Human mesenchymal stem cell (MSC) therapy has shown neuroprotective effects and improvement on recovery from neonatal intraventricular hemorrhage (IVH). This study focused on histological evaluations of human amniotic fluid MSC therapy during early prenatal life in a preterm IVH rabbit model. IVH was diagnosed at 24 h of age with ultrasound and animals were randomized into subgroups with confirmed IVH and an IVH negative control group. Animals with confirmed IVH received vehicle only or MSCs at two different doses via intraperitoneal administration. The animals were sacrificed at 48 h post administration. The severity of IVH was histologically analyzed via staining of endogenous peroxidase activity in cryosections and the distribution of red blood cells and cell-free hemoglobin was scored. Primary antibodies targeting human epitopes were validated in IHC assays of frozen MSC pellet. An anti-human nuclear mitotic apparatus (hNuMA) antibody labeled the majority of cells in the MSC pellet and did not cross-react with rabbit NuMA when tested in the nontreated rabbit brain. Significant levels of red blood cells and cell-free hemoglobin were found in the IVH confirmed group, whereas the control group showed no hemorrhage. The MSC therapy groups showed similar scoring results as the IVH-vehicle group. Anti-hNuMA immunolabeling did not detect any cells in the brain of MSC treated rabbits. However, extracellular (nonnuclear) immunolabeling was detected, located in the midbrain of the animals that received MSCs, indicating the presence of MSC nuclear debris. The preterm rabbit model was proven successful for inducing IVH, whereas MSC treatment did not affect the degree of hemorrhage. To increase the possibility to detect the MSCs post administration, future studies should include prelabeling of the MSCs with a suitable cell tracker and analyses at time points closer to the administration of MSCs. / Human mesenkymal stamcellsterapi har visat neuroprotektiva effekter samt förbättring av återhämtning efter neonatal intraventrikulär blödning (IVH). Denna studie fokuserade på histologiska utvärderingar av stamcellsterapi med humana mesenkymala stamceller (MSC) från fostervatten under tidigt prenatalt liv i en prematur IVH-kaninmodell. IVH diagnostiserades med ultraljud vid 24 tim. ålder och djuren delades slumpmässigt in i undergrupper med konfirmerad IVH och en IVH-negativ kontrollgrupp. Djur med konfirmerad IVH mottog endast bärmedel eller MSC i två olika doser via intraperitoneal administration. Djuren avlivades 48 tim. post administration. Graden av IVH analyserades histologiskt genom färgning av peroxidasaktivitet i kryosnitt av hjärna och distributionen av erytrocyter samt fritt hemoglobin graderades. Primärantikroppar riktade mot humana epitop validerades i immunhistokemiska analyser av fryst MSC-pellet. En anti-human nukleär mitotisk apparat (hNuMA) antikropp märkte majoriteten av cellerna i MSC-pelleten och korsreagerade inte med kanin-NuMA under försök i obehandlad kaninhjärna. Signifikanta nivåer av erytrocyter och fritt hemoglobin påvisades i gruppen med konfirmerad IVH, medan kontrollgruppen inte visade någon blödning. Samtliga IVH-grupper; IVH-vehicle och de som mottog MSC- terapi, visade liknande blödningsgrad. Anti-hNuMA-immuninmärkning kunde inte detektera några celler i de MSC-behandlade kaninhjärnorna. Dock detekterades extracellulär (icke-nukleär) immuninmärkning lokaliserad i mitthjärnan hos de djur som mottog MSC, vilket indikerar närvaro av nukleär MSC-debris. Den prematura kaninmodellen bevisades vara framgångsrik för induktion av IVH, men MSC-terapi påverkade inte blödningsgraden. För att öka sannolikheten att detektera MSC efter administration, borde framtida studier inkludera förmärkning av MSC med en lämplig cellmarkör samt analyser vid tidpunkter närmare administrationen av MSC.

Introduktion: Hyalint brosk består av kondrocyter inbäddade i ett extracellulärt matrix som täcker alla kroppens synoviala leder. I dag är skador på hyalint brosk ett folkhälsoproblem med begränsade behandlingsmöjligheter. Mesenkymala stamceller har i flertalet studier visat sig vara en lovande kandidat för framtida behandling av broskskador, eftersom dessa kan differentiera till broskproducerande kondrocyter. Modern behandling av broskskador innefattar odling av patientens egna kondrocyter eller stamceller för att sedan återföra dem till broskskadan. För att göra detta effektivt behöver optimering av odlingsförhållanden för aktuella celler utföras. Syfte: Att undersöka tillväxt hos kondrocyter samt mesenkymala stromaceller från benmärg i varierande odlingsförhållanden, detta med avseende att utvärdera vilka tillsatser som mest gynnar cellernas viabilitet och proliferation. Material & Metod: Framtagning av kondrocyter och mesenkymala stromaceller från benmärg i denna studie utfördes på överblivet ortopediskt material från en individ. Cellerna kollagenasbehandlades innan de odlades ut i ett standardmedium under tre veckor. Därefter odlades de i närvaro av olika tillsatser under sex dagar. Cellernas viabilitet mättes genom relativ fluorescens med CellTiter-Blue® reagens medan proliferationen mättes genom cellräkning med flödescytometri. Resultat: Det fanns en signifikant skillnad (ANOVA, p<0,05) mellan minst två tillsatser inom grupperna för viabilitetsanalys samt cellräkning för både kondrocyter och benmärgderiverade mesenkymala stromaceller (BMMSC). Kondrocyterna som odlades i närvaro av fetalt bovint serum (FBS) hade högre proliferation och viabilitet än de celler som odlades i frånvaro av FBS. FBS i kombination med insulin-transferrin-selen (ITS) och kondrocytfaktorerna (KF) dexametason, prolin, insulin samt transforming growth factor beta hade störst positiv effekt på proliferationen. Vidare visade Minimum Essential Medium α med tillsats av FBS 10 % ha störst effekt, av den panel som undersöktes, på både viabilitet och proliferation hos BMMSC. Slutsats: FBS i kombination med ITS och KF hade störst stimulerande effekt på proliferation hos kondrocyter. Val av standardmedium hade större betydelse än tillsats av faktorer vid odling av BMMSC in vitro. / Introduction: Articular cartilage consists of chondrocytes and covers all the synovial joints in the body. Articular cartilage injuries are today a public health issue with limited orthopedic treatments. Mesenchymal stem cells have shown to be a promising candidate for future treatment of articular cartilage injuries due to their many abilities. Modern treatment of cartilage damage involves cultivation of the patient´s own chondrocytes and stem cells. To make this treatment as effective as possible the culture conditions for chondrocytes and stem cells must be optimized. Aim: To study cell growth in chondrocytes and mesenchymal stromal cells from bone marrow in varying culture conditions, this regarding to evaluate the most optimal culture conditions for cell viability and proliferation. Method: Cell extraction in this study was performed on leftover orthopedic material. The cells were treated with collagenase and then cultured in a standard medium for three weeks before they were cultured in presence of various factors for six days. Cell viability was measured by relative fluorescence while proliferation was measured by cell counting. Result: There was a statistically significant difference (ANOVA, p<0,05) between at least two additives within the groups for viability analysis and cell count for both chondrocytes and bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BMMSC). The chondrocytes cultured in presence of fetal bovine serum (FBS) had a higher proliferation and viability compared to the cells cultured in the absence of FBS. FBS in combination with insulin-transferrin-selenium (ITS) and the chondrocyte factors (CF) dexamethasone, proline, insulin and transforming growth factor beta had the biggest impact on proliferation. Minimum Essential Medium α with FBS 10% additive showed positive effects on both viability and proliferation of BMMSCs. Conclusion: FBS in combination with ITS and CF had a good effect on the proliferation of chondrocytes. The choice of standard medium seems to have a more important role than growth factor additive when studying BMMSCs expansion in vitro.

Studien utvärderar egenskaper hos mesenkymala stromaceller (MSC) i passage 2 och 3. I ett samarbete mellan Cellcolabs och Karolinska Institutet (KI) genomfördes projektet med Katarina Le Blancs forskargrupp. Genom att studera membranmarkörer från tre friska MSC-donatorer, tillsammans med deras förmåga att differentiera till osteoblaster, adipocyter och kondrocyter, samt deras förmåga att inhibera profileringen av CD8+ och CD4+ T-lymfocyter, och slutligen deras möjlighet att öka uttrycket av Indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) och interleukin 6 (IL6), kunde en jämförelse mellan passage 2 och 3 göras. I korta drag kunde enbart en tydlig skillnad göras mellan de två passagerna. Skillnaden sågs i förmågan att differentiera till osteoblaster, där passage 3 inte kunde prestera på samma nivå som passage 2. Utöver detta var resultaten för de två typerna jämförbara och antydde inte till några större förändringar mellan passage 2 och 3. För att stärka tillförlitligheten av resultatet bör dock fler MSC-donatorer jämföras. / The study evaluates the characteristics and consistency of mesenchymal stromal cells (MSCs) in two different passages, specifically 2 and 3. In a collaboration between Cellcolabs and Karolinska Institutet (KI), the project was conducted with Katarina Le Blanc’s research group. Through studying the surface expression on cells from three distinct MSC donors, along with their differentiation ability into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes, their capability to suppress the proliferation of CD8+ and CD4+ T lymphocytes, and finally their possibility to increase the expression of indoleamine 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) and interleukin 6 (IL6), a comparison between passage 2 and 3 could be done. It was seen that a clear distinction could be made between the two passages while looking at their ability to differentiate into osteoblasts. The remaining results showed comparable outcomes between passage 2 and 3, suggesting minor changes with the increased passage number. However, to strengthen the reliability of the outcome, more MSC donors should be compared.