Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. Analyse der Matrixmetalloproteinase-2 in Aortenaneurysmen von Patienten mit bikuspider und trikuspider Aortenklappe eingereicht von: Katja Wolter angefertigt in/ an: Klinik für Herzchirurgie Herzzentrum Leipzig, Universität Leipzig Klinikdirektor: Prof. Michael A. Borger, MD, PhD Strümpellstraße 39, 04289 Leipzig betreut von: Prof. Dr. med. Christian D. Etz Dr. med. Josephina Haunschild Juni 2019 Die bikuspide Aortenklappe weist eine Inzidenz von 0,9 - 2 % auf und ist damit die häufigste kongenitale Herzklappenanomalie in der allgemeinen Bevölkerung (Fedak et al., 2005; Braverman et al., 2005). Nur bei 20 % der Patienten mit bikuspider Aortenklappe bleibt diese lebenslang funktionstüchtig (Collins et al., 2008; Butany et al., 2005, Michelena et al., 2008). Patienten mit bikuspider Aortenklappe haben oft ein erhöhtes Risiko für Komplikationen der Aorta ascendens. Aneurysmen treten häufiger und schwerer in jüngeren Jahren auf (Etz et al., 2010). Die Festigkeit der Aortenwand ist abhängig von der Balance zwischen Synthese und dem Abbau der extrazellulären Proteine. Der Verlust der Elastizität und der Aortencompliance begleitet möglicherweise langsam, aber fortschreitend die Dilatation der Aorta (Abaci et al., 2012). Matrixmetalloproteinasen gehören zur Familie der Proteasen, die eine wichtige Rolle in der Homöostase des Bindegewebes spielen (Stamenkovic et al., 2000; Sternlicht et al., 2001). Sowohl extrazelluläre als auch zelluläre Prozesse sind an der Pathogenese der Aortenaneurysmen beteiligt. Aneurysmen sind durch eine Schwäche und Deformierung der Architektur der Aorta gekennzeichnet und sind relativ häufig Ursache für den Tod durch Ruptur oder Dissektion (Mohamed et al., 2011). Die Aortendilatation bei Patienten mit bikuspiden Aortenklappe ist bedingt durch eine intrinsische Pathologie der Aortenwand, welche durch Medianekrose und -zerstörung charakterisiert ist (Abaci et al., 2012). Dies macht bikuspide Aortenklappen zu einer potentiell tödlichen Erkrankung (Tadros et al., 2009). Metalloproteinasen sind Bestandteile des Matrixstoffwechsels und beeinflussen so die Festigkeit der arteriellen Gefäßwand (Abaci et al., 2012). In der Aorta ascendens kommen hauptsächlich die Gelatinasen MMP-2 (Gelatinase A) und MMP-9 (Gelatinase B) vor, welche bevorzugt Kollagen Typ IV, teilweise auch Elastin und fibrilläres Kollagen abbauen (Abaci et al., 2012). Hintergrund der Studie waren Untersuchungen von Aortengewebe bikuspider Aortenklappenträger anderer Autoren, die Veränderungen der Matrixzusammensetzung bei Aortenaneurysmen von BAV-Patienten beschrieben (Wilton et al., 2007; Abaci et al., 2012). Daraus ergab sich die Hypothese, dass die Veränderung der Matrixenzyme bei BAV-Patienten eine Schwächung der Gefäßwand der Aorta ascendens bewirkt, die eine gehäufte Aneurymaausbildung erklärt. Fragestellung: Ist die Expression des MMP-2-Gens in der Gefäßwand aneurysmatisch veränderter Aorta ascendens bei BAV-Patienten im Vergleich zu TAV-Patienten erhöht und hat dies eine vermehrte Proteinmenge und Aktivität des Matrixenzyms in der Aortenwand zur Folge? Bestehen Mutationen im MMP-2-Gen, die diese Veränderung des Matrixenzyms erklären? Methoden: Es wurden Gefäßwandproben von Patienten mit aneurysmatisch erweiterter Aorta ascendens auf Veränderungen der Matrixmetalloproteinase-2 bei bikuspider und trikuspider Aortenklappe untersucht. Zunächst erfolgte die Bestimmung der Genexpression des Matrixenzyms MMP-2. Des Weiteren erfolgte die Quantifizierung des Enzyms im Aortengewebe der Probanden mittels Western Blot Analyse und ELISA. Außerdem wurde die Aktivität des matrixabbauenden Enzyms mittels Zymographie bestimmt. Weiterhin wurde die DNA aus den Aortenwandproben von BAV- und TAV-Patienten isoliert und die kodierende Region des MMP-2-Gens mittels High-Resolution-Melting-PCR (HRM-PCR) analysiert. Ergebnisse: Auf mRNA-Ebene zeigte sich eine signifikant erhöhte Expression der MMP-2 bei Patienten mit bikuspider Aortenklappe. Dies spiegelt sich auch in der Quantifizierung des MMP-2 Proteins in der Western Blot Analyse und im ELISA wider. Ebenso konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit eine erhöhte Enzymaktivität der MMP-2 in der Zymographie bei BAV Patienten nachgewiesen werden. Bei der HRM-Analyse zeigte sich in der Kohorte der BAV-Patienten eine Veränderung der Basenabfolge im MMP-2-Gen. Diskussion: Die bikuspide Aortenklappe ist die häufigste kongenitale kardiale Malformation und betrifft ca. 0,9 - 2 % der Bevölkerung . Sie ist mit einem erhöhten Risiko für Komplikationen, wie beispielsweise einem vermehrten Auftreten von Aortenaneurysmen, verbunden (Fedak et al., 2005; Yuan et al., 2010). Patienten mit BAV entwickeln zu etwa 26 % ein Aneurysma der Aorta ascendens (Ferencik et al., 2003; Roberts et al., 1991). Sie stellen ein erhöhtes Risiko für eine Aortendissektion dar. Die Studie zielte darauf ab Unterschiede in der Entstehung von Aneurysmen bei BAV-Patienten im Vergleich zu TAV-Patienten zu detektieren und eine Erklärung für das gehäufte Auftreten von Aneurysmen bei der Patientengruppe mit bikuspider Aortenklappe zu finden. Unter den in dieser Studie untersuchten Probanden wiesen 72 % der BAV-Patienten und nur 15 % der TAV-Patienten eine Aortenklappenstenose auf. Es traten also signifikant mehr Aortenstenosen bei Patienten mit BAV-Klappe auf. Diese Ergebnisse korrelieren mit Daten weiterer Studien, die ebenfalls zeigten, dass BAV-Patienten zur Ausbildung von Stenosen neigen und mit Aortenpathologien wie einer häufigeren Aneurysma-Ausbildung assoziiert sind (Michelena et al., 2011; Braverman et al., 2005; Fedak et al., 2002; Tadros et al., 2009; Ferencik et al., 2003; Ward et al., 2000). Die veränderte Hämodynamik ist als ein Faktor der gehäuften Erweiterung anzusehen. Aber auch genetische Faktoren, insbesondere diejenigen, die den Stoffwechsel der extrazellulären Matrix regulieren, wurden als maßgebliche Mechanismen für die Aneurysmabildung erkannt. Im Rahmen dieser Studie wurden aneurysmatisch veränderte Aortenproben von BAV- und TAV-Patienten untersucht, um Unterschiede in der Aktivität der Matrixmetalloproteinase-2 zu detektieren. In unserer untersuchten Kohorte zeigten im MMP-2 SNP rs243865 nur 39 % der BAV Patienten eine unveränderte Basenabfolge. Das bedeutet, dass BAV-Patienten gehäuft Mutationen im MMP-2-Gen aufweisen, die den Matrixstoffwechsel durch Überwiegen der Matrix-abbauenden Enzyme beeinflussen könnten. In der vorliegenden Arbeit wiesen BAV-Patienten, verglichen mit TAV-Patienten, eine signifikant höhere MMP-2 mRNA Expression auf, was zunächst keine Rückschlüsse auf die tatsächliche Proteinmenge und Aktivität des MMP-2-Enzyms im Aortengewebe zulässt. Jedoch zeigte sich sowohl eine erhöhte mRNA-Expression und ein vermehrter Proteingehalt an MMP-2 im untersuchten Gewebe als auch eine signifikant höhere MMP-2 Enzymaktivität im Aortengewebe von BAV-Patienten. Schlussfolgerung: Die Daten der vorliegenden Arbeit zeigen, dass Patienten mit bikuspider Aortenklappe und assoziiertem proximalen Aortenaneurysma eine erhöhte Enzymaktivität der Matrixmetalloproteinase-2 aufweisen und dies eine potenzielle Ursache für die Entstehung der Aneurysmen, durch einen vermehrten Abbau der extrazellulären Matrix, darstellt. In Einklang mit der Enzymaktivität steht eine erhöhte Proteinmenge, sowie auf mRNA-Ebene eine vermehrte Expression der MMP-2. Auch die Häufigkeit sogenannter single nucleotide polymorphisms weicht von der der Patienten mit trikuspider Aortenklappe und assoziiertem Aortenaneurysma ab. Ob dies funktionelle Auswirkungen hat bleibt unklar.:Inhaltsverzeichnis 2 Abkürzungsverzeichnis 4 1. Einleitung 7 1.1. Bikuspide Aortenklappe (BAV) 7 1.1.2. Inzidenz 8 1.1.3. Histologie 9 1.1.4. Genetik 9 1.2. Molekulare Veränderungen 10 1.2.1. Matrixmetalloproteinasen allgemein 10 1.2.2. Veränderung der Matrixmetalloproteinasen bei BAV-Patienten 12 1.2.3. Blutfluss 12 1.2.4. Aortenwandveränderungen 12 1.3. Pathologie 13 1.4. Assoziierte Erkrankungen 14 1.4.1. Marfan-Syndrom 14 1.4.2. Turner-Syndrom und Williams-Beuren-Syndrom 15 1.5. Familiäres und spontanes thorakales Aortenaneurysma (TAA) 16 1.5.1. Thorakales Aortenaneurysma (TAA) 16 1.6. Operative Versorgung von Aortenaneurysmen 17 1.6.1. Guidelines – Wann Ersatz (45 mm, ACC AHA Guidelines 2014) 17 1.6.2. Operative Verfahren 18 1.6.4. Bentall-Operation 20 1.6.5. Suprakoronarer Ascendensersatz 21 2. Zielstellung 22 3. Material 23 3.1. Geräte 23 3.2. Verbrauchsmaterialien 24 3.3. Chemikalien und kommerzielle Kits 25 3.4. verwendete Antikörper 28 3.5. Puffer und Lösungen 29 3.6. DNA Isolation 32 32 3.7. Gele für SDS-PAGE 33 3.8. Gel für Zymographie 33 3.7. Software 34 3.8. Materialien der High-Resolution-Melting-PCR 35 4. Methoden 36 4.1. mRNA Gen-Expressionsanalyse mittels Chip Array Analyse 36 (Firma OakLabs, Berlin) 36 4.2. DNA-Isolation aus humanen Aorten 37 4.2.1. Photometrische Erfolgskontrolle 38 4.3. SDS-Gelelektrophorese 39 4.4. Western Blot Analyse 40 4.5. Zymographie 41 4.5.1. MMP-2 Aktivitätsbestimmung mittels Zymographie 41 4.6. SNP-Analyse mittels High-Resolution-Melting-PCR 43 5. Ergebnisse 46 5.1. mRNA Gen-Expressionsanalyse mittels Chip Array Analyse (Firma OakLabs, Berlin) 46 5.1.1. genome-wide Gen-Expressionsanalyse des MMP-2-Gens 46 5.2. Analyse der MMP-2 SNPs als Ausdruck genetischer Variationen 48 5.2.1. Gene scanning der MMP-2 mittels High-Resolution-Melting-PCR 48 5.3. Untersuchung der Proteinmenge der MMP-2 mittels Western Blot Analyse 54 5.3. Analyse der MMP-2 Proteinexpression mittels Western Blot Analyse 56 5.4. Untersuchung der Proteinmenge der MMP-2 im ELISA 59 5.5. Untersuchung der Enzymaktivität der MMP-2 mittels Zymographie 61 5.6. Zusammenfassung 64 6. Diskussion 65 6.1. Die Patientenpopulation 65 6.2. Diskussion der MMP-2 SNPs als Ausdruck genetischer Variationen 67 6.3. MMP-2 Genexpression und quantitativer Vergleich der MMP-2 Proteinexpression 68 6.4. Aktivität des MMP-2-Enzyms 70 7. Schlussfolgerungen 73 8. Limitationen 74 9. Zusammenfassung der Arbeit 75 10. Literaturverzeichnis 79 11. Abbildungsverzeichnis 87 12. Tabellenverzeichnis 88 13. Danksagung 89 14. Eigenständigkeitserklärung 90 15. Lebenslauf 91

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Zweck der molekularen Bildgebung ist es, biologische Prozesse auf zellulärer und molekularer Ebene zu messen und zu charakterisieren, um so die Ursachen von Krankheiten und Veränderungen im Organismus zu diagnostizieren. Sie basiert auf dem Einsatz molekularer Bildgebungssonden, welche einen spezifischen biologischen Vorgang darstellen oder sich spezifisch in dem zu untersuchenden Gewebe anreichern oder aktiviert werden. Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung und Analyse neuer Bildgebungssonden für die spezifische in-vivo-Bildgebung der Apoptose und von Enzymaktivitäten mittels Magnetresonanztomographie (MRT) auf der Grundlage sehr kleiner Eisenoxidnanopartikel (very small iron oxide particles, VSOP). VSOP sind superparamagnetisch und durch ihre negativ geladene Citrathülle elektrostatisch stabilisiert. Für die Apoptose-Bildgebung sollte durch Bindung des Proteins Annexin A5 (AnxA5) an die Citrathülle der VSOP eine zielgerichtete Sonde hergestellt werden (AnxA5-VSOP). Für die Bildgebung von Enzymaktivitäten sollte eine durch die Matrixmetalloproteinase-9 (MMP-9) aktivierbare Sonde hergestellt werden (Protease-spezifische Eisenoxidpartikel, PSOP). / The goal of molecular imaging is to characterize and measure biological processes at cellular and molecular levels for the purpose of diagnosing the cause of diseases and molecular abnormalities. Molecular imaging is based on the use of probes with a high affinity to the target tissue and / or which are specifically activated. The aim of this study was to develop and analyze new molecular imaging probes for the in vivo imaging of apoptosis and enzyme activity using magnetic resonance imaging (MRI), based on very small iron oxide particles (VSOP). VSOP are superparamagnetic and electrostatically stabilized due to their negatively charged citrate surface. For the imaging of apoptosis the protein annexin A5 (AnxA5) was coupled to the citrate surface (AnxA5-VSOP). For the imaging of enzyme activities an activatable imaging probe with a cleavage site for the matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) was synthesized (protease-specific iron oxide particles, PSOP).