Nessa pesquisa foram testados separadamente dois inóculos solo/compostagem e lodo termofílico de reator anaeróbio de manta de lodo e fluxo ascendente (UASB) do tratamento de vinhaça em relação ao potencial de produção de compostos de valor agregado a partir do bagaço de cana-de-açúcar (BCA) em reatores em batelada em condição mesofílica e termofílica, respectivamente. Pré-tratamentos térmico, ácido e diluição seriada foram aplicados ao inóculo termofílico, como tentativa de inibir as arqueias metanogênicas. A diluição seriada foi o pré-tratamento aplicado em ambos os inóculos, mesofílico e termofílico, para obtenção de consórcio de bactérias fermentadoras. Cinco meios de culturas foram testados como fonte de nutrientes para o crescimento de bactérias celulolíticas e fermentadoras. Dentre esses foi selecionado para os ensaios mesofílicos e termofílicos, o meio de cultura mais complexo suplementado com extrato de levedura. O BCA foi submetido à pré-tratamento biológico, térmico, explosão a vapor, deslignificação alcalina e hidrotérmico sendo o último utilizado nos ensaios do planejamento fatorial. O efeito das variáveis independentes de concentração de extrato de levedura e temperatura foi avaliado na produção de hidrogênio, metano e ácidos orgânicos a partir do inóculo termofílico. O efeito da concentração de extrato de levedura e substrato (BCA) foi avaliado na produção de bioprodutos a partir do inóculo mesofílico (37ºC). A maior produção de hidrogênio foi de 17,30 mmol/L à 60ºC e 3,42 g/L de extrato de levedura para a condição termofílica. Em relação aos ensaios mesofílicos observou-se 1,53 mmol/L com 3,42 e 5,00 g/L de extrato de levedura e BCA, respectivamente. Caracterização taxonômica e funcional dos microrganismos dos reatores de melhor desempenho de produção de hidrogênio dos planejamentos fatoriais termofílico e mesofílico foi realizada por análise Metagenômica (Illumina HiSeq). Nestas condições foram identificados microrganismos dos domínios Archaea, Bacteria, Eukarya, além de vírus. Para o domínio Bacteria foram identificados microrganismos celulolíticos e fermentadores como Coprothermobacter e Clostridium, enquanto para o domínio Archaea, foram identificadas metanogênicas hidrogenotróficas e acetoclásticas, como Methanothermobacter e Methanosarcina. Foram ainda identificados genes codificantes de enzimas catalisadoras da degradação de celulose, hemicelulose e lignina, constituintes principais da biomassa lignocelulósica utilizada como substrato, tais como celulase, carboxylesterase e 2-ácido hidroxi oxidase, respectivamente. Microrganismos aderidos no BCA in natura foram observados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e identificados por sequenciamento do RNAr 16S, e semelhantes a Streptomyces, Paenibacillus, Stenotrophomonas, Sphingomonas. Os microrganismos do lodo termofílico, solo e compostagem foram caracterizados por sequenciamento do RNAr 16S, e foram semelhantes a Clostridium, Thermoanaerobacter, Caloramator, Anaerobaculum, Tatlockia, Coprothermobacter, Dysgonomonas, Coprococcus, Sporomusa, Methanobacterium, Methanothermobacter, Methanosaeta, dentre outros. / In the present study, two inoculum (soil/compost and thermophilic sludge from upflow anaerobic sludge blanket from vinasse treatment) were separately evaluated as potential to production of value-added products from sugarcane bagasse in mesophilic and thermophilic conditions, respectively. Thermal, acid and serial dilution pretreatments were performed in the thermophilic inoculum to inhibition of methanogenic archaea. Serial dilution was applied into the mesophilic inoculm. Five culture medium were evaluated as nutritional source to enrichment of cellulolytic and fermenters bacteria; between then, the most complex one, supplemented with yeast extract was selected for the mesophilic and thermophilic bioassays. The sugarcane bagasse (SCB) was submitted to biological, thermal, stem explosion alkaline delignification and hydrothermal pretreatments, and the last one was used as substrate for the factorial designs. The effect of independent variables, such as yeast extract and temperature were evaluated on the hydrogen, methane and organic acids production from the thermophilic inoculum. The effect of yeast extract and substrate (SCB) concentrations were evaluated on the bioproducts generation from the mesophilic inoculum. The highest hydrogen production of 17.3 mmol/L was obtained at 60ºC and 3.42 g/L of yeast extract, on the thermophilic factorial design. In relation to the mesophilic factorial design, obtained 1.53 mmol/L of hydrogen with 3.42 and 5.00 g/L of yeast extract and SCB, respectively. Taxonomical and functional characterizations from the microorganisms were performed in the reactors with highest hydrogen production on the factorial designs using Metagenomics analysis (Illumina HiSeq). In both condition, mesophilic and thermophilic were found microorganisms from Archaea, Bacteria, Eukarya domin, besides Viruses. Concerning the Bacteria domain were found cellulolytic and fermenters microorganisms similar to Coprothermobacter and Clostridium, whiles for Archaea domain were identified hydrogenotrophic and acetoclastic methanogenic similar to Methanothermobacter and Methanosarcina. There were obtained genes coding to enzymes related to the cellulose, hemicellulose and lignin degradation such as carboxylesterase e 2-acid-hydroxioxidase, respectively. Microorganisms adhered into the in natura SCB fiber were observed by scanning electronic microscopy (SEM) and identified by 16 S rRNA sequencing, mainly as similar to Streptomyces, Paenibacillus, Stenotrophomonas, Sphingomonas. The microorganisms from the thermophilic sludge, soil and composting were also characterized by 16S RNAr sequencing and were similar to Clostridium, Thermoanaerobacter, Caloramator, Anaerobaculum, Tatlockia, Coprothermobacter, Dysgonomonas, Coprococcus, Sporomusa, Methanobacterium, Methanothermobacter, Methanosaeta, among others.

For the last 150 years many studies have shown the importance of earthworms for plant growth, but the exact mechanisms involved in the process are still poorly understood. Many important functions required for plant growth can be performed by soil microbes in the rhizosphere. To investigate earthworm influence on the rhizosphere microbial community, it was performed a macrocosm experiment with and without Pontoscolex corethrurus (EW+ and EW-, respectively) and followed various soil and rhizosphere processes for 217 days with sugarcane. In the second chapter of this thesis it was demonstrate that in EW+ treatments, N2O concentrations belowground (15 cm depth) and relative abundances of nitrous oxide genes (nosZ) were higher in bulk soil and rhizosphere, suggesting that soil microbes were able to consume earthworm-induced N2O. Shotgun sequencing (total DNA) revealed that around 70 microbial functions in bulk soil and rhizosphere differed between EW+ and EW- treatments. Overall, genes indicative of biosynthetic pathways and cell proliferation processes were enriched in EW+ treatments, suggesting a positive influence of worms. In EW+ rhizosphere, functions associated with plant-microbe symbiosis were enriched relative to EW- rhizosphere. Ecological networks inferred from the datasets revealed decreased niche diversification and increased keystone functions as an earthworm-derived effect. Plant biomass was improved in EW+ and worm population proliferated. Considering that earthworms contributed to with extra resources, it was evaluated in chapter three response of the soil resistome of sugarcane macrocosms under the influence of earthworms. Mechanisms of resistance against antimicrobial compounds appear to be an obligatory feature for the ecology and evolution of prokaryotic forms of life. However, most studies on resistance dynamics have been conducted in artificial conditions of anthropogenic inputs of antibiotics into very specific communities such as animal microbiomes. To resolve why and how resistance evolves, it is important to track antibiotics resistance genes (ARGs) (i.e., the resistome) in their natural hosts and understand their ecophysiological role in the environment. The results demonstrated that earthworms influenced changes of ARGs in bulk soil and rhizosphere. Negative correlations between ARGs and taxonomical changes were increased in EW+. Differential betweenness centrality (DBC=nBCEW+ - nBCEW-) values comparing the network models with and without earthworms showed earthworm presence changed the composition and the importance of the keystone members from the models. Redundancy analysis suggested that ARGs may be associated with microbial fitness, as the variance of relative abundance of members of the group Rhizobiales could be significantly explained by the variance of a specific gene responsible for one mechanism of tetracycline detoxification / Ao longo dos últimos 150 anos muitos estudos têm demonstrado a importância das minhocas para o crescimento de plantas. Porém o exato mecanismo envolvido neste processo ainda é muito pouco compreendido. Muitas funções importantes necessárias para o crescimento de plantas podem ser realizadas pela comunidade microbiana da rizosfera. Para investigar a influência das minhocas na comunidade microbiana da rizosfera, foi desenvolvido um experimento de macrocosmo com cana-de-açúcar com e sem Pontoscolex corethrurus (EW+ e EW-, respectivamente) seguindo diversos procedimentos por 217 dias. No Segundo capítulo da tese é demonstrado que no tratamento EW+, as concentrações de N2O dentro do solo (15 cm profundidade) e a abundância relativa dos genes óxido nitroso redutase (nosZ) foram elevadas no solo e na rizosfera, sugerindo que microrganismos do solo foram capazes de consumir a emissão de N2O induzida pelas minhocas. O sequenciamento do DNA total revelou que aproximadamente 70 funções microbianas no solo e na rizosfera apresentaram diferenças entre os tratamentos EW+ e EW-. No geral, genes associados a biossíntese e proliferação de células foram enriquecidos em EW+, sugerindo uma influencia positiva por parte das minhocas. Na rizosfera EW+, funções associadas a simbiose entre planta e microrganismos foram relativamente enriquecidas comparado com rizosfera EW-. Modelos de rede de interação ecológica revelam menor número de diversificação de nichos e aumento de funções importantes como um efeito derivado da influência das minhocas. A biomassa das plantas foi aumentada no tratamento EW+ e a população de minhocas proliferou. Considerando que as minhocas contribuíram com o aumento de nutrientes, foi avaliado no capítulo três a resposta do resistoma presente nas comunidades microbianas dos solos do experimento. Mecanismos de resistência contra compostos antimicrobianos parecem ser características obrigatórias para a ecologia e evolução de procariotos. Entretanto, a maior parte dos estudos sobre genes de resistência tem sido conduzida em condições artificiais utilizando fontes antropogênicas de antibióticos em comunidades microbianas muito específicas como por exemplo o microbioma animal. Para resolver por que e como a resistência evolui, é importante estudar genes de resistência a antibióticos (GRA) (i.e., resistoma) no seu ambiente natural e entender seu papel ecofisiologico no ambiente. Os resultados demonstraram que minhocas influenciaram a mudança na composição de GRA no solo e na rizosfera. Tratamentos EW+ apresentaram maior número de correlações negativas entre ARG e grupos taxonômicos. A medida de centralidade diferencial (DBC=nBCEW+ - nBCEW-) comparando os modelos de rede de interações obtidos mostrou que a composição e o nível de importância dos indivíduos mais influentes é alterado nos tratamentos EW+ comparado com EW-. Além disso, por meio de uma análise de redundância (RDA) foi demonstrado que as alterações na abundancia relativa de GRA podem ser explicadas pelas alterações verificadas em grupos taxonômicos

Este trabalho teve como objetivo analisar, através de uma abordagem metagenômica/computacional, a variação do conteúdo gênico e do potencial metabólico das comunidades microbianas associadas a dois ambientes da Fundação Parque Zoológico de São Paulo: um reservatório artificial, o Lago São Francisco e o sistema de compostagem de resíduos do parque. Para o estudo do primeiro ambiente, amostras foram coletadas mensalmente no Lago São Francisco de outubro de 2012 a setembro de 2013 e submetidas ao sequenciamento metagenômico. Esse estudo mostrou que agrupamentos de amostras de uma mesma estação são estatisticamente suportados. As coocorrências de espécies, com suporte estatístico alto, foram estabelecidas e representadas em uma rede separada em 60 grupos ou módulos. A maioria dos grandes módulos foram formados quase exclusivamente por espécies do mesmo filo, indicando possíveis mecanismos de resposta a fatores ambientais e à presença de nutrientes ao invés da pura interação entre espécies. Os fatores que levaram à variação dos táxons também influenciaram o potencial metabólico da comunidade: embora os módulos metabólicos de forma geral estivessem distribuídos ao longo dos meses, alguns se destacaram pela variação intensa, principalmente na amostra de novembro de 2012. Para o estudo do segundo ambiente, foram analisados dois conjuntos de dados de sequenciamento metagenômico gerados a partir de amostras seriadas coletadas ao longo do processo de compostagem. Nos dias iniciais do processo de compostagem, os mais discrepantes, houve uma super-representação de módulos metabólicos relacionados principalmente ao metabolismo de carboidratos e à síntese de aminoácidos. Em conjunto, os dados obtidos nesse estudo indicaram uma comunidade microbiana com potencial metabólico variando direcionalmente em função dos compostos inicialmente presentes ou oriundos do substrato, em função da presença de oxigênio e em função da etapa do processo. / This project aimed to analyze, through a computational approach, the change of gene content and metabolic potential in metagenomes from two microbiomes from São Paulo Zoo Park Foundation: an artificial reservoir, Lake São Francisco, and the compost systems in the park. For the study on the first microbiome, samples were monthly collected in Lake São Francisco from October 2012 to September 2013 and submitted to metagenomic sequencing. This study showed that clustering of the samples from a same season is statistically supported. The species co-occorrences, with high statistical support, were established and represented in a network composed by 60 groups or modules. The most biggest modules were formed almost exclusively by species of the same phylum, pointing possible response mechanisms to environmental factors and to presence of nutrients instead of the simple species interaction. The factors which leaded to taxa variation also influenced the metabolic potential of the community: although the metabolic modules generally are spreaded through the months, some highlighted because the intense variation, mainly in the sample from November 2012. For the latter environment, two metagenomic datasets were analyzed from serial samples collected throughout the composting process. In the initial days of composting process, the most discrepant, there was an uprepresentation of metabolic modules related to carbohydrates metabolism and amino acids synthesis. All data in this study indicated a microbial community with metabolic potential varying according to nutrientes, oxygen presence and process stage.

O processo de domesticação e posterior melhoramento das plantas cultivadas foram essenciais para o sustento do crescimento populacional observado na recente história da humanidade. Porém, no processo de melhoramento das culturas não foi considerado o importante papel que o microbioma rizosférico desempenha nas plantas. Neste contexto, esta pesquisa foi direcionada ao estudo do microbioma rizosférico do feijoeiro, considerando um genótipo selvagem e outro cultivado, a fim de determinar a composição e funcionalidade do microbioma em cada rizosfera. Assim, para testar a hipótese de que materiais ancestrais têm maior capacidade de hospedar micro-organismos benéficos na rizosfera quando comparados a cultivares modernas, os genótipos de feijão cultivado IAC Alvorada e selvagem Wild Mex foram cultivados em Terra Preta da Amazônia (TPA), solo caracterizado por abrigar uma grande diversidade microbiana. O DNA total do solo rizosférico de cada genótipo de feijão e do bulk soil foi extraído para realizar o sequenciamento metagenômico usando a plataforma Illumina MiSeq. O solo rizosférico também foi usado para isolar e selecionar bactérias antagonistas a fungos radiculares patógenos do feijoeiro, Rhizoctonia solani e Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. A abordagem dependente de cultivo permitiu recuperar 11 bactérias que apresentaram atividade antagônica in vitro contra os patógenos avaliados, os isolados bacterianos foram identificados como pertencentes aos gêneros Streptomyces, Kitasatospora, Alcaligenes, Achromobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Brevibacillus e Paenibacillus. A abordagem independente de cultivo revelou que a composição da comunidade microbiana na rizosfera do feijão selvagem Wild Mex foi caracterizada pela maior abundância relativa dos filos bacterianos Acidobacteria, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes, e do filo fúngico Glomeromycota quando comparada com a composição da rizosfera do genótipo cultivado IAC Alvorada, a qual foi constituída em maior proporção pelos filos bacterianos Firmicutes, Planctomycetes, Deinococcus-Thermus e pelo filo fúngico Ascomycota. No nível taxonômico de gênero, a comunidade microbiana da rizosfera do feijão selvagem Wild Mex apresentou maior frequência relativa de gêneros fixadores do nitrogênio, nitrificadores, antagonistas e promotores do crescimento vegetal. A rizosfera do feijão selvagem Wild Mex apresentou maior abundância relativa de funções relacionadas à fixação do nitrogênio, produção de sideróforos e de ácido indol acético (AIA), quando comparada com o genótipo cultivado IAC Alvorada. O padrão de distribuição observado na análise de ordenação das funções no microbioma da rizosfera do feijão selvagem Wild Mex foi diferente do padrão encontrado no bulk soil e na rizosfera do feijão cultivado IAC Alvorada. Os resultados indicaram que o genótipo selvagem é mais seletivo no recrutamento de micro-organismos e funções na rizosfera quando comparado com o cultivar moderno. Em conclusão, os resultados revelaram que o processo de domesticação e melhoramento genético das plantas cultivadas potencialmente debilitou a capacidade do hospedeiro em selecionar e sustentar micro-organismos e funções benéficas na rizosfera. / The process of domestication and subsequent plant breeding were key to support human population growth over the last decades. However, plant breeding has neglected the important role of the rhizosphere microbiome on plant performance. In this context, this research aimed the study of common bean rhizosphere microbiome in a wild and in a cultivated genotype to determine the composition and functionality of their microbial community. We tested the hypothesis that ancestor materials have higher ability to host beneficial microorganisms in the rhizosphere when compared to modern cultivars. The common bean genotype IAC Alvorada and wild common bean Wild Mex were grown in highly biodiverse soil (Amazonian Dark Earth - ADE) and the total DNA from bulk soil and each common bean rhizosphere was extracted for sequencing by using Illumina MiSeq platform. In addition, rhizosphere soil was also used to isolate and select antagonistic bacteria against soil borne pathogens Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. Using cultivation-dependent approach, 11 bacteria were isolated and showed antagonistic in vitro activity against the evaluated pathogens. The bacterial isolates were identified belonging to Streptomyces, Kitasatospora, Alcaligenes, Achromobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Brevibacillus and Paenibacillus genus. The cultivation- independent approach revealed that microbial community composition in the Wild Mex bean rhizosphere was characterized by higher relative abundance of bacterial phyla Acidobacteria, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes and fungal phylum Glomeromycota when compared with IAC Alvorada cultivated bean, which showed a higher relative abundance of bacterial phyla Firmicutes, Planctomycetes, Deinococcus-Thermus and fungal phylum Ascomycota. Wild Mex rhizosphere microbiome showed higher relative frequency of nitrogenfixing, nitrifying, antagonists and plant growth promoting microorganisms. The wild bean also showed higher relative abundance of functions related to nitrogen fixation, siderophore and indole acetic acid (IAA) production, when compared with IAC Alvorada bean. The distribut ion pattern observed in the functions ordination analysis of Wild Mex was different from the bulk soil and IAC Alvorada patterns. The results showed that wild genotype is more selective for recruiting microorganisms and functions in the rhizosphere when compared with modern cultivar. In conclusion, the results revealed that domestication and plant breeding potentially undermined rhizosphere microbiome composition and functions debilitating the host\'s abilit y to select and support beneficial microbes.

For the last 150 years many studies have shown the importance of earthworms for plant growth, but the exact mechanisms involved in the process are still poorly understood. Many important functions required for plant growth can be performed by soil microbes in the rhizosphere. To investigate earthworm influence on the rhizosphere microbial community, it was performed a macrocosm experiment with and without Pontoscolex corethrurus (EW+ and EW-, respectively) and followed various soil and rhizosphere processes for 217 days with sugarcane. In the second chapter of this thesis it was demonstrate that in EW+ treatments, N2O concentrations belowground (15 cm depth) and relative abundances of nitrous oxide genes (nosZ) were higher in bulk soil and rhizosphere, suggesting that soil microbes were able to consume earthworm-induced N2O. Shotgun sequencing (total DNA) revealed that around 70 microbial functions in bulk soil and rhizosphere differed between EW+ and EW- treatments. Overall, genes indicative of biosynthetic pathways and cell proliferation processes were enriched in EW+ treatments, suggesting a positive influence of worms. In EW+ rhizosphere, functions associated with plant-microbe symbiosis were enriched relative to EW- rhizosphere. Ecological networks inferred from the datasets revealed decreased niche diversification and increased keystone functions as an earthworm-derived effect. Plant biomass was improved in EW+ and worm population proliferated. Considering that earthworms contributed to with extra resources, it was evaluated in chapter three response of the soil resistome of sugarcane macrocosms under the influence of earthworms. Mechanisms of resistance against antimicrobial compounds appear to be an obligatory feature for the ecology and evolution of prokaryotic forms of life. However, most studies on resistance dynamics have been conducted in artificial conditions of anthropogenic inputs of antibiotics into very specific communities such as animal microbiomes. To resolve why and how resistance evolves, it is important to track antibiotics resistance genes (ARGs) (i.e., the resistome) in their natural hosts and understand their ecophysiological role in the environment. The results demonstrated that earthworms influenced changes of ARGs in bulk soil and rhizosphere. Negative correlations between ARGs and taxonomical changes were increased in EW+. Differential betweenness centrality (DBC=nBCEW+ - nBCEW-) values comparing the network models with and without earthworms showed earthworm presence changed the composition and the importance of the keystone members from the models. Redundancy analysis suggested that ARGs may be associated with microbial fitness, as the variance of relative abundance of members of the group Rhizobiales could be significantly explained by the variance of a specific gene responsible for one mechanism of tetracycline detoxification / Ao longo dos últimos 150 anos muitos estudos têm demonstrado a importância das minhocas para o crescimento de plantas. Porém o exato mecanismo envolvido neste processo ainda é muito pouco compreendido. Muitas funções importantes necessárias para o crescimento de plantas podem ser realizadas pela comunidade microbiana da rizosfera. Para investigar a influência das minhocas na comunidade microbiana da rizosfera, foi desenvolvido um experimento de macrocosmo com cana-de-açúcar com e sem Pontoscolex corethrurus (EW+ e EW-, respectivamente) seguindo diversos procedimentos por 217 dias. No Segundo capítulo da tese é demonstrado que no tratamento EW+, as concentrações de N2O dentro do solo (15 cm profundidade) e a abundância relativa dos genes óxido nitroso redutase (nosZ) foram elevadas no solo e na rizosfera, sugerindo que microrganismos do solo foram capazes de consumir a emissão de N2O induzida pelas minhocas. O sequenciamento do DNA total revelou que aproximadamente 70 funções microbianas no solo e na rizosfera apresentaram diferenças entre os tratamentos EW+ e EW-. No geral, genes associados a biossíntese e proliferação de células foram enriquecidos em EW+, sugerindo uma influencia positiva por parte das minhocas. Na rizosfera EW+, funções associadas a simbiose entre planta e microrganismos foram relativamente enriquecidas comparado com rizosfera EW-. Modelos de rede de interação ecológica revelam menor número de diversificação de nichos e aumento de funções importantes como um efeito derivado da influência das minhocas. A biomassa das plantas foi aumentada no tratamento EW+ e a população de minhocas proliferou. Considerando que as minhocas contribuíram com o aumento de nutrientes, foi avaliado no capítulo três a resposta do resistoma presente nas comunidades microbianas dos solos do experimento. Mecanismos de resistência contra compostos antimicrobianos parecem ser características obrigatórias para a ecologia e evolução de procariotos. Entretanto, a maior parte dos estudos sobre genes de resistência tem sido conduzida em condições artificiais utilizando fontes antropogênicas de antibióticos em comunidades microbianas muito específicas como por exemplo o microbioma animal. Para resolver por que e como a resistência evolui, é importante estudar genes de resistência a antibióticos (GRA) (i.e., resistoma) no seu ambiente natural e entender seu papel ecofisiologico no ambiente. Os resultados demonstraram que minhocas influenciaram a mudança na composição de GRA no solo e na rizosfera. Tratamentos EW+ apresentaram maior número de correlações negativas entre ARG e grupos taxonômicos. A medida de centralidade diferencial (DBC=nBCEW+ - nBCEW-) comparando os modelos de rede de interações obtidos mostrou que a composição e o nível de importância dos indivíduos mais influentes é alterado nos tratamentos EW+ comparado com EW-. Além disso, por meio de uma análise de redundância (RDA) foi demonstrado que as alterações na abundancia relativa de GRA podem ser explicadas pelas alterações verificadas em grupos taxonômicos

Os micro-organismos apresentam uma imensa diversidade genética e desempenham funções únicas e cruciais na manutenção de ecossistemas. Uma dessas funções é a produção de enzimas extracelulares, que ajudam na degradação da matéria orgânica e são cada vez mais procuradas e exploradas pela indústria. Essa propriedade aumenta a busca por enzimas que possam ser utilizadas nos diversos setores industriais com maior aproveitamento e baixo custo. A celulase pertence a essa classe de enzimas e é formada por um complexo multienzimático capaz de hidrolisar celulose por meio da quebra da ligação β,1-4. A partir dessa característica da celulase, foi realizada uma expressão heteróloga relacionada com a hidrólise da celulose em biblioteca metagenômica de solo da Caatinga. Foram realizados testes de produção enzimática por meio dos quais selecionamos os clones 283/A8 e 307/E11 como melhores produtores de endoglicanases. Com o objetivo de analisar a cinética de produção de celulases pelos clones, estes foram inoculados em diferentes fontes de celulose, pH e temperatura. A faixa ideal de pH foi 5,0 e de temperatura, 50º C, verificada para as enzimas Celulase Total, Endoglicanase e β-glicosidase. Quanto à termoestabilidade, as enzimas presentes mantiveram mais de 60% da atividade inicial após 2 horas de incubação a 50º C. O perfil de proteínas analisado por SDS-PAGE demonstrou que os clones secretam um conjunto de enzimas celulolíticas com 25 a 100 KDa, quando cultivado em farelo de trigo, e 30 a 60 KDa, quando cultivados em CMC. No ensaio de cromatografia para o clone 307/E11, foram selecionadas 5 frações que obtiveram melhores resultados na dosagem enzimática e testados frente ao pH e à temperatura. O resultado obtido foi que o complexo enzimático bruto, extraído do sobrenadante produzido pelo clone, possui melhor atividade frente ao pH e à temperatura do que as frações parcialmente purificadas. / Microorganisms are distinguished by a wide genetic diversity and they perform unique and crucial functions concerning the maintenance of ecosystems. One of those functions is the production of extracellular enzymes, which help in the degradation of organic matter and which are increasingly wanted and explored by industry. Such feature boosts the search of enzymes that can be exploited in several industrial sectors with improved full use and low cost. Cellulase belongs to such class of enzymes and it is composed of a multi-enzymatic complex which is able to hydrolyse cellulose through the breaking of the chemical bond β,1-4. Considering such attribute of the cellulase, a heterologous expression, related to cellulose hydrolysis in a metagenomic inventory of the soil of Caatinga, was realized. Tests of enzymatic production were performed, and through them, we could elect the clones 283/A8 and 307/E11 as the best endoglicanase producers. Those clones were inoculated in different cellulose sources, pH and temperature, so that we could analyse the kinetic of cellulase production between them. The ideal pH range was 5.0 and the ideal temperature range was 50º C (122º F), verified for the enzymes Total Cellulase, Endoglicanase and β-glucosidase. With regard to thermostability, the present enzymes kept more than 60% of the initial activity after 2 hours of incubation at 50º C (122º F). The proteins profile analysed with the help of SDS-PAGE proved that the clones secrete a group of cellulolytic enzymes with a weight average of 25 to 100 KDa, when cultivated in wheat bran, and of 30 to 60 KDa, when cultivated in CMC. Five fractions with the best results, regarding enzymatic dosage and tested before pH and temperature, were chosen by the chromatography research for the clone 307/E11. The achieved result proved that the raw enzymatic complex, extracted from the supernatant produced by the clone, develops a better activity before pH and temperature than the fractions partially purified.

Submitted by Kelson Anthony de Menezes (kelson@ucb.br) on 2016-11-23T12:14:00Z No. of bitstreams: 1 JessicaCarvalhoBergmannTeseparcial2013.pdf: 124515 bytes, checksum: 0d2877a5336a887b74ef27ed08081d9a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-23T12:14:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 JessicaCarvalhoBergmannTeseparcial2013.pdf: 124515 bytes, checksum: 0d2877a5336a887b74ef27ed08081d9a (MD5) Previous issue date: 2013-10-07 / The necessity to be a self-suficient producer of fuels is stimulating research for alternative types of energy. Brazil, as well as other countries, is investing in this sector and in 2012 was the second largest biofuel producer in the world. Bioethanol production can double productivity with second generation technology in which bioethanol is produced from cellulose. Biodiesel production from oils using different feedstocks can also contribute for this independency in biofuels production, both locally and globally. This doctorate thesis is divided in two chapters, both attempting to make a contribution to the development of the biofuels sector in Brazil. The first chapter focuses on enzyme discovery for ethanol production from cellulose. The second chapter focuses on the characterization of the soil microbiota associated with oil palm plants with fatal yellowing, which has hindered the development of a biodiesel industry based on palm oil. The first chapter describes prospection for hydrolytic enzymes to be used for biomass deconstruction in second generation bioethanol production. Enzymes were screened from an Amazon soil large insert metagenomic library (30-50 kb). The library containing approximately 213,000 clones was functionally screened, and 15 clones with cellulolytic activity and 16 clones resistant to hydroquinone were identified. The sequences of these 31 clones and an additional 65 other random clones were obtained and analysed using the IMG/MER pipeline. In silico analysis identified several coding regions (CDS) that were amplified by PCR and cloned in expression vectors. The sequences for two beta-glucosidases enzymes, BGL17 and BGL18, were codon optimized before being expressed and purified. Characterization of both enzymes showed that the optimum temperature for BGL17 and BGL18 was 45oC and 40oC, respectively. The optimum pH for BGL17 and BGL18 was 6.0 and for 6.5, respectively. Half-life stability was approximately one hour for both enzymes. Regarding enzyme kinetics, BGL18 showed higher Vmax and Km (11 U/mg ?? 0.0011 and 0.36 mM ?? 0.01612) when compared to BGL17 (85 U/mg ?? 0.0028 and 0.30 mM ?? 0.017). Kcat was only calculated for BGL17 as 38.57 s-1 ?? 0.37 as the purification of BGL18 was not successfull. Chapter two aimed to study the soil bacterial diversity from oil palm trees affected by fatal yellowing disease (bud rot) in three different stages. The strategy used was pyrosequencing of the gene for the 16S ribosomal RNA (16S rRNA). Oil palm is an oilcrop produced in the north region of Brazil with hight oil yield, which makes it a good candidate for biodiesel production. However, oil palm trees are being affected by fatal yellowing (FY) for more than 20 years, but to this date no etiological agent was identified. Observation was reported where healthy palm tree were planted in the same spot as previously sick tree, developed FY after a period of time, suggesting that the disease could be transmitted by some microorganism in the soil. In this work, the gene for 16S rRNA was amplified from DNA extracted from soil of diseased oil palm trees (stages 5 and 8) and from plants with no symptoms of the disease and sequenced. Pyrosequencing originated 839,694 sequences. After artifacts and chimeras were removed, 498,397 sequences distributed in 9 samples (3 for each disease stage) remained to be analyzed. Sequences were analyzed using the Qiime pipeline (Quantitative Insights in Microbial Ecology) and taxonomic classification of sequences was obtained based on the RDP (Ribossomal Database Project). The most abundant phyla in the samples were Acidobacteria, Proteobacteria, Planctomycetes, Firmicutes and Verrucomicrobia. Alpha and Beta diversity were calculated and taxonomic comparisons were performed by STAMP software. Results showed that the bacterial communtiy associated with soils of diseaded plants on stage 5 (DCA5) and stage 8 had a higher number of observed OTUs than stage 0, as determined by the Chao1 phylogenetic diversity index. Beta-diversity analysis showed that the different biological replicates of soil from diseased plants of the same stage are significantly different, as shown in PCoA (Principal Coordenate Analysis). Taxonomic comparison showed more rare phyla associated to stages 5 and 8 of the disease. This work is the first to study the bacterial microbiota associated with soils of oil palm plants with and without symptoms of fatal yellowing with next generation sequencing. / A necessidade de produzir combust??veis para que futuramente haja independ??ncia na produ????o de energia, vem impulsionando pesquisas no setor de energias alternativas. O Brasil, assim como outros pa??ses emergentes, tem investido e ganhado espa??o neste cen??rio, sendo hoje o segundo maior produtor mundial de biocombust??veis. A produ????o de bioetanol, apesar de j?? bem estabelecida no pa??s, poder?? dobrar com a tecnologia de produ????o de etanol de segunda gera????o (a partir da biomassa). Al??m disso, com a produ????o de biodiesel a partir do ??leo de diferentes culturas oleaginosas poder?? contribuir para esta independ??ncia na produ????o de biocombust??veis localmente e globalmente. Esta tese est?? dividida em dois cap??tulos, ambos tratando como produto final a produ????o de biocombust??veis. O cap??tulo um teve como objetivo a prospec????o de enzimas hidrol??ticas para serem utilizadas durante o processo de hidr??lise enzim??tica e clones resistentes a produtos secund??rios formados durante o processo de pr??-tratamento na produ????o de etanol de segunda gera????o. Construiu-se uma biblioteca metagen??mica de grandes insertos (30-50 kb) em fosm??deo a partir de DNA da comunidade microbiana do solo amaz??nico. A biblioteca contendo aproximadamente 213.000 clones foi triada funcionalmente, identificando 15 clones com atividade celulol??tica e 16 clones resistentes ?? hidroquinona (produto t??xico a leveduras produzido durante o pr??tratamento). Estes 31 clones com atividade na triagem funcional, somados a outros 65 clones selecionados aleatoriamente, foram sequ??nciados e suas sequ??ncias depositadas no pipeline IMG/MER (JGI) onde foram anotadas. A an??lise computacional dos clones com atividades enzim??ticas permitiu a identifica????o de diferentes regi??es codificantes (CDs) que foram amplificadas por PCR e clonadas em vetores de express??o. Conseguiu-se a express??o de duas enzimas beta-glicosidases (BGL17 e BGL18) que tiveram suas sequ??ncias otimizadas antes de serem purificadas. A caracteriza????o destas enzimas mostrou que a BGL17 e BGL18 possuem uma temperatura ??tima de 45oC e 40oC, respectivamente, e um pH ??timo de 6 e 6,5, respectivamente, com estabilidade m??dia nestas condi????es em torno de uma hora. A BGL17 possui um valor de Vmax e Km de 85 U/mg e 0,30 mM ?? 0.017 enquanto a BGL18 possui os valores de Vmax e Km de 11,01 U/mg e 0,36 mM ?? 0,01612. O cap??tulo dois visou o estudo da microbiota de solo de dendezeiros acometidos pelo amarelecimento fatal (AF) em diferentes est??gios da doen??a utilizando como estrat??gia o pirosequenciamento do gene para 16S rRNA. A planta do dend?? ?? uma oleaginosa produzida principalmente no norte do Brasil e possui um alto rendimento de ??leo o que a torna uma boa candidata a produ????o de biodiesel. Por??m, o dendezeiros t??m sido acometidos pelo AF, sendo seu agente etiol??gico procurado h?? mais de 20 anos sem resultados conclusivos. Plantas sadias que foram replantadas no mesmo lugar de plantas doentes desenvolveram a doen??a, criando-se a hip??tese da transmiss??o do AF ocorrer pelo solo. Neste trabalho, realizou-se o pirosequenciamento do gene para 16S rRNA amplificado da comunidade bacteriana de uma amostra de solo da base de dendezeiros acometidos por AF em dois est??gios da doen??a (est??gio 5 e est??gio 8) e aparentemente sem doen??a (est??gio 0). O sequenciamento gerou 839.694 sequ??ncias que depois de retirados os artefatos totalizaram 498.397 sequ??ncias distribu??das em 9 pontos (3 para cada est??gio da doen??a). As sequ??ncias foram analisadas utilizando-se o programa Qiime (Quantitative Insights in Microbial Ecology) e sua classifica????o taxon??mica atribu??da de acordo com o RDP-II (Ribossomal Database Project). Os filos mais abundantes encontrados foram Acidobacteria, Proteobacteria, Planctomycetes, Firmicutes e Verrucomicrobia. An??lises de alfa e beta diversidade foram realizadas e compara????es taxon??micas foram feitas utilizando o programa STAMP (Statistical Analysis of Metagenomic Profiles). Os resultados mostraram que os pontos DCA5 (dendezeiros com AF no est??gio 5 da doen??a) apresentam maior quantidade de OTUs observadas em rela????o a diversidade filogen??tica e ??ndice de Chao1. As an??lises de beta-diversidade mostraram que os agrupamentos entre os pontos por sintomas da doen??a s??o significativamente diferentes. Compara????es taxon??micas mostraram uma maior presen??a de filos raros nos est??gios 5 e 8. Este trabalho foi o primeiro realizado tentando elucidar o causador do AF utilizando sequenciamento de ??ltima gera????o. Estes resultados ir??o contribuir para futuros estudos do Amarelecimento Fatal.

Submitted by Kelson Anthony de Menezes (kelson@ucb.br) on 2016-12-09T13:47:20Z No. of bitstreams: 1 RayaneNogueiradosSantosDissertacao2015.pdf: 555926 bytes, checksum: f0d1ecfbcace9fe6c92b10a14d0327c5 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-12-09T13:47:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RayaneNogueiradosSantosDissertacao2015.pdf: 555926 bytes, checksum: f0d1ecfbcace9fe6c92b10a14d0327c5 (MD5) Previous issue date: 2015-03-27 / Acute gastroenteritis, especially in developing countries, is a major cause of mortality and morbidity, which affects people of all social classes. The knowledge of etiological agent assists the choice of a treatment strategy, but also directs epidemiological studies for control measures and disease prevention, as the development of vaccines and diagnostic tests. Metagenomic approaches enable the detection of viral sequences to determine the virus population present in the stool. The objective of this study was to evaluate the viroma of human feces in 4 distinct groups, consisting of diarrheal stool samples from children, diarrheal from adults, no diarrhea from adults and immunocompromised, identifying likely pathogens involved in cases of gastroenteritis. The viral metagenomic execution method consists of the semi-purification, extraction of RNA and DNA, amplification of RNA and DNA, library construction, sequencing and analysis of the data by bioinformatics. In the analysis of the first group were detecting bacteriophages, astrovirus and torque teno virus; in the second group were identified, among others, bacteriophages, adenoviruses and torque teno virus; the third group of viruses Circoviridae family and bacteriophages; in the fourth group adenovirus, torque teno virus, gyrovirus and human papillomavirus. These results emphasize what has been identified in the literature and provides evidence that viral metagenomics has facilitated advances in the field of virology, for being a sensitive technique for the detection of viruses which can not be identified by traditional culture.Acute gastroenteritis, especially in developing countries, is a major cause of mortality and morbidity, which affects people of all social classes. The knowledge of etiological agent assists the choice of a treatment strategy, but also directs epidemiological studies for control measures and disease prevention, as the development of vaccines and diagnostic tests. Metagenomic approaches enable the detection of viral sequences to determine the virus population present in the stool. The objective of this study was to evaluate the viroma of human feces in 4 distinct groups, consisting of diarrheal stool samples from children, diarrheal from adults, no diarrhea from adults and immunocompromised, identifying likely pathogens involved in cases of gastroenteritis. The viral metagenomic execution method consists of the semi-purification, extraction of RNA and DNA, amplification of RNA and DNA, library construction, sequencing and analysis of the data by bioinformatics. In the analysis of the first group were detecting bacteriophages, astrovirus and torque teno virus; in the second group were identified, among others, bacteriophages, adenoviruses and torque teno virus; the third group of viruses Circoviridae family and bacteriophages; in the fourth group adenovirus, torque teno virus, gyrovirus and human papillomavirus. These results emphasize what has been identified in the literature and provides evidence that viral metagenomics has facilitated advances in the field of virology, for being a sensitive technique for the detection of viruses which can not be identified by traditional culture. / A gastroenterite aguda, especialmente em pa??ses em desenvolvimento, ?? uma importante causa de mortalidade e morbidade, que atinge pessoas de todas as classes sociais. O conhecimento do agente etiol??gico nestas infec????es auxilia a escolha da estrat??gia de tratamento, como tamb??m direciona estudos epidemiol??gicos para medidas de controle e preven????o de doen??a, como o desenvolvimento de vacinas e testes diagn??sticos. Abordagens metagen??micas possibilitam a detec????o de sequ??ncias virais, para determinar a popula????o viral presente nas fezes. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o viroma de fezes humanas em 4 grupos distintos, sendo composto por amostras fecais diarreicas de crian??as, diarreicas de adultos, n??o diarreicas de adultos e de imunocomprometidos, identificando prov??veis pat??genos envolvidos nos quadros de gastroenterite. O m??todo de execu????o da metagen??mica viral consistiu na semi-purifica????o, extra????o de RNA e DNA, amplifica????o do RNA e DNA, constru????o da biblioteca, sequenciamento e an??lises dos dados por bioinform??tica. Na an??lise do primeiro grupo houve detec????o de bacteri??fagos, astrov??rus e torque teno v??rus; no segundo grupo foram identificados, entre outros, bacteri??fagos, adenov??rus e torque teno v??rus; no terceiro grupo v??rus da fam??lia Circoviridae e de bacteri??fagos; no quarto grupo adenov??rus, torque teno v??rus, gyrovirus e papilomav??rus humano. Esses resultados enfatizam o que tem se identificado na literatura e fornece evid??ncia de que a metagen??mica viral tem facilitado os avan??os no campo da virologia, sendo esta, uma t??cnica sens??vel para a detec????o de v??rus que n??o podem ser identificados por cultura tradicional.

O processo de domesticação e posterior melhoramento das plantas cultivadas foram essenciais para o sustento do crescimento populacional observado na recente história da humanidade. Porém, no processo de melhoramento das culturas não foi considerado o importante papel que o microbioma rizosférico desempenha nas plantas. Neste contexto, esta pesquisa foi direcionada ao estudo do microbioma rizosférico do feijoeiro, considerando um genótipo selvagem e outro cultivado, a fim de determinar a composição e funcionalidade do microbioma em cada rizosfera. Assim, para testar a hipótese de que materiais ancestrais têm maior capacidade de hospedar micro-organismos benéficos na rizosfera quando comparados a cultivares modernas, os genótipos de feijão cultivado IAC Alvorada e selvagem Wild Mex foram cultivados em Terra Preta da Amazônia (TPA), solo caracterizado por abrigar uma grande diversidade microbiana. O DNA total do solo rizosférico de cada genótipo de feijão e do bulk soil foi extraído para realizar o sequenciamento metagenômico usando a plataforma Illumina MiSeq. O solo rizosférico também foi usado para isolar e selecionar bactérias antagonistas a fungos radiculares patógenos do feijoeiro, Rhizoctonia solani e Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. A abordagem dependente de cultivo permitiu recuperar 11 bactérias que apresentaram atividade antagônica in vitro contra os patógenos avaliados, os isolados bacterianos foram identificados como pertencentes aos gêneros Streptomyces, Kitasatospora, Alcaligenes, Achromobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Brevibacillus e Paenibacillus. A abordagem independente de cultivo revelou que a composição da comunidade microbiana na rizosfera do feijão selvagem Wild Mex foi caracterizada pela maior abundância relativa dos filos bacterianos Acidobacteria, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes, e do filo fúngico Glomeromycota quando comparada com a composição da rizosfera do genótipo cultivado IAC Alvorada, a qual foi constituída em maior proporção pelos filos bacterianos Firmicutes, Planctomycetes, Deinococcus-Thermus e pelo filo fúngico Ascomycota. No nível taxonômico de gênero, a comunidade microbiana da rizosfera do feijão selvagem Wild Mex apresentou maior frequência relativa de gêneros fixadores do nitrogênio, nitrificadores, antagonistas e promotores do crescimento vegetal. A rizosfera do feijão selvagem Wild Mex apresentou maior abundância relativa de funções relacionadas à fixação do nitrogênio, produção de sideróforos e de ácido indol acético (AIA), quando comparada com o genótipo cultivado IAC Alvorada. O padrão de distribuição observado na análise de ordenação das funções no microbioma da rizosfera do feijão selvagem Wild Mex foi diferente do padrão encontrado no bulk soil e na rizosfera do feijão cultivado IAC Alvorada. Os resultados indicaram que o genótipo selvagem é mais seletivo no recrutamento de micro-organismos e funções na rizosfera quando comparado com o cultivar moderno. Em conclusão, os resultados revelaram que o processo de domesticação e melhoramento genético das plantas cultivadas potencialmente debilitou a capacidade do hospedeiro em selecionar e sustentar micro-organismos e funções benéficas na rizosfera. / The process of domestication and subsequent plant breeding were key to support human population growth over the last decades. However, plant breeding has neglected the important role of the rhizosphere microbiome on plant performance. In this context, this research aimed the study of common bean rhizosphere microbiome in a wild and in a cultivated genotype to determine the composition and functionality of their microbial community. We tested the hypothesis that ancestor materials have higher ability to host beneficial microorganisms in the rhizosphere when compared to modern cultivars. The common bean genotype IAC Alvorada and wild common bean Wild Mex were grown in highly biodiverse soil (Amazonian Dark Earth - ADE) and the total DNA from bulk soil and each common bean rhizosphere was extracted for sequencing by using Illumina MiSeq platform. In addition, rhizosphere soil was also used to isolate and select antagonistic bacteria against soil borne pathogens Rhizoctonia solani and Fusarium oxysporum f. sp. phaseoli. Using cultivation-dependent approach, 11 bacteria were isolated and showed antagonistic in vitro activity against the evaluated pathogens. The bacterial isolates were identified belonging to Streptomyces, Kitasatospora, Alcaligenes, Achromobacter, Pseudomonas, Stenotrophomonas, Brevibacillus and Paenibacillus genus. The cultivation- independent approach revealed that microbial community composition in the Wild Mex bean rhizosphere was characterized by higher relative abundance of bacterial phyla Acidobacteria, Verrucomicrobia, Gemmatimonadetes and fungal phylum Glomeromycota when compared with IAC Alvorada cultivated bean, which showed a higher relative abundance of bacterial phyla Firmicutes, Planctomycetes, Deinococcus-Thermus and fungal phylum Ascomycota. Wild Mex rhizosphere microbiome showed higher relative frequency of nitrogenfixing, nitrifying, antagonists and plant growth promoting microorganisms. The wild bean also showed higher relative abundance of functions related to nitrogen fixation, siderophore and indole acetic acid (IAA) production, when compared with IAC Alvorada bean. The distribut ion pattern observed in the functions ordination analysis of Wild Mex was different from the bulk soil and IAC Alvorada patterns. The results showed that wild genotype is more selective for recruiting microorganisms and functions in the rhizosphere when compared with modern cultivar. In conclusion, the results revealed that domestication and plant breeding potentially undermined rhizosphere microbiome composition and functions debilitating the host\'s abilit y to select and support beneficial microbes.

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:05:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 UaskaBS_TESE.pdf: 2951660 bytes, checksum: 93152a3c6ea30c7f4eaa465f3f5d2969 (MD5) Previous issue date: 2013-04-16 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / The screening for genes in metagenomic libraries from soil creates opportunities to explore the enormous genetic and metabolic diversity of microorganisms. Rivers are ecosystems with high biological diversity, but few were examined using the metagenomic approach. With this objective, a metagenomic library was constructed from DNA soil samples collected at three different points along the Jundia?-river (Rio Grande do Norte-Brazil). The points sampled are from open area, rough terrain and with the direct incidence of sunlight. This library was analyzed functionally and based in sequence. For functional analysis Luria-Bertani solid medium (LB) with NaCl concentration varied from 0.17M to 0.85M was used for functional analysis. Positives clones resistant to hypersaline medium were obtained. The recombinant DNAs were extracted and transformed into Escherichia coli strain DH10B and survival curves were obtained for quantification of abiotic stress resistance. The sequences of clones were obtained and submitted to the BLASTX tool. Some clones were found to hypothetical proteins of microorganisms from both Archaea and Bacteria division. One of the clones showed a complete ORF with high similarity to glucose-6-phosphate isomerase which participates in the synthesis of glycerol pathway and serves as a compatible solute to balance the osmotic pressure inside and outside of cells. Subsequently, in order to identify genes encoding osmolytes or enzymes related halotolerance, environmental DNA samples from the river soil, from the water column of the estuary and ocean were collected and pyrosequenced. Sequences of osmolytes and enzymes of different microorganisms were obtained from the UniProt and used as RefSeqs for homology identification (TBLASTN) in metagenomic databases. The sequences were submitted to HMMER for the functional domains identification. Some enzymes were identified: alpha-trehalose-phosphate synthase, L-ectoina synthase (EctC), transaminase L-2 ,4-diaminobutyric acid (EctB), L-2 ,4-diaminobutyric acetyltransferase (EctA), L-threonine 3 dehydrogenase (sorbitol pathway), glycerol-3-phosphate dehydrogenase, inositol 3-phosphate dehydrogenase, chaperones, L-proline, glycine betaine binding ABC transporter, myo-inositol-1-phosphate synthase protein of proline simportadora / PutP sodium-and trehalose-6-phosphate phosphatase These proteins are commonly related to saline environments, however the identification of them in river environment is justified by the high salt concentration in the soil during prolonged dry seasons this river. Regarding the richness of the microbiota the river substrate has an abundance of halobacteria similar to the sea and more than the estuary. These data confirm the existence of a specialized response against salt stress by microorganisms in the environment of the Jundia? river / A busca por genes baseada na constru??o e an?lise de bibliotecas metagen?micas a partir de solo gera oportunidades para explorar uma enorme diversidade gen?tica e metab?lica de microrganismos. Os rios s?o ecossistemas com alta diversidade biol?gica, mas ainda pouco explorados por meio de metagen?mica. Com o objetivo de explorar a diversidade microbiana, uma biblioteca metagen?mica foi constru?da a partir de DNA extra?do de substrato de rio em tr?s pontos ao longo do rio Jundia? (Rio Grande do Norte-Brasil). Os pontos de amostragem s?o derivados de ?rea aberta, terreno acidentado e com a incid?ncia direta da luz solar. Esta biblioteca foi analisada funcionalmente e tamb?m com base em sequ?ncias. Para a an?lise funcional foi utilizado meio de cultura s?lido LB com concentra??o de NaCl variando de 0,17M a 0,85M. Foram obtidos 15 clones positivos com caracter?sticas halotolerantes. Os DNAs recombinantes foram extra?dos e retransformados em cepa de Escherichia coli DH10B e curvas de sobreviv?ncia foram obtidas para confirma??o e quantifica??o da resist?ncia ao estresse abi?tico. As sequ?ncias dos clones foram obtidas e submetidas a ferramenta BLASTX e assim foi comprovado que alguns clones codificavam prote?nas hipot?ticas. Um dos clones apresentou uma ORF completa com elevada similaridade de glucose-6-fosfato-isomerase que participa na s?ntese do precursor de glicerol, sendo um soluto compat?vel para equilibrar a press?o osm?tica no interior e no exterior das c?lulas. Posteriormente, para identifica??o de genes que codificam osm?litos relacionados com halotoler?ncia e identifica??o da diversidade microbiol?gica, amostras de DNA ambiental do substrato do rio e da coluna d??gua do estu?rio e oceano foram coletadas e pirosequenciadas. As sequ?ncias de osm?litos de diferentes microrganismos foram obtidas a partir do UniProt e utilizadas como RefSeqs para a identifica??o por homologia (TBLASTN) nos bancos de dados metagen?micos. As sequ?ncias identificadas nos bancos de dados ambientais foram submetidas ao programa HMMER com o fim de identificar dom?nios funcionais. Foram identificadas as enzimas: alfa-trealose-fosfato sintase, L-ectoina sintase (ectC), transaminase do ?cido L-2,4-diaminobut?rico (EctB), ?cido L-2 ,4-diaminobut?rico acetiltransferase (EctA), L-treonina 3-desidrogenase (via de s?ntese do sorbitol), Glicerol-3-fosfato desidrogenase, inositol-3-fosfato desidrogenase, chaperonas, L-prolina glicina beta?na liga??o transportador ABC, mio-inositol-1-fosfato sintase, a prote?na simportadora de prolina/s?dio -PutP e trealose-6-fosfato fosfatase. Estas s?o enzimas que participam da s?ntese de osm?litos comumente relacionados a ambientes salinos, no entanto a identifica??o desses solutos em ambiente de rio ? justificada pela elevada concentra??o salina no solo durante prolongadas esta??es de seca neste rio. Quanto ? riqueza da microbiota foi identificado que o substrato do rio possui uma abund?ncia de halobact?rias semelhante a do mar e superior a do estu?rio. Esses dados confirmam a exist?ncia de uma resposta especializada contra o estresse salino por microrganismos no ambiente do rio Jundia?