Submitted by CLAUDIO DAMASCENO PAVANI null (claudio_dp913@hotmail.com) on 2017-07-10T13:24:55Z No. of bitstreams: 1 Tese Claudio_Damasceno _Pavani.docx: 10100219 bytes, checksum: b0579cc0881c7d4a4bd458b37a7be301 (MD5) / Rejected by Monique Sasaki (sayumi_sasaki@hotmail.com), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Por favor, corrija o formato do arquivo e realize uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2017-07-13T19:46:29Z (GMT) / Submitted by CLAUDIO DAMASCENO PAVANI null (claudio_dp913@hotmail.com) on 2017-07-17T13:16:54Z No. of bitstreams: 1 Tese Claudio_Damasceno _Pavani.pdf: 4981240 bytes, checksum: c45fa10351f84e64eb25cd201dcc69c9 (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-07-18T16:17:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 pavani_cd_dr_jabo.pdf: 4981240 bytes, checksum: c45fa10351f84e64eb25cd201dcc69c9 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-18T16:17:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 pavani_cd_dr_jabo.pdf: 4981240 bytes, checksum: c45fa10351f84e64eb25cd201dcc69c9 (MD5) Previous issue date: 2017-06-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A comunidade mundial busca pela obtenção de biocombustível celulósico, embora ainda seja um grande desafio a desconstrução do arranjo lignocelulósico para obtenção de açúcares livres de forma eficiente e economicamente viável. A fim de superar tais desafios, avanços conquistados pela metagenômica ressaltam sua aplicação como alternativa para compreender e desvendar o grande potencial metabólico presente nos ambientes, buscando encontrar em tais ambientes novas enzimas que atuem de forma eficiente na desconstrução do material lignocelulósico. Neste trabalho utilizou-se, a abordagem metagenômica para caracterização de genes com potencial para degradar biomassa vegetal e também para avaliação da diversidade taxonômica do ambiente ruminal bovino (Cow_1), bem como comparar os dados coletados com outros metagenomas disponíveis. Amostras de conteúdo ruminal de três bovinos machos da raça Nelore foram coletadas para a obtenção da amostra de DNA metagenômico, que posteriormente foi sequenciada pelo sequenciador HiScan SQ (Illumina). Foram obtidas aproximadamente 63 milhões de sequências (Cow _1), 2 x 100 pb. Dentre os 26 filos encontrados o filo Bacteroidetes foi o mais abundante, seguido de Firmicutes e Proteobacteria. Para a anotação gênica foi utilizado os bancos de dados Pfam, GO, KEGG e CAZy. Foram associadas ORFs relacionadas a 86 famílias de Glycoside Hydrolases (GHs), 52 famílias de Carbohydrate-Binding Modules (CBMs), 4 famílias de Auxiliary Activities (AAs), 16 famílias de Carbohydrate Esterases (CEs), 55 famílias de Glycosyl Transferases (GTs), 16 famílias de Polysaccharide Lyases (PLs), 1 família de S-layer homology (SLH) domain e 1 família de cohesina e dockerina, estes genes estão relacionados a formação do complexo enzimático para desconstrução da biomassa vegetal (celulossoma). O metagenoma da cow_1 analisado apresentou maior quantidade de genes relacionados à desconstrução da biomassa vegetal, quando comparados com outros 11 metagenomas. Além disso, os metagenomas dos ambientes lignocelulósicos apresentaram, principalmente, maior abundância de GH3, GH5, GH8, GH10 e GH11, genes que são importantes na degradação da lignocelulose quando comparados com o grupo de metagenomas não lignocelulósico. Os ambientes lignocelulósicos também revelaram maior abundância de sequências de domínios que se ligam na estrutura da celulose (CBM1, CBM10, CBM11, CBM16, CBM3, CBM63, CBM79 e CBM56), domínios que se ligam na estrutura da hemicelulose (CBM35, CBM61, CBM62 e CBM67) e domínios que atuam na estrutura da celulose e xilana (CBM37, CBM44 e CBM59). O metagenoma ruminal mostrou uma grande diversidade de enzimas responsáveis pela degradação da biomassa vegetal, demonstrando seu potencial como fonte de enzimas com potencial biotecnológico. Os metagenomas lignocelulósicos mostraram uma maior abundância de GH3, GH5, GH8, GH10 e GH11, genes que são importantes na degradação de celulose, celobiose, manana, xilana e xilo-oligossacarídeos quando comparados ao grupo não-lignocelulósico. / The world community search to obtain cellulosic biofuel; however the deconstruction of the lignocellulosic arrangement to obtain free sugars in an efficient and economically viable way is still a great challenge. Advances achieved through the metagenomic emphasize its application as an alternative to unfold the great metabolic potential present in the environments in order to overcome such challenges. Thus, a metagenomic approach was used to characterize genes with potential to degrade plant biomass and to evaluate the taxonomic diversity of the Nelore bovine ruminal environment. Samples were collected from three bovine males to obtain the DNA sample, which were sequentially sequenced by the HiScan SQ (Illumina) sequencer. About 63 million sequences, 2 x 100 bp, were obtained. Among the 26 phyla found, Bacteroidetes was the most abundant, followed by Firmicutes and Proteobacteria. For gene annotation was used the Pfam, GO, KEGG and CAZy databases. A total of 86 families of Glycoside Hydrolases (GHs), 52 families of Carbohydrate Binding Modules (CBMs), 4 families of Auxiliary Activities (AAs), 16 Esterase Carbohydrate (CEs), 55 GlycosylTransferases (GTs) Polysaccharide Lyases (PLs), 1 S-homology homology (SLH) domain and 1 family of cohesin and dockerine was associated. these genes are related to the formation of the enzymatic complex for deconstruction of plant biomass (cellulosome). The cow_1 metagenome presented a greater number of genes related to deconstruction of plant biomass when compared to other 11 metagenomes. In addition, the metagenomes of the lignocellulosic environments presented, mainly, greater abundance of GH3, GH5, GH8, GH10 and GH11, genes that are important in the degradation of lignocellulose when compared with the group of non-lignocellulosic metagenomes. Focusing on the CBMs, the metagenomes of the lignocellulosic group showed a greater abundance of CBM1, CBM10, CBM11, CBM16, CBM3, CBM63, CBM79 and CBM56 that bind in the cellulose structure; CBM35, CBM61, CBM62 and CBM67 which bind to the hemicellulose structure; CBM37, CBM44 and CBM59 that act on the structure of cellulose and xylan. The ruminal metagenome showed a great diversity of enzymes responsible for the degradation of the plant biomass, demonstrating its potential as a source of enzymes with biotechnological potential. Lignocellulosic metagenomes showed a greater abundance of GH3, GH5, GH8, GH10 and GH11, genes that are important in the degradation of cellulose, cellobiose, mannan, xylan and xylo-oligosaccharides when compared to the non-lignocellulosic group.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2015-12-15T17:45:11Z No. of bitstreams: 1 HenriqueCesarDeJesusFerreira_DISSERT.pdf: 3079036 bytes, checksum: 669ef1f5f7345e06f0db2159cfbc3fcd (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2015-12-29T20:46:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 HenriqueCesarDeJesusFerreira_DISSERT.pdf: 3079036 bytes, checksum: 669ef1f5f7345e06f0db2159cfbc3fcd (MD5) / Made available in DSpace on 2015-12-29T20:46:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HenriqueCesarDeJesusFerreira_DISSERT.pdf: 3079036 bytes, checksum: 669ef1f5f7345e06f0db2159cfbc3fcd (MD5) Previous issue date: 2014-09-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / Muitas esp?cies se especializaram em viver nos mais variados ambientes existentes demonstrando a not?vel capacidade de adapta??o do mundo microbiano as mais diversas condi??es f?sico-qu?micas. Ambientes expostos ? radia??o natural e a metais s?o escassos ao redor do mundo, apresentando uma microbiota ainda desconhecida. Com um n?mero total estimado entre 4 e 6 x 1030 microrganismos na terra, estes constituem um enorme pool biol?gico e gen?tico a ser explorado. Abordagens metagen?micas, independentes de cultivo, proporcionam uma nova forma de acesso ao potencial gen?mico de amostras ambientais tornando-se uma importante ferramenta para elucida??o de fun??es ecol?gicas, bem como para identifica??o de novas esp?cies e biomol?culas. Neste trabalho, o material gen?tico ambiental de amostras de solo e ?gua do A?ude Boqueir?o de Parelhas-RN, sob influ?ncia de radia??o natural e da presen?a de metais, foi extra?do, pirosequenciado, e as sequ?ncias geradas foram analisadas atrav?s de programas de bioinform?tica (MG-RAST e STAMP). Perfis taxon?micos comparativos de ambas as amostras mostraram alta abund?ncia do Dom?nio Bacteria, seguida por uma pequena parcela atribu?da aos Dom?nios Eucaryota, Archaea e V?rus. Proteobacteria, Actinobacteria e Bacterioidetes foram os filos que mostraram maior domin?ncia em ambas as amostras. Importantes g?neros e esp?cies associados ? resist?ncia aos agentes estressores encontrados na regi?o foram observados. Sequ?ncias relacionadas ? replica??o e reparo do DNA, ao estresse oxidativo e estresse pelo calor e a resist?ncia a compostos t?xicos foram observadas, mostrando uma importante rela??o entre a microbiota e seu perfil metab?lico, influenciada pelas vari?veis ambientais regionais. Os resultados encontrados neste estudo adicionam valiosos e in?ditos dados sobre a composi??o de comunidades microbianas nestas regi?es. / Many species have specialized to live in the most varied existing environments showing the remarkable adaptability of the microbial world the most diverse physicochemical conditions. Environments exposed to natural radiation and metals are scarce around the world, presenting a microbiota still unknown. With a total number estimated between 4 and 6 x 1030 microrganisms on earth, they constitute an enormous biological and genetic pool to be explored. Metagenomic approach independent of cultivation, provides a new form to access to the potential genomic environmental samples becoming a powerful tool for the elucidation of ecological functions, metabolic profiles, as well as to identify new biomolecules. In this context, the genetic material of environmental soil and water samples from A?ude Boqueirao Parelhas-RN, under the influence of natural radiation and the presence of metals, was extracted, pirosequencing and the generated sequences were analyzed by bioinformatics programs (MG-RAST and STAMP). Taxonomic comparative profiles of both samples showed high abundance of Domain Bacteria, followed by a small portion attributable to Eucaryota Domains, Archaea and Viruses. Proteobacteria, Actinobacteria and Bacterioidetes phyla showed the greater dominance in both samples. Important genera and species associated with resistance to various stressors found in region were observed. Sequences related to oxidative and heat stress, DNA replication and repair, and resistance to toxic compounds were observed, suggesting a significant relationship between the microbiota and their metabolic profile, influenced by regional environmental variables. The results of this study add valuable and unpublished data on the composition of microbial communities in these regions

Nessa pesquisa foram testados separadamente dois inóculos solo/compostagem e lodo termofílico de reator anaeróbio de manta de lodo e fluxo ascendente (UASB) do tratamento de vinhaça em relação ao potencial de produção de compostos de valor agregado a partir do bagaço de cana-de-açúcar (BCA) em reatores em batelada em condição mesofílica e termofílica, respectivamente. Pré-tratamentos térmico, ácido e diluição seriada foram aplicados ao inóculo termofílico, como tentativa de inibir as arqueias metanogênicas. A diluição seriada foi o pré-tratamento aplicado em ambos os inóculos, mesofílico e termofílico, para obtenção de consórcio de bactérias fermentadoras. Cinco meios de culturas foram testados como fonte de nutrientes para o crescimento de bactérias celulolíticas e fermentadoras. Dentre esses foi selecionado para os ensaios mesofílicos e termofílicos, o meio de cultura mais complexo suplementado com extrato de levedura. O BCA foi submetido à pré-tratamento biológico, térmico, explosão a vapor, deslignificação alcalina e hidrotérmico sendo o último utilizado nos ensaios do planejamento fatorial. O efeito das variáveis independentes de concentração de extrato de levedura e temperatura foi avaliado na produção de hidrogênio, metano e ácidos orgânicos a partir do inóculo termofílico. O efeito da concentração de extrato de levedura e substrato (BCA) foi avaliado na produção de bioprodutos a partir do inóculo mesofílico (37ºC). A maior produção de hidrogênio foi de 17,30 mmol/L à 60ºC e 3,42 g/L de extrato de levedura para a condição termofílica. Em relação aos ensaios mesofílicos observou-se 1,53 mmol/L com 3,42 e 5,00 g/L de extrato de levedura e BCA, respectivamente. Caracterização taxonômica e funcional dos microrganismos dos reatores de melhor desempenho de produção de hidrogênio dos planejamentos fatoriais termofílico e mesofílico foi realizada por análise Metagenômica (Illumina HiSeq). Nestas condições foram identificados microrganismos dos domínios Archaea, Bacteria, Eukarya, além de vírus. Para o domínio Bacteria foram identificados microrganismos celulolíticos e fermentadores como Coprothermobacter e Clostridium, enquanto para o domínio Archaea, foram identificadas metanogênicas hidrogenotróficas e acetoclásticas, como Methanothermobacter e Methanosarcina. Foram ainda identificados genes codificantes de enzimas catalisadoras da degradação de celulose, hemicelulose e lignina, constituintes principais da biomassa lignocelulósica utilizada como substrato, tais como celulase, carboxylesterase e 2-ácido hidroxi oxidase, respectivamente. Microrganismos aderidos no BCA in natura foram observados por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e identificados por sequenciamento do RNAr 16S, e semelhantes a Streptomyces, Paenibacillus, Stenotrophomonas, Sphingomonas. Os microrganismos do lodo termofílico, solo e compostagem foram caracterizados por sequenciamento do RNAr 16S, e foram semelhantes a Clostridium, Thermoanaerobacter, Caloramator, Anaerobaculum, Tatlockia, Coprothermobacter, Dysgonomonas, Coprococcus, Sporomusa, Methanobacterium, Methanothermobacter, Methanosaeta, dentre outros. / In the present study, two inoculum (soil/compost and thermophilic sludge from upflow anaerobic sludge blanket from vinasse treatment) were separately evaluated as potential to production of value-added products from sugarcane bagasse in mesophilic and thermophilic conditions, respectively. Thermal, acid and serial dilution pretreatments were performed in the thermophilic inoculum to inhibition of methanogenic archaea. Serial dilution was applied into the mesophilic inoculm. Five culture medium were evaluated as nutritional source to enrichment of cellulolytic and fermenters bacteria; between then, the most complex one, supplemented with yeast extract was selected for the mesophilic and thermophilic bioassays. The sugarcane bagasse (SCB) was submitted to biological, thermal, stem explosion alkaline delignification and hydrothermal pretreatments, and the last one was used as substrate for the factorial designs. The effect of independent variables, such as yeast extract and temperature were evaluated on the hydrogen, methane and organic acids production from the thermophilic inoculum. The effect of yeast extract and substrate (SCB) concentrations were evaluated on the bioproducts generation from the mesophilic inoculum. The highest hydrogen production of 17.3 mmol/L was obtained at 60ºC and 3.42 g/L of yeast extract, on the thermophilic factorial design. In relation to the mesophilic factorial design, obtained 1.53 mmol/L of hydrogen with 3.42 and 5.00 g/L of yeast extract and SCB, respectively. Taxonomical and functional characterizations from the microorganisms were performed in the reactors with highest hydrogen production on the factorial designs using Metagenomics analysis (Illumina HiSeq). In both condition, mesophilic and thermophilic were found microorganisms from Archaea, Bacteria, Eukarya domin, besides Viruses. Concerning the Bacteria domain were found cellulolytic and fermenters microorganisms similar to Coprothermobacter and Clostridium, whiles for Archaea domain were identified hydrogenotrophic and acetoclastic methanogenic similar to Methanothermobacter and Methanosarcina. There were obtained genes coding to enzymes related to the cellulose, hemicellulose and lignin degradation such as carboxylesterase e 2-acid-hydroxioxidase, respectively. Microorganisms adhered into the in natura SCB fiber were observed by scanning electronic microscopy (SEM) and identified by 16 S rRNA sequencing, mainly as similar to Streptomyces, Paenibacillus, Stenotrophomonas, Sphingomonas. The microorganisms from the thermophilic sludge, soil and composting were also characterized by 16S RNAr sequencing and were similar to Clostridium, Thermoanaerobacter, Caloramator, Anaerobaculum, Tatlockia, Coprothermobacter, Dysgonomonas, Coprococcus, Sporomusa, Methanobacterium, Methanothermobacter, Methanosaeta, among others.

Este trabalho teve como objetivo analisar, através de uma abordagem metagenômica/computacional, a variação do conteúdo gênico e do potencial metabólico das comunidades microbianas associadas a dois ambientes da Fundação Parque Zoológico de São Paulo: um reservatório artificial, o Lago São Francisco e o sistema de compostagem de resíduos do parque. Para o estudo do primeiro ambiente, amostras foram coletadas mensalmente no Lago São Francisco de outubro de 2012 a setembro de 2013 e submetidas ao sequenciamento metagenômico. Esse estudo mostrou que agrupamentos de amostras de uma mesma estação são estatisticamente suportados. As coocorrências de espécies, com suporte estatístico alto, foram estabelecidas e representadas em uma rede separada em 60 grupos ou módulos. A maioria dos grandes módulos foram formados quase exclusivamente por espécies do mesmo filo, indicando possíveis mecanismos de resposta a fatores ambientais e à presença de nutrientes ao invés da pura interação entre espécies. Os fatores que levaram à variação dos táxons também influenciaram o potencial metabólico da comunidade: embora os módulos metabólicos de forma geral estivessem distribuídos ao longo dos meses, alguns se destacaram pela variação intensa, principalmente na amostra de novembro de 2012. Para o estudo do segundo ambiente, foram analisados dois conjuntos de dados de sequenciamento metagenômico gerados a partir de amostras seriadas coletadas ao longo do processo de compostagem. Nos dias iniciais do processo de compostagem, os mais discrepantes, houve uma super-representação de módulos metabólicos relacionados principalmente ao metabolismo de carboidratos e à síntese de aminoácidos. Em conjunto, os dados obtidos nesse estudo indicaram uma comunidade microbiana com potencial metabólico variando direcionalmente em função dos compostos inicialmente presentes ou oriundos do substrato, em função da presença de oxigênio e em função da etapa do processo. / This project aimed to analyze, through a computational approach, the change of gene content and metabolic potential in metagenomes from two microbiomes from São Paulo Zoo Park Foundation: an artificial reservoir, Lake São Francisco, and the compost systems in the park. For the study on the first microbiome, samples were monthly collected in Lake São Francisco from October 2012 to September 2013 and submitted to metagenomic sequencing. This study showed that clustering of the samples from a same season is statistically supported. The species co-occorrences, with high statistical support, were established and represented in a network composed by 60 groups or modules. The most biggest modules were formed almost exclusively by species of the same phylum, pointing possible response mechanisms to environmental factors and to presence of nutrients instead of the simple species interaction. The factors which leaded to taxa variation also influenced the metabolic potential of the community: although the metabolic modules generally are spreaded through the months, some highlighted because the intense variation, mainly in the sample from November 2012. For the latter environment, two metagenomic datasets were analyzed from serial samples collected throughout the composting process. In the initial days of composting process, the most discrepant, there was an uprepresentation of metabolic modules related to carbohydrates metabolism and amino acids synthesis. All data in this study indicated a microbial community with metabolic potential varying according to nutrientes, oxygen presence and process stage.

Orientador: Laura Maria Mariscal Ottoboni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:24:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carlos_Camila_D.pdf: 3834562 bytes, checksum: ae067ac8bf3731e5d1ab6af674e63c67 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Os recifes de corais são ecossistemas sensíveis que estão ameaçados pelas mudanças climáticas. Estudos têm demonstrado a importância da microbiota associada aos corais na resistência às doenças e aos estresses. Neste trabalho, a caracterização taxonômica e funcional da microbiota associada a corais encontrados no litoral de São Paulo permitiu a identificação de associações espécie-específicas entre corais e bactérias e a identificação de funções bacterianas responsáveis pelo estabelecimento de associações coral-bactéria. A composição taxonômica associada a ambientes coralíneos (muco, água e sedimento do entorno) de quatro espécies de corais encontradas no litoral de São Paulo foi avaliada por pirosequenciamento do gene de rRNA 16S. Os resultados indicam que a comunidade microbiana do muco não é apenas distinta do ambiente do entorno, todavia é, também, mais estável ao longo das estações do ano. A composição taxonômica da microbiota do coral mole Palythoa caribaeorum foi bastante distinta das demais espécies, pertencentes estas à ordem Scleractinia, indicando a influência das relações filogenéticas na moldagem das comunidades microbianas associadas aos corais. O metagenoma de Madracis decactis e da espécie brasileira endêmica Mussismilia hispida foi sequenciado por pirosequenciamento. A maior parte das sequências obtidas não pôde ser anotada, o que pode indicar a abundância de micro-organismos, especialmente vírus, ainda não estudados. Entre as sequências anotadas, foi observada uma grande abundância de sequências de origem viral em ambas as bibliotecas. Os metagenomas de M. hispida e M. decactis foram comparados a outros metagenomas disponíveis no banco de dados do MG-RAST e foi possível identificar genes ou funções mais abundantes nessas bibliotecas, como genes de resistência a antibióticos da classe dos aminoglicosídeos, que podem estar sujeitos à transferência horizontal nesse ambiente. Por último, foi sequenciado o genoma de uma bactéria isolada de muco de M. hispida, Paracoccus sp. SM22M-07. A análise comparativa desse genoma com outros genomas do gênero Paracoccus revelou funções únicas do isolado de muco de coral, por exemplo, genes do sistema de secreção do tipo IV podem exercer a função de contribuir com o estabelecimento de interações bactéria-coral. Todos os resultados aqui apresentados e analisados apontam para uma grande diversidade tanto taxonômica quanto funcional da comunidade bacteriana associada aos corais brasileiros. A estabilidade sazonal dessas comunidades é uma propriedade importante que contribui para a prevenção da colonização de bactérias patogênicas. Os resultados aqui apresentados representam um extenso inventário da diversidade microbiana em um ecossistema ameaçado pelas mudanças climáticas globais e permitirão futuros estudos comparativos e a criação de modelos e estimativas das taxas de redução da diversidade microbiana em ambientes marinhos / Abstract: Coral reefs are one of the ecosystems most threatened by global climate changes. Studies have shown the importance of the coral microbiota in stress and disease resistance. In this work, the taxonomic and functional characterization of the bacterial communities associated with corals from the coast of São Paulo State, Brazil, allowed the identification of species-specific interactions between corals and bacteria and the identification of the bacterial functions responsible for the establishment of these interactions. The taxonomic composition of mucus, water and surrounding sediment of four coral species found in the coast of Sao Paulo State was assessed by 16S rDNA pyrosequencing of metagenomic DNA. The microbial communities found in samples of mucus, water, and sediment differed according to the taxonomic composition, and the coral mucus community seemed to be more stable to seasonal changes. The taxonomic composition of the microbiota of the soft coral Palythoa caribaeorum was distinct from the other species belonging to the order Scleractinia, indicating the influence of phylogenetic relationships in shaping the microbial communities associated with the coral. The metagenome of Madracis decactis and the Brazilian endemic species Mussismilia hispida was sequenced by pyrosequencing. Most of the sequences obtained could not be annotated, which might indicate an abundance of unknown microorganisms, especially viruses. Among the annotated sequences, an abundance of viral sequences in both libraries was observed. The metagenomas M. decactis and M. hispida were compared with metagenomes datasets available in the MG-RAST database and through these comparisons, the most abundant genes or functions of the corals¿ metagenomes were identified, for example, genes for resistance to antibiotics of the aminoglycoside class. Finally, the genome of an isolate of mucus of M. hispida, Paracoccus sp . SM22M - 07 was sequenced. The comparative analysis of this genome with other genomes of the genus Paracoccus revealed unique functions of the bacteria isolated from coral mucus, such as genes of the type IV secretion system, which may contribute to the establishment of coral-bacteria interactions. All results presented and analyzed in this work show a great diversity, both taxonomic and functional, of the bacterial community associated with Brazilian corals. The seasonal stability of these communities is an important property that contributes to preventing the colonization by pathogenic bacteria. The results presented here represent an extensive inventory of microbial diversity in an ecosystem threatened by global climate change and will allow future comparisons, modeling and estimates of the rates of reduction of microbial diversity in marine environments / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Valéria Maia Merzel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-25T14:04:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Verde_LeandroCostaLima_D.pdf: 7821596 bytes, checksum: b0f165c3b35ff62438f4e8f59035eb82 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O processo de biodegradação do petróleo em reservatórios pode resultar em mudanças na composição e propriedades físico-químicas de óleos brutos e gases naturais, as quais levam à diminuição do teor de hidrocarbonetos saturados, produzindo óleos mais pesados e com baixo valor econômico. O uso combinado de técnicas dependentes e independentes de cultivo pode nos permitir um melhor entendimento acerca da comunidade de micro-organismos que habita os reservatórios de petróleo, incluindo aqueles responsáveis por esta biodegradação. O conhecimento sobre a composição microbiana, suas funções e interações com outros micro-organismos e com o ambiente pode levar à definição de estratégias de monitoramento e/ou controle da biodegradação em reservatórios. Este estudo teve como finalidade avaliar a diversidade de micro-organismos e genes envolvidos na degradação de hidrocarbonetos presentes em amostras de petróleo provenientes de dois poços terrestres da Bacia Potiguar (RN), identificados como GMR75 (poço biodegradado) e PTS1 (poço não-biodegradado), através da construção de bibliotecas de genes catabólicos (alcano monooxigenases - alk, dioxigenases que hidroxilam anéis aromáticos ¿ ARHDs e 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hidroxilase - bamA) e sequenciamento em larga escala de metagenoma e metatranscriptoma de enriquecimentos microbianos aeróbios. Os resultados obervados mostraram uma distribuição diferencial dos genes catabólicos entre os reservatórios, sendo o óleo biodegradado mais diverso para os genes alk e bamA. As sequências foram semelhantes aos genes alkB dos gêneros Geobacillus, Acinetobacter e Streptomyces, aos genes ARHD dos gêneros Pseudomonas e Burkholderia, e aos genes bamA do gênero Syntrophus. A análise quantitativa dos genes catabólicos de degradação de hidrocarbonetos presentes e expressos nos enriquecimentos microbianos em diferentes etapas da biodegradação do óleo, através de PCR Tempo Real, demonstrou maior atividade do gene que codifica a enzima dioxigenase nas comunidades microbianas enriquecidas, e os resultados obtidos pela técnica de microarray sugeriram a existência de novas sequências dos genes alk e ARHD provindas do reservatório de petróleo. As análises das sequências obtidas a partir do metagenoma e metatranscriptoma mostraram que a comunidade bacteriana recuperada no enriquecimento aeróbio é bastante diversa, com predominância do Filo Actinobacteria, seguido de Proteobacteria. As sequências com maior abundância e níveis de expressão foram relacionadas aos genes que codificam as proteínas ligase CoA de ácido graxo de cadeia longa, envolvida na degradação de compostos aromáticos; descarboxilase, envolvida com o ciclo do glioxilato, e o fator sigma da RNA polimerase, envolvida com a regulação da resposta ao estresse oxidativo, sugerindo uma adaptação da comunidade microbiana às condições do enriquecimento e um processo inicial de biodegradação dos hidrocarbonetos. Os resultados obtidos neste trabalho fornecem dados inéditos sobre a diversidade de genes catabólicos e de membros da comunidade microbiana potencialmente envolvidos com a degradação do óleo em reservatórios de petróleo / Abstract: The process of oil biodegradation in reservoirs may result in changes in the composition and physico-chemical properties of crude oils and natural gases, which lead to the decrease of the content of saturated hydrocarbons, producing heavy oils and with low economic value. The combined use of both dependent and independet cultivation techniques may allow us to better understand the microbial community inhabiting oil reservoirs, including those microorganisms responsible for oil degradation. The knowledge about the microorganisms, ther functions and interactions with other microorganisms and the environment may lead to the definition of monitoring and/or control strategies of biodegradation in oil reservoirs. This study aimed at evaluating the diversity of microorganisms and genes involved in the degradation of hydrocarbons present in oil samples from two onshore reservoirs at Potiguar Basin (RN), identified as GMR75 (biodegraded) and PTS1 (non- biodegraded), through the construction of catabolic gene libraries (alkane monooxygenases - alk, aromatic ring hydroxylating dioxygenases ¿ ARHD and 6-oxocyclohex-1-ene-1-carbonyl-CoA hydroxylase - bamA) and highthroughput sequencing of metagenome and metatranscriptome from aerobic microbial enrichments. Results observed showed a differential distribution of catabolic genes between the reservoirs, being the biodegraded oil more diverse for the alk and bamA genes. The sequences were similar to alkB genes from Geobacillus, Acinetobacter and Streptomyces genera, to the ARHD genes from Pseudomonas and Burkholderia genera, and to the bamA genes from Syntrophus genus. Quantitative analysis of the hydrocarbon degradation genes present and expressed in the microbial enrichments during the different phases of oil biodegradation by Real-Time PCR showed that there was a higher activity of dioxygenase enzymes in the enriched microbial communities and results from microarray assays suggested the existence of new alk and ARHD gene sequences originated from the oil reservoir. Metagenomic and metatranscriptomic analyses showed a highly diverse bacterial community, dominated by the Phylum Actinobacteria, followed by Proteobacteria. The most abundant and active sequences were affiliated to the Long-chain-fatty-acid-CoA ligase protein, involved in the degradation of aromatic compounds; decarboxylase, which is involved with the glyoxylate cycle, and RNA polymerase sigma factor, which is involved in regulating the oxidative stress response, suggesting an adaptation of the microbial community to the enrichment conditions and an initial process of biodegradation of hydrocarbon compounds. The results obtained in this work bring innovative data on the diversity of catabolic genes and microbial community members potentially involved with oil degradation in petroleum reservoirs / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Valeria Maia Merzel / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-22T20:30:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tomazetto_Geizecler_D.pdf: 2728814 bytes, checksum: 5ca8845e4db01805f12ccff354b0a0b0 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O hidrogênio é apontado como o candidato mais promissor para substituição do combustível fóssil devido a sua maior eficiência na conversão de energia útil e ausência de emissão de substâncias tóxicas. A produção de hidrogênio a partir de resíduos orgânicos é realizada por meio de digestão anaeróbica, tornando-se uma alternativa ecologicamente correta para atender à futura demanda por hidrogênio. No entanto, os micro-organismos e os processos metabólicos envolvidos estão longe de serem exaustivamente caracterizados. Nesse trabalho, amostras de uma planta de tratamento de esgoto doméstico foram analisadas em dois estudos complementares visando à caracterização de sua diversidade filogenética e a descrição de novas hidrogenases. O primeiro trabalho combinou a análise dos genes de RNAr 16S e FeFehidrogenase (hydA) com ferramentas estatísticas para estimar a riqueza e diversidade da comunidade procariótica em nível filogenético e funcional. As análises filogenéticas e de diversidade das bibliotecas gênicas demonstraram que todas as sequências de arquéias foram afiliadas a Euryarchaeota não cultivadas e, com relação ao Dominio Bactéria, Proteobacteria foi grupo filogenético predominante apresentando os maiores índices de diversidade e riqueza. As sequências putativas de hydA foram identificadas como sequências de genes de FeFehidrogenases ainda não descritas. Na segunda abordagem, a biblioteca metagenômica de fosmideo construída nesse estudo foi analisada empregando a tecnologia de pirosequenciamento 454 e resultou em aproximadamente 218 Mb de dados. Os três diferentes classificadores aplicados permitiram uma visão geral dos grupos taxonômicos mais abundantes devido ao enorme número de sequências metagenômicas não classificadas. Contudo, análises taxonômicas revelaram Gammaproteobacteria e Deltaproteobacteria, respectivamente, como as classes taxonômicas predominantes, enquanto que as espécies do gênero Methanospirillum foram dominantes entre as arquéias metanogênicas. A análise do metabolismo da comunidade microbiana através das bases de dados COG e Carma revelou que a degradação da biomassa depende de diferentes grupos filogenéticos, como por exemplo, Bacteroidia e Gammaproteobacteria, os quais foram indicados como envolvidos na degradação de carboidratos e proteínas, respectivamente. Além disso, as análises sugerem Clostridia e Methanomicrobiales e Methanosarcinales como principais micro-organismos produtores de hidrogênio e metano, respectivamente. As análises das seis sequências codificantes de FeFehidrogenase identificadas no conjunto de dados metagenômicos revelaram que essas representam novas sequências do gene alvo. Contudo, quatro dessas sequências foram identificadas na biblioteca de fosmídeo pela triagem gênica baseada no uso de PCR. O conjunto de resultados obtido nesse estudo permitiu elucidar a composição e o potencial metabólico dos micro-organismos residentes na planta de tratamento de esgoto analisada e sugere esse ambiente como um reservatório potencial de novos genes de hidrogenases para a exploração biotecnológica / Abstract: Hydrogen appears to be the most promising candidate for the replacement of fossil fuel due to its potentially higher efficiency of conversion to usable power and no toxic emission production. The production of hydrogen from organic wastes is performed through the anaerobic digestion, making it an environmentally friendly alternative for satisfying future hydrogen demands. Nonetheless, the microorganisms and metabolic processes involved are far from being exhaustively characterized. In this work, samples of a domestic sewage treatment plant were analyzed in two complementary studies aiming at the characterization of its phylogenetic diversity and the description of new hydrogenases. The first one, combined the analysis of 16S rRNA and [FeFe]-hydrogenase (hydA) genes with statistical tools to estimate richness and diversity of the prokaryotic community at the phylogenetic and functional levels. Phylogenetic analysis showed that all archaeal sequences were affiliated with yet uncultured Euryarchaeota and that Proteobacteria were the most predominant and diversified phylogenetic group within the bacterial library. The putative hydA sequences were identified as hitherto undetected [Fe-Fe]- hydrogenase gene sequences. Diversity statistical analysis confirmed a great richness and diversity of bacterial and hydA sequences retrieved from the sewage sludge sample. In the second approach, a fosmid metagenomic library was constructed and analyzed employing 454- pyrosequencing technology, resulting in approximately 218 Mb of data. Three different classifiers applied allowed a broad overview of the most abundant taxonomic groups due to a huge number of metagenome reads remained unidentified. However, taxonomic analysis revealed Gammaproteobacteria and Deltaproteobacteria, respectively, as the most abundant classes, whereas species of the genus Methanospirillum were dominant among methanogenic Archaea. The analyzes of the microbial community metabolism by means of COG and Carma databases revealed that the degradation of biomass depends on different phylogenetic groups, for instance, Bacteroidia and Gammaproteobacteria were indicated as involved into the degradation of carbohydrate and proteins. Furthermore, the analysis suggested Clostridia and Methanomicrobiales and Methanosarcinales as the main microorganisms producing hydrogen and methane, respectively. Analysis of the six coding sequences of FeFe-hydrogenases identified into the dataset revealed that they represented novel target gene sequences. However, only four of these coding sequences could be detected into the fosmid library by PCR screening. The combined results obtained in this study allowed us to have an insight of the composition and potential metabolism of the microbes residing in the analyzed domestic sewage treatment plant and suggested such environment as a potential reservoir for new hydrogenase genes to biotechnological exploration / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutora em Genética e Biologia Molecular

Devido à grande diversidade de microrganismos desconhecidos no meio ambiente, 99% deles não podem ser cultivados nos meios de cultura tradicionais dos laboratórios. Para isso, projetos metagenômicos são propostos para estudar comunidades microbianas presentes no meio ambiente, a partir de técnicas moleculares, em especial o seqüenciamento. Dessa forma, para os próximos anos é esperado um acúmulo de seqüências produzidas por esses projetos. As seqüências produzidas pelos projetos genomas e metagenomas apresentam vários desafios para o tratamento, armazenamento e análise, como exemplo: a busca de clones contendo genes de interesse. Este trabalho apresenta uma abordagem algébrica que define e gerencia de forma dinâmica as regras para a seleção de clones em bibliotecas genômicas e metagenômicas, que se baseiam em álgebra de processos. Além disso, uma interface web foi desenvolvida para permitir que os pesquisadores criem e executem facilmente suas próprias regras de seleção de clones em bancos de dados de seqüências genômicas e metagenômicas. Este software foi testado em bibliotecas genômicas e metagenômicas e foi capaz de selecionar clones contendo genes de interesse. / Due to the wide diversity of unknown organisms in the environment, 99% of them cannot be grown in traditional culture medium in laboratories. Therefore, metagenomics projects are proposed to study microbial communities present in the environment, from molecular techniques, especially the sequencing. Thereby, for the coming years it is expected an accumulation of sequences produced by these projects. Thus, the sequences produced by genomics and metagenomics projects present several challenges for the treatment, storing and analysis such as: the search for clones containing genes of interest. This work presents an algebraic approach that defines it dynamically and manages the rules of the selection of clones in genomic and metagenomic libraries, which are based on process algebra. Furthermore, a web interface was developed to allow researchers to easily create and execute their own rules to select clones in genomic and metagenomic sequence database. This software was tested in genomics and metagenomics libraries and it was able to select clones containing genes of interest.

Os micro-organismos que habitam o trato digestivo dos ruminantes têm uma profunda influência no desenvolvimento e funcionamento do animal hospedeiro. O rúmen abriga comunidades microbianas complexas dominadas por bactérias que participam de um processo eficiente de degradação dos materiais que compõem a parede celular vegetal. Por esta razão, o microbioma do rúmen representa uma fonte inexplorada de enzimas hidrolíticas com potencial aplicação na produção de combustíveis a partir da biomassa lignocelulósica. Nós usamos a plataforma Ion Torrent (PGM) para acessar o microbioma do rúmen de quatro animais da raça Santa Inês submetidos a uma dieta base. A fim de descrever a estrutura da comunidade microbiana no rúmen de ovinos e explorar o seu potencial como uma fonte de genes de degradação da biomassa, usamos a abordagem de sequenciamento do gene RNA ribossomal 16S (rRNA), utilizando Ion Tags, e a abordagem de sequenciamento metagenômico shotgun (DNA total), respectivamente. Além disso, medimos parâmetros químicos do ambiente do rúmen, relacionados a cada animal, incluindo pH, Degradabilidade da Matéria Orgânica (OMD), Produção total de Gás (GP) e Emissões de Metano (CH4), a fim de buscar correlações entre estas variáveis químicas e os grupos bacterianos. Em termos de estrutura da comunidade microbiana (bacteriana), encontramos Bacteroidetes como o filo dominante, seguido por Firmicutes, Proteobacteria e Actinobacteria. Alguns táxons foram correlacionados com os parâmetros químicos, como as famílias Corynebacteriaceae e Streptococcaceae, que foram positivamente correlacionadas com OMD; e a família Streptomycetaceae, negativamente correlacionada com GP e CH4. Algumas glicosil hidrolases conhecidas foram identificadas, como Endo-1,4-beta-glucanases, Beta-D-glicosídioglicohidrolases e outras foram designadas como putativas. Estas descobertas mostram interações ecológicas entre os grupos microbianos e funções importantes do rúmen, assim como o potencial do rúmen de ovinos para a descoberta de novas enzimas celulolíticas. / The microorganisms inhabiting the digestive tracts of ruminants have a profound influence on the host animal development and functioning. The rumen harbors complex microbial communities dominated by bacteria, which participate in an efficient process to digest plant cell wall materials. For this reason, the rumen microbiome represents an untapped source of hydrolytic enzymes with potential application for fuel production from lignocellulosic biomass. We used the Ion Torrent (PGM) platform to access the rumen microbiome of four animals of Santa Inês breed under a base diet. In order to describe the structure of the microbial community in the sheep rumen and explore its potential as a source of biomass-degrading genes, we used 16S ribosomal RNA (rRNA) Ion Tags sequencing approach and shotgun metagenomic sequencing (total DNA) approach, respectively. Furthermore, we measured rumen chemical environmental parameters related to each animal, including pH, Organic Matter Degradability (OMD), Total Gas Production (GP) and Methane emissions (CH4) in order to search for correlations between these chemical variables and bacterial groups. In terms of microbial (bacterial) community structure, we found Bacteroidetes as the dominant phylum in sheep rumen microbiome, followed by Proteobacteria, Firmicutes and Actinobacteria. Some taxa were correlated with the environmental parameters, like the Corynebacteriaceae and Streptococcaceae families, which was positively correlated with OMD, and the Streptomycetaceae family, negatively correlated with GP and CH4. Some known glycoside hydrolases were identified, such as Endo-1,4-betaglucanases, Beta-D-glucoside glucohydrolases and others were designated as putative ones. These findings show ecological interactions among microbial groups and important rumen functions, as well as the potential of the sheep rumen for the discovery of new cellulolytic enzymes.

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolinie.pdf: 1105289 bytes, checksum: fb4a9af7cf4012e7784dfbcf92246455 (MD5) Previous issue date: 2010-03-09 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / In the Amazon agricultural soils are found in soil called Anthropogenic Dark Earths (ADE), a soil rich in organic matter and minerals. The biodiversity is a source of very high value of non-cultivable microorganisms that can be isolated through construction of metagenomic libraries, using vectors of large fragments, with the goal of finding new biocatalytic enzymes. Enzymes widely used in the industrial market are amylase and protease, are applied in industry: chemical, pharmaceutical, textile, detergent and food industries. Amylases degrade starch into smaller units of saccharides, as proteases catalyze the hydrolysis of peptide bonds. The aim of this study was to isolate and partially characterize enzymes amylase and protease of clones isolated from a selection of functional metagenomic library of TPI in the Amazon region. In this study were isolated 1.344 clones, only 4 producing halo of starch hydrolysis and 3 proteolytic clones belonging to metagenomic library constructed with total DNA extracted from microorganisms present in soil samples of the TPI, were partially characterized the enzymes produced by 4 clones amilolytic and 1 proteolytic clone. After isolation, the clones were inoculated in culture medium Luria Bertani (LB) at 37ºC under agitation of 150 rpm and subjected to assays at pHs of 3 to 10 and temperatures ranging from 25 to 100ºC for up to 90 of incubation. Amylases had its highest production in 24 h (4.3 U/mL) and its activity was optimal at neutral pH to slightly alkaline, the clone P1C4 showed the highest production at 70°C (6.93 U/mL), since the clones P5C4 and P6C12 reported higher thermostability at 80°C, these results indicate that the gene for alpha-amylase to be cloned encoding a thermostable enzyme, such as the enzyme produced by Bacillus liqueniformis. Since the clone P3A3 produced 26.3 U/mL protease in 10 hours of production, its activity was optimal at neutral pH, and its optimum temperature at 30ºC (56.0 U/mL) and its thermostability was demonstrated in 50°C (22,0 U/mL). These features contribute to the implementation of these enzymes in industrial sectors as in food production, chemical industry and production of detergents. The enzymes isolated in this study demonstrated new features and performance when compared to enzymes described today, which proves the efficiency of the construction of metagenomic libraries for isolation of new bioproducts. / Na floresta Amazônica são encontrados solos agricultáveis denominado de solo de Terra Preta de Índio (TPI), um solo rico em matéria orgânica e em minerais. A biodiversidade da Amazônia constitui uma fonte de valor altíssimo de micro-organismos não-cultiváveis que podem ser isolados através das construções das bibliotecas metagenômicas, utilizando vetores de grandes fragmentos, com o objetivo de encontrar novas enzimas biocatalíticas. As enzimas de maior aplicação no mercado industrial são as amilases e proteases, aplicadas nas indústrias: química, farmacêutica, têxtil, de detergentes e alimentícia. As amilases são capazes de degradar o amido em unidades de sacarídeos menores, já as proteases catalisam a hidrólise de ligações peptídicas. O objetivo deste trabalho foi isolar e caracterizar parcialmente enzimas amilolíticas e proteolíticas de clones isolados a partir de uma seleção funcional da biblioteca metagenômica de TPI da região Amazônica construída com DNA total extraído dos micro-organismos presentes nas amostras de solos de TPI, inseridos no vetor fosmidial (pCC1Fos ) e clonado na célula hospedeira Escherichia coli (EPI300). De 1.344 clones pertencente a biblioteca metagenômica, apenas 4 clones foram produtores de halo de hidrólise de amido e 3 clones foram proteolíticos, além disso, todas as enzimas produzidas pelos 4 clones amilolíticos e 1 clone proteolítico foram caracterizadas parcialmente. Após o isolamento, os clones foram inoculados em meio de cultura Luria Bertani (LB) a 37oC, sob agitação de 150 rpm e submetidos aos ensaios enzimáticos nos pHs de 3 a 10 e temperatura variando de 25 a 100ºC por até 90 minutos de incubação. As amilases tiveram sua maior produção em 24 horas (4,3 U/mL) e sua atividade ótima foi em pH neutro a levemente alcalino, o clone P1C4 demonstrou a maior produção a 70ºC (6,93 U/mL), já os clones P5C4 e P6C12 demonstraram a maior termoestabilidade a 80°C, tais resultados indicam que o gene de alfa-amilase clonado deve ser codificador de uma enzima termoestável, como por exemplo, a enzima produzida por Bacillus liqueniformis. Já o clone P3A3 produziu 26,3 U/mL de proteases em 10 horas de produção, sua atividade ótima foi em pH neutro, sendo sua temperatura ótima em 30ºC (56,0 U/mL) e sua termoestabilidade foi demonstrada em 50ºC (22,0 U/mL). Estas características contribuem para a aplicação destas enzimas em setores industriais como na produção de alimentos, indústria química e produção de detergentes. As enzimas isoladas neste trabalho demonstraram características e atuações novas quando comparadas a enzimas descritas atualmente, a qual comprova a eficiência da construção de bibliotecas metagenômicas para o isolamento de novos bioprodutos.