnetic stimulation can interact with cortical architecture to produce various cognitive and behavioral changes.</p><p>Finally, we explored how monkeys decide how to behave in competitive social interactions. In a zero-sum computer game in which two monkeys played as a shooter or a goalie during a hockey-like “penalty shot” scenario, we found that shooters developed complex movement trajectories so as to conceal their intentions from the goalies. Additionally, we found that neurons in the dorsolateral and dorsomedial prefrontal cortex played a role in generating this “deceptive” behavior. We conclude that these regions of prefrontal cortex form part of a circuit that guides decisions to make an individual less predictable to an opponent.</p> / Dissertation

Die vorliegende Arbeit soll dazu beitragen, Unstimmigkeiten in den Verwandtschaftsverhältnissen innerhalb der Papionini, einem Stamm innerhalb der Altweltaffen (Cercopithecidae), zu klären. Die Papionini, die zusammen mit den Cercopithecini die Unterfamilie der Cercopithecinae bilden, beinhalten sieben Gattungen (Macaca, Cercocebus, Mandrillus, Lophocebus, Papio, Theropithecus, Rungwecebus) und 45 Arten. Sechs der sieben Gattungen kommen heute hauptsächlich in Afrika vor. Eine Ausnahme ist die Gattung Papio, die mit einer Art (P. hamadryas) auch in Südwest-Arabien vorkommt. Im Gegensatz zu den sechs hauptsächlich afrikanischen Gattungen hat die siebte Gattung (Macaca) nur ein kleines Verbreitungsgebiet im Norden Afrikas und kommt sonst hauptsächlich in Asien vor. Fossilfunde belegen allerdings, dass während des Plio- und Pleistozäns die Gattungen Macaca und Theropithecus auch in Europa vorkamen. Von der Gattung Theropithecus, die heute ausschließlich in Afrika beheimatet ist, wurden zudem auch Fossilien aus dem Pliozän im Norden Indiens gefunden. Die Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der Papionini wurden bisher mit Hilfe morphologischer und genetischer Merkmale untersucht, allerdings waren die Ergebnisse nicht immer übereinstimmend und es gibt immer noch viele Unklarheiten. Zum einen ist nicht eindeutig geklärt, wie die Gattungen Papio, Lophocebus und Theropithecus zu einander in Beziehung stehen. Zum anderen ist auch unklar, wie die einzelnen Pavianarten innerhalb der Gattung Papio mit einander verwandt sind. Außerdem sind auch die Verwandtschaftsverhältnisse zwischen und innerhalb der Artgruppen der Makaken nicht eindeutig geklärt. Um mehr Klarheit in die Evolution der Papionini zu bringen, habe ich im Rahmen dieser Arbeit drei Studien durchgeführt (Kapitel 2-4). Ziel dabei war es, Verwandtschaftsbeziehungen auf unterschiedlichen taxonomischen Ebenen (zwischen und innerhalb von Gattungen, sowie innerhalb einer Art) zu untersuchen. Dazu wurden komplette mitochondriale Genome von Vertretern der Papionini sequenziert und damit Phylogenien und Aufspaltungszeiten berechnet. Die Ergebnisse meiner Arbeit zeigen unter anderem drei Hauptkladen innerhalb der Papionini (Kapitel 2): 1) Papio, Theropithecus, Lophocebus; 2) Mandrillus, Cercocebus; 3) Macaca, wobei Macaca in der mitochondrialen Phylogenie näher mit Mandrillus und Cercocebus verwandt zu seien scheint und nicht wie erwartet, als Schwestergruppe der afrikanischen Papionini abgebildet wird; ein Ergebnis, das im Widerspruch zu nukleären und morphologischen Studien steht. Meine Arbeit zeigt auch, dass komplette mitochondriale Genome in manchen Fällen nicht ausreichen, um phylogenetische Beziehungen vollständig zu rekonstruieren. So bleibt weiterhin unklar wie die Gattungen Papio, Theropithecus und Lophocebus zueinander stehen (Kapitel 2). Außerdem zeigen die Ergebnisse Paraphylien für Mandrillus und Cercocebus (Kapitel 2), sowie innerhalb der Paviane (Kapitel 3). Die Paviane werden dabei gemäß ihrer geographischen Verbreitung und nicht nach ihrer taxonomischen Zugehörigkeit abgebildet, wodurch die meisten Pavian-Arten paraphyletisch sind. Der Grund für diese Baumtopologie ist sehr wahrscheinlich sekundärer Genfluss zwischen parapatrisch vorkommenden Pavian-Arten. In der dritten Studie (Kapitel 4), in der innerartliche Verwandtschaftsverhältnisse innerhalb einer südostasiatischen Makaken-Artgruppe (Macaca fascicularis) untersucht wurden, zeigt sich eine klare Unterteilung in eine kontinentale und eine insulare Klade. Sowohl die kontinentale, als auch die insulare Linie sind auf Sumatra zu finden, was für einen sekundären genetischen Austausch zwischen beiden Populationen spricht. Generell kann man sagen, dass komplette mitochondriale Genome robuste Phylogenien mit hoher statistischer Unterstützung ergeben, die eine gute Grundlage für künftige vergleichende Studien bilden. Die berechneten Aufspaltungszeiten stimmen weitestgehend mit vorherigen Studien überein, wobei sich die ermittelten Konfidenzintervalle verkleinert haben. Allerdings zeigt die Arbeit auch, dass Phylogenien basierend auf mitochondrialen Genomen keine hohe Auflösung erzielen wenn sich Taxa innerhalb kurzer Zeit voneinander trennten. Die hier gezeigten Paraphylien und die abweichenden Ergebnisse zu nukleären Studien wurden höchstwahrscheinlich durch sekundären genetischen Austausch hervorgerufen. Um Verwandtschaftsverhältnisse möglichst exakt rekonstruieren zu können, müssen neben der maternal-vererbten, mitochondrialen Linie noch paternal- und biparentalvererbte Merkmale in Betracht gezogen werden. Zu beachten ist in diesem Zusammenhang, dass ein bestimmter molekularer Marker immer nur eine mögliche Phylogenie von vielen wiedergibt.

The distinctive feature of the Human Immunodeficiency Virus (HIV) epidemic in the 21st century is the burden it places on women. Scientists believe that the best opportunities for successful interventions to prevent sexual HIV transmission lie in the initial stages of infection at the portal of entry, the genital tract (GT), which offers the greatest host advantages and viral vulnerabilities. However, understanding of the correlates of protection/vulnerability and innate immunity at the portal of entry is poor. First and foremost, there is no agreement about which GT sub-compartment is the primary site of HIV/SIV infection. Second, the epithelium, previously studied solely for its function as a barrier, has hardly been investigated for its role in innate immunity in the context of SIV/HIV infection. MIP-3&alpha;, a chemokine secreted by epithelial cells, was previously proposed to have a role in amplifying the early Simian Immunodeficiency Virus (SIV) infection events in the GT of female macaques. Specifically, MIP-3&alpha; was shown to be secreted by epithelial cells of the endocervix, accumulating subepithelially within the first 24 hours post exposure, following deposition of an intravaginal inoculum of SIV. Similar studies in humans have not been reported. We hence undertook to study MIP-3&alpha; for its role in early HIV infection events in the endocervix of humans. In order to achieve this, we first characterised MIP-3&alpha; constitutive secretion patterns in different sub-compartments of the GT before proceeding to determine its induced secretion patterns, stimulating with HIV-1 and various Toll-like receptor ligands. For completeness we determined constitutive and induced secretion patterns of multiple soluble proteins (SPs) and antimicrobial peptides (AMPs) in the endocervices of humans and macaques. The GT being an immunohormonal system, we further studied the influence of endogenous hormonal changes on the stability of MIP-3&alpha; and that of other innate immune markers. We quantified MIP-3&alpha; with a sandwich Elisa, and SPs and AMPs with the Luminex multiplex bead assay. Our results showed that the GT is a rich source of MIP-3&alpha; with its levels being among those of the highest SPs in the GT. Constitutive levels were highest in the endocervical sub-compartment of all the sub-compartments studied. Further, the GT is an inflammatory environment, which would explain the high levels of MIP-3&alpha;. The primary driver of MIP-3&alpha; levels appears to be inflammation rather than hormonal levels. MIP-3&alpha; levels are significantly higher in the GT of humans than in macaques. There was no evidence that MIP-3&alpha; levels are elevated on exposure to HIV and SIV in humans and macaques, respectively. We therefore concluded that since the endocervix is unlikely to respond to HIV/SIV by secreting MIP-3&alpha; in vivo, contrary to the previous reports, MIP-3&alpha; is hence not a key player in amplifying early events in infection. And as such, it should not be a prime target for preventive therapy. Further, the human GT having a pre-existing inflammatory profile may explain the high rates of HIV sexual transmission. Lastly, we concluded that the infection mechanisms described in the macaque model (i.e. the 'outside-in' signaling) are likely not required for human infection.

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BACKGROUND: Natural killer (NK) cells are traditionally considered part of the innate immune system but have recently been shown to possess adaptive qualities similar to T cells in response to an infection with a pathogen. In addition to possessing adaptive features, NK cells have also been found to reside in different organs such as the liver, spleen, and lymph nodes and differ based on phenotypic markers and their responses to different cytokines. Utilizing these findings, several groups have isolated and identified CD49a as a marker for tissue-resident NK cells. In the liver, CD49a has also been shown to be a positive indicator for NK cell memory-like responses in murine models. Building off work that demonstrated antigen-specific responses in rhesus macaques, this project focuses on characterizing the phenotypic markers and functional profile of CD49a+ NK cells in non-human primates. To better understand the role of CD49a in memory-like NK cells outside of the liver, this project utilized spleen samples from rhesus macaques infected with SIV/SHIV. This work aims to help us better understand the dysfunction NK cells experience as a result of HIV-1 infection in humans and also to demonstrate the changes NK cells experience as the disease progresses. A thorough understanding of the adaptive capabilities of NK cells can pave the way for targeted therapies to increase NK cell antiviral activity in HIV and other infections. METHODS: To characterize the functional and phenotypic profiles of CD49a+ NK cells by multiparameter flow cytometry, thirteen samples of spleen from rhesus macaques were thawed and then stained with two different protocols. A phenotyping protocol involved staining with antibodies against surface markers as well as intracellular markers T-Bet and Eomes. For the functional characterization protocol, the same thirteen samples were stained intracellularly after being stimulated with a cocktail of PMA and ionomyocin. The antibodies used in this were for functional markers. Of the thirteen samples used, six were infected with SHIVSF162P3, two were infected with SIVmac239X, and the remaining five were uninfected. After staining, these samples were analyzed on an BD LSRII from BD Biosciences. The data obtained were then analyzed using FlowJo software to study NK cells, which were characterized as CD45+CD14-CD20-CD3-CD159+. RESULTS: The analysis compared NK cells with T cells, B cells, and NKB cells. Some increases were seen among CD49a+ NK cells in the frequency of CD336+ (NCR2/NKp44), CD337+ (NKp30), and CD366+ (Tim-3) after infection. Although there were some mild increases in CD107a and TNF- in infected samples compared to uninfected, a significant increase was observed in the frequency of IFN-ɣ among infected CD49a+ NK cells compared to uninfected. CONCLUSION: When comparing samples that were infected vs uninfected, it appears there were some mild decreases after infection in the ratio of NK cells to other lymphocytes. In addition, there did not appear to be a significant increase in the frequency of CD49a+ among these NK cells as a result of the infection. However, among the CD49a+ subpopulation, there were some observed non-significant decreases in CD56-CD16+ cells. Furthermore, there was found to be an almost significant increase in TNF- (p = 0.06) among CD49a+ cells after infection. These findings demonstrate an increase in cytotoxic activity in splenic NK cells associated with an adaptation to the virus. Although there does not appear to be significant changes in the ratio of NK cell populations in the spleen, the changes observed in phenotypic and functional markers associated with CD49a+ demonstrate an increase in the cytotoxic activity of NK cells as a result of infection with SIV/SHIV. However, it remains to be seen if CD49a is a direct indicator of this type of infection. Future work geared toward memory-like NK cells in non-human primate splenic tissue could look at the contrast in CD49a+ NK cells from different states of infection with HIV-1 and/or SIV (acute vs chronic) to better understand the integrin’s role in adaptation.